TW302368B

TW302368B -

Info

Publication number: TW302368B
Application number: TW082102133A
Authority: TW
Original assignee: Torf Ets
Priority date: 1992-02-13
Filing date: 1993-03-23
Publication date: 1997-04-11
Also published as: HUT70434A; ES2072244T1; DE69327310D1; FI943733A0; NO942930D0; RU2141337C1; SK86994A3; GR950300017T1; WO1993016087A2; NO304026B1; RU94040167A; ATE187734T1; CA2130106A1; MX9300759A; US5723504A; DE632813T1; HU9402347D0; AU672595B2; FI943733A; RO115633B1

Description

A6 B6 S02368 五、發明説明（1 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明涉及新的阿馬多瑞反應化合物和産物，其生産方法以及這些化合物和産物的新用途。所説化合物和産 —κ 物至少有部分經過如以下反應系統的阿馬多瑞氏重排和 /或美拉德反應： Η OH Η NH-R H 1/ 1/ 1 C -1 I c- I H - C - NH.R I 1 Η - C - OH 1 H - C _ OH C = 0 1 1 阿馬多瑞氏 i ΙΟ - C - Η + Η-,Ν-R ——> HO - C - H 一-> HO-C-H 1 重排 1 Η - C - OH H - C - OH Η - C - OH ο 1 ο 1 Η - C -1 1 H - C -1 I Η - C - OH I 1 ch2oh ch2oh 1 ch2oh 阿馬多瑞反應産物是已知的，它們是反應産物，例如，氨基酸或呔與糖、寡糖或多糖經過阿馬多瑞氏重排的産 ( J . Biol. Soc、2 1 5 ( 1 9 5 5-)~~Henri Borsook等人）〇所以，在DE-C-3914354中描述了從燕麥種子提取的氨基酸和糖的水溶性糖蛋白。還有，EP-A-406087描逑了衍生自革蘭氏陽性細®的細胞壁的水溶性多糖-糖呔復合物，而旦J . B 〇 i 1 . C h e m . 1 9 8 5 , 2 6 0 / 9指出由蛋白質的游離氨基與糖反應生成的阿馬多瑞反應産物已用NMR -光譜學作了說明。經濟部中央標準局员工消費合作社印*'1取本發明現在描述如同申請專利範圍第1項描述的具體的新的阿馬多瑞氏重排的化合物。優選和改進的方案是 -3 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐> 82.1. 20,000 A6 B6 五、發明説明（2 ) 在申諳專利範圍第2至4項中描述。在生物活性物質試驗反應中上述化合物還原鐵氰化鉀《所説活性物質是由糖和氨基酸反應生成的》本發明邏涉及如申請專利範圍第11至17項描述的上述化合物的新用途，同時，是一般的糖和氨基酸的阿馬多瑞反應産物的新用途。過去沒有人就生物活性試驗過阿馬多瑞産物提取物提純的各種步驟（為了除去惰性物質 ballast substances和雜質）。來源於天然的免疫剌激藥物，如槲寄生屬（mistletoe) 提取物，泥炭提取物等，已確知其缺點在於處理大量材料需昂貴的費用.，且只獲得幾克的活性物質；不能控制雜質，因而可能導致毒性和副作用，由於複雜性質和幾乎不^能重現的組分，當實際使用時還存在給藥問題。來源於人造的同性質的産物_或産物混合物，如干擾素或其他遣傳工程方法則費用更昂。而且，對於滲入人的細胞壁來說，人的干擾素的分子量通常都太大，因此，所施蕖劑只有小部能有效地起作用。而遣傳工程的産物通常也有副作用，有些甚至有毒性。而且，它們之中有些只在一天能有效地起作用，而第二天則不起作用，其原因至今未明。經濟部中央標準局S工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁) 裝- 現在，意想不到地發現幾乎任何經過至少部分阿馬多瑞氏重排的簡單氨基酸/糖復合物沒有顯示以上所説的缺點，相反，有意想不到的免疫活性。因此，它們可用 —j — · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 經濟部中央標準局W：工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（3 ) 於藥物的配方和美容剤。這些低分子容易滲入細胞壁，實際上起了營養物的作用。它們誘導€括腫瘤壊死因子的天然干擾素和其他細胞素（cytokines)的形成。即使給藥後三天，它們仍然顯示生物活性的刺激效果。該效果随著阿馬多瑞氏重排的愎合物的增加而增大，再随著復合物的分解的增大而減小。單糖也可用多糖代替，最好是低分子量的，尤其是分子量小於1000道爾頓的多糖代替，例如《聚糖，其反i 相似。多糖顯示生物活性，且它們變成寡糖後可保留一些生物活性。在此之前，人們對這些化合物的生物活性了解甚少。今發現這些物質的混合物與人的白細胞接觸産生干擾素和其他的細胞素。這叫做多細胞激活性（poly clonal activation)〇在這些化合物影饗下，試驗産生的物質和檢驗生物活性是可能的。所説生.物活性是以與特殊的細胞素有關的國際單位表示的。這些化合物在純物質濃度在 /ml的範圍内有待別高的生物活性。在分子里，氨基酸的特性比分子里糖部分的性質更重要。在經過阿馬多瑞氏重排的L -天門冬氨酸與葡萄糖或半乳糖的反應産物，當與人的白細胞接觸，並在37 °C, $ 5 % C 0 2的氣氛下，在組鏃培養介質中培育2 M、時將可産生30-1(300抗病毒單位的干擾素。該干擾素是以用人 -5 - · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事嗔再塡寫本頁)

J 丨裝· 五、發明説明（4 A7 B7

的癌细胞的生物檢定測量的β在這些化合物的影蜜下，匯瘤鹿死的化合物也可産生。具有上述意想不到的用途的産物的通式為： Ri - ΝΗ - R2 Ri 代表衍生自單糖、寡糖和多糖的1-去氧-2-酮糖殘基，所說多糖最好是低分子量的，尤其是分子量小於1000道爾頓的經濟部中央標準局員工消費合作社印製 R 2 代表氨子量的因此，生重排的化合一種的單糖代的衍生物生物的其他生物活性。小於1 0 0 0道在上式中其是（但不糖、木糖、 «萄糖、葡酸的或所説氨基酸為絲丙氨酸、天基酸殘基或妝殘基，所敦呔基，最好是低分，尤其是分子量小於1 0 G 0道爾頓的。物活性化合物包括上述的持殊的阿馬多瑞氏物或鳥同氨基酸化合物的N -取代的衍生物和、寡糖或多糖，或一種氨基酸化合物的N-取和多種的單糖、募糖和/或多糖，或這些衍任何组合，它們中的每一痼组合都有足夠的所説多糖最好是低分子置的，尤其是分子量爾頓的。. ，優選的^ 可以是選自D -型單糖殘基，尤是唯一）選自以下化合物的殘基：D-型葡萄半乳糖、鼠李耱、果糖、甘露糖、6 -去氣-糖胺和半乳搪胺；R 2 可以是薛自L-型氛基氛基酸的任何组合的其他的呔的殘基，所説氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、半胱 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IOX 297公釐）五、發明説明（5 ) A7 B7 補充 2. al 月丨、氨酸、胱氛酸、.谷氨匿胺、天冬匿胺、蛋氛酸、酪氨酸、羥脯氨酸、色氨‘、纈氨酸、異亮ί酸、賴氨酸和亮氨酸。本發明還涉及如申請專利範圍第5項所描述的上述的化合物和産物的生産方法，借此産生下式的一種中間體 ,該式為 N H-R' 其中R’是直碳鏈的1-去氧-2-酮糖殘基或單糖或寡糖或多糖的任 —種〇-橋型。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製代表氨基酸殘基或肽殘基，所説中間體是至少有部分绖過阿馬多瑞氏重排和/或绖過美拉德反應。該反箧是連缰加熱反應混合物，最好在壓力下，且同時或隨後除去溶劑。該方法的優選方案是在申請專利範圍第6至 10項中描述。在某些情況下，尤其是當使用含有兩β羧基的氨基酸時，在該方法中加入缓衝鹽是有利的，所說缓衝鹽如碩酸氫鈉，其莫耳比最好為1: 1。己發現阿馬多瑞産物較易分解，且分解産物有暗褐色和焦油般的性質，但组成未明的化合物己失去它們的生物活性β所以，最好在反應混合物變為淡橙棕色時就停止阿馬多瑞氏重排反應。值得注意的是，當原不透明的氨基酸溶液變為清澈時 (阿馬多瑞氏重排之前）生成的中間體反應物易水解， -1Τ 身！本紙張尺度逋用中國國家標牟（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 302368 專利申請案第821〇2133號 ROC Patent Appln. No.82102133 中文説明臂修正頁-附件(―）

Amended Pages of thi7Chinese ______ 五、發明説明（谷 XAmenSI 1994) ---- 你印”1 .即該反應是可逆的。隨著重排的1 gj 産物變為更穩定，且顔色逐漸由淡黃运'變為淡接色，最後，當阿馬多瑞氏重排象是完成時則爱為橙掠色。由重排反匾中取出並試驗（按下文所述的各種方法）的樣品證簧隨著阿馬多瑞氏重排處理，生物活性增大，而進一步加熱導致分解時，生物活性減小。所説分解，其徴兆是顔色變為暗褐色》如果反應混合物含有別的酮基1和7 或含硫的氨基酸，如半胱氨酸時，鐵氰化物迅速還原，且會發生顔色變化；否則，它在3至5分鐘内就會發生 t Ί ，這是對阿馬多瑞氏重排發展程度的一種很好檢査方法。.未反應的糖只在半個小時或幾痼小時後將顯示顔色變化。分離纯阿馬多瑞氏重排産物是按己知方法進行的.該方法是基於將混合物裝於強陽離子交換劑（如乂181^1'1“600或0〇^^\(：«)，以水連缜地洗滌，在減壓下蒸發洗出'掖的已選擇.的確定部分，將純化合物置於無水甲醇中结晶（J · Ε · H 0 d g e a n d Β · Ε · F i s h e Γ， M e t h 0 d s in Carbohydrate Chemistry, Vol. II, Reactions of Carbohydrates, Academic Press, N.Y . London , 1963 ,

Page 105 - 106;或如前所引之Borsook>at al·;或J.

Dubourg and P. Devi I I iers) ° 按照本發明的方法，所有上述的衍生自單糖和氣基^ 化合物的優選的殘基保持不變。此外，慶選的糖作用物 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（210X297公釐） ^ -裝------訂-----Μ線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 83. 3.10,000 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) 的混合物包括D-型的葡萄耱、木糖、半乳糖、E李糖和果糖，它們的重量比為2 0 : 1 0 : 4 : 1 : .1 ，而優選的氨基酸作用物包括L-型的絲氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸，它們的重量tb為2 0.6: 3 5.8 : 1 3 2 : 180 :360: 216: 160: 72: 68: 780〇如己述，阿馬多瑞氏重排産物能還原鐵氰化鉀，1這_ 化學試驗反應提供了快速檢定由糖和氛基酸反應生成的组合物的生物活性的依據。已發現，在含水溶劑，最好是加低级醇的含水溶劑存在下，於高溫（和任意壓力下）將按存在於天然泥炭提取物的同樣成分和同樣重量比的單糖混合物與按存在於天然泥炭提取物的同樣成分和同樣重量比的氨基酸化合物的混合物及存在於該天然提取物的任意微量元素反應，隨後延長加熱以使生成的産物進行阿馬多瑞氏重排，同時'•或隨後除去溶劑，當反應混合物變為淡橙棕色時停止重排反應，乾燥生成的産物，並以柱色譜純化該産物，收集引致戡氡化鉀最大量還原的部分。在一痼方案中，本發明藥物配方含有活性成分和藥學上可接受的載體和/或佐藥和/或任意的潤滑劑，活性成分與其餘成分的重量比在1 : 1和1 : 1 Q Q之間，較好是 1: 8至1: 2Q,最好是1: 9。所説活性成分是式Ri _R2'的至少的一種反應産物，或者是式R1-MH-R2的 i ' * - 9 - * ^ .裝訂 f 冰 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3. 10,000 A6 _-_B6_ 五、發明説明（8 ) 一種具體化合物。另一镝有效的藥物配方中，除含有活性成分，還含有乳糖和潤滑劑，乳糖與潤滑劑的重量比在20: 1和100: 1之間，最好是5 0 : 1。這些藥物製劑是用於治療和/或預防血液學的和/或免疫學的疾病和/或通過誘導細胞素的形成以剌瀲人的和/或哺乳動物的免疫条统。活性成分的另一種用途是在美容製劑方面。活性成分存在於該裂劑中的含量為ο.(π-ΐ(α (重量），最好含量為0.01-1% (重量），尤其是0.05-0. 1%的含量。這些美容裂劑，除含有活性成分，還含有一般載體、佐藥、營養成分和/或芳香料。以下實施例將進一步說明和證實本發明，但這些實施例並不限制本發明任何方面的i圍。啻旃例1 放入加熱水浴旋轉'蒸發器中的25Π11燒瓶中裝人1.47g (0.01M) L-谷氨酸、0.84g(0.01M) NaHC03 、 0.91g D- 葡耱、0 . 9 1 g半乳糖扣3 . 0 0 m 1再蒸餾水。經濟部中央標準局β工消費合作社印製混合物加熱到8 0°C ,從而最好在減壓下蒸發掉5 0 %水，然後在大氣壓下加熱到80-82 °C,在此混度保溫120分鐘，直至混合物變成橙色。之後，將漿狀濃縮水溶液減壓蒸乾。由此得到的橙紅色固體反應産物榡為符號D-10 並貯存起來備用於生物試驗。 -10-· 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公釐〉 302368 A6 B6 經濟部中央標準局B工消費合作社印製五、發明説明（9 ) 奮旅例2 放入加熱水浴旋轉蒸發器中的25ml贤瓶中裝人1.33g (0.01M) L-天冬氨酸、0.84g(0.01M) NaHC03、0.91g D-葡糖、0.91g半乳糖和3.0Qb1再蒸皤水。將混合物攪拌著（利用旋轉法）加熱到80 °C，減壓濃縮，從而蒸發總體積為1.5ml的水，然後在80-85 °C大氣壓下處理，直至混合物變成淺橙色，歴時約60分鐘。反應混合物為漿狀濃縮水溶液，然後將其減壓乾燥。所得反應産物為乾燥的橙黃色粉末，標為符號D-11並貯存起來備用於生物試驗。奮掄例3 放入熱水浴旋轉蒸發器中的25b1燒瓶中裝入1.05g (0.01M)L -絲氨酸、0.91g D-葡糖、0.91g半乳糖和2.50 B 1再蒸播水。將混合物攪拌著（利用旋轉法）加熱到85-92 °Ce 10 b 分鐘之後，溶液變成橙色。減壓，並將混合物蒸乾。燒瓶壁上的反應産物形成了橙色透明層。刮掉反應産物並研成末，標為符號D-12並貯存起來備用於生物試驗。啻旆例4· 放入熱水浴旋轉蒸發器中的25ml燒瓶中裝入0.66g ( 0.0 0 5 M) D-天冬氨酸、0.42g( 0.0 0 5 M) MaHC03、0.45g ϋ-¾糖、0.4 5g半乳糖和3.0 Oral再蒸餾水。將混合物加熱到8 (TC ,減壓蒸發，從而揮發掉绾體積 -11-· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公坌） 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木頁) -装. 訂經濟部中央標準局β工消費合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明（10) 為1.5b1的水，然後於85°C大氣壓下處理。60分鐘加熱後混合物變成橙色，減壓，並將所得漿狀濃缩水溶液蒸乾。在殘餘物完全乾燥之前，往燒瓶中加入兩次l〇Bl無水乙醇並蒸發以消除殘餘水分。由此得到的乾燥的反應産物研成粉末，標為符號D-13並貯存起來備用於生物試驗《 . 窖掄例5 為了以合成方式得到某種天然泥炭提取物的生物活性部分的同等物，往放入加熱水浴旋轉蒸發器的燒瓶中裝入 20.5mg L -絲氨酸、35.8ng L.-甘氨酸、35.8mg L -組氣酸、1 3 2 . 0 m g L -精氨酸、1 8 0 · 0 m g L -丙氨酸、3 6 0 m g L -脯氨酸、2 1 6 · 0 b g L -酪氨酸、1 6 0纈氨酸、6 8 . 0異亮氧酸、72.0ag L -亮氨酸、780.0mg L -賴氨酸、2000.0 mg D-# 萄糖、lOOO.Omg D -本_藶、400.[)mg D-半乳糖、 lOO.Omg D -鼠李糖、lOQ.Omg D -果糖和6.0ml再蒸皤水。利用旋轉法攪拌混合物，並加壓加熱45分鐘以使溫度由7 5 °C提高到8 6 在此期間，蒸發掉約3 m 1水，並將基質完全溶解。然後，於85-86 °C大氣壓下處理混合物以進行阿馬多瑞氏重排。在此期間，溶液迅速變成紅棕色。減壓，並持绩84 °C加熱，從而同時蒸發掉溶劑。蒸發结束後加入兩次15nil無水乙醇並使反應混合物乾燥。將裝有乾燥過的反應産物的燒瓶置於氣化鈣乾燥器中乾燥1 8小時，然後將反應産物研成粉末，得到约4 . 5 g粉末 -12-· (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 丨裝· 訂 7 本紙張尺度速用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公爱> 82.1. 20,000 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（U ) 狀産物，標為符號ΕΚ 2-S。將一份4g的該反應産物溶於20b1蒸餾水並置於尺寸為 25nm X 330bjb的色辑柱上，柱中裝有吸箸劑Anberlite050 X AD-2 (分析级）。柱子用0.4ml /分蒸餾水洗脱。收集每次10ml體積级分到總體積為450b1 。用色譜法監測諸级分含量，合併連串柱11-13的级分並減壓蒸發。這些级分的待徽在於為高含量的阿馬多瑞氏重排反應産物（用氰鐵酸鉀還原試驗得到證實）。産物以符號EK-S-11 貯存起來備用於生物試驗。用8-10周齡雄性雌性兩種免疫的Balb/c小鼠進行測定生物活性的生物試驗。小鼠的免疫是通過腹膜注射0.2 ml 10%羊的红細胞（8兄8〇懸浮液，即6><108値細胞而進行的。這些紅细胞固定在具有以下組成的無菌Alsever (阿爾塞弗氏）溶液中：一 . 葡糖 2 . 0 5g 檸檬酸鈉〇 . 8g 氣化鈉〇 · 42g 檸檬酸 0 . Q 5 5 g 再蒸餾水 100ml 往這種A 1 s e v e r溶液中以1 : 1的比率加入羊血細胞無菌樣品，並將混合物在+ 4 °C保持至少3天。然後，將由此穩定的红細胞無菌製樣並加到磷酸鹽缓衝溶液（PBS) 中以便將它們清洗出。紅細胞用PBS清洗兩遍，並以 -13-· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 (犄先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) ;裝- 訂經濟部中央標準局8工消費合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明（12 ) 2000rpn離心分離10分鐘。洗出的細胞以於PBS中的10% 懸浮液形式使用。造種懸浮液用於Bali/ c小鼠的免疫。待試驗的反應産物以所選剤量腹膜内（i.P)給藥或口服（P.0)四次。第一次給藥在小鼠用BRBC免疫之前2小時，而剩下三次劑量在免疫之後以2 4小時間隔給藥。各試驗的動物组用不同剤量的被測反應産物處理：10 π g / k g , 1 a g / k g , 0 · 1 n g / k g 和 0 . 0 1 π g / k g。對照的動物组也用SRBC免疫，但不用被測物質。0.2ml PBS以同樣時間間隔給藥。各動物組一對照組和試驗組在所有試驗均由8-12個小鼠構成。在免疫之後第四天或（測定7S型抗體而言）第十天，將小鼠用乙醚麻醉並通過眼球摘除而放血。把血液收集到試管中。接著，將脊髓破fjfe取出脾臓。用該血液獲得_定19S + 7S和7S型血凝抗體所需的血清，而脾_用於製備能形成E -花结的細胞百分率和溶血活性測定用的細胞。對於這種用途而言，將鼠脾臟粉碎。將所得脾细胞懸浮於4°C約2ml Hanks介質中，以1.077密度的FicoU-Uropolin梯度成層，然後，於+4°C以3000 rpm離心分離 15分鐘。從内柑分離後，將淋巴细胞血沉棕黃色層置於 Hanks介質中（ + 4°C)並以180〇rpm離心清洗兩次，每次7 -10分鐘。然後將脾細胞以能使其含有lx 10s個細胞的比率懸浮於lffll Hanks介質中。 -1 4 - * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐〉 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再瑣寫本頁) -裝· .π. A6 B6 ^02368 五、發明説明（13) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 對於每次試驗，通過將一滴試驗用脾细胞懸浮液與一滴當場製備的含4份D.2X錐蟲藍溶液嵇1份4.253ί HaCl 溶液混合物測定死细胞的百分率。在顯橄鏡下，對每 100値細胞测定死脾細胞的百分率。死細胞是海軍藍，而明亮的細胞是活細胞。存在不高於10%的死細胞百分率是臨界值；這種樣品必須從另外用途中消除。

測定細胞所進行的所有步驟應該在一锢放置在冰浴中的無菌的硅化實驗室用玻璃設備中進行。 g旃例B .裝. 第一步，測定試驗的反應産物對産生溶血的抗體（P F C -IgM)數量的影響。試驗如下：把0.5ml 0.5%瓊脂糖溶液放入試管中並保存在45 °C熱水浴中，摻入0.1ml 10% SRBC懸浮液（製法如上）。之後，加入密度為lXl〇e 個細胞/ ml的O.lffll脾細胞懸浮液，迅速攪拌混合物， Μ立即倒在以前披有瓊脂糖的載片上。將載片於37 °C保溫2小時。接著再甩2小時，將試樣包覆以1 : 2 Q的比率稀釋的豚鼠補體。試樣與該補體一起保溫之後，計數空班形成細胞（PFC)的數量並重新計算為IX 106脾細胞。各試驗進行兩次。經濟部中央標準局8工消費合作社印製在D-11物質以O.lmg/kg的劑量給藥之後，觀察以産生溶血素IgM(PFC)的脾細胞數增加表逹的應答對SRBC的最強放大率。該放大率為119%。當日劑量提高1Q倍逹到1 |^/1^時，應答的放大率降到53%。 -15-· 本紙張度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（丨4 ) 反應産物D-12表明最強的活性一在lmg/kg的劑S增加 I · . · I 58% 〇 I ' 該試驗的反應産物EK2-S-11在0.1 mg/kg劑量表現了：最強的活性（增加65%)。劑量高10倍，即lmg/kg,增 - 加率稍有下降，即52 %。以lmg/kg劑量試驗的反應産物D-13造成增加率為40% 。當劑量提高到1 0 hi g / k g , ΚΓ增1 0倍，應答僅為1 4 &增— 丨加率。 ! ! g旃例7 , 1 3 ，也進行血凝試驗以測定抗-S R B C型1 9 S + 7 S和7S抗體之水：平。為了測定19S-IgH型抗體水平，在用SRBC免疫後第四天製備鼠血清；而對測定7 S - I g G型抗皚水平，這種製i 備是在小鼠用SRBC免疫之後第10天進行的，該天數涉及 ί -I 用SRBC免疫小鼠中所給類型想_遷的最大計數的天數β | Α.測定19S + 7S抗體劑數 \ 將血樣''以35Q.0 rpm離心分離30分鐘。從由此裂得的各 I I 樣品收集血清並置於56 °C熱水浴中30分鐘以使補體減活 | β接箸，採用澉量滴定劑和各具有容積為2 5 0 a 1的ϋ -型 : ；徹孔板來裂備每種血清幾種不同稀釋度的多種溶液（由 1 : 1 - 1 : 4 0 9 6 ) ^稀釋的血清液於室溫保溫1小時。每種血清中加入1滴1¾ SRBC的PBS憨浮液（製法如上）； 1 混合物於3 7 °C.再保溫2小時，然後貯存在+ 4 第二天 I ' !取结果。仍造成血凝作用的最大稀釋度被議為是抗體劑ί · i !, -1 6 -. ---------j -裝------訂-----{線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐〉 83.3. 10,000 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五 '發明説明（15) 數。孔板底部的環形物是血凝發生的微兆。孔板底部的扭扣狀物形成被議為是負结果，即無£凝發生。為了統計分析結果，使試驗物中血清的稀釋度增量與對照組的進行比較》劑量為lig/kg的反應産物D-11使IgM計數提高了 2.57 倍。在剤量10倍提高的情況下，與對照组柑比，剌激作用提高了 3 . 5倍〇本試驗中，反應産物D-12表現出較弱的活性。在0.1 ag/kg劑量，它使IgM計數提高2倍；而在lmg/kg劑量，提高1 . 4倍。反應産物EK2 -S-11在本試驗中表現出最強的活性。在0.1mg/kg劑量，它使IgM計數提髙4.3倍，而在1|!^/]1£_ 劑量，提高3 . 6倍。劑量為lfflg/kg的反應産物D-13使IgM計數提高3倍， ίϊό高於10倍劑量，提高1.5倍。 Β .測定7 S抗體計數. 將試驗的減活血液以1 : 1的比率為0 . 1 Μ的2 -疏基乙醇液合併，並將混合於37 °C保溫30分鐘。2 -疏基乙醇破壞了 19S-(IgM)型免疫球蛋白，而7S-(IgG)型免疫球蛋白對2-疏基乙醇的作用不敏感。保溫3 0分鐘之後，用1 5分鐘的時間將溫度冷卻到+ 4 °C 來中止反應。接箸，按上述測定I 9 S -抗體劑數的類似方式製備若干種稀釋液並與1% SRBC懸浮液合併；於37 Ό -1 7 - * 表紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货〉 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝· .11 A6 _B6_ 五、發明説明（16) 2小時保溫之後，將樣品貯存在+ 4 °C。按照上述測定血凝作用計數的標準第二天評估結果。類'似地，以1 : 1的比率混合1¾ SRBC懸浮液與PBS來進行對照試驗。當按上述方法試驗物質D-11時，在lmg/kg劑量，該物質使抗體IgG的産率提高3.16倍。在10mg/kg劑，量高 2 · 2倍。分別以〇·1 ng/kg和1 ng/kg劑量試驗的反應産物D-12 剌撖抗體IgG的産率提高1.3倍，10 mg/kg劑量提高1.5 倍。 0.1 11^/1^劑量的反應産物EK-S-11剌瀲IgG産率提高 1.9倍，而1以/1^劑量提高2.89倍（與對照相比）。對於各批量生産或按照本發明合成並給出上述免疫應答的生物活性反應産物的各組分獲得的試驗A和B的結果按照 T -學生試驗法（T-student method; or=0.05)統 #分析。各試驗劑量獲得的結果與平行對照試驗進行比較，並顯示出生物活.性的增加率。啻旃例8 按照實施例1 - 5獲得的生物活性反應産物組也進行如此試驗，其中測定形成E -花結的脾细胞的百分率。經濟部中央標準局β工消費合作社印製往55〇α1 Hanks介質中加人250//1的1¾ SRBC懸浮液-和待試驗的濃度為IX 10s個細胞/ ml的2 50# 1細胞。在37 °C,將每種這樣的樣品在配有振盪器的熱水浴中保溫1 5分鐘。然後，將其在+ 4 °C再貯存2 0小時。在懸浮液 "1 8 ~ * 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） C：368 A7 B7 五、發明説明（丨7 ) 經濟部中央揉準局員工消費合作社印製用卜3滴晶體紫著色之後測定用S R B C形成E -花结的脾細胞的百分率。將各樣品測定3次脾细胞的百分率（在每種情況下以 4 0 0烜脾細胞計）。為了進行统計學評估，在待測物質和對照組之間進行具有E-花结的脾细胞數量的百分增量的比較。在本試驗中，顯示出最強的剌激作用的是劑量為Tnfg /kg的反應産物D-1U63%)和EK2 -S-ll(7(U)e在低10倍劑量（即0 · 1 m g / k g ),該值分別降到4 5 %和5 7 %。 j 與對照组相比，1 rag/kg劑量的反應産物D-12使形成 E -花结的能力提高了 2 2 %。低1 0倍的劑量_ (即〇 . 1 n g / k g )的各值為2 9 %。反應産物D-13在1 rag/kg劑量顯示出最大作用（58%), 而在更高劑量，作用稍稍下降。按照以下試驗評估合成的化合物的生物活性： 1 .按照 B a'c h 和 D.arde.nne的方法（〇611.,1111111]11〇1.3，1-1 6，1 9 7 2 )進行形成E -花结的脾细胞百分率_定試驗 » 2. 按照由 Hishell 和 Dutton改進的 Jerne法（J. Exp. Hed 1 2 6 , 4 2 3 - 4 4 2 , 1 9 6 7 )進行産生丨gM型溶血性抗體的細胞數潮定試驗，以及 3. 按照 Adler 活性血令法（J. Immunol. 95, 2 _6- 38, 39 -4 7 , 1 9 6 5 ),用徹孔板進行血凝1 9 S + 7 S和7 S抗體劑數 -19-· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3. 10,000 ---------1.-裝------訂------J 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 1.33g(0.01H) 0 . 84g (0.01M) 1 0 . 0 0 g 五、發明説明（18 ) 潮定法（J. IniHUnopharmacol· 4， 43-52， 1982) 實施例9 、置於熱水浴中的旋轉蒸發器燒瓶中裝入： L-天冬氨酸 N aHCO a 平均分子量為3000道爾頓的水解的《聚糖 l〇.〇〇ml 再蒸餾水。將混合物於70 °C加壓加熱，直至固體物完全被溶解並在此期間用蒸餾的方法排出約3 nl水為止（加熱時間約為30分鐘）。裝有該溶液的燒瓶鬆鬆蓋住，置於蒸器滅菌器中並於121 °C加壓加熱4Q分鐘。冷卻之後、所得橙黃色溶液用1 5 in 1水稀釋，利用離心法淨化並用入口温度 + 1 6 (TC。出口溫度+ 8 5 °C的空噴霧乾燥。得到易溶於水的10.5 g淺米色反應産物。這種反應産物中存在阿馬多瑞氏重排産物得到了 Borsook, Abrams和 Lr>_wy介绍的鐵氰酸鉀法[J. biol， (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. •ΤΓ. 實證法譜色和免的物産述上了實證法驗試 12物 1-生 11的，绍 5)介 95中 (1例，施 15實 2面 m 笱 θ ^Rn 經濟部中央標準局κκ工消費合作社印製似類的出示顯所劑製的到得糖單簡用與性例活胳疫奮為約 : 量入子裝分中均瓶平燒形og. 錐5 糖聚 ¾ 的解水的頓爾道本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 經濟部中央標準局3工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（19) 1 · lg L-脯氛酸 4 . 0 b 1再蒸餾水。 ~ 利用攪拌的方法溶解内容物。將由此得到的均勻混合物置於蒸汽滅菌器中並於110 °C加壓加熱40分鐘。所得透明的橙色液用20ml再蒸餾水稀釋並用離心法淨化。將清亮液噴霧乾燥。得到易溶於水的5.3g反應産物。免疫活性與按照前述實施例的其它試驗中所觀察到的類似。奮旃例1 1 用傳統方法測試化合物在小鼠而不是在人中的生物活性。為此，引入了新的生物檢定法。該方法測定了用按照實施例1-5, 9和10的反應物處理的人體末梢血液白細胞（PBL)中釋放出的細胞素的量和活性。這種細胞素是激素狀蛋白質，在實際上所免疫反應以及決定箸體内平衡的調節過程中起著重要作用。舖朐羞袢檢宙在人肺腺癌細胞糸A549中（包括ATCC CCL 185在内）測定反應産物的細胞毒性。細胞單層胰蛋白酶化，於 dulbecco改進的Engle最小基本介質（DMEM)加1%牛血清 (CS)中的2X 10 s個細胞/ ml的懸浮液與不同劑量的藥物混合，在塑料微孔板中接種，並於3 7°C保溫4 8小時。 C D %是按照用中性红於1) Μ E Μ的0 . 0 1 5 X溶液箸色而測定的、造成約50 %細胞培養破鹿的化合物的最低濃度。 -2 1 - * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公坌） 82.1. 2 0,000 {請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. 訂. A6 B6 ο 2 明里説^ 發ί五氣照按 0 層黃棕沉《血的者血供康健得獲心中血输方地從的人等

法 311 理處 11 C

K Γ δ 胞細红化溶 X S 8 C —r F 約ί 有清含血 Π 牛每胎 (% 胞10 细了白充的補得於獲置體者供後艏，一 }和 h.由胞胺 et僅細醛 Μ用白氨 on使锢谷 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 的素菌抗的量批各試測先預 0 中基養培裂絲非的用養培 L B P 用使只中C 基Ina 養ar 培ph 的)( 積HA 容(P IB1素 1 集自到凝得加物和體植} 導是en 誘體ed 素導SW 胞誘，細素1S 將胞ca 〇細Π1 CS的he 7. C 用 Ϊ 6 照 η 對F1 -裝-

.—_ ο C E

的 4 B 誘將有含在物養培 L G P 的導

溫保 p 7 3 · 於下氛氣氣空的I 在存貯液清上 0 親分心離行進並時小内周 11- 在並 °c 和 P T 0 定褥檢平性活 Ϊ巾 0%板 10孔 ί0 素的菌中抗ΕΗ ΠΗ Μ 年 D 胺的 0 ) 氨素谷番一 -twt·- L 鍵 li 'ff s / C σϋ % ο ο ο 1Χ IX 有和含素於霉處青在nl / 經濟部中央標準局S工消費合作社印製的釋稀板孔將 0 層 ο # C 0马 *-% 合 5 匯含的在胞並細中 9 4 層 5 A 單備胞製細於中氣空的到時加小口印 2 樣溫 ^保 rL °c 毒病炎肌心腦用並滌洗胞细將後然疫免

作 31 理病胞細毒病使後之時小 8 4 溫保為義定度定滴的. N 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公辇） 82.1. 20,000 A6 B6 五、發明説明（21) 用降低50 %的IFN樣品的稀釋度。也可採用為測定ELISA 掃描器中細胞致死率的MTT (3-〔4, 5=二甲基瞎唑- 2- 基〕-2，5 -二苯基溴化四唑銪法（Hansen, M.B., Nielsen, S.E., and Berg, K · :Re-exainatiοn and Further Developnent of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth//Cell Kill. J . I n m u η o . M e t h ·，1 9 8 9 , 1 1 9 , 2 0 3 - 2 1 0 )。I F N s 的試驗室標準法也包括在所有檢定方法中：重組人體IFN-r (Genentech Inc., USA, specific activiy 2 x 10 8 單位/fflg),自然人體白細胞IFN-cr (3X106 IU/ml)和 I PN- y ( 2 x 1 0 6 I U/bi 1)(得自 Dr. K . Cantel 1 , Helsinki, Finland) 〇睡廇鹿死庆1; (TNP)檢宙按照F 1 i c k和G i f f o r d法測定L S 2 9细胞中的T N P细胞毒活性（Flick, D. A . , Gifford, 6.E. :Comparison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor . J. Immunol . H e t h . , 68, 1 6 7, 1984)。經濟部中央標準局S工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) |裝· 往單層細胞培養物中加人樣品和放線菌素D溶液。在 37 Ό保溫20小時後，培養物用晶體紫羥色並測定毒性效果。把約50 %細胞培養物破壞的量定義為一痼TNF活性單位。與ΤΝΡ-α製劑（Genentech Inc., USA)相比表明 :本發明人的檢定法中1個單位等於100-200pg/inl TNF。 -2 3 - · 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)曱4規格（210 X 297公货） 82.1. 20,000 A6 _B6_ 五、發明説明（22 ) 细朐袤中袢掄宙所用的抗血清是：兔抗人體TNF-α，種12958-40和兔抗人體 IFN-y,種 2891-56 (Gencentech Inc., USA) ，羊抗人TFN-a, 和羊抗人IFN-y (得自Dr. K. Cantell, Finland)。细胞素製劑用在培養基中1: 200 稀釋的血清處理並於室溫保溫1小時。然後，按上述方法測定殘餘I F N或T N F活性。使用由健康供血者的血液製得的不同的五組（Li -Ls ) PBL 。經實測，用於鑒定的最佳PBL濃度為8xi0e値細胞/ lml培養基（補充了 1G%胎牛血清和抗菌素的RPMI 1640) 〇人體PBL與新的反應産物I-XI(表1)—起保溫導致 IFN和TNF合成》觀測的應答是範圍在3-1GQ// g/ml化合物（表2)所涉及的劑量。在所指出的濃度内使用的化会物是非細胞毒性。在所有的生物鑒定中，包括了負的和正的對照。負的對照測定了在沒加入任何外源剌激物的條件下自動生成的細胞素（IFN和TNF)的量。正的對照指出了随公知的對照誘發剤所生成的細胞素的量；在本案中，該誘發劑為植物凝集素（PHA, Pharmacia, Sweden , 10// g / m 1) 〇經濟部中央標準局R工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 應指出，在由不同的個體獲得的人體PBL培養物中誘發細胞素一般得到變化相當大的結果。這種現象可根據人口遣傳的差異而解釋。此外，PBL培養物常自發地産 -24-· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 A6 B6 302368 五、發明説明（23) (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 生 IFN和 TNF。換句話説，在PBL的健康供體中一暌觀察到高應答者和低應答者，甚至是非應答者。盡管有示出的限制條件，但生物檢定的結果表明用反應産物（I-XI)處理的PBLUi -L5 )生成了可定董測定的 I FN和 / 或 THF。 --裝. 就含有高應答者的白细胞的Li而言，經實測反應産物Π (含L -形式的天冬氨酸）作為細胞素誘發劑遠比反慝物Π1 (含D-形式天冬氨酸，它也更廉價達兩個數量级 )要活性的多，。這種觀察結果很顯著，主要是因為L -型的氨基酸被生化反應中作為天然作用物的細胞識別。此外，對於反應産物的生物活性的表逹，分子的氨基酸部分遠比糖的形式更重要。可使用優選低分子量、恃別是低於1QQQ道爾頓的多糖（例如葡聚糖，反應産物X :X I)代替單糖，它們反應很類似。反之亦然。含氨棊酸殘基的多糖可具有生物活性，而且當它們被分解成具有結合氨基酸的寡糖時，這種活性仍被保持（未示出數據）。如果取短肽而不是單値氨基酸且用於剌激白細胞生成細胞介素，則也可觀到類似結果（未示出數據）。烴濟部中央標準局β工消費合作社印3來在由不同的供體得到的100多個PBL培養鑒定的未分级分離Τ Τ P的七値對照組得到1 〇 - 1 , 〇〇〇單位I p N / m 1 ,和9 -750單位TNP (ml。由相當於天然泥炭提取物（實施例5 -25-· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 五、發明説明（24) A6 B6 供臨誘。因。外的 A 性在到死性胃同¾活存察壊活腸不^ 。種與觀瘤毒以個BII}這。被腫病可八據，性也和抗也。由 I 數劑活性素到但定在^ 出節的活擾意，穩己71示調明癌干注服常表分 Η 未疫證抗發也口非物部 Mi免經的誘。及乎産 -S申劑為一開在到涉似應 2 製作另有存察用物反 EK㈣的是是素與觀應産的ί*性用生因。被要 C1 得L3活應再死性也主藥表製ΡΒ最的織壞活性的給物個NF能組瘤毒活物部合八DT可。腫病癌産局混的PNf物用和抗抗應如的到IP産有素到的反例量得發應很擾意關述，含者誘反上干注有上療 } 血是床發也素治 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 编號作用物 I (D-10) L -谷氨酸，葡耱，半乳糖 II ( D - 1 1 ) L -天冬氨酸，葡糖，半乳糖 ΙΠ (D-13) D -天冬氨酸，葡糖，半乳糖 IV (D-12) L -絲氛酸，《糖，半乳糖烴濟部中央標準局貝工消費合作社印製

VVIWVIBIX 1 6 8 2^ 分分分分葡级级级级 ’ ( ( ( ( ^ s s s s , i 1 1 I I® 2 222 鋪本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 82.1. 20,000 A6 B6 經濟部中央標準局β工消費合作社印製五、發明説明（25) X L-天冬氨酸 + ¾聚糖（變種1) XI L-天冬氨酸 +¾聚糖（變種2) 實施例1 2 採用以下反應産物製備含按照實施例1-5, 9和10的反應産物作為活性成分的藥物配方： A. 片劑膠囊 5.0g 按照S施例1或1G得到的反醮産物（作為活性成分） 4 4 4 . 0 g 藥用乳糖 1 . 0 g 潤滑劑，如 MYVATEX^ (Eastman Kodak 的商標）混合諸成分並按照傳統方式用30 %含水乙醇造粒，然後於40°C干燥。用這些顆粒製成膠囊，其中各含約450 mg穎粒，即5 Bg活性物。另外，也可以用顆粒製片劑，各重約450mg且含5mg活性物.真1 . B. 以同樣的傳統方式，用合適的載體，將按照前面實施例1-5，9-10得到的活性物質配製成其它藥物配方。實施例1 3 按照前面實施例1-5, 9和10得到的活性物質用作旨在每日護理頭髮和身體的美容製劑的益添加劑，該活性物質的含置根據製劑類型、給藥方法和具體製劑的使用頻率的不同而定，可在〇.〇卜1〇°/。（重置）之間。 -27-· 本紙張尺度遑用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐> 82.1. 20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝. B7 五、發明説明（M ) -表2, :人體PBL中反應產物I XI的生物活性剞量 IFN 單位/ml TNF 單偉/ml . pg/ml L-| L-| L·? L3 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 PHA 10 I 100 30 10 3 II 100 30 10 3 III 100 30 1 0 3 IV 1 00 30 10 3 V 1 00 30 10 3 v/I 100 3 0. 10 3 100 30 10 3 /III 100 30 ! 10 ： 3 tx 100 30 10 3 C 100 30 10 3 ：I 100 30 10 3 ο ο ο ο ο 1 ο ο 3 ο ο ο ο ο ο ο 3 1000 10 <10 <10 <10 <10 <10 10 <10 30 30 <10 <10 <10 <10 <10 10 <1.0 <10 <10 10 <10 <10 <10 <10 <10 10 <10 1 00 30 100 <10 <10 10 <10 10 <10 30 <10 30 <10 <10 <10 30 10 <10 1 0 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 20 <10 <10 <；〇 20 60 20 30 30 1 0 10 1 0 10 10 10 30 10 10 20 20 20 20 60 60 10 10 20 10 20 10 ο ο 000010000.0 000 1 ο I-I - — 1 /S 1 ν < <<<<%✓<>✓<< 2 2 2 2 2 ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο C055 18 15 15 15 18 18 18 18 IB ΙΒ 15 18 18 18 9 0 9 8 7 0 9 2 5 2 10 20 20 ΙΌ 20 30 30 30 30 10 10 20 9 8 8 8 ο 5 9 2 7 0 00000000 2560665556 2 1 5-ΛΙ 12 2 2 1 <9 250 2 ο 6 ο 5 ο 5 2 12 12 7 7 0 2 12 16 0 7/7 7 0 7 0 8~2|2|215|2一8 2 2 2 8 8 9 8 8 9 8 8 7 7 2-2 2 0000070000000000 5558628 858888865 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 <9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 2 8 8 8 7 7 0 1 I 1 I 1 I 2 I 2 I 8 2 2 2 οοοοοοοοοο 8885585555 ο ο 8 .5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 ---- B6 ---- B6 經濟部t央標準局員工消货合作社印製五、發明説明（）專利申請案第82102133號 ROC Patent Appln. No.82102133 補充之脫明窨中文本-附件(三）

Supplemental Specification in Chinese - Encl( 1) (民國83年1月日送呈） (Submitted on January 1994 ) 1 .於S〖-DEAE管柱上以HPLC測定阿馬多瑞化合物及單純的犛，接著再依Reutter 及 Eichner (Lebensn. Unters. Forsch. m，28, 1989)使用氣化三苯基四唑铋（TTC)之醇溶液以後管柱衍生法測定之。以上所舉之方法可評估出後反應混合物中個別阿馬多瑞化合物之定量比例，一般而首，賅比例係不會不同於胺基酸混合物之起始比例（由於不同之反應速率與降解反應速率）》 2_於凝膠管柱〇H-Pak Q-801 (Shodex)(以蒸雔水洗提）上，以 HPLC方法分離後反應混合物。賅方法係依據分子之大小進行分離，於不同時段之反應混合物中所取得之試樣中（即於可變之反應期問後），高重量分子之部份增加，此乃由於 Mail lard反應之下一個階段，即分解阿馬多瑞化合物，接著以胺基酸縮合分解產物。賅部份具有一些cytokine產生效應之影響，以致於反應期間之色層分析控制可使其與其他部份維持逋當之比例。當以UV(波長215或280nm)及折射計追踪洗出液時，未反應之糖基質會於折射紀錄中視得，且其並未有任何UV吸收。 3.IR光糌可對個別的許多產物的組成差異做相對性之評估。將本案產物之光謄與先前具有所欲生物活性之產物的相關光謄，或與標準產物做一比對是爲了改良反應之過程。

, 94-9torf.025-S 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） ....................................................................................裝.....................-訂....................緯一請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消¢合作社印製 A 6 B6 五、發明説明（）提及生物測試，除了已於說明害中所提到的分析之外，更使用了以下之方法： 4. 以使用氫化可的松（hydrocortisone)培養18及20小時之老鼠胸腺細胞殘存測定所得到製劑之效應。此一方法係波藺用於例行控制核准之免疫調節製劑（TFX( 胸腺中之活化肽萃取液）及TTP(得自泥煤萃取液中者_))的活性。以下則更進一步對賅分析做一样述，所附者係以本發明製劑（一爲實例5之產物EK2-S-11，而另一爲實例5Α之產物St-2)進行測試所得之實驗結果。賅二產物所得到之結果係與上述已核准之免疫調節薬物（TF][及TTP)的相關結果報吿完全一致。應予提及的是上述之結果係以與TTP相關壤度相當之壤度，及較TFX可產生相同效應之瀵度低了數倍的瀵度所得到者。 5. 爲了比較之故，上述之測試係用來顯示本發明產物於鼠的成纖維細胞L929上的效應。此一測試係用來砰估習知免疫治療製劑（如報吿於文獻：1) BUck-Olszewska Ζ., f

Zaczynska E., Arch. Immunol .Ther . Exp., 1991 39. 597-606 及2) Zaczynska E. et al. Acta Virol.,1992, 逆，121-8中之LEVAM丨SOL及丨MMUTIOL)的細胞毒性。以下則样述賅程序，並列出本發明產物一些試樣所得到之結果。於此須指出一點，所有測試之轼樣均表現出了較市售產品爲低之毒性。

實例5 A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公發） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 •訂 A6 B6 五、發明説明（）使用實例5之設備與程序，並以下述之物質做爲起始物： 1 OOmg 卜天冬氮酸， 100mg L-酪氨酸， 20mg L-蘇氨酸， 20og L-絲氮酸， lOOng 苯基丙氨酸， 70mg 谷氮酸， 90mg 甘氮酸， 90mg L-丙氮酸， 50mg L-纈氨酸， 40mg 異亮氨酸， 60mg 亮氨酸， 1 OOmg 組氨酸氫氯化物， 20mg 賴氮酸氫氣化物， 10mg 精氮酸氫氣化物， lOOmg NaHC〇3， 80mg D-葡荀糖，以及 5mg 水 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝經濟部中央橒準局員工消赀合作社印製於減壓蒸發約2.8ml水後，於75-801C之热浴下將賅些基質溶解，然後於常壓及86-90TC之溫度下，加热賅液態反應混合物2小時，接著減麈，並將反應混合物蒸發至乾。於蒸發終了時，分兩部份加入無水乙辟，毎部份之《稹係15ml»於乾燥器中冷卻反應容器，將產物（產置爲1.5g)製成粉末，並標本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210X297公釐） B6 經濟部中央標準局員工消费合泎社印製五、發明説明（以"S t - 2 "。測試： 1 .於受測物質（D-10, EK2-S-11及ST-2)存在下，以氫化可的松培養18及20小時，测定老鼠胸腺細胞的殘存以氫化可的松培養18及20小時，測試老鼠胸腺細胞的殘存：測試動物：5星期大之雌性Ba丨b/C鼠，調節細胞來源：老鼠胸腺之胸腺細胞團。試劑：1>RPM丨1640溶液，2)胎牛血清一經鈍化者（56¾

下3G分鐘），3)半琥珀酸氫化可的松鹽與一溶劑-針薬（ HC)-得自波蘭之菜物製造商-POLFA 測弑溶液：蔣發測物質溶於RPtff 1640,分別製備出含有g/ml，lu g/m丨及〇.5u g/ml受測物質之溶液。程序：以乙醚將2-3隻雌鼠（每一受測物質）導入潛伏狀態，以分離胸腺，碾製賅腺«I，並將其懸浮於具有10% 鈍化FCS之RPMI 1640中，然後以用於血液過濾之濾器過濾該懸浮液，並於相同之培養基中（具有10%鈍化FCS之 RPM丨1640 )以1200 rpn之轉速離心2次（毎次10分鏟），接著將賅些細胞再懸浮於相同的培養基（濃度爲4 X 1〇6 細胞/ml)中》將經由如此製備的胸腺細胞懸浮液分散於無菌試管中：每一支lml懸浮液。將賅些試管置於冰浴中，每一测定製備兩支試管，於層室中進行所有之步騄。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210X297公釐） ....................................................................................裝......................訂--------------------線請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（）進行以下之測定： 1.於具有10%FCS之RPMI 1640中的胸腺細胞。 2 .於具有10% FCS +氫化可的松（HC) 50 u g/m丨之RPM[ 1640中的胸腺細胞。 3. 於具有10% FCS +澳度分別爲5u g/ml，U g/ml及0.5 ug/ml的受測物質之RPMI 1640中的胸腺細胞。於將受測物質加至胸腺細胞培養物後，於5% C〇2之恆定流動及37_C之溫度的培養器中培養賅培養物1小時。 4. 於具有10% FCS+澳度爲第3項中所述者的受測物質+ HC 50tig/ml之RPMI 1640中的胸腺細胞。於37¾及 5%C〇2大氣下，培養此測試培養物18及20小時。於毎一培養物中，测定到了 3至4倍的活及死細胞百分比，以提爾盼（tyrpan)藍染色死細胞：於測定細胞殘存前即刻將0.2%提爾盼藍溶液與4.25% NaCl溶液以4:1之比例混合。染成藍色之胸腺細胞係被認定爲死細胞，而無色細胞係爲活細胞》結果之解釋：對毎一受测培養物做了 3-4次之肝估，胸腺細胞對氫化可的松的敏感性係計算如下：於具有HC之培養物中的活胸腺細胞％ a)相對殘存之％ =- 於不具HC之培養物中的活胸腺細胞％於具有HC所給澳度之受測物質的培養物中的活胸腺細胞％ b )相對殘存之％ =- 於不具HC相關濃度之受測物質的培養物中的活胸腺細胞％於受測澳度：5/x g/ml，ltt g/ml及0.5U g/ml可於具有氫 -5 - 本紙張足度適用中ϋ國家標準（CNS)甲4规格（210x297公釐) ............................. ................................I.......................玎....................-^ t請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 302368 A6 B6 五、發明説明（）化可的松的培養物中增加至少25 %之殘存胸腺細胞的受測物質係被認爲具活性者，依據槲準程序'，於6次测試中（3劑量，每一饋兩次）至少一次顯示增加高於25 %即應被鼢爲具活性者。測試劑量殘存胸腺細胞之增加％製劑 η [ a g/ml] 18小時後 20小時後 D-10 8 5 12 18 8 1 19 28 8 0.5 27 30 ST-2 8 5 41 35 8 1 27 38 8 0.5 42 33 EK2-S-11 8 5 23 23 8 1 35 26 8 0.5 36 34 ...................—................................................................裝......................訂.................：線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝Η消费合作社印製 I .製劑對鼠成織維細胞L929的培養物的細胞毒性效應之測定源自人類及動物之成繊維細胞係可懸浮於不同性質之細胞毒性物質中，細胞株L929 —般係用來測定TNF之細胞毒性，受測物質於細胞株上之效應係以下法測定之：程序：將欲測物質溶於再蒸餹水中，製備D-10及St-2之 16ng/ml基礎溶液，使用具有10%鈍化FCS之RPMI 1649 培養基再製作稀釋液，使用96平底板（Flow -6 · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐) A6 B6 五、發明説明（） 'Laboratories )製作稀释液。以100 it 1，濃度爲1 . 5 X 1〇5細胞/ml之L929細胞懸浮液對稀釋液進拧接種，最後受測之D-10與St-2稀釋液係爲以下者：800 a g/ml，400 u g/ml，200tt g/ml.···低至 12.5/i g/ml 及 6.25it g/ml。於毎一平板上有一對照組：一爲由培養基（RPM丨1640 + 10% FCS)中之L929細胞培養物所組成，其他則由具有逋量再蒸餹水之培養基中的L929細胞培養物所組成。於 5%C〇2大氣中，及於37¾下，培養賅些所製得的平板，於24及48小時後，使用逆顛微鏡0ΡΤ0Ν評估結果，每一測試重複3次。結果：裝.......................玎....................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局β工消Φ合作社印51 於本測試中顧示受测物質係不具細胞毒性*以相同的測試砰估IHHUTI0L與LEVAHISOL的細胞毒性，丨HMUTI0L於 liig/ml之瀵度仍具細胞毒性（猜見Zaczynska et al.之引證案），而LEVAMISOL於500 u g/ml之瀵度具細胞毒性（猜見Blach-Olszewska等人之引證案），如上所述，賅兩種市售之製劑已於波蘭被核准用於《療的用途上》對於該三種物質：EK2-S-11, D-10及St-2,請見附件之圖表，於其中提供了更詳盡之確認數據：每一物質有2 最高測試濃度於24小時後於48小時後製劑 [a g/ml] 、之活細胞％之活細胞％ D-10 800 100 100 ST-2 800 100 100 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210x297公釐） A6 B6 五、發明説明（）個色層分析圖及丨1{光譜圖。除了提供了 1991及1993年對D-11部份所做之IR光譜及色屠分析圖（於管柱OH-pak Q-801上）以顯示所有結果之再現性外，於此亦更提供了 4張豳表。 ............................................................................... 裝......................訂....................線 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消"合作社印奴本紙張尺度適用中國國家標準（CNSj甲4规格（210x297公釐）

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（一專利申請案第82102133號 ROC Patent Appln. No.82102133 補充之試驗資料中文本-附件㈢ Supplemental Test Data in Chinese - EncI. (ffl ) (民國85年12月3i曰WW) ~ (Submitted on December 31 , 1996 ) TORF標準產品（PTT)之微量分析元素分析選用二補充之方法進行該分析，第一種方法稱爲能量分散X射線螢光法。然而，由於氣離子之濃度過高，以該方法僅確認了一半製備性之分析。該預備性之資料給予了我們有關所預知之元素，其之大約量與試樣稀釋程度的資訊。 ΡΊΊ之丰定量XRF—屏蔽分析硫⑸ 鉀(Κ) 鈣（Ca) 鐵(Fe) 鐘（Li) 鈀（Pd) 鎘（Cd) 錫（Sn) 銻（Sb) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X297公釐） <6% >0.13% <3% > 61ppm <0.0003 <0.002 <0.001 <0.003 <0.001 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製破⑴ <0.0742 鎖（Ba) <0.001 铪（Hf) <0.001 鎢⑺ <0.001 始（Pt) <0.003 金（Au) <0.016 汞(Hg) <0,014 絶（T1) <0.001 錯⑽ <0.002 叙（Bi) . <0.001 稀土金屬元素之濃度（g/L = g/kg)': 鈽（Ce) <0.0003 钕（Nd) <0.0004 釤（Sm) <0.0005 銪（Eu) <0.0003 釓（Gd) <0.0002 鏑（Dy) <0.0004 鈥（Ho) <0.0001 铒(Er) <0.0001 铥（Tm) <0.0001 镱(Yb) <0.0004 鍀（Lu) <0.0001 鑭（La) <0.0003 <:位於特定元素檢測極限之値。 -2 - ---------^ 衣------訂------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 0^368 (由本局壤舄) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製承辦人代碼：大類： I P C分類： A6j補充本案已向：波蘭國（地區）申請專利，申請曰期：案號：，□有d無主張優先權歐洲 1992年2月13日案號：P293464 1992年 3月 3日案號：92103614.1 有關微生物已寄存於：，寄存日期：，寄存號碼：一 2 - B 一 -I - .1 . I -I - I - ---九— - -i- -I - - - - - - -- -11 一 · - - I I - - - - - -I II I - I ! -I- ί - - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁各欄) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐）

Claims

s〇2S68 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍公告 1#正補充專利申請案第82102133號 ROC Patent Appln. No.82102133 修正之申請專利範園肀文本-附件㈠ Amended Claims in Chinese - Enc1.(T ) (民國85年12月曰~~WIT) (Submitted on December , 1996) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 J· 一種製造至少一種用於謗導人類及哺乳動物之細胞素之阿馬多瑞（Amadori)重組化合物的方法，該化合私係具式R1-NH-R2,其中Ri係包括衍生自單糖或分子量低於5,000道爾呑之寡糖或多糖之卜去氧-2-酮糖基， R2係包括胺基酸基图，該方法係包括於70至121·(〇之高溫下，任意地於壓力及/或Ci_4醇存在下，以水爲溶劑，令多數個不同之胺基酸與單糖、寡糖或多糖反應，或令以上之任何結合反應，其中單糖及/或寡糖或多糖與胺基酸之莫耳比係介於2 ·· 1與1 : 1間。 2根據申請專利範圍第1項之方法，其中係使用D-形之單糖。 3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中係使用L-形之胺基酸。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中單糖及/寡糖或多糖與胺基酸之莫耳比係1.5·· 1。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中單糖及/或寡糖或多糖係於存於天然泥炭萃取物之無機微量元素存在下與胺基酸反應。 -29 - -------(I裝------訂-----^ -線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 96-9T0RF _ 1549A-M 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^02368 ll D8 六、申請專利靶圍 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中單糖及/或寡糖或多糖與胺基酸之反應係於每lpbw (重量份）水性溶劑含有0.67至2.75pbw(重量份）固體物之濃縮水溶液中進行，以及任選地於反應之同時或其後移除溶劑，直JL (於30至120分鐘後）所形成之產物已進行了阿馬多瑞重组，以及反應混合物變成淡橙色。、 7. 根據申請專利範圍第1或6項之方法，其中反應係於莫耳比爲1 : 1之具有二羧基的胺基酸與緩衝鹽之存在下進行。 / S.根據申請專利範圍第7項之方法，其中缓衝鹽係爲碳酸氫鈉。 9·根據申請專利範圍第1,5或6項之方法，其中單糖及/ 或寡糖或多糖與胺基酸，以及任意之無機微量元素係實質上與存於天然泥炭萃取物中者具有相同之組成及 /或重量比。 m根據申請專利範圍第1或6項之方法，其中將反應混合物（其已進行阿馬多瑞重組）以管柱色層分析純化，由此收集可使鐵氰化鉀還原的特殊部份。几一種藉誘導細胞素形成而刺激人類或哺乳動物免疫系統之醫禁組合物，其係包括至少一種根據申請專利範圍第1項之方珐所製得的阿馬多瑞重組化合物做爲活性成分。 111 ( —裝 H 訂 ί .線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4· ( 21()χ297公着） 302368 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 12.根據申請專利範圍第11項之組合物，其更包括至少一種醫察可接受之添加劑，其係選自於載體、佐劑、潤滑劑、濃縮劑及香料中，且其中阿馬多瑞重组化合物係以0.01至50重量％之量存在。议根據申請專利範圍第11或12項之組合物，其中阿馬多瑞重組化合物與其他組份的重量比係介於1 : 1至1 : •V 100 間。从根據申請專利範圍第13項之组合物，其中阿馬多端重組合物與其他组份的重量比係介於1 : 8至1 : 20間。瓜根據申請專利範圍第13項乏組舍物，其中阿馬多瑞重組合物與其他组份的重量比係1 : 9。览·根據申請專利範園第12項之組合物，其中阿馬多瑞重組化合物係存在於乳糖與潤滑劑之摻合物中，乳糖與潤滑劑之重量比係介於20 : 1與100 : 1間。 J7·根據申請專利範園第16項之組合物，其中乳糖與湖滑劑之重量比係50 : 1。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -.;y' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）