BG62172B1 - Съединения и продукти на реакцията на amaдори, метод затяхното производство и използването им - Google Patents

Съединения и продукти на реакцията на amaдори, метод затяхното производство и използването им Download PDF

Info

Publication number
BG62172B1
BG62172B1 BG98956A BG9895694A BG62172B1 BG 62172 B1 BG62172 B1 BG 62172B1 BG 98956 A BG98956 A BG 98956A BG 9895694 A BG9895694 A BG 9895694A BG 62172 B1 BG62172 B1 BG 62172B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
reaction
radical
molecular weight
amadori
glucose
Prior art date
Application number
BG98956A
Other languages
English (en)
Other versions
BG98956A (bg
Inventor
Jan Z. Mioduszewski
Krystyna Witkiewicz
Anna Inglot
Original Assignee
Torf Establishment
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PL29346492A external-priority patent/PL171023B1/pl
Application filed by Torf Establishment filed Critical Torf Establishment
Publication of BG98956A publication Critical patent/BG98956A/bg
Publication of BG62172B1 publication Critical patent/BG62172B1/bg

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/60Sugars; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/06Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00Preparations for care of the skin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02Acyclic radicals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K9/00Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61QSPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00Preparations for care of the hair

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящето изобретение се отнася до нови съединения и продукти на реакцията на Amadori, тяхното производство, както и новото използване на тези съединения и продукти, влезли най-малко частично в прегрупиране на Amadori съгласно следната схема и/или реакция на Maillard :
Н ,0Н
С-----
н - C - OH H -
но - C - H + H.N-R --> HO -
2
н - C - OH H -
0
н - c H - 1
CH, OH 2
ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ
Продуктите на реакцията
продукти на реакция между,
пептид със захар, олиго-
прегрупиране на Amadori (J
Borsook et al.). В
Н /NH.R ' / Н Н - С - NH.R
f !
C - OH ) I Прегрупиране С = 0
C - H - - > НО - С - Н
на
C - OH Amadori Н - С - ОН
0
C------- н - с - ОН
I CH^OH сн.он
HA ТЕХНИКАТА
на Amadori са известни; те са
например аминокиселина или
или полизахарид, претърпял
Biol. Soc.215 (1955) , Henri
DE-C-3914354 е описан
водоразтворим гликопротеин на аминокиселина и захар, изолиран от екстракт на семена от Avena sativa. Освен това,
ЕР 406087 се описват водоразтворими полизахаридни-гликопептидни комплекси, които са извлечени от клетъчните стени на Gram положителна
бактерия, а в списание J. Biol. Chem. 1985,260/9 се
съобщава, че е използвана NMR-спектроскопия за
характеризиране на продуктите от реакцията на Amadori,
получени при реакция между глюкоза и свободни аминогрупи на белтък.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение описва специфични нови съединения, продукти на прегрупирането на Amadori съгласно претенция 1. Предпочитаните варианти са описани в претенции от 2 до 4.
Тези съединения редуктират калиев ферицианид - реакция за тестване на биологично-активни субстанции, формирани в реакция между захар и аминокиселина.
Изобретението се отнася и за ново използване на такива съединения и едновременно за ново използване на продукти на реакцията на Amadori от захари и аминокиселини въобще, както е описано в претенции от 11 до 17. До този момент никой не е изследвал различните стъпки на пречистване на екстракт от продукти на реакцията на Amadori ( с цел да бъдат освободени от баластни субстанции и примеси ) и тяхната биологична активност.
Известни са имуностимулатори от естествени източници , като екстракти от имел, торфени екстракти и т.н., чиито недостатъци са скъпото обработване на големи количества суров материал, за да се получат няколко грама активна субстанция; неконтролируеми примеси, които могат да доведат до токсичност и странични ефекти , както и до проблеми по време на използване, дължащи се на сложната природа и трудно възпроизводимия състав.
Сравними продукти или смеси от продукти от изкуствени източници като интерферон или получени по други методи на генното инженерство, са още по-скъпи. Освен това, молекулите на човешкия интерферон често са твърде големи > за да проникнат през клетъчните стени така, че само част от приетата доза е ефективна. Продуктите на генното инженерство обикновено имат странични ефекти, а някои са дори токсични. Освен това, някои от тях един ден са ефективни, а на следващия не, по причини^неизвестни досега.
Беше установено, че почти всеки прост комплекс от аминокиселина и захар ,влязъл най-малко частично в прегрупиране на Amadori, не показва никой от посочените погоре недостатъци, а напротив , има неочаквано висока иммунна активност. По тази причина те могат да бъдат използвани за лекарствени средства и в козметиката. Малките им молекули лесно проникват през клетъчните стени и действието им е приблизително като на подхранващо вещество. Те индуктират образуването на естествен интерферон и други цитокини, включително и туморонекротизиращ фактор. Дори три дни след приемане, те все още показват стимулиращ ефект върху биологичната активност. Ефектът нараства със завършване на прегрупирането на Amadori и намалява отново при разграждането на комплекса.
Вместо прости захари, могат да се използват и полизахариди, за предпочитане с ниско молекулно тегло,по специално под 1000 daltons, например декстран, който реагира подобно.
Полизахаридите показват биологична активност и могат да запазят част от тази активност и след като се превърнат в олигозахариди.
До този момент се знаеше твърде малко за биологичната активност на тези съединения. ·_ ξ/становено че комбинация от тях в контакт с човешки левкоцити стимулират продуцирането на интерферон и други цитокини. Това се нарича поликлонално активиране на клетките.
Възможно е да се изследват субстанциите, продуцирани под влияние на тези съединения и да се определи биологичната им активност в международни единици, съответстващи на специфичните цитокини. Съединенията показват най-висока биологична активност при концентрация от 1-100 g/ml.
В рамките на молекулата специфичната природа на аминокиселината е по-важна от тази на захарта.
Продуктите от реакцията на L-аспарагинова киселина с глюкоза или галактоза след прегрупиране на Amadori когато контактуват с човешки левкоцити и се инкубират в среда , подходяща за тъканни култури при температура 3 7°С за 20 часа в атмосфера с 5% съдържание на въглероден двуокис, продуцират от 30-1000 антивирусни единици интерферон. Интерферонът се измерва чрез биотест, използващ човешки ракови клетки. Под влияние на гореспоменатите продукти могат да се продуцират също и туморонекротизиращи съединения.
Продуктите, позволяващи такова неочаквано използване, имат обща формула
R1 -NH- R2 («2/ където
R1 представлява 1- дезокси- 2 - кетозен радикал, получен от групата на простите захари, олиго- и за предпочитане с ниско молекулно тегло, под 1000 daltons полизахариди и ι
R2 представлява аминокиселина или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, под 1000 daltons.
Така групата от биологична-^активни съединения може да обхване или специфичните съединения с прегрупиране на Amadori, описани по-горе, или N-субституирани деривати на голям брой съединения на различни аминокиселини и една проста захар, олиго- или за предпочитане с ниско молекулно тегло /по-малко от 1000 daltons/ полизахарид, или Nсубституирани деривати на едно съединение на аминокиселина и голям брой прости захари, олиго- и/или полизахариди от описания тип, или каквато и да е комбинация от тези деривати, всеки от които има достатъчна биологична активност.
За предпочитане е R'l в горната формула да бъде радикал, подбран от прости захари с D-форма, по-специално (но не изключително) глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, фруктоза, маноза, 6-дезоксиглюкоза, глюкозамин и галактозамин; R2 може да бъде радикал, подбран от Lформата на съединения на аминокиселини, такива като серин, глицин, хистидин, аргинин, глутамин, аспарагин, аланин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, фенилаланин, треонин, цистеин, цистин, метионин, хидроксипролин, триптофан, пролин, тирозин, валин, изолевцин, левцин и лизин или други пептиди на тези аминокиселини във всякаква комбинация.
Изобретението се отнася и до метод за получаване на горепосочените съединения и продукти, при което се формира и междинен продукт с формула
Rl' - NH - R2' където:
R1' е 1-дезокси - 2 - кетозен радикал с нормална въглеродна верига или която и да е О-мостова форма на проста захар или олиго- или полизахарид, а
R2 ' представлява аминокиселина или пептиден радикал,
като този междинен продукт е бил най-малкото частично подложен на прегрупиране на Amadori и/или на реакцията на Maillard чрез непрекъснато нагряване на реакционната смесза предпочитане под налягане- и едновременно или последващо отделяне на разтворителите.
В някои случаи, особено когато се използва аминокиселина с две карбоксилни групи, добре е при метода да се добави буферна сол, като например сода бикарбонат, за предпочитане в моларно отношение 1:1.
По-нататък беше установено, че продуктите на прегрупирането на Amadori са относително податливи на декомпозиция, а продуктите на декомпозицията са тъмнокафяви катраноподобни неидентифицирани съединения, които са загубили биологичната си активност. Затова се предпочита реакцията на Amadori да се спре на фазата, в която реакционната смес придобие светло-оранжево-кафяв цвят.
Интересно е да се отбележи, че междинните продукти на реакцията, получени когато първоначално непрозрачният аминокиселинен разтвор се избистри (преди прегупирането на Amadori), лесно се хидролизират, т.е. реакцията е обратима. С напредване на прегрупирането, обратимостта намалява, т.е. продуктите стават по-стабилни, а цветът постепенно се променя от светложълт към светлооранжев и накрай в оранжевокафяво, когато реакцията на Amadori клони към завършване. Проби, взети по време на реакцията и тествани (съгласно различни процедури, описани по-късно) , доказват, че биологичната активност нараства с напредване на реакцията на Amadori и намалява, когато по-нататъшното нагряване резултира в декомпозиция, за което индикатор е промяната на цвета към тъмнокафяво. Ако реакционната смес съдържа други кето- групи и/или сяросъдържащи аминокиселини, като цистеин, ще протече незабавна редукция на ферицианид и резултираща промяна в цвета ; в противен случай редукцията ще протече за 3 до 5 мин., което е добра проверка за степента на развитие на прегрупирането на Amadori. Нереагиралите захари ще покажат промяна в цвета чак след половин час или няколко часа.
Изолирането на чисти продукти на реакцията на Amadori се извършва съгласно известни методи, базирани върху свързване на сместа със силен катионообменник ( като Amberlite или Dovex ), последователно елюиране /отмиване/ с амониева вода, изпаряване на определена избрана фракция на елюата под редуцирано налягане и кристализиране на чистото съединение от безводен метанол ( J.E. Hodje and В.Е. Fisher, Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol.II, Reactions of Carbohydrates, Academic Press, N.Y., London, 1963, page 105106; или Borsook at al, както беше цитирано по-напред; или J.Duborg and Р.Devilliers).
ЙО метода съгласно изобретението ? всички горепосочени предпочитания по отношение вида на радикалите, извлеченни от проста захар и аминокиселинни съединения, остават непроменени. Допълнително, една предпочитана смес от захарни субстрати съдържа Д-формите на глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза и фруктоза в тегловно съотношение 20:10:4:1:1, докато предпочитаната смес от аминокиселинни субстрати съдържа L-формите на серин, глицин, хистидин, аргинин, аланин, пролин, тирозин, валин, левцин, изолевцин и лизин в тегловно съотношение 20.5:35.8:35.8:132:180:360:216:160:72:68:780.
Както беше вече отбелязано, продуктите от прегрупирането на Amadori могат да редуктират калиев ферицианид, като такава химическа тестваща реакция осигурява база за бързо определяне на биологичната активност на съединенията, формирани в реакция между захар и аминокиселина.
Беше установено, че продуктите от реакцията на Amadori са особено активни, ако смес от прости захари със същия състав и тегловно съотношение, както в естествените торфени екстракти, влезе в реакция със смес от аминокиселинни съединения със същия състав и в същите тегловни съотношения, както в естествените торфени екстракти в присъствието на воден разтворител, за предпочитане с добавка на нискомолекулен алкохол и евентуално следи от неорганични елементи, характерни за такива естествени торфени екстракти при повишена температура (и евентуално под налягане) и последващо продължаване на нагряването с цел да се осъществи прегупиране на Amadori в получените продукти, едновременно или последващо отстраняване на разтворителите, спиране на реакцията на Amadori когато реагентната микстура стане светлей.—-оранжево-кафява на цвят, изсушаване на така получените продукти и пречистване на същите чрез колонна хроматография и събиране на фракциите, които причиняват максимална редукция на калиев ферицианид.
В един от вариантите на изобретението.
фармацевтичният препарат съдържа като активна съставка най-малко един реакционен продукт с формула R съединение с формула R -NH-R приемлив носител и/или добавка, препарата и/ или евентуално мазилно вещество в тегловно заедно или специфично с фармацевтично усилваща действието на съотношение на активната съставка към останалите компоненти между 1:1 и 1:100, за предпочитане от 1:8 до 1:20, а найдобре 1:9.
Друг вариант на фармацевтичния препарат съдържа в добавка на активната съставка лактоза и мазилно вещество, като тегловното съотношение на лактозата към мазилното вещество е между 20:1 и 100:1, за предпочитане 50:1.
Тези фармацевтични препарати се използват за лечение и/или профилактика на хематологични и/или имунологични заболявания и/или за стимулиране на имунната система на хора и/или млекопитаещи чрез индукция на формиране на цитокини.
Активните съставки могат да намерят приложение и в козметични препарати. Присъствието на тези съставки в козметичните препарати е в количества от 0,01-10 тегловни %,за предпочитане от 0,01-1 тегловен % и най-вече от 0,050,1 % . Тези козметични препарати съдържат освен активна съставка и традиционни носители, стимулиращи и обогатяващи добавки и/или ароматни вещества.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение ще бъде по-подробно обяснено и илюстрирано с помощта на следните примери, които в никакъв случай не ограничават неговият обхват.
Пример 1.
25-милилитрова колба на ротационен изпарител, поставен в затоплена водна баня, се пълни с:
1.47 g (0.01 М) L-глутаминова киселина
0.84 g (0.01 М) NaHCO
0.91 g D-глюкоза
0.91 g галактоза и
3.00 ml редестилирана вода
Сместа се загрява до 80° С ,за предпочитане под понижено налягане, при което 50% от водата се изпарява и след това под атмосферно налягане - се загрява до температура 80-85°С, която се поддържа в продължение на 12 0 min, докато сместа придобие оранжев цвят. След това сиропоподобният концентриран воден разтвор се изпарява до изсушаване под понижено налягане. Така полученият оранжево-червен твърд продукт се маркира със симвог D-10 и се съхранява за биологични тестове.
Пример 2.
25-милилитрова колба на ротационен изпарител, поставен в затоплена водна баня, се пълни с:
1.33 g (0.01 М)L-аспарагинова киселина
0.84 g (0.01 М) NaHCO
0.91 g D-глюкоза
0.91 g галактоза и
3.00 ml редестилирана вода
Сместа се загрява до 80°С с разбъркване (чрез ротация), концентрира се под налягане, общ обем 1.5 ml и след налягане при температура цвят; това става за около при което се изпарява вода с това се поставя под атмосферно 80-85° С}докато стане оранжева на 60 min.
Реакционната смес, представляваща сиропоподобен концентриран воден разтвор, се изсушава налягане. Полученият реакционен продукт е сух прах. Маркира се със символ D-11 и се биологични тестове.
Пример 3.
25-милитрова колба на затоплена водна баня, при понижено жълто-оранжев съхранява за ротационен изпарител, поставен в се пълни с:
1.05 (0.01 М) L-серин
0.91
D-глюкоза
0.91 галактоза и
2.50 ml редестилирана вода
Сместа се загрява (посредством ротация).
до
След
85-92° С , като се разбърква добива
100 min, разтвор®» оранжев цвят.Понижава се край. Продуктът налягането и сместа по стените на на реакцията образува оранжев колбата, който се изпарява допрозрачен слой се изсгъргва
Маркира се със символ'. D-12 и се съхранява и разпрашава. за биологични тестове.
Пример 4.
25-милитрова колба на ротационен изпарител, поставен в затоплена водна баня, се пълни с:
0.66 д (0.005 М)D-аспарагинова киселина
0.42 g (0.005 M) NaHCO
0.45 g D-глюкоза
0.45 g галактоза и
3.00 ml редестилирана вода
Сместа се загрява до 80° С, изпарява се под налягане, докато 1.5 ml от количеството вода се изпари и след това се подлага на атмосферно налягане при температура 85°С. След 60 min нагряване сместа става оранжева на цвят; налягането се понижава и образувалият се сироповиден концентриран воден разтвор се изпарява да_^край. Преди утайката да е засъхнала съвсем , се прибавя два пъти по 10 ml безводен етанол и се изпарява в колбата с цел да се елиминира остатъчната влага. Така получения сух продукт на реакцията се разпрашава, маркира се със символ D-13 и се съхранява за биологични тестове.
Пример 5;
За да бъде получен по синтетичен начин еквивалент на биологичнси^активната фракция на някои естествени торфени екстракти, колбата на ротационния изпарител, поставен в
затоплена водна баня се пълни с:
20.5 mg L-серин
35.8 mg L-глицин
35.8 mg L-хистидин
132.0 mg L-аргинин
180.0 mg L-аланин
360.0 mg L-пролин
216.0 mg L-тирозин
160.0 mg L-валин
68.0 mg L-изолевцин
72.0 mg L-левцин
780.0 mg L-лизин
2000.0 mg D-глюкоза
1000.0 mg D-ксилоза
400.0 mg D-галактоза
100.0 mg D-рамноза
100.0 mg D-фруктоза
6.0 ml редестилирана вода
Сместа се разбърква посредством ротация и се загрява под налягане за 45 min, при температура f нарастваща от 75° С до 86° С. През този период около 3 ml от водата се изпаряват, а субстратите се разтварят напълно. След това в продължение на 30 min сместа се подлага на атмосферно налягане при температура 85-86 С за осъществяване на прегрупиране на Amadori.През този период разтворът бързо добива червенокафяв цвят. Налягането се понижава и нагряването при температура 84° С се продължава, като заедно с това разтворителите се изпаряват. В края на изпаряването се прибавя два пъти по 10 ml безводен етанол и рективната смес се изсушава. Колбата с изсушения продукт се поставя в ексикатор върху калциев хлорид за 18 часа; след това се разпрашава. Получават се около 4.5д от разпратения продукт и се маркира със символ . ЕК -S.
Порция от 4д от този продукт се разтваря в 20 ml дестилирана вода и се поставя на хроматографска ректификационна колона с размери 25 mm х 30 mm, пълна със сорбент Amberlite(R) XAD-2, аналитична фракция. Колоната се елюира с 0.4 ml/min дестилирана вода. Фракции с обем 10 ml се събиращдокато бъде достигнат общ обем 450 ml.
Съдържанието на фракциите се проверява хроматографично. Фракции с поредни номера 11-13 се комбинират и изпаряват под понижено налягане. Тези фракции се характеризират с високо съдържание на продукти на реакцията на Amadori (потвърдено чрез калиев ферицианиден редукционен тест ) . Продуктът се съхранява за биологични тестове със символ ЕК -S-11.
Биологичните тестове за определяне на биологичната активност се провеждат с имунизирани Balb/C мишки от двата пола на възраст 8-10 седмици. Мишките се имунизират чрез перитонално въвеждане на 0.2 ml 10 % суспензия от овчи еритроцити (SRBC), т.е. 6x10 клетки. Еритроцитите се фиксират в стерилен разтвор на Alsever със следния състав :
глюкоза натриев цитрат натриев хлорид лимонена киселина
2.05 g
0.8 g
0.42 g
0.055 g редестилирана вода до 100 ml
В такъв разтвор на Alsever се поставя асептична проба
от овчи кръвни клетки в отношение 1:1 и сместа се държи поне 3 дни при температура +4° С. От така стабилизираните еритроцити се вземат асептични проби и се поставят във фосфатно неутрализиран солен разтвор (PBS)^ с цел да бъдат промити. Еритроцитите се промиват с PBS два пъти и след това се центрофугират 10 min при 2000 оборота в минута
Промитите клетки се използват под формата на 10% суспензия в PBS . Тази суспензия се използва за имунизиране на Balb/C мишки.
За да бъде тестван, продуктът на реакцията се въвежда интраперитонално (i.p) или през устата четири пъти при определени дози , като първото въвеждане се прави 2 часа преди имунизацията на мишките с SRBC, а следващите три след имунизацията на 24 часови интервали.
Всяка група от изследваните животни се третира с различни дози от тестувания реактивен продукт: 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0.1 mg/kg и 0.01 mg/kg. Контролна група от животни също се имунизира с SRBC, но вместо тестваната субстанция се въвеждат 0.2 ml PBS на същите интервали.
Всяка от групите животни, контролна и тестова, се състоят от 8-12 мишки.
На четвъртия ден (в случай на детерминиране на антитела тип 7S) или десетия след имунизацията, мишките се упоявват с етер и след това кръвта им се изцежда чрез отстраняване на очните ябълки. Кръвта се събира в изпитателни тубуси. След това гръбначният мозък се прекъсва и се отстранява далакът. Кръвта се използва за получаване на серум, необходим за определяне на хемоаглутиниращи антитела от тип 19S+7S и 7S, докато далаците се използват за приготвяне на клетки, приложими за определяне на хемолитичната активност и процентът на клетки, способни да формират Е-розетки. За
целта мишите далаци се пулверизират. Получените далачни клетки/спленоцити/ се суспензират в около 2 ml среда на Hanks при +4*С, наслояват се върху Ficoll-Uropolin градиент с гъстота 1.077 и след това се центрофугират за 15 Min при 3000 оборота и 4* С. След разделяне от междинната фаза, лимфоцитните корички се поставят в среда на Hanks при +4e С и се изплакват двойно с центрофугиране за 7-10 min, всеки път при 1800 оборота. След това далачните клетки се суспензират в 1ml среда на Hanks в такова съотношение, че да се съдържат 1x10 клетки.
За всеки тест процентът на мъртвите клетки се определя чрез смесване на капка от изпитваната суспензия далачни клетки с капка от приготвен ex tempore багрилен разтвор, съдържащ 4 части 0.2 %-ен син трипанов разтвор и 1 част 4.25 %-ен разтвор на натриев хлорид. Процентът на мъртвите далачни клетки се определя под микроскоп за всеки 100 клетки. Мъртвите клетки са морсксюини, а блестящите клетки са живи. Наличието на повече от 10 % мъртви клетки е критично; такива проби се елиминират от по-нататъшно използване.
Всички операции, които се извършват с клетките, подлежащи на тестване, трябва да бъдат изпълнени в стерилен, силиконизиран лабораторен стъклен апарат, поставен в ледена баня.
Пример 6.
В първия тест се определя ефектът на тестваните реакционни продукти върху броя на клетките, продуциращи кръвни антитела (PFC-IgM). Тестът се извършва както следва. Към 0.5ml от 0.5% разтвор на агароза, поставен в изпитателен тубус в затоплена водна баня с температура 45° С}се добавя 0.1 м1 10%-на суспензия на SRBC (приготвена както беше описано по-горе). После се добавя 0.1 ml суспензия от далачни клекти с гъстота 1x10 клетки /мл, като сместа се разбърква бързо и се излива върху предметни стъкла, предварително намазани с агароза. Предметните стъкла се инкубират при температура 37° С в продължение на два часа. След това пробите се намазват с добавка от морско свинче, разредена в отношение 1:20 и се инкубират за още два часа. След инкубацията на пробите заедно с добавката се изброяват плакообразуващите клетки (PFC) и се преизчисляват за 1x10 далачни клетки. Всеки тест се провежда по два пъти.
Най-голямо усилване на реакцията спрямо SRBC, изразено в повиш>аване броя на далачните клетки, продуциращи хемолизини IgM (PFC), се наблюдава след приемане на субстанцията D-11 в доза от 0.1 mg/kg. Усилването е 119% .
При увеличаване на дозата 10 пъти, до 1 mg/kg, усилването на реакцията намалява до 53% .
Реакционният продукт D-12 показва най-голяма активност - повишаване с 50% - при доза от 1 mg/kg.
Реакционният продукт ЕК -S-11 в този тест показва найголяма активност при доза от 0.1 mg/kg (повишаване с 65%) .
mg/kg, повишаването е
При десет пъти по-висока доза, малко по-ниско - 52% .
т.е.
Реакционният продукт D-13, тестван при 40% . Когато дозата предизвиква повишаване mg/kg, т.е. десет пъти, реакцията се усилва доза от 1 ml/kg, се повиши на 10 само с
14%
Пример 7 тест, хемоаглутинационен нивото на антителата анти - SRBC тип 19S+7S и 7S.
Провежда се също определящ
За да се определи нивото на серум на четвъртия антителата тип 19S-IgM,ce приготвя миши ден след имунизацията със SRBC, докато за определяне нивото на антителата тип 7S-IgG, серумът се приготвя на десетия е свързано с деня, ден след имунизацията на мишките, което в които се отчита максималният брой от дадения тип антитела при мишкиимунизирани с SRBC.
А.Определяне броя на антителата тип 19S+7S
Кръвните проби се центрофугират в продължение на 30 min при 3500 оборота. От всяка от така приготвените проби се събира серумът и се поставя в затоплена водна баня с температура 56° С за 30 min за да се дезактивира. След това се приготвят множество разтвори с различна степен на разреждане от всеки тестван серум ( от 1:1 до 1:4096) с помощта на микротитратор и U-образни микротарелки с обем от 250 1 всяка. Разредените серуми се инкубират за 1 час при стайна температура. По една капка 1%-на суспензия на SRBC в PBS (приготвена както е описано по-горе) се добавя към всеки серум; сместа се инкубира за още 2 часа при температура 37РС с
и след това се съхранява при температура +4 С. Резултатът се отчита на следващия ден. Максималното разреждане, при което все още протича хемоаглутинация, зависи от броя на антителата. Оформянето на пръстен на дъното на тарелката е знак, че протича хемоаглутинация. Наличието на подобно на копче образувание, се счита за негативен резултат - не протича хемоаглутинация.
За статистически анализ на резултатите повишаването на разредеността на серума на изпитваната субстанция се сравнява с тази на контролната група.
Реакционният продукт D-11 в доза от lmg/kg повишава броя на IgM 2.57 пъти. При десет пъти по висока доза, стимулиращият ефект, в сравнение с контролната група, се увеличава 3.5 пъти.
Реакционният продукт D-12 в този тест показва по-слаба активност. В доза от 0.1 mg/kg той повишава броя на IgM два пъти, а при доза 1 mg/kg - 1.4 пъти.
Реакционният продукт ЕК -S-11 показва най-голяма активност при този тест. В доза от 0.1 mg/kg той повишава броя на IgM 4.3 пъти, а в доза от 1 mg/kg - 3.6 пъти.
Реакционният продукт D-13 в доза от 1 mg/kg повишава броя на IgM 3 пъти, а при десет пъти по-висока доза - 1.5 пъти.
Б.Определяне броя на антителата тип 7S
Изпитваните дезактивирани серуми се смесват в съотношение 1:1 с 0.1 М разтвор на 2- меркаптоетанол и сместа се инкубира за 30 min при температура 37с С. 2меркаптоетанолът разрушава имуноглобулините от типа 19 S(IgM) , докато имуноглобулините от типа 7S-(IgG) не са чувствителни на въздействието му.
След 30 min инкубация редукцията се спира чрез понижаване на температурата до 4° С за 15 min. След това се приготвят множество разтвори по описания по-горе начин за определяне броя на 19S антителата , които се смесват с 1% на SRBC суспензия; след 2 часа инкубация при температура 37° С пробите се съхраняват при температура +4° С. Резултатът се отчита на другия ден, съгласно критериите за определяне на хемоаглутинацията, описани по-горе. Едновременно се провежда и контролен тест с комбинация от 1%-на суспензия SRBC и PBS в съотношение 1:1.
При тестване на субстанцията D-11, както е описано погоре, при доза 1 mg/kg се увеличава продуцирането на антитела тип IgG 3.16 пъти. При доза 10 mg/kg, увеличението е 2.2 пъти.
Реакционният продукт D-12, тестван при дози от 0.1 m9/kg и 1 mg/kg стимулира съответно продуцирането на антитела IgG 1.3 пъти, а при доза от 10 mg/kg - 1.5 пъти.
Реакционният продукт ЕК -S-11 при доза от 0.1 mg/kg стимулира продуцирането на IgG 1.9 пъти, а при доза от 1 mg/kg - 2.89 пъти (в сравнение с контролната проба).
Резултатите от тестовете А и Б, получени за всяка производствена партида или за всяка фракция от биологичноактивните реакционни продукти, синтезирани съгласно изобретението и даващи горепосочените имунологични реакции, бяха подложени на статистически анализ по метода ’’Т-student, = 0.05. Получените резултати за всяка доза от изпитваните бяха сравнени с паралелен контролен тест и показаха увеличаване на биологичната активност.
Пример 8
Групата от биологично-активни реакционни продукти, получени съгласно примери от 1 до 5^се подлага също на тест, в който се определя процентното съотношение на спленоцитите, формиращи Е-розетки.
250 1 от 1%-на суспензия SRBC и 250 1^подлежащи на тестване клетки в концентрация 1 х 10 клетки/ml, се добавят към 550 L среда на Hanks. Всяка такава проба се инкубира в затоплена водна баня, съоръжена със шейкър, за 15 min при температура 37°С. След това пробите се съхраняват при температура +4°C за още 20 часа. Процентът на спленоцитите, оформили Е-розетки със SRBC , се определя след като суспензията се оцвети с 1 до 3 капки кристалвиолет.
Всяка проба се подлага на трикратно определяне на процента на спленоцитите в нея, като всеки път спленоцитите възлизат на 400 броя. Спленоцит, обграден с най малко 3 еритроцита, се счита за Е-розетка.
За статистическа оценка процентното нарастване на броя на спленоцитите с Е-розетки се сравнява между изпитваните субстаниции и контролна група.
В този тест най-силен стимулиращ ефект показват реакционният продукт D-11 (63%) и ЕК -S-11 (70%) при доза от 1 mg/kg. При десет пъти по-малка доза, т.е. 0.1 mg/kg, нивото намалява съответно на 45% и 57%.
Реакционният продукт D-12 при доза от 1 mg/kg причинява повишаване способността за образуване на Е-розетки с 22% в сравнение с контролната група. При десет пъти по-малка доза, т.е. 0.1 mg/kg, този процент е 29% .
Реакционният продукт D-13 показва максимален ефект при доза 1 mg/kg (58%), докато при по-големи дози ефектът е малко по-нисък.
Биологичната активност на синтезираните съединения е оценена чрез следните тестове:
1. Тест за определяне процент на спленоцитите, формиращи Е-розетки, проведен съгласно Bach и Dardenne (Cell. Immunol. 3, 1-16, 1972)
2. Тест за определяне броя на клетките, продуциращи кръвни антитела от типа 1дМ, проведен съгласно метода на Jerne , модифициран от Mishell и Dutton (J. Exp. Med. 126, 423-442, 1967) и
3. Хемоаглутинационен тест за определяне броя на антитела тип 19S + 7S и 7S, проведен съгласно методите на Adler за активна хемоаглутинация (J.Immunol. 95,26-38, 3947, 1965) с използването на микротарелки (J.
Immunopharmacol. 4, 43-52, 1982).
Пример 9.
Ротационна изпарителна колба, поставена в затоплена водна баня>се пълни с:
1.33 g (0.01 М) L-аспарагинова киселина
0.84 9 (0.01 М) NaHCO
10.00 9 хидролизиран декстран със средно молекулно тегло 3000 daltons
10.00 9 редестилирана вода
Сместа се загрява под налягане до температура 70° С, докато твърдите вещества се разтворят напълно, като през това време се отстраняват чрез дестилация около 3 ml вода (времето за загряване е приблизително 30 min). Колбата с разтвора се покрива свободно, поставя се в паров стерилизатор и се стерилизира под налягане при температура 121° С в продължение на 40 min. След охлаждане получения жълто-оранжев разтвор се разрежда с 15 ml вода, избистря се чрез центрофугиране и се изсушава чрез въздушен спрей с входяща температура +160° С и изходяща температура +85^0. В резултат се получава светлобежов реакционен продукт, лесно разтворим във вода.
Присъствието на продукти на прегрупирането на Amadori в този реакционен продукт се потвърждава чрез тестване по калиево- ферицианидния метод, описан от Borsook, Abrams and Lowy, J. Biol. Chem 215, (1955), 111-124 и по хроматографски методи.
Биологичните тестове, както се описани в предходните примери, потвърждават имунната активност на горепосочения продукт, подобна на тази, показана от препаратите, получени от прости захари.
Пример 10
Конична колба се пълни с:
5.0 g хидролизиран декстран със средно молекулно тегло прибл. 5000 daltons
1.1 g L-пролин
4.0 ml редестилирана вода
Съдържанието се разтваря чрез разбъркване. Получената по този начин еднородна смес се поставя в паров стерилизатор и се загрява под налягане до температура 110(’с за 40 min. Полученият прозрачен оранжев разтвор се разрежда с 20 ml редестилирана вода, избистря се чрез центрофугиране и се изсушава.
Получават се 5.3 g реакционен продукт, лесно разтворим
във вода. Имунотропната му активност е подобна на тази,
наблюдавана при другите експерименти съгласно предходните
примери.
Пример 11
С конвенционалните методи се тества биологичната
активност на различните съединения при мишки , но не и при
хора. По тази причина се въвеждат нови биотестове, с които се измерват количествата и активността на цитокините, освободени от човешки периферни кръвни левкоцити (PBL), третирани с реакционните продукти, съгласно примери от 1 до 5, 9 и 10. Цитокините са хормоноподобни протеини, които играят важна роля практически във всички имунни реакции, както и в регулаторните процеси, отговорни за поддържането на хомеостазата.
Тестове за цитотоксичност. Цитотоксичността на реакционните продукти е определена в човешка белодробна аденокарциномна клетъчна линия А549 (включително и в Американската типова колекция от култури - ATCC CCL 185) . Клетъчните монослоеве се трипсинизират, суспензии от 2x10 клетки/ml в Dulbecco модифицирана Eagle's minimum essential medium (DMEM) плюс 10% телешки серум (CS) се смесват с различни дози от активната субстанция, посяват се в пластмасови микротарелки и се инкубират за 48 часа при температура 3Ί° С. CD е минималната концентрация на субстанцията, която причинява приблизително 50% разрушаване на клетъчната култура, което се установява чрез оцветяване с 0.015%-ен разтвор неутрално червено в DMEM.
Индукция на цитокини. Кръвни съсиреци от здрави кръводарители се осигуряват от регионалния кръвопреливен център. Еритроцитите се лизират чрез третиране с NH CL съгласно Cantell и flp.(Cantell, К., Hirvonen, S., Kauppinen, H.L. : Production and Partial Purification of Human Immune Interferon. Meth. Enzymol., 119, 54, 1986). Използват се левкоцитите от индивидуален донор, приблизително 8x10 левкоцити/ml, поставени в RPMI 1640 среда , допълнена с 10% ембрионален телешки серум (FCS), L-глутамин и антибиотици. Всички количества FCS се тестват повторно. За културите PBL се използват само немитогенни FCS. Индукторите на цитокини се прибавят към 1 ml обеми от културите. Използваните индуктори на цитокини са фитохемаглутинин (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) и LPS от E. coly 0111 :В4 (Difco Laboratories). Индуктираните PBL култури се инкубират в атмосфера с 5% -но съдържание на CO при температура 37°С за 20 часа и се центрофугират. Филтратът се съхранява при 4°С и се тества за TNF и IFN активност в рамките на една седмица.
Тест за интерферон (IFN). Слетият монослой от клетки А549 се приготвя в микротарелки в DMEM с 10% CS, L-глутамин и антибиотици (100 единици/ml пеницилин и 100 g/ml стрептомицин). Пробите IFN, разредени в тарелки, се добавят към клетъчния монослой, инкубират се при 37° С за 20 часа в атмосфера с 5% CO . След това клетките се измиват и се възбуждат с енцефаломиокардитен вирус (EMCV). Титърът на IFN се определя като разреждане на IFN пробата, което намалява с 50% вирусния цитопатогенен ефект след 48 часа инкубация. За измерване на убитите клетки в скенер ELISA се използва също и метода МТТ (3-[5,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5дифенилтетразолиум бромид)(Hansen М.В., Nielsen, S.E., and Berg K.:Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth/Cell Kill.
J. Immuno. Meth.,1989, 119, 203-210). Лабораторните стандарти за интерферони са включени във всички тестове: рекомбинантен човешки гама-интерферон ( Genetech Inc.,USA, специфична активност 2 х 10 units/mg), естествен човешки левкоцитен алфа-интерферон (3 х 10 IU/ml и гама-интерферон (2 х 10 IU/ml), получени от Dr. К. Cantell, Helsinki, Finland.
Тест за туморонекротизиращ фактор (TNF) Цитотоксичната активност на TNF се измерва в клетки L-929 съгласно Flick и Gifford (Flick, D.A., Gifford, G.Е.:Comparison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor. J. Immunol. Meth., 68, 167, 1984).
Пробите от разтвор на актиномицин D се прибавят към монослойните клетъчни култури. След инкубация при 37° С в продължение на 20 часа, културите се оцветяват с кристален виолет и се определя токсичният ефект. Количеството, причиняващо приблизително 50% деструкция на клетъчните култури,се дефинира като единица TNF активност. Сравнението с препарат от алфа-TNF (Genetech Inc., USA) показва, че 1 единица от нашия тест е равна на 100-200 pg/ml TNF.
Тестове за неутрализация на цитокини: Използваните антисеруми са: заешки античовешки алфа-TNF, партида 2958-40 и заешки античовешки гама-IFN, партида 2891-56 (Genetech Inc., USA), овчи античовешки алфа-, бета- IFN и овчи античовешки гама-IFN (получен от Dr. К. Cantell, Finland). Цитокиновите препарати се третират със серуми, разредени в отношение 1:200 в културна среда и се инкубират за един час при стайна температура. След това остатъчната активност на IFN и TNF се определя^както е описано.
Използват се пет различни партиди (от L до L ) PBL, приготвени от кръвта на здрави кръводарители.Беше установено, че оптималната концентрация на PBL за тестовете е 8x10 клетки на милилитър среда (RPMI 1640 с добавка на 10% телешки ембрионален серум и антибиотици).
Инкубацията на човешки PBL с новите реакционни продукти от I до XI (Таблица 1) резултира в синтез на IFN и TNF. Наблюдаваните реакции са зависими от дозата в обхват от 3 до 100 g/ml от съединенията (Таблица 2) . Използваните съединения в посочената концентрация не са токсични. Във всички биотестове са включени позитивни и негативни контролни тестове. Негативният контрол измерва количеството цитокини (IFN и TNF), спонтанно освободени, без помощта на стимуланти. Позитивният контрол индикира количествата цитокини, продуцирани като реакция спрямо известен индуктор; в този случай е използван фитохемаглутинин (PHA,Pharmacia, Sweden, 10 g per ml).
Трябва да се отбележи, че индукцията на цитокини в човешки PBL култури, получени от различни индивиди , обикновено показва съществени отклонения в резултатите. Това явление би могло да бъде обяснено с генетичната диференциация на човешката популация. Освен това , PBL културите често продуцират IFN и TNF спонтанно.
С други думи^сред здравите донори на PBL обикновено се наблюдават такива със силна реакция, слаба реакция или дори без реакция.
Независимо от представените ограничения, резултатите от биотестовете показват, че PBL ( от L до L ) , третирани с реакционните продукти (от I до XI) , продуцират IFN и/или TNF, които могат да бъдат измерени количествено.
В случая с L , която съдържа левкоцити с висока реактивност, се установи, че реакционният продукт II (съдържащ L-формата на аспарагиновата киселина) е значително по-активен като индуктор на цитокини, отколкото продуктът III ( съдържащ D-формата на аспарагиновата киселина, която е и два пъти по-скъпа). Този резултат е важен, защото главно L-формите на аминокиселините се припознават от клетките като естествени субстрати в биохимичните реакции.
Освен това за изразяване на биологичната активност на реакционните продукти, аминокиселинната част от молекулата е много по-важна от формата на захарта. Вместо прости захари (за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално под 1000 daltons) , биха могли да се използват и полизахариди (като декстран, реактивни продукти X-XI), които реагират по подобен начин.
И обратно, полизахаридите, съдържащи остатъчни аминокиселини биха могли да притежават биологическа активност и тази активност се запазва, когато те се декомпозират на олигозахариди със свързани аминокиселини (данни не са посочени).
Подобни резултати също биха могли да се наблюдават, ако вместо проста аминокиселина се вземе къс пептид и се използва за стимулиране на левкоцитите да продуцират цитокини (данни не са посочени).
Седем различни партиди нефракциониран ТТР, изпитани на повече от 100 PBL култури от различни донори, продуцират от 10 до 1000 единици IFN на милилитър и от 9 до 750 единици TNF на милилитър. Фракцията ЕК -S, приготвена от смес, съответстваща по съдържание на естествен торфен екстракт (Пример 5) , беше изпитана в осем PBL култури от осем различни кръвни донори. Беше установено, че това е найактивният препарат и за IFN и за TNF (данни не са посочени).
Възможно приложение на реакционните продукти е тяхното клинично използване като имуномодулатори. Друго изпитано тяхно действие е регенерирането на тъкани. Наблюдава се също и антиканцерогенно действие, вероятно свързано с присъствието на индуктиран интерферон и туморонекротизиращ фактор. Забелязана е също и антивирусна активност.
Основно използването на горепосочените реакционни продукти е свързано с тяхната орална администрация, но е възможно и приложението им чрез инжектиране. Продуктите са относително стабилни.
Таблица 1. Списък на реакционните продукти
No Субстрат
I (D-10) L-глутаминова киселина, глюкоза, галактоза
II (D-11) L-аспарагинова киселина, глюкоза, галактоза
III (D-13) D-аспарагинова киселина, глюкоза, галактоза
IV (D-12) L-серин глюкоза, галактоза
V ЕК -S (фракции 11 - 13)
VI ЕК -S (фракции 6-7)
VII ЕК -S (фракции 8-10)
VIII ЕК -S (фракции 28 - 34)
IX L-пролин, глюкоза
X L-аспарагинова киселина + декстран (вид 1)
XI L-аспарагинова киселина + декстран (вид 2)
Пример 12
Фармацевтични рецептури, съдържащи като активна съставка реакционните продукти съгласно Примери от 1 до 5, 9 и 10, приготвени с помощта на следните реакционни продукти: А. Таблетки/Гранули:
5.0 g от реакционния продукт, получен съгласно Пример 1 или 10 (активна субстанция)
444.0 g от фармацевтично приемлива лактоза
1.0 g мазилно вещество, например MIVATEX , търговска марка на Eastman Kodak)
Съставките се смесват и гранулират с 30%-н воден етанол по конвенционален начин, след това се сушат при температура 40°С. Гранулите се използват за приготвяне на капсули, всяка съдържаща приблизително 450 mg гранули, т.е. 5 mg активна субстанция. Също така гранулите могат да се използват за оформяне на таблетки, тежащи приблизително 450 mg и съдържащи 5 mg активна субстанция.
Б. По същия конвенционален начин активните субстанции, получени съгласно посочените Примери от 1 до 5, 9 и 10, се включват в други фармацевтични рецептури, като се използват подходящи носители.
Таблица 2.
Биологична активност на реакционните продукти I-ΧΙ в човешки PBL
Доза g/ml L IFN units/ml TNF units/ml
L L L L L L L L L
Контр проба 10 <10 <10 20 <10 80 9 27 27 <9
РНА 10 100 30 30 60 100 250 80 250 250 250
I 100 100 <10 <10 20 - 250 9 9 160 -
30 - - - 30 - - - - 500 -
10 30 <10 <10 30 - 80 9 18 160 -
3 - - - 10 - - - - 160 -
II 100 100 10 <10 10 <10 250 18 18 250 <9
30 - - - 10 <10 - - - 250 <9
10 1000 10 30 10 10 250 50 27 250 <9
3 - - - 10 <10 - - - 160 <9
III 100 <10 <10 10 10 <10 250 9 18 250 <9
30 - - - 30 <10 - - - 250 <9
Таблица 2 - Продължение
Биологична активност на реакционните продукти I-ΧΙ в човешки PBL
Доза g/ml L L IFN units/ml L L L L TNF L units/ml L L L
10 <10 <10 <10 10 <10 80 27 18 250 <9
3 - - - 10 <10 - - - 80 <9
IV 100 <10 10 10 20 <10 80 60 9 160 <9
30 - - - 20 <10 - - - 27 <9
10 <10 30 <10 20 <10 80 50 18 80 <9
3 - - - 20 <10 - - - 80 <9
V 100 30 <10 <10 60 - 80 50 18 250 -
30 - - - 60 - - - - 80 -
10 <10 <10 <10 10 - 80 27 9 80 -
3 - - - 10 - - - - 80 -
VI 100 <10 <10 <10 20 - 80 27 18 80 -
30 - - - 10 - - - - 80 -
10 10 <10 <10 20 - 50 27 18 160 -
3 - - - 10 - - - - 250 -
VII 100 <10 <10 <10 - - 80 27 27 - -
30 - - - - - - - - - -
10 10 <10 <10 - - 80 27 27 - -
3 - - - - - - - - - -
VIII 100 <10 <10 <10 - - 80 160 27 - -
30 - - - - - - - - - -
10 <10 <10 <10 - - 750 80 27 - -
3 - - - - - - - - - -
Таблица 2 - Продължение
Биологична активност на I-ΧΙ в човешки PBL реакционните продукти
Доза g/ml L L IFN units/ml L L L L TNF L units/ml L L L
IX 100 10 <10 <10 10 - 27 27 18 80 -
30 - - - 20 - - - - 80 -
10 100 30 <10 20 - 80 27 18 80 -
3 - - - 10 - - - - 50 -
X 100 100 <10 20 20 - 27 27 18 250 -
30 - - - 30 - - - - 80 -
10 <10 10 <10 30 - 18 50 27 50 -
3 - - - 30 - - - - 250 -
XI 100 <10 10 <10 30 - 18 27 27 50 -
30 - - - 10 - - - - 250 -
10 <10 30 <10 10 - 18 80 80 80 -
3 - - 20 - - - - 750 -
Пример 13
Активните субстанции, получени съгласно предходните Примери от 1 до 5, 9 и 10 ? се използват като подобрителни съставки в козметични препарати , предназначени за всекидневни грижи за косата и тялото, като съдържанието на активните субстанции в тях са в обхват от 0.01 до 10 тегловни процента в зависимост от вида на препарата, метода на приложение и честотата на употреба на съответния препарат.

Claims (21)

1. Използване на най-малко едно съединение на реакцията на Amadori с формула
Rl - NH - R2, (I)
Където:
R1 е радикал, включващ 1-дезокси-2-кетоза, извлечен от захар в D-форма, избрана от групата, включваща глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, 2-дезоксиглюкоза, 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин или от олиго- или полизахарид с молекулно тегло не по-голямо от 5000 далтона, и
R2 включва радикал на аминокиселина в нейната L-форма, подбрана от групата, включваща серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, аланин, аспаргинова киселина, глутаминова киселина, фениланин, треонин, цистеин, цистин, глутамин, аспарагин, метионин, тирозин, хидроксипролин, лизин, триптофан, изолевцин, левцин или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално под 1000 далтона, за производството на фармацевтични препарати за лечение и профилактика на хематологични и/или имунологични заболявания и/или за индуциране на цитокинови формации при хора и животни.
2. Използване на най-малко едно съединение на реакцията на Amadori с формула I където:
R1 е радикал, включващ 1-деокси-2-кетоза, извлечен от захар в D-форма, избрана от групата, включваща глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, 2-дезоксиглюкоза, 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин или от олиго- или полизахарид с молекулно тегло не по-голямо от 5000 далтона, и
R2 включва радикал на аминокиселина в нейната L-форма, подбрана от групата включваща серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, аланин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, фениланин, треонин, цистеин, цистин, глутамин, аспарагин, метионин, тирозин, хидрооксипролин, лизин, триптофан, изолевцин, левцин или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално под 1000 далтона за производството на козметични препарати, подхранване на клетките на бозайниците и/или за регенерация на тъкани.
3. Използване съгласно претенции 1 и 2, където в допълнение присъства най-малко една от посочените субстанции: фармацевтично приемливи носители, козметичноприемливи носители, полезни добавки, мазилно вещество, като споменатата поне една съставка на реакцията на Amadori и споменатите допълнителни субстанции са в теглово съотношение 1:1 до 1:100, за предпочитане 1:8 до 1:20, а най-добре 1:9.
4. Използване съгласно претенция 3, където споменатото мазилно вещество се използва в смес с лактоза, като лактозата и мазилното вещество са в теглово съотношение между 20:1 и 444:1, за предпочитане около 50:1.
5. Използване съгласно всяка от предходните претенции, където споменатото поне едно съединение на реакцията на Amadori присъства в споменатите препарати в теглово процентно съотношение 0.01-10%.
6. Метод за получаване на поне една съставка на реакцията на Amadori с формула R1-NH-R2, където R1 включва 1-деокси-2-кетозен радикал, извлечен от проста захар в нейната D-форма или от олиго- или полизахарид с ниско молекулно тегло, a R2 е получен от аминокиселина в L-форма или пептиден радикал с ниско молекулно тегло, характеризиращ се с това, ченяколко различни аминокиселини или пептидни радикали с ниско молекулно тегло и една проста захар, олиго- или полизахарид, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално по-малко от 1000 далтона, или една аминокиселина или пептиден радикал с ниско молекулно тегло и няколко прости захари, олиго- или полизахарид, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално по-малко от 1000 далтона, или която и да е комбинация от тях, реагират в присъствието на вода като катализатор при повишена температура, около 70-121°С, за да могат получените продукти да взаимодействат по реакцията на Amadori като едновременно или в последствие се отстранява водния солвент, докато- за предпочитане след около 30 до 120 min реагиращата смес приеме светъл оранжево-кафяв цвят и стане биологичноактивна, и се забелязва ферицианидно редуцираща способност в проби, взети от сместа, след което реакцията на Amadori се спира, преди да се осъществи разлагане на компонентите и загуба на биологична активност, и реакционната смес се суши и/или се подлага на пречистване чрез колонна хроматография и се отделят биологичноактивните съставки, редуциращи животинския ферицианид,
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че реакцията протича в присъствието на неорганични индикатори, съдържащи се в натуралния торфен екстракт; в даден случай под налягане и/или в присъствието на слаб алкохол, като предпочитаното моларно съотношение между захарите и/или полизахаридите към аминокиселините и/или пептидите е между 2:1 и 1:1, поспециално 1.5:1.
8. Метод съгласно претенции 6 или 7, характеризиращ се с това, че различните L-аминокиселини се избират от групата, състояща се от серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, аланин, аспартова киселина, лутаминна киселина, фениланин, треонин, цистеин, цистин, глутамин, жалин, аспарагин, метионин, тирозин, хидрооксипролин, лизин, трифтофан, изолевцин, и левцин, и различните захари се избират от групата, състояща се от глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, маноза, 2-дезокси-глюкоза, 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин.
9. Метод съгласно която и да е претенция от 6 до 9, характеризиращ се с това, че малко една аминокиселина съдържа две карбоксилни групи и реакцията протича в присъствието на буферна сол, за предпочитане натриев бикарбонат в моларно съотношение с киселината 1:1.
10. Метод съгласно която и да е претенция от 6 до 9, характеризиращ се с това, че най-реакцията на захарта (ите) и/или захарида (ите) с аминокиселината (ите) и/или пептида(ите) се провежда в концентриран воден разтвор- около 0.67, до 2,75 т/обем твърди частици на 1 т/обем воден разтворител.
11. Метод съгласно всяка от претенции 6 до 10, характеризиращ се с това, че изсушената смес или биологично активната част се комбинира с най-малко една фармацевтично или козметичноприемлива съставка, избрана от групата, състояща се от ускорител, помощно вещество и мазилно вещество.
12. Смес от съставки на реакцията на Amadori с обща формула I, където R1 е радикал, включващ 1-деокси-2-кетоза, извлечен от захар в D-форма, избрана от групата, включваща глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, 2-дезокси-глюкоза, 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин или от олиго- или полизахарид с молекулно тегло не по-голямо от 5000 дал тона, и R2 включва радикал на аминокиселина в нейната L-форма, подбрана от групата, включваща серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, аланин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, фениланин, треонин, цистеин, цистин, глутамин, аспарагин, метионин, тирозин, хидрооксипролин, лизин, триптофан, изолевцин, левцин или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално под 1000 далтона, характеризираща се с това, че сместа от споменатите съставки включва съставки на реакцията на Amadori, имащи различни 1-деокси-2-кетозни радикали и/или различни аминокиселини или пептидни радикали с ниско молекулно тегло, и има способността да стимулира имунната система и да индуцира цитокинни формации при животни и хора, и/или да осигурява хранителни вещества за клетките на бозайниците.
13. Смес от съединения на реакцията на Amadori, съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че съдържа съединения на реакцията на Amadori с различни 1-деокси-2-кетозни радикали и различни аминокиселини и/или пептидни радикали с ниско молекулно тегло, основно в същия състав и/или в същото теглово съотношение, както и в споменатите торфени екстракти, и евентуално следи от неорганични елементи, съдържащи се в споменатите екстракти.
14. Смес от съединения на реакцията на Amadori съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че споменатата смес се съдържа във фармацевтични препарати, подходящи за орално и/или локално, и/или интравенозно приложение.
15. Фармацевтичен препарат за профилактика или лечение на хематологични заболявания, и/или за индуциране на цитокинни формации при животни и хора, характеризиращ се с това, че включва най-малко един фармацевтично приемлив ускорител и/или добавка, и ефективно количество от най-малко една съставка на реакцията на Amadori с обща формула R1-NH-R2, където R1 е радикал, включващ 1-деокси-2-кетоза, извлечен он захар в D-форма, избрана от групата, включваща глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, 2-дезокси-глюкоза. 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин или от олиго- или полизахарид с молекулно тегло не по-голямо от 5000 далтона, и R2 включва радикал на аминокиселина в нейната Lформа подбрана от групата, включваща серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, аланин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, фениланин, треонин, цистеин, цистин, глутамин, аспарагин, метионин, тирозин, хидрооксипролин, лизин, триптофан, изолевцин, левцин или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, по-специално под 1000.
16. Фармацевтичен препарат съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че включва ефективно количество от съставки на реакцията на Amadori, дефинирани в претенции 12 и 13.
17. Козметичен препарат за подхранване клетките на бозайниците и/или за регенерация на тъкани, характеризиращ се с това, че включвя поне един козметичноприемлив фармацевтичноприемлив ускорител и/или добавка, и ефективно количество от най-малко една съставка на реакцията на Amadori с обща формула I, където R1 е радикал, включващ 1-деакси-2-кетоза, извлечен от захар в D-форма, избран от групата, включваща глюкоза, ксилоза, галактоза, рамноза, 2-дезокси-глюкоза, 6-дезокси-глюкоза, глюкозамин, галактозамин или от олиго- или полизахарид с молекулно тегло не по-голямо от 5000 далтона, и R2 включва радикал на аминокиселина в нейната L-форма, подбрана от групата, включваща серин, глицин, пролин, хистидин, аргинин, атанин, аспарагинова киселина, глутаминова киселина, фениланин, треонин, цистеин. цистин, глутамин, аспарагин, метионин, тирозин, хидрооксипролин, лизин, триптофан, изолевцин, левцин или пептиден радикал, за предпочитане с ниско молекулно тегло, поспециално под 1000.
18. Козметичен препарат според претенция 17, характеризиращ се с това, че включва ефективно количество от съставки на реакцията на Amadori, дефинирани в претенции 12 и 13.
19. Препарат съгласно която и да е претенция от 15 до 19, характеризиращ се с това, че споменатия най-малко един ускорител и/или добавка се намира в теглово съотношение 1:1 до 1:100 към споменатите съставки на реакцията на
Amadori.
20. Препарат съгласно която и да е претенция от 15 до 19, характеризиращ се с това, че споменатите добавки включват мазилно вещество в смес с лактоза, където лактозата се намира в теглово съотношение с мазилното вещество между 20:1 и 444:1.
21. Препарат съгласно която и да е претенция от 15 до 19, характеризиращ се с това, че споменатите съставки на реакцията на Amadori се намират в теглова концентрация 0.01-10 %.
BG98956A 1992-02-13 1994-08-05 Съединения и продукти на реакцията на amaдори, метод затяхното производство и използването им BG62172B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL29346492A PL171023B1 (pl) 1992-02-13 1992-02-13 Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin
EP92103614 1992-03-03
PCT/EP1993/000327 WO1993016087A2 (en) 1992-02-13 1993-02-11 Amadori reaction compounds and products, process for their manufacture, and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98956A BG98956A (bg) 1995-07-28
BG62172B1 true BG62172B1 (bg) 1999-04-30

Family

ID=26130822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98956A BG62172B1 (bg) 1992-02-13 1994-08-05 Съединения и продукти на реакцията на amaдори, метод затяхното производство и използването им

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5723504A (bg)
JP (1) JPH07506344A (bg)
AT (1) ATE187734T1 (bg)
AU (1) AU672595B2 (bg)
BG (1) BG62172B1 (bg)
BR (1) BR9305878A (bg)
CA (1) CA2130106A1 (bg)
CZ (1) CZ285200B6 (bg)
DE (2) DE632813T1 (bg)
ES (1) ES2072244T1 (bg)
FI (1) FI943733A0 (bg)
GR (1) GR950300017T1 (bg)
HU (1) HUT70434A (bg)
MX (1) MX9300759A (bg)
NO (1) NO304026B1 (bg)
RO (1) RO115633B1 (bg)
RU (1) RU2141337C1 (bg)
SG (1) SG52390A1 (bg)
SK (1) SK86994A3 (bg)
TW (1) TW302368B (bg)
WO (1) WO1993016087A2 (bg)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629412A (en) * 1994-07-11 1997-05-13 Glinskii; Guennadi V. Synthetic glycoamines that promote or inhibit cell adhesion
FR2746316B1 (fr) * 1996-03-19 1998-06-12 Guerlain Nouvelles compositions cosmetologiques ou dermatologiques
AU3511297A (en) * 1996-06-27 1998-01-14 Picower Institute For Medical Research, The 3-alkylamino-2-hydroxy-4-hydroxymethyl-2-cyclopenten-1-one advanced glycosylation endproducts and methods of use therefor
DE19705233A1 (de) * 1997-02-12 1998-08-13 Froelich Juergen C Verfahren zur Herstellung einer Formulierung enthaltend Arginin
GB0319463D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-17 Givaudan Sa Compounds
TW200925268A (en) * 2007-12-06 2009-06-16 Mallinckrodt Baker Inc Fluoride-containing photoresist stripper or residue removing cleaning compositions containing conjugate oligomeric or polymeric material of alpha-hydroxycarbonyl compound/amine or ammonia reaction
JP2012140360A (ja) * 2010-12-28 2012-07-26 Kracie Home Products Ltd 抗酸化剤、化粧料、飲食品組成物及び医薬品組成物
JP5835894B2 (ja) * 2010-12-29 2015-12-24 クラシエホームプロダクツ株式会社 チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン産生抑制剤及び美白剤、並びにこれらを含有する化粧料、飲食品組成物及び医薬品組成物
JP2012140377A (ja) * 2010-12-29 2012-07-26 Kracie Home Products Ltd チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン産生抑制剤及び美白剤、並びにこれらを含有する化粧料、飲食品組成物及び医薬品組成物
JP2012140378A (ja) * 2010-12-29 2012-07-26 Kracie Home Products Ltd チロシナーゼ活性阻害剤、メラニン産生抑制剤及び美白剤、並びにこれらを含有する化粧料、飲食品組成物及び医薬品組成物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1514910A (en) * 1974-07-02 1978-06-21 Unilever Ltd Amadori compounds and their use to flavour foods
US4629692A (en) * 1982-12-06 1986-12-16 Miles Laboratories, Inc. Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments an index of glycemia
DE3405841A1 (de) * 1984-02-17 1985-08-22 Bayer Ag, 5090 Leverkusen N-acylierte 1-alkylamino-1-desoxy-ketose-derivate, verfahren zur herstellung und ihre verwendung
DE3601472A1 (de) * 1986-01-20 1987-07-23 Fresenius Ag Verwendung von umsetzungsprodukten von reduzierenden zuckern und serotonin oder serotonin-precursoren zur behandlung cerebraler stoerungen
DK163689A (da) * 1988-04-08 1989-10-30 Sandoz Ag Peptidderivater
KR100212946B1 (ko) * 1991-03-16 1999-08-02 크리스토퍼 피아세키 이탄 유도성 생활성 물질과 이를 포함하는 제약학적 성분물 및 화장 성분물

Also Published As

Publication number Publication date
AU672595B2 (en) 1996-10-10
DE69327310D1 (de) 2000-01-20
WO1993016087A2 (en) 1993-08-19
GR950300017T1 (en) 1995-04-30
DE632813T1 (de) 1996-02-15
RU2141337C1 (ru) 1999-11-20
JPH07506344A (ja) 1995-07-13
MX9300759A (es) 1993-11-01
BG98956A (bg) 1995-07-28
HUT70434A (en) 1995-10-30
RO115633B1 (ro) 2000-04-28
CZ285200B6 (cs) 1999-06-16
CZ194594A3 (en) 1994-12-15
NO304026B1 (no) 1998-10-12
FI943733A (fi) 1994-08-12
HU9402347D0 (en) 1994-10-28
FI943733A0 (fi) 1994-08-12
RU94040167A (ru) 1996-07-10
AU3496693A (en) 1993-09-03
NO942930L (no) 1994-08-08
WO1993016087A3 (en) 1993-09-16
TW302368B (bg) 1997-04-11
SG52390A1 (en) 1998-09-28
US5723504A (en) 1998-03-03
CA2130106A1 (en) 1993-08-14
NO942930D0 (no) 1994-08-08
ES2072244T1 (es) 1995-07-16
ATE187734T1 (de) 2000-01-15
SK86994A3 (en) 1995-02-08
BR9305878A (pt) 1997-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ287816B6 (en) Peptide, process of its preparation, pharmaceutical preparation in which it is comprised and use thereof
BG62172B1 (bg) Съединения и продукти на реакцията на amaдори, метод затяхното производство и използването им
US5114926A (en) Tetrapeptide inhibiting the entry into cycle of hemopoietic stem cells processes for its preparation, and its uses
SU638243A3 (ru) Способ очистки гамма- -глутамилтаурина
US4046877A (en) Method of increasing immunologic competence
AU728539B2 (en) Myelopeptides and their therapeutic use
EP0632813B1 (en) Amadori reaction compounds and products, process for their manufacture, and their use
JPS6388200A (ja) 胸腺抽出物、その製造方法及びそれを含む薬剤組成物
PL171319B1 (pl) S posób wytwarzania kompozycji przydatnej do uzytku farmaceutycznegoi/lub kosmetycznego PL PL PL
AU665789B2 (en) Pharmaceutical lysine-containing polypeptide compositions and methods of use thereof
RU2136695C1 (ru) Сывороточный гликопротеин, обладающий биологической активностью в сверхмалых дозах
CA1322715C (en) Use of a tripeptide and composition thereof as an immunostimulating agent
US6458761B2 (en) Synthetic, statistic thymic peptide combination and its use as a preparation with immunological and/or endocrinological effect
US5948442A (en) Stimulating ENTEROGENIN compositions and methods for their isolation and use
CA1056305A (en) Protein having thymus hormone-like activity
CA1337731C (en) Inhibitory tetrapeptide of entry into cycle of hemopoietic stem cells, processes for its preparation and its uses
RU2097432C1 (ru) Гликопротеин tcf-ii и фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество гликопротеина tcf-ii
RU2110275C1 (ru) Способ получения пептида, обладающего анаболической активностью, стимулирующего увеличение массы тела, развитие эпидермального слоя и роста волосяного покрова
PL171023B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin
RU2121480C1 (ru) Пептид, обладающий влиянием на регенерацию кроветворной и иммунной систем, и фармацевтическая композиция на его основе
JPH07506564A (ja) 医薬的ペンタペプチド組成物およびその使用法
JPH07138287A (ja) 新規なペプチドおよび免疫賦活剤
JPS5858340B2 (ja) N↓−ε↓−トリメチル↓−L↓−リジン塩
JPH02215730A (ja) 細胞増殖抑制剤
JPH0320300A (ja) 悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有する新規蛋白質