PL171319B1 - S posób wytwarzania kompozycji przydatnej do uzytku farmaceutycznegoi/lub kosmetycznego PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania kompozycji przydatnej do uzytku farmaceutycznego i/lub kosmetycznego, zdolnej do stymulowania ukladu immunologicznego u ludzi i ssaków i zawierajacej co najmniej jeden zwiazek po przegrupowaniu Amadoriego, o wzorze ogólnym R 1-NH-R2 , w którym R 1 oznacza rodnik 1-dezoksy-2-ketozowy pochodzacy od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy, znam ienny tym , ze prowadzi sie reakcje kilku róznych aminokwasów lub peptydów z jednym cukrem prostym, oligo- lub polisacharydem, albo jednego aminokwasu lub peptydu i kilku cukrów prostych, oligo- lub polisacharydów lub tez dowolnej ich kombinacji, w srodowisku wodnym w podwyzszonej temperaturze okolo 70 do 121° C, az do momentu - korzystnie przez okolo 30 do 120 minut, w którym otrzymane produkty ulegly przegrupowaniu Amadoriego 1 przerywa sie reakcje gdy przegrupowanie dobiega konca, co ustala sie stosujac test redukcji zelazicy- janku i/lub na podstawie obserwacji zmiany koloru mieszaniny reakcyjnej. 13. Preparat kosmetyczny posiadajacy zdolnosc stymulowania systemu im m unolo- gicznego ludzi 1 ssaków, znam ienny tym, ze zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nosnik i/lub dalszy dodatek i co najmniej jeden zwiazek po przegrupowaniu Amadoriego o wzorze ogólnym R 1-NH-R2 , w którym R 1 oznacza rodnik 1-dezoksy-2-ketozowy pochodzacy od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy. PL PL PL

Description

Obecny wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji przydatnej do użytku farmaceutycznego i/lub kosmetycznego, zdolnej do stymulowania układu immunologicznego u ludzi i ssaków.

171 319

Znane są produkty reakcji przegrupowania Amadoriego; są to przykładowo produkty reakcji aminokwasu lub peptydu i cukru, oligo- lub polisacharydu, które przeszły przegrupowanie Amadoriego (J. Biol. Soc. 215 (1955), Henri Borsook i wsp.). 1 tak w opisie DE-C-3914354, opisana jest rozpuszczalna w wodzie glikoproteiną z aminokwasu i cukru, wyodrębniona z ekstraktu z nasion Avena sativa. Ponadto, w opisie EP-A-406087 ujawniono rozpuszczalne w wodzie kompleksy polischarydowo-glikopeptydowe, wyodrębnione ze ścianek komórkowych bakterii Gram-dodatnich a w J. Biol. Chem. 1985, 260/90 podano, ze wykorzystano spektroskopię NMR w celu scharakteryzowania produktów reakcji Amadoriego otrzymanych w reakcji glukozy z wolnymi grupami aminowymi białka.

Obecny wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji przydatnej do użytku farmaceutycznego i/lub kosmetycznego, w którym specyficzne związki poddawane są przegrupowaniu Amadoriego, a przebieg reakcji kontroluje się prowadząc test na redukcję żelazicyjanku. Redukcja tego związku stanowi reakcję specyficzną na obecność substancji biologicznie czynnych otrzymanych w reakcji cukru i aminokwasu.

Dotychczas w przeszłości nie badano rozliczny etapów oczyszczania ekstraktu produktów reakcji przegrupowania Amadoriego (w celu usunięcia substancji balastowych i zanieczyszczeń) na aktywność biologiczną.

Znane są produkty immunostymulacyjne pochodzenia naturalnego, takie jak ekstrakt z jemioły, ekstrakt torfowy i tym podobne. Mają one jednak takie wady, że ich otrzymywanie wiąże się z przerobem dużych ilości surowca w celu otrzymania kilku gramów substancji aktywnej; że zawierać mogą niekontrolowane zanieczyszczenia, których obecność prowadzić może do toksyczności i efektów ubocznych a w konsekwencji także do kłopotów z podawaniem przy praktycznym zastosowaniu, z uwagi na złożony charakter i trudno odtwarzalny skład.

Porównywalne produkty lub mieszanki produktów ze źródeł sztucznych, takie jak interferon lub inne produkty otrzymywane metodami inżynierii genetycznej są jeszcze droższe w produkcji. Ponadto cząsteczki ludzkiego interferonu są często zbyt duże aby przeniknąć ścianki komórek, przez co tylko część podanej dawki jest efektywnie wykorzystana. Dodatkowo produkty inżynierii genetycznej mają zwykle efekty uboczne a niektóre z nich są nawet toksyczne. Niektóre z nich działają przy tym efektywnie jednego dnia a nie są aktywne dnia następnego z dotychczas niewiadomych przyczyn.

Nieoczekiwanie obecnie okazało się, że niemal każdy kompleks prostego aminokwasu i cukru po co najmniej częściowym przejściu przegrupowania Amadoriego nie wykazuje żadnej z niekorzystnych cech omówionych wyżej lecz wręcz przeciwnie ma nieoczekiwanie wysoką aktywność immunologiczną. Mogą one być zatem wykorzystane w preparatach farmaceutycznych i w kosmetykach. Te niewielkie cząsteczki z łatwością przenikają ścianki komórek i w praktyce działają tak jak substancje odżywcze. Indukują tworzenie naturalnego interferonu i innych cytokin, łącznie z czynnikiem nekrozy nowotworów (TNF). Nawet trzy dni po podaniu wykazują nadal stymulujący wpływ na aktywność biologiczną. Działanie takie nasila się wraz ze stopniem przereagowania substratów w kierunku przegrupowania Amadoriego i słabnie ponownie ze wzrostem stopnia rozkładu pożądanego kompleksu.

Zamiast prostego cukru stosować można także polisacharydy - korzystnie o niskim ciężarze cząsteczkowym, zwłaszcza poniżej 1000 daltonów - przykładowo dekstran, które reagują podobnie. Polisacharydy przejawiają aktywność biologiczną i mogą zachowywać część swej aktywności po przekształceniu w oligosacharydy. Zamiast prostego aminokwasu można stosować niskocząsteczkowy peptyd.

Sposób wytwarzania kompozycji przydatnej do użytku farmaceutycznego i/lub kosmetycznego, zdolnej do stymulowania układu immunologicznego ludzi i ssaków i zawierającej co najmniej jeden związek po przegrupowaniu Amadoriego, o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym R| oznacza rodnik 1-dezoksy-2-ketozowy pochodzący od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy, według wynalazku polega na tym, że prowadzi się reakcję kilku różnych aminokwasów lub peptydów z jednym cukrem prostym, oligo- lub polisacharydem, albo jednego aminokwasu lub peptydu i kilku cukrów prostych, oligolub polisacharydów lub też dowolnej ich kombinacji, w środowisku wodnym w podwyższonej

171 319 temperaturze około 70 do 12ł°C, aż do momentu - korzystnie przez około 30 do 120 minut, w którym otrzymane produkty uległy przegrupowaniu Amadoriego i przerywa się reakcję gdy przegrupowanie dobiega końca, co ustała się stosując test redukcji żelazicyjanku i/lub na podstawie obserwacji zmiany koloru mieszaniny reakcyjnej.

Zgodnie z wynalazkiem korzystnie reakcję prowadzi się w obecności pierwiastków śladowych występujących w ekstraktach z naturalnego torfu i ewentualnie pod ciśnieniem i/lub w obecności niższego alkoholu, przy czym korzystny stosunek molowy cukrów i/lub sacharydów do aminokwasów i/lub peptydów wynosi od 2:1 do 1:1, korzystnie 1,5:1.

Korzystnie w sposobie według wynalazku mieszaninę reakcyjną suszy się i/lub poddaje oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej, zbierając specyficzne frakcje powodujące redukcję żelazicyjanku potasu.

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem cukry i/lub sacharydy o niskim ciężarze cząsteczkowym z jednej strony i/lub aminokwasy i/lub peptydy o niskim ciężarze cząsteczkowym z drugiej strony, oraz ewentualnie nieorganiczne pierwiastki śladowe, wprowadza się do reakcji zasadniczo w takim samym składzie i/lub zasadniczo w tych samych stosunkach wagowych jakie występują w ekstraktach z naturalnego torfu. Ewentualnie, gdy co najmniej jeden stosowany wyjściowy aminokwas ma dwie grupy karboksylowe a reakcje prowadzi się w obecności soli buforującej, korzystnie kwaśnego węglanu sodu w stosunku molowym do aminokwasu 1:1.

Zgodnie z wynalazkiem reakcję cukru/cukrów i/lub sacharydu/sacharydów z aminokwasem/aminokwasami i/lub peptydem/peptydami korzystnie prowadzi się w stężonym roztworze wodnym, korzystnie o stężeniu około 0,67 do około 2,75 części wagowych substancji stałych na 1 część wagową wodnego rozpuszczalnika, a następujące po niej przegrupowanie Amadoriego prowadzi się z jednoczesnym lub następczym usuwaniem wodnego rozpuszczalnika aż do momentu w którym mieszanina reakcyjna nabiera koloru jasno pomarańczowego.

Ewentualnie, zgodnie z wynalazkiem, do kompozycji określonej wyżej dodaje się co najmniej jedną dodatkową substancję: farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik i ewentualnie substancję pomocniczą i/lub środek poślizgowy, przy stosunku wagowym co najmniej jednego wskazanego związku po przegrupowaniu Amadoriego do tej substancji zawartym w granicach od 1:1 do 1: 100, korzystnie 1:8 do 1:20, a najkorzystniej około 1:9. Korzystnie, do kompozycji dodaje się co najmniej jedną dodatkową substancję: farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik i ewentualnie substancję pomocniczą i/łub środek poślizgowy, w takiej ilości, że co najmniej jeden wskazany związek po przegrupowaniu Amadoriego jest zawarty w tej otrzymanej mieszaninie w ilości 0,01-10% wagowych, korzystnie 0,01-1% wagowych, najkorzystniej 0,05-0,10% wagowych. Gdy wprowadza się środek poślizgowy, korzystnie środek ten dodaje się do kompozycji wraz z laktozą, a stosunek wagowy laktozy do środka poślizgowego zawiera się pomiędzy 20:1 a 100:1, korzystnie 50:1.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, stosując odpowiedni związek wyjściowy w formie D wytwarza się związek aktywny, w którym rodnik cukrowy korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej rodnik glukozowy, ksylozowy, galaktozowy, ramnozowy, fruktozowy, mannozowy, 2-dezoksyglukozowy, 6-dezoksyglukozowy, glukozoaminowy, galaktozoaminowy. Jednocześnie, korzystnie, stosując odpowiedni związek wyjściowy w formie L wytwarza się związek aktywny, w którym rodnik aminokwasowy korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej rodnik serynowy, glicynowy, prolinowy, histydynowy, argininonwy, alaninowy, pochodzący z kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, fenyloalaninowy, treonmowy, cysternowy, cystynowy, glutaminowy, asparaginowy, metioninowy, tyrozynowy, hydroksyprolinowy, tryptofanowy, walinowy, izoleucynowy, lizynowy, leucynowy. Ewentualnie, zgodnie z wynalazkiem, stosując odpowiednie związki wyjściowe wytwarza się związek aktywny, w którym rodniki oligo- lub polisacharydowy i/lub peptydowy mają niski ciężar cząsteczkowy, zwłaszcza mniejszy niż 1000 daltonów.

Produktem bezpośrednio wytworzonym przedstawionym wyżej sposobem jest kompozycja do użytku farmaceutycznego lub kosmetycznego.

Preparat kosmetyczny posiadający zdolność stymulowania systemu immunologicznego ludzi i ssaków, wytworzony sposobem według wynalazku zawiera co najmniej jeden farmaceu6

171 319 tycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik i/lub dalszy dodatek i co najmniej jeden związek po przegrupowaniu Amadoriego o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym Ri oznacza rodnik 1-dezoksy-2-ketozowy pochodzący od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy.

Korzystnie, preparat taki zawiera wskazaną substancję aktywną, w której rodniki oligolub polisacharydowe i/lub peptydowe mają niski ciężar cząsteczkowy, zwłaszcza mniejszy niż 1000 daltonów. Korzystnie zawiera on różne związki przegrupowania Amadoriego otrzymane z kilku różnych aminokwasów lub niskocząsteczkowych peptydów i z jednego cukru prostego, oligo- lub polisacharydu, albo z jednego aminokwasu lub peptydu i kilku cukrów prostych, oligolub polisacharydów lub też z dowolnej ich kombinacji, korzystnie zasadniczo w takim samym składzie i/lub zasadniczo w tych samych stosunkach wagowych jakie występują w ekstraktach z naturalnego torfu 1 ewentualnie dodatkowo zawiera nieorganiczne pierwiastki śladowe występujące w takich ekstraktach. Szczególnie korzystnie, preparat zawiera substancję aktywną, w której rodnik cukrowy korzystnie ma formę D i wybrany jest z grupy obejmującej rodnik glukozowy, ksylozowy, galaktozowy, ramnozowy, fruktozowy, mannozowy, 2-dezoksyglukozowy, 6-dezoksyglukozowy, glukozoaminowy, galaktozoaminowy, zaś rodnik aminokwasowy korzystnie ma formę L i wybrany jest z grupy obejmującej rodnik serynowy, glicynowy, prolinowy, histydynowy, argininowy, alaninowy, pochodzący z kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, fenyloalaninowy, treoninowy, cysteinowy, cystynowy, glutaminowy, asparaginowy, metioninowy, tyrozynowy, hydroksyprolinowy, tryptofanowy, walinowy, izoleucynowy, lizynowy, leucynowy.

Preparaty farmaceutyczne wytworzone bezpośrednio sposobem według wynalazku omówione są w dalszej części opisu i w przykładach.

Jak dotąd niewiele wiadomo było na temat biologicznej aktywności omawianych związków. Obecnie stwierdzono, że połączenia tych związków w kontakcie z ludzkimi leukocytami powodują wytwarzanie interferonu i innych cytokin. Określa się to zjawisko terminem poliklonalnej aktywacji komórek.

Możliwe jest zbadanie substancji wytwarzanych pod wpływem omawianych związków i ustalenie ich aktywności w międzynarodowych jednostkach aktywności w odniesieniu do poszczególnych cytokin. Związki te mają szczególnie wysoką aktywność biologiczną w granicach stężeń czystych substancjiod 1 do 100 μg/ml. W obrębie cząsteczek omawianych związków reszta aminokwasowa odgrywa większą rolę niż charakter reszty cukrowej.

Produkty reakcji kwasu L-asparaginowego i glukozy lub galaktozy - po przejściu przegrupowania Amadoriego - w kontakcie z ludzkimi leukocytami po inkubacji w pożywce kultur tkankowych w temperaturze 37°C przez 20 godzin w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 powodują wytworzenie 30-1000 przeciwwirusowych jednostek interferonu. Stężenie interferonu oznacza się w próbie biologicznej z użyciem ludzkich komórek rakowych. Pod wpływem tych związków powstawać może czynnik nekrozy nowotworów'.

Produkty, które mogą być wykorzystane w tak nieoczekiwanych zastosowaniach mają wzór ogólny

R1’-NH-R2’ w którym:

Rf oznacza rodnik C-1-dezoksy-2-ketozowy pochodzący od prostego cukru, oligo- 1 polisacharydu - korzystnie o niskim ciężarze cząteczkowym, zwłaszcza nizszym niż 1000 daltonów, zaś

R2’ oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy - korzystnie o niskim ciężarze cząsteczkowym, zwłaszcza niższym niż 1000 daltonów.

Tak więc grupa biologicznie czynnych związków może obejmować albo konkretne związki przegrupowania Amadoriego opisane wyżej lub N-podstawione pochodne szeregu różnych związków aminokwasowych i jednego cukru, oligo- lub polisacharydu - korzystnie o niskim ciężarze cząsteczkowym, zwłaszcza niższym niż 1000 daltonów, bądź N-podstawione pochodne jednego związku aminokwasowego 1 szeregu prostych cukrów, oligo- i/lub wskaza171 319 nych polisacharydów, albo też dowolne kombinacje takich pochodnych, z których każdą cechuje zadowalająca aktywność biologiczna..

Korzystnie Rf w powyższym wzorze może być rodnikiem wybranym z grupy prostych cukrów o konfiguracji D, zwłaszcza (choć niewyłącznie) z grupy obejmującej formy D glukozy, ksylozy, galaktozy, ramnozy, fruktozy, mannozy, 6-dezoksy-glukozy, glukozoaminy, galaktozoammy; R2’ może oznaczać rodnik wybrany z grupy związków aminokwasowych o konfiguracji L, takich jak seryna, glicyna, histydyna, arginina, glutamina, asparagina, alanina, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, fenyloalanina, treonina, cysteina, cystyna, metionina, hydroksyprolina, tryptofan, prolina, tyrozyna, walina, izoleucyna, leucyna 1 lizyna albo tez peptydy zbudowane z tych aminokwasów w dowolnej kombinacji.

Podczas otrzymywania wskazanych wyżej związków i produktów tworzy się związek pośredni o wzorze

R’-NH-R” w którym:

R’ oznacza C1-1-dezoksy-resztę cukru prostego, oligo- lub polisacharydu o prostym łańcuchu węglowym lub w postaci cyklicznej z mostkiem tlenowym, zaś

R” oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy, i ten związek pośredni co najmniej częściowo przeszedł przegrupowanie Amadoriego i/lub reakcję Maillarda w wyniku ciągłego podgrzewania mieszaniny reakcyjnej, korzystnie pod obniżonym ciśnieniem, z jednoczesnym lub następnym usuwaniem rozpuszczalników.

Stwierdzono, że produkty przegrupowania Amadoriego - zachodzącego zgodnie ze schematem reakcji uwidocznionym na załączonym rysunku - są stosunkowo podatne na rozkład oraz, że produkty rozkładu mają charakter ciemno brązowych smołowatych niezidentyfikowanych związków bez aktywności biologicznej. Dlatego korzystnie przerywa się reakcję przegrupowania Amadoriego w momencie gdy mieszanina reakcyjna nabiera jasno pomarańczowo-brązowego koloru.

Zauważono, ze pośrednie produkty reakcji, tworzące się gdy początkowo mętny roztwór aminokwasu ulega sklarowaniu (przed przegrupowaniem Amadoriego), łatwo ulegają hydrolizie, to znaczy reakcja jest odwracalna. Wraz z postępującym zaawansowaniem przegrupowania Amadoriego, odwracalność reakcji zanika, to znaczy powstające produkty stają się bardziej stabilne, a kolor mieszaniny reakcyjnej zmienia się stopniowo z jasno żółtego na jasno pomarańczowy, a w końcu na pomarańczowo-brązowy gdy przegrupowanie Amadoriego zdaje się być zakończone. Próbki pobierane w czasie trwania reakcji przegrupowania badano (zgodnie z licznymi metodami opisanymi w dalszej części opisu) i stwierdzono, że w miarę postępu reakcji Amadoriego biologiczna aktywność wzrasta a następnie maleje gdy pod wpływem dalszego ogrzewania zapoczątkowuje się proces rozkładu, którego zewnętrznym symptomem jest przejście koloru mieszaniny w ciemny brąz. Natychmiastowa redukcja żelazicyjanku i zmiana koloru nastąpi gdy mieszanina zawiera inne grupy ketonowe i/lub aminokwasy zawierające siarkę, takie jak cysteina. W innych przypadkach zjawiska te nastąpią w przeciągu 3 do 5 minut, co jest dobrym sprawdzianem zachodzenia przegrupowania Amadoriego. Nieprzereagowane cukry spowodują zmianę koloru dopiero po upływie pół godziny do kilku godzin.

Wyodrębnianie czystych produktów przegrupowania Amadoriego można prowadzić znanymi metodami opartymi na wiązaniu mieszaniny na silnym kationowym wymieniaczu jonowym (takim jak Amberlite® lub Dowex® ) i kolejnym wymywaniu wodą amoniakalną, odparowaniu wybranej frakcji eluatu pod obniżonym ciśnieniem i krystalizacji czystego związku z bezwodnego metanolu (J.E. Hodge i B.E. Fisher, Methods in Carbohydrate Chemistry, Tom II, ReactminsofCarbohydrales, AcademicPress,N.Y.,London, 1963 str. 105-106: lubBorsook 1 wsp. jak cytowano wcześniej; lub J. Dubourg i P. Devilliers).

W sposobie według wynalazku, wszystkie wskazane wyżej preferencje co do rodzaju rodników pochodzących od prostych związków cukrowych i aminokwasowych, zachowują aktualność. Dodatkowo, korzystna mieszanina substratów cukrowych zawiera formy D glukozy, ksylozy, galaktozy, ramnozy i fruktozy w stosunku wagowym około 20:10:4:1:1, a korzystna

171 319 mieszanina substratów aminokwasowych zawiera formy L seryny, glicyny, histydyny, argininy, alaniny, proliny, tyrozyny, waliny, leucyny, izoleucyny i lizyny w stosunku wagowym 20,5:35, 8:35, 8:132:180.360:216:160:72:68:780. '

Jak iuz wspomniano, produkty przegrupowania Amadoriego mają zdolność redukowania zelazicyjanku potasowego i taka testowa reakcja chemiczna zapewnia podstawę do szybkiego ustalenia czy otrzymana w reakcji cukru i aminokwasu kompozycja ma aktywność biologiczną.

Stwierdzono, że produkty reakcji Amadoriego są szczególnie aktywne, gdy mieszanina prostych cukrów o tym samym składzie i stosunku wagowym składników jakie cechują ekstrakty z torfu naturalnego, poddawana jest reakcji z mieszaniną związków aminokwasowych o takim samym składzie i stosunku wagowym składników jakie cechują ekstrakty z torfu naturalnego, prowadzonej w środowisku wodnym, korzystnie z dodatkiem niższego alkoholu - i ewentualnie nieorganicznych pierwiastków śladowych, występujących w ekstraktach z torfu naturalnego - w podwyższonej temperaturze (i ewentualnie pod ciśnieniem), a następnie kontynuowane jest przewlekłe ogrzewanie w celu spowodowania przegrupowania Amadoriego w uzyskanych produktach, z jednoczesnym lub następnym odpędzeniem rozpuszczalników, zatrzymaniem reakcji przegrupowania w momencie gdy mieszanina reakcyjna nabiera koloru jasno pomarańczowo-brązowego, wysuszeniem tak otrzymanych produktów, oczyszczeniem tych produktów metodą chromatografii kolumnowej i zebraniem frakcji powodujących maksymalną redukcję żelazicyjanku potasu.

W jednym z przykładów realizacji obecnego wynalazku, preparat farmaceutyczny otrzymywany bezpośrednio tym sposobem zawiera jako składnik aktywny co najmniej jeden produkt reakcji w o wzorze R1-NH-R2’ lub konkretny związek o wzorze R1-NH-R2 wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub środkiem pomocniczym i/lub ewentualnie środkiem poślizgowym, w stosunku wagowym składnika aktywnego do pozostałych składników pomiędzy I:I a 1:100, korzystnie 1:8 do 1:20, a najkorzystniej około I:9

Inny korzystny preparat farmaceutyczny zawiera obok składnika aktywnego - laktozę i środek poślizgowy, przy czym stosunek wagowy laktozy do środka poślizgowego wynosi pomiędzy 20:I a 100:1, korzystnie 50:1.

Wskazane preparaty farmaceutyczne stosuje się do leczenia i/lub zapobiegania chorobom hematologicznym i/lub immunologicznym i/lub do stymulowania systemu immunologicznego ludzi i/lub ssaków poprzez indukowanie tworzenia cytokin.

Innym wskazanym wyżej przeznaczeniem kompozycji wytwarzanych sposobem według wynalazku jest ich wykorzystanie do celów kosmetycznych. W takich kompozycjach wskazany składnik aktywny występuje w ilości 0,01-10%, korzystnie 0,01-1% wagowego a zwłaszcza w ilości 0,05-0,1%. Te kompozycje kosmetyczne zawierają zwykłe nośniki, środki pomocnicze i wzbogacające i/lub zapachowe.

Obecny wynalazek zostanie objaśniony i dokładniej zaprezentowany w następujących przykładach, które w żadnej mierze nie stanowią ograniczenia zakresu obecnego wynalazku.

Przykład l.Do kolbki wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w gorącej łaźni wodnej wprowadzono:

I,47 g (0,01 M) kwasu L-glutaminowego

0,84 g (0,01 M) NaHCOs

0,91 gD-glukozy

0,91 g galaktozy oraz

3,00 ml redestylowanej wody.

Mieszaninę ogrzewano do 80°C, przez co - korzystnie pod obniżonym ciśnieniem odparowano 50% wody i następnie pod ciśnieniem atmosferycznym ogrzewano do temperatury 80-85°C i w tej temperaturze utrzymywano przez 120 minut aż do wystąpienia pomarańczowego zabarwienia. Syropowaty, zatężony roztwór wodny odparowano następnie do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymany pomarańczowo-czerwony stały produkt reakcji oznaczono symbolem D-10 i zachowano do badań biologicznych.

Przykład 2. Do kolbki wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w gorącej łaźni wodnej wprowadzono:

1,33 g (0,01 M) kwasu L-asparaginowego

0,84 g (0,01 M) NaHCO₃

0,91 g D-glukozy

0,91 g galaktozy oraz

3,00 ml redestylowanej wody.

Mieszaninę ogrzewano do 80°C z jednoczesnym mieszaniem (poprzez obracanie), zatężono pod obniżonym ciśnieniem, przez co całkowita objętość 1,5 ml wody została odparowana, a następnie pod ciśnieniem atmosferycznym całość poddawano obróbce w temperaturze 80-85°C do wystąpienia jasno pomarańczowego zabarwienia.Nastąpiło to po upływie około 60 minut. Mieszanina reakcyjna była syropowatym, zatężonym roztworem wodnym. Następnie odparowana została do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Tak otrzymany produkt reakcji był suchym żółto-pomarańczowym proszkiem. Oznaczono go symbolem D-11 i zachowano do badań biologicznych.

Przykład 3. Do kolbki wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w gorącej łaźni wodnej wprowadzono:

1,05 g (0,01 M) kwasu L-seryny

0,91 g D-glukozy

0,91 g galaktozy oraz

2,50 ml redestylowanej wody.

Mieszaninę ogrzewano do 85-92°C z jednoczesnym mieszaniem (poprzez obracanie). Po 100 minutach roztwór nabrał zabarwienia pomarańczowego. Obniżono ciśnienie i mieszaninę odparowano do sucha. Produkt reakcji tworzył na ściankach kolbki pomarańczową przeźroczystą warstwę. Produkt reakcji zeskrobano i sproszkowano. Oznaczono go symbolem D-12 i zachowano do badań biologicznych.

Przykład 4. Do kolbki wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w gorącej łaźni wodnej wprowadzono:

0,66 g (0,005 M) kwasu D-asparaginowego

0,42 g (0,005 M) NaHCO₃

0,45 g D-glukozy

0,45 g galaktozy oraz

3.00 ml redestylowanej wody.

Mieszaninę ogrzewano do 80°C, odparowano - podciśnienie - odpędzając 1,5 ml wody i następnie - pod ciśnieniem atmosferycznym - poddano obróbce w temperaturze 85°C. Po 60 minutach ogrzewania wystąpiło pomarańczowe zabarwienie mieszaniny. Obniżono ciśnienie i otrzymany syropowaty, zatężony roztwór wodny odparowano do sucha. Zanim pozostałość stała się całkowicie sucha, dwukrotnie wprowadzono do kolbki 10 ml porcje bezwodnego etanolu i kontynuowano odparowywanie w celu usunięcia resztkowej wilgoci. Tak otrzymany suchy produkt reakcji sproszkowano, oznaczono symbolem D-13 i zachowano do badań biologicznych.

Przykład 5. W celu otrzymania - na drodze syntetycznej - odpowiednika biologicznie aktywnej frakcji pewnego ekstraktu z torfu naturalnego do kolbki wyparki rotacyjnej wprowadzono:

20,5 mg	L-seryny
35,8 mg	L-glicyny
35,8 mg	L-histydyny
132,0 mg	L-argininy
180,0 mg	L-alaniny
360,0 mg	L-proliny
216,0 mg	L-tyrozyny
160,0 mg	L-waliny
68,0 mg	L-izoleucyny
72,0 mg	L-leucyny

171 319

780,0 mg L-lizyny

2000,0 mg D-glukozy

1000,0 mg D-ksylozy

400,0 mg D-galaklozy

100,0 mg D-ramnozy

100,0 mg D-fn-klozy

6,0 ml wody -edestylowrnej.

Całość mieszano przez obracanie I ogrzewano pod obniżonym ciśnieniem przez 45 min. utrzymując wzrost temperami-y od 75°C do 86°C. W tym czasie oddestylowano około 3 ml wody, a substraty uległy całkowitemu rozpuszczeniu, Następnie mieszaninę poddawano obróbce przez 30 minut pod ciśnieniem atmosferycznym w temperaturze 85-86°C realizując przegrupowanie Amadoriego, W tym okresie roztwór szybko nabrał zabarwienia czerwono-brązowego, Obniżono ciśnienie i kontynuowano ogrzewanie w temperaturze 84°C odpędzając rozpuszczalnik, Przed końcem odparowywania dwukrotnie wprowadzono porcje 15 ml bezwodnego etanolu i odparowano mieszaninę do sucha, Kolbę z suchym produktem reakcji umieszczono w eksykatorze nad chlorkiem wapnia na 18 godzin, Następnie sproszkowano produkt reakcji, Otrzymano około 4,5 g sproszkowanego produktu i oznaczono go symbolem EK2-S,

Porcję 4 g tego produktu rozpuszczono w 20 ml destylowanej wody i wprowadzono na kolumnę chfomatogfa-iczną o wymiarach 25 mm x '330 mm, wypełnioną sorbentem Amberlite® XAD-2, analytical grade, Kolumnę eluowano wodą destylowaną z prędkością 0,4 ml/minutę, Zbierano frakcje o objętości 10 ml, do sumarycznej objętości 450 ml, Zawartość frakcji monitorowano chromatograficznie, Frakcje o kolejnych numerach 11-13 połączono i odparowano do suchapod obniżonym ciśnieniem, Frakcje te cechowała wysoka zawartość produktów przegrupowania Amadoriego (potwierdzona testem redukcji żelazicyjanku potasu), Produkt zachowano do badań biologicznych, oznaczając go symbolem EK2-S-11,

Badania biologiczne mające na celu oznaczenie aktywności biologicznej przeprowadzono używając immunizowanych myszy szczepu Balb/C obu płci, w wieku 8-10 tygodni, Immunizację myszy osiąga się przez dootrzewnowe podanie 0,2 ml 10% zawiesiny erytrocytów owcy (SRBC), to znaczy 6 x 10⁸ komórek, Erytrocyty uprzednio poddano utrwaleniu w sterylnym płynie Alsevera o następującym składzie:

glukoza - 2,05 g cytrynian sodu - 0,8 g chlorek sodu - 0,42g kwas cytrynowy - 0,055 g woda redystylowana do 100 ml,

Do tak przygotowanego roztworu Alsevera wprowadzono pobraną w jałowy sposób krew owcy w stosunku 1:1 całość pozostawia się na co najmniej trzy doby w temperaturze +4°C, Ustabilizowane w ten sposób erytrocyty dzieli się na próbki w sposób aseptyczny i próbki te wprowadza się do roztworu soli zbuforowanych fosforanami (PBS) celem opłukania, Erytrocyty płucze się w PBS dwukrotnie i odwirowuje się przez 10 minut przy 2000 obrotów/minutę, Z tak przemytych erytrocytów sporządza się 10% zawiesinę w PBS, Zawiesina ta stosowana jest do immunizacji myszy,

Badany produkt reakcji podawano dootrzewnowo (i,p,) lub doustnie (p,o,) czterokrotnie w wybranych dawkach, Pierwszą dawkę podaje się 2 godziny przed immunizacją myszy SRBC, a kolejne trzy dawki oddaje się po immunizacji w odstępach 24-godzInnych, Każdą z grup zwierząt doświdczalnych traktowano inną dawką badanych produktów reakcji: 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0,1 mg/kg i 0,01 mg/kg, Kontrolna grupa zwierząt była także immunizowana SRBC, lecz zamiast dawek substancji badanych zwierzętom tym podawano, w tych samych interwałach czasowych, 0,2 ml PBS/mysz,

Każda grupa zwierząt, zarówno doświadczalna jak i kontrolna, we wszystkich doświadczeniach liczyła 8-12 myszy,

W czwartym lub dziesiątym dniu (oznaczanie przeciwciał typu 7S) po immunizacji myszy lekko usypiano eterem i skrwawiano przez ekstyrpację gałki ocznej, Wypływającą krew zbierano do probówki. Następnie, po przerwaniu rdzenia, pobierano śledzionę. Krew służyła do otrzymania surowicy do oznaczenia przeciwciał hamaglutynacyjnych typu 19S+7S i 7S, natomiast ze śledziony uzyskiwano komórki służące do określenia odsetka rozet E i aktywności hemolitycznej. W tym celu śledziony myszy rozdrabniano. Uzyskane splenocyty zawieszano w około 2 ml płynu Hanksa o temperaturze +4°C, nawarstwiano na mieszanin E Ficoll-Uropolin o gęstości 1,077, a następnie wirowano przez 15 minut przy 3000 obr./min. w temperaturze +4°C. Po odwirowaniu interfazy kożuszek splenocytów przenoszono do płynu Hanksa o temperaturze +4°C i dwukrotnie płukano przez wirowanie 7-10 minut przy 1800 obrotach na minutę. Następnie sporządzano zawiesinę splenocytów w płynie Hanksa w takiej ilości, ze w 1 ml płynu Hanksa jest 1x10⁶ komórek.

Dla każdej próby określa się procent splenocytów martwych przez zabarwienie kropli badanej zawiesiny splenocytów kroplą wykonanego ex tempore barwnika składającego się z 4 części 0,2% błękitu trypanu i 1 części 4,25% roztworu NaCl. Pod mikroskopem ustala się odsetek splenocytów martwych (na każde 100 komórek). Komórki martwe są granatowe, podczas gdy komórki błyszczące są komórkami żywymi. Obecność w próbce komórek martwych w ilości powyżej 10% jest krytyczna; taka próba musi być wyeliminowana z dalszych badań.

Wszystkie czynności z komórkami wytypowanymi do badań powinno się przeprowadzać sterylnym silikonowym szkle laboratoryjnym umieszczonym w kąpieli lodowej.

Przykład 6. W pierwszym teście biologicznym ustalono wpływ substancji badanych na ilość komórek produkujących przeciwciała hemolityczne (PFC-IgM). Test przeprowadzono w następujący sposób: Do 0,5 ml 0,5% roztworu agarozy umieszczonego w probówce w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 45°C dodawano 0,1 ml 10% zawiesiny SRBC (przygotowanej w wyżej podany sposób). Następnie dodawano 0,1 ml zawiesiny splenocytów o gęstości 1x106, całość szybko mieszano i wylewano na szkiełka podstawowe, uprzednio naagarozowane. Szkiełka inkubuje się w cieplarce o temperaturze 37°C przez 2 godziny. Następnie próby zalewa się komplementem świnki morskiej rozcieńczonym 1:20 na kolejne dwie godziny. Po inkubacji badanych prób z komplementem odczytuje się ilość komórek tworzących łysinki (PFC) i przelicza na 1x106 splenocytów. Każdą próbę wykonywano dwukrotnie.

Najsilniejsze działanie potęgujące odpowiedź na SRBC, wyrażające się wzrostem ilości splenocytów produkujących hemolizyny IgM (PFC) obserwowano po podaniu substancji D-11 w dawce 0,1 mg/kg; amplifikacja wynosiła 119%. Przy dziesięciokrotnym zwiększeniu dawki dobowej do 1 mg/kg, amplifikacja odpowiedzi uległa zmniejszeniu do 53%.

Produkt reakcji D-12 wykazywał najsilniejszą aktywność - wzrost o 58% - przy dawce 1,0 mg/kg.

Produkt reakcji EK 2-S-11 w tym teście wykazywał najsilniejsze działanie przydawce 0,1 mg/kg (wzrost o 65%). Przy dziesięciokrotnie większej dawce, to jest 1,0 mg/kg wzrost jest zmniejszony nieznacznie, tj. do 52%.

Produkt reakcji EK2-S-11 wykazywał najsilniejszą aktywność w tym teście. W dawce 0,1 mg/kg zwiększał miano IgM 4,3 raza, a w dawce 1 mg/kg - 3,5 raza.

Produkt reakcji D-13 w dawce 1 mg/kg wykazywał 3-krotne podwyższenie miana IgM, a w dawce dziesięciokrotnie wyższej - 1,5-krotne.

B. Oznaczenie miana przeciwciał typu 7S-IgG

Badane inaktywowane surowice połączono w stosunku 1:1 z 0,1 m roztworem 2-merkaptoetanolu i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C. Pod wpływem 2-merkaptoetanolu dochodzi do zniszczenia immunoglobulin typu 19S (IgM), natomiast immunoglobuliny 7S (IgS) są niewrażliwe na działanie 2-merkaptoetanolu. Po 30 minutach inkubacji reakcję redukcji przerywa się przez ochłodzenie do temperatury +4°C przez 15 minut. Następnie sporządza się szereg rozcieńczeń jak przy oznaczaniu miana przeciwciał typu 19S, łączy się te rozcieńczone roztwory z 1% zawiesiną SRBC 1 po 2 godzinach inkubacji w 37°C umieszcza się próby w temperaturze +4°C. Wyniki odczytuj się na drugi dzień przyjmując kryteria określania miana hemaglutynacji jak powyżej. Równolegle przeprowadza się ślepą próbę z kombinacją 1% zawiesiny SRBC z PBS w stosunku 1:1.

171 319

Gdy badano substancję D-11 w sposób wyżej opisany, w dawce 1 mg/kg wykazywała ona spotęgowane 3,16-krotnie wytwarzanie przeciwciał IgG. W dawce 10 mg/kg wzrost wyniósł 2,2 raza.

Produkt reakcji D-12 badany w dawce 0,1 mg/kg i 1 mg/kg odpowiednio stymulował wytwarzanie przeciwciał IgF 1,3 raza, a w dawce 10 mg 1,5 raza.

Produkt reakcji EK2-S-11 w dawce 0,1 mg/kg stymuluje wytwarzanie IgG 1,9 raza, a w dawce 1 mg/kg 2,89 razy (w porównaniu z próbką kontrolną).

Wyniki testów A i B uzyskiwane dla każdej szarży produkcyjnej lub dla każdej frakcji biologicznie czynnych produktów reakcji syntezowanych sposobem według wynalazku, zdolnych do powodowania odpowiedzi immunologicznej, poddano analizie statystycznej metodą T-studenta, a=0,05. Wyniki otrzymane dla każdej badanej dawki porównywano z wynikami równolegle prowadzonej próby kontrolnej. Stwierdzono podwyższenie aktywności biologicznej.

Przykład 8. Grupę biologicznie czynnych produktów reakcji otrzymanych według przykładów 1 do 5 poddano próbom biologicznym, w których oznaczano procent splenocytów tworzących rozety E.

250 μΐ 1% zawiesins SBB C i 250 μ! komórekjak ie mają być przedmiotem badania w stężeniu 1x10⁶ komórek/ml wprowadzono do 550 0 pożywki Hanksa. Każdą taką próbkę inkubowano w gorącej kąpieli wodnej wyposażonej w wytrząsacz przez 15 minut w temperaturze 37°B. Następnie próbkę przechowywano w temperaturze +4°B przez dalszych 20 godzin. Procent splenocytów tworzących rozety E z SRBB ustalano po zabarwieniu zawiesiny 1 do 3 kroplami fioletu krystalicznego.

Każdą próbkę poddawano ustaleniu procentu splenocytów trzy razy, zliczając za każdym razem 400 splenocytów. Splenocyt otoczony co najmniej 3 erytrocytami uważany był za rozetę E. Do oceny statystycznej procentowy wzrost ilości splenocytów z rozetami E porównywano zarówno pomiędzy substancjami badanymi jak i z grupą kontrolną W tym teście najsilniejszy efekt stymulujący zaobserwowano w przypadku produktu reakcji D-11 (63%) i EK2-S-11 (70%) w dawce 1 mg/kg. W dawce dziesięciokrotnie niższej, to jest 0,1 mg/kg wartości te uległy obniżeniu odpowiednio do 45% i 57%.

Produkt reakcji D-12 w dawce 1 mg/kg powodował wzrost zdolności tworzenia rozet 22% w porównaniu do grupy kontrolnej. Odpowiednia wartość dla dawki dziesięciokrotnie mniejszej, to jest 0,1 mg/kg wynosiła 29%.

Produkt reakcji D-13 wykazywał maksymalny efekt w dawce 1 mg/kg (58%) a w wyższych dawkach nico mniejszy.

Biologiczna aktywność zsyniezowasych związków oceniana była według następują cych prób:

1. Próba na oznaczanie procentu splenocytów tworzących rozety E, prowadzona według Bach’a i Da^enne^ (Bell. Immunol. 3,1-16, 1972).

2. Próba na oznaczenie ilości komórek produkujących hómolityczsó przeciwciała typu IgM, prowadzona metodą Jerne’a, według modyfikacji MishelFa i Dutton^ (J. Exp. Med. 126, 423-442, 1967) oraz

3. Próba na oznaczanie miana przeciwciał hemaglutynacyjnych 19S+7S i 7S, prowadzona metodą hemogluty nacji czynnej według Adlera (J. Immunol. 95,26-38,39-47,1965) przy użyciu mikropłytek (I. Immunopharmacol. 4,43-52, 1982).

Przykład 9. Do kolbki wyparki rotacyjnej, zanurzonej w gorącej łaźni wodnej wprowadzono:

1,33 g (0,01 M) kwasu iLiaspuragiiKowe^o

0,84 g (0,01 M) NaHBOs

10,91 g dekstranu hydrolizowanego, o średnim ciężarze cząsteczkowym 3000 daltonów oraz

10,00 mli dcsyylowaiiej wody.

Mieszaninę ogrzewano pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 70°B do całkowitego rozpuszczenia substancji stałych, usuwając jednocześnie w tym czasie przez odparowanie około 3 ml wody (czas ogrzewania wynosił około 30 minut). Kolbkę z roztworem, pod luźnym przykryciem umieszczono w sterylizatorze parowym i ogrzewano pod ciśnieniem w temperaturze 121°C przez 40 minut. Po oziębieniu otrzymany żółto-pomarańczowy roztwór rozcieńczono 15 ml wody, sklarowano przez odwirowanie i wysuszono rozpylowo przy temperaturze wlotowej powietrza +160°C i temperaturze powietrza wylotowego +85°C. Otrzymano 10,5 g jasno beżowego produktu łatwo rozpuszczalnego w wodzie.

Obecność produktów przegrupowania Amadoriego w tak otrzymanym produkcie reakcji potwierdzona została testem redukcji żelazicyjanku potasowego, opisanym przez Borsook, Abrams i Łowy, w J. Biol..Chem. 215, (1955), 111-124 oraz metodami chromatograficznymi.

Badania biologiczne opisane w poprzedzających przykładach potwierdziły działanie immunotropowe wyżej otrzymanego produktu, podobne do aktywności preparatów otrzymanych w reakcji z cukrami prostymi.

Przykład 10. W kolbce stożkowej umieszczono.

5,0 g dekstranu hydrolizowanego o średnim ciężarze cząsteczkowym około 5000 daltonów,

1.1 g L-proliny oraz

4,0 g wody redestylowanej.

Zawartość kolbki rozpuszczono przez mieszanie. Jednorodną mieszaninę tak otrzymaną umieszczono w sterylizatorze parowym i ogrzewano pod ciśnieniem w temperaturze 110°C przez 40 minut. Otrzymany przeźroczysty pomarańczowy roztwór rozcieńczono 20 ml wody redestylowanej i sklarowano przez odwirowanie. Klarowny roztwór poddano suszeniu rozpłowemu. Otrzymano 5,3 g produktu reakcji łatwo rozpuszczalnego w wodzie. Aktywność immmunotropowa zbliżona była do aktywności obserwowanej w doświadczeniach opisanych w poprzednich przykładach.

Przykład 11. Konwencjonalne metody badają aktywność biologiczną na myszach a nie na ludziach. Z tego względu wprowadzono nowe testy biologiczne, w których można oznaczać ilość i aktywność cytokin uwalnianych przez ludzkie leukocyty krwi obwodowej (PBL) poddane działaniu produktów reakcji otrzymanych w przykładach 1 do 5 oraz 9 i 10. Cytokiny są białkami hormonopodobnymi, odgrywającymi ważną rolę w praktycznie wszystkich reakcjach immunologicznych jak i w procesach regulacyjnych odpowiedzialnych za utrzymanie homeostazy.

Oznaczanie cytotoksyczności.

Cytotoksyczność produktów reakcji oznaczano stosując linię ludzkich komórek nowotworowych adenocarcinoma A549 (z American Type Culture Collection ATCC CCL 185).Monowarstwy komórek trypsynizowano; zawiesiny 2xl0⁵ komórek/ml w minimalnej pożywce podstawowej Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) z 10% surowice cielęcej (CS), zmieszano z różnymi dawkami badanych leków, zaszczepiono na plastikowych mikropłytkach i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Dawka CD50 odpowiadała minimalnemu stężeniu badanego związku, który powodował uszkodzenie około 50% hodowli komórkowej, co mierzono zabarwiając hodowlę 0,015% roztworem czerwieni neutralnej w DMEM.

Indukcja cytokin

Kozuszki od zdrowych dawców krwi mogą być uzyskane z regionalnych stacji krwiodawstwa. Erytrocyty lizuje się przez działanie NHąCl według Cantella et al. (Cantell, K., Hiibonen, S., Kauppinen, H.L.: Production and Partial Purification of Human Immune Interferon. Meth. Enzymol. 119, 54, 1986). Stosowano leukocyty od jednego dawcy, zawierające około 8x10⁶ leukocytów/ml w pożywce RPMI-1640, suplementowanej 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), L-glutaminą i antybiotykami. Wszystkie partie FBS uprzednio badano. Do hodowli PBL stosowano tylko niemitogenne FBS. Induktory cytokin dodawano do 1 ml porcji hodowli. Referencyjnymi induktorami cytokin były fitohemaglutynina (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Szwecja) i LPS z E. coli 0111 :B4 (Difco Laboratories). Indukowane hodowle PBL inkubowano przez 20 godzin w atmosferze powietrza z 5% CO2 w 37°C 1 wirowano. Supernatanty przechowywano w 4°C i oznaczano aktywność TNF i IFN w ciągu 1 tygodnia.

Oznaczanie interferonu

Zlane monowarstwy komórek A549 przygotowano na mikropłytkach w minimalnej pożywce podstawowej zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) z 10% FBS, L-glutaminą i antybiotykami (penicylina 100 jednostek/ml i streptomycyna 100 pg/ml). Próbki IFN rozcieńczano na płytkach i dodawano do monowarstwy komórek i inkubowano w 37^UC przez 20 godzin w atmosferze powietrza z 5% CO 2. Następnie komórki przemywano i poddawano prowokacji wirusem zapalenia mięśnia sercowego (EMCV). Miano IFN zdefiniowano jako rozcieńczenie próbki IFN, powodujące zmniejszenie efektu cytopatogenicznego wirusa o 50% po 48 godzinach inkubacji Do pomiaru zabijania komórek w skanerze ELISA stosowano metodę MTT (bromek 3-[4,S-dimetylotiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolium) (Hansen, M.B., Nielsen, S.E. i Berg K.: Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth/Cell Kill, J. Immunol. Meth. 1989, 1I9, 203-210). We wszystkich oznaczeniach musiały być stosowane wzorce laboratoryjne IFN, to jest rekombinacyjny ludzki IFN-γ (Gencntech Inc, USA, aktywność właściwa 2x 10^sjednostek/mg), naturalny ludzki leukocytowy IFN-et (xxl6I IU/m li i IFN - y(XxWI IU/ml) otrzyman y dd Dr K. Cantell’a, Heisikki, Finlandia.

Oznaczanie TNF

Aktywność cytotoksyczną TNF mierzono w komórkach L929 według Flicka i Gifforda (Flick, D.A., Gifford, G. E.: Comparison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumour Necrosis Factor, J. Immunol. Meth. 68, 1667, I984).

Do monowarstowych hodowli komórkowych dodawano próbki i roztwór cktynomycynz D. Po inkubacji przez 20 godzin w 37°C oznaczano efekty cztotokszczne TNF stosując barwienie fioletem krystalicznym. Ilość powodującą destrukcję około 50% hodowli komórkowej definiowano jako jedną jednostkę aktywności TNF. Porównanie z preparatem TNF-α (Genentech Inc., USA) wykazało, że 1 jednostka w tych oznaczeniach była równoważna 100-200 pg/ml TNF.

Oznaczanie cytokin technikami neutralizacji

Stosowano następujące przeciwsurowice: królicza surowica anty-ludzki TNF-α, partia 2958-40 1 królicza surowica aatz-lunzki IFN-γ, partia 2891-56 (Genentech Inc., USA), owcza surowica anty-ludzki INF-α, β i owcza surowica anty-ludzki IFN- (otrzzmaaz od Dr K. CantelTa, Helsinki, Finlandia). Preparaty zawierające cztokiaz zadawano surowicami rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w pożywce hodowlanej 1 inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie oznaczano w sposób opisany wyżej resztkową aktywność IFN lub TNF.

W badaniach wykorzystano pięć różnych porcji (Li do L5) PBL otrzymanych z krwi zdrowych dawców krwi. Stwierdzono, że optymalne stężenie PBL w prowadzonych oznaczeniach wynosi 8xI0⁶ komórek/ml pożywki (RPMI 1640 suplementownej 10% płodowej surowicy cielęcej i antybiotykami).

Po inkubacji ludzkich PBL z nowymi produktami reakcji I-XI (Tabela 1) stwierdzono indukcję IFN i TNF. Zaobserwowane odpowiedzi były zależne od dawki badanych związków w granicach 3-100 pg/ml (Tabela 2). Związki stosowane w podanych stężeniach były nietoksyczne. We wszystkich oznaczeniach biologicznych stosowano pozytywną i negatywną kontrolę. W negatywnej próbie kontrolnej mierzono ilość cytokin (IFN i TNF) produkowanych spontanicznie, bez dodatku jakiegokolwiek zewnętrznego stymulanta. W pozytywnej próbie kontrolnej oznaczano ilość cytokin wytwarzanych w odpowiedzi na znany induktor referencyjny, w obecnych doświadczeniach stosowano fitohemcglutyaiaę (PHA, Pharmacia, Szwecja, 10 pg/ml).

Należy podkreślić, że indukcja cytokia w kulturach ludzkich PBL. otrzymanych od różnych dawców zwykle przebiega w sposób zróżnicowany pod względem wyników. Zjawisko to można wyjaśnić zróżnicowaniem genetycznym populacji ludzkiej. Ponadto w kulturach PBL często obserwuje się spontaniczną produkcję IFN i TNF. Innymi słowy, wśród zdrowych dawców PBL wyróżnić można jednostki z silną odpowiedzią, słabą odpowiedzią a nawet jednostki mereagujące (bez podpowiedzi).

Niezależnie od ograniczeń przedstawionych powyżej, wyniki przeprowadzonych badań biologicznych wykazują, że PBL (Li do L5) zadawane produktami reakcji (I-XI), produkują IFN i/lub TNF w ilościach nadających się do oznaczenia ilościowego.

171 319

W przypadku hodowli Li zawierających leukocyty dawcy o silnej odpowiedzi immunologicznej, stwierdzono, że produkt reakcji II ( zawierający formę L kwasu asparaginowego) jest wyraźnie aktywniej szyj ako induktor cytokin niż produkt reakcji III (zawierający formę D kwasu asparaginowego, która jest także droższa o dwa rzędy wielkości ). Obserwacja ta ma duze znaczenie, poniważ formy L aminokwasów rozpoznawane są przez komórki jako naturalne substraty reakcji biochemicznych. Ponadto dla'wyrażenia aktywności biologicznej produktów reakcji, część aminokwasowa tych produktów jest znacznie bardziej istotna niż część pochodząca od cukru. W miejsce cukrów prostych mogą być użyte polisacharydy - korzystnie o niskim ciężarze cząsteczkowym, zwłaszcza poniżej 1000 daltonów - takie jak dekstrany (produkty reakcji X-XI), a reakcja zachodzi podobnie. I vice versa, polisacharydy zawierające reszty aminokwasowe mogą przejawiać aktywność biologiczną, a aktywność ta zachowywana jest gdy ulegają one dekompozycji do oligosacharydów z wbudowanymi resztami aminokwasowymi (dane nieuwidocznione).

Podobne wyniki można też obserwować gdy w miejsce prostego aminokwasu stosuje się krótki peptyd; taki produkt stymuluje leukocyty do wytwarzania cytokin (dane nieuwidocznione).

Siedem różnych szarż nierozfrakcjonowanego PTT badanych przy użyciu ponad 100 hodowli PBL od różnych dawców krwi powodowało wytwarzanie od 10 do 1000 jednostek IFN/ml oraz od 9 do 750 jednostek TNF/ml. Frakcja EK2-S otrzymana z mieszaniny substratów odpowiadającej swym składem ekstraktom z torfu naturalnego (przykład 5) badana była przy użyciu 8 hodowli PBL od ośmiu różnych dawców krwi. Stwierdzono, że jest ona najaktywniejszym produktem powodującym indukcję zarówno IFN jak i TNF (dane nieuwidocznione).

Możliwe jest zastosowanie produktów reakcji jako immunomodulatorów i aktywność taka okazała się klinicznie przydatna. Regeneracja tkanek jest innym udokumentowanym efektem oddziaływania. Zaobserwowano także działanie przeciw-nowotworowe, prawdopodobnie związane z pojawianiem się inkubowanego interferonu i czynnika nekrozy nowotworów. Odnotowano też działanie przeciwwirusowe.

Produkty reakcji podaje się zasadniczo doustnie, chociaż pozajelitowe podawanie jest także możliwe, w tym podawanie zewnętrzne. Produkty okazują się stosukowo trwałe.

Tabela 1

Lista produktów reakcji

No	Substraty
I(D-10)	kwas L-glutaminowy, glukoza, galaktoza
II (D-11)	kwas L-asparaginowy, glukoza, galaktoza
m (D-13)	kwas D-asparaginowy, glukoza, galaktoza
IV (D-12)	L-seryna, glukoza, galaktoza
V	EK2-S (frakcje 11-13)
VI	EK2-S (frakcje 6-7)
VII	EK2-S (frakcje 8-10)
VIII	EK2-S (frakcje 28-34)
IX	L-prolina, glukoza
X	kwas L-asparaginowy + dekstran (odmiana 1)
XI	kwas L-asparaginowy + dekstran (odmiana 2)

Przykład 12. Preparaty farmaceutyczne zawierające jako składnik aktywny produkty reakcji otrzymane jak w przykładach 1 do 5 oraz 9 110 przygotowano stosując następujące produkty:

171 319

A. Tabletki/Granulki:

5.0 g - produktu reakcji otrzymanego według przykładu 1 lub przykładu 10 (substancja aktywna),

444.0 g - farmaceutycznie dopuszczalnej laktozy,

1.0 g -~środka poślizgowego (n p. MMVATEX®, prpdodt firmy εastman κ odak).

Składniki zmieszano i ogranulowano w znany sposób z dodatkiem 30% wodnego roztworu etanolu, a następnie wysuszono w temperaturze 40°C. Granulat wykorzystano do przygotowania kapsułek, z których każda zawierała około 450 mg granulatu, to jest 5 mg substancji aktywnej. Alternatywnie, granulat wykorzystano do wytwarzania tabletek, z których każda miała masę około 450 mg i zawierała 5 mg substancji aktywnej.

B. Podobnie w znany sposób, substancje aktywne otrzymane zgodnie z poprzedzającymi przykładami 1 do 5 oraz 9 i 10 sformułowano w inne preparaty farmaceutyczne stosując odpowiednie nośniki.

Tabela 2

Biologiczna aktywność produktów reakcji 1-XI badana w hodowlach ludzkich leukocytów PBL

	dawka gg/m	IFNjednostki/ml	TNFjednostki/ml
L1	L2	L3	L4	U	L1	L2	L3	l4	U
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Kontrola	-	10	<10	<10	20	<10	80	9	27	27	<9
PHA	10	100	30	30	60	100	250	80	250	250	250
I	100	100	<10	<10	20	-	250	9	9	160	-
	30	-	-	-	30	-	-	-	-	500	-
	10	30	<10	<10	30	-	80	9	18	160	-
	3	-	-	-	10	-			-	160	-
II	100	100	10	<10	10	<10	250	18	18	250	<9
	30	-	-	-	10	<10	-	-	-	250	<9
	10	1000	10	30	10	10	250	50	27	250	<9
	3	-	-	-	10	<10	-	-	-	160	<9
m	100	<10	<10	10	10	<10	250	9	18	250	<9
	30	-	-	-	30	<10	-	-	-	250	<9
	10	<10	<10	<10	10	<10	80	27	18	250	<9
	3	-	-	-	10	<10	-	-	-	80	<9
IV	100	<10	10	10	20	<10	80	60	9	160	<9
	30	-	-	-	20	<10	-	-	-	27	<9
	10	<10	30	,10	20	<10	80	50	18	80	<9
	3	-	-	-	20	<10	-	-	-	80	<9

171 319

Tabela 2 (ciąg dalszy)

1	2	3	4 r	5	6	—7 r	8	9	10	n	T2
V	100	30	<10	<10	60	-	80	50	18	250	-
	30	-	-	-	60	-	-	-	-	80	-
	10	<10	<10	<10	10	-	80	27	9	80	-
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	80	-
			-j.			1				L
VI	100	<10	<10	<10	20	-	80	27	18	80	-
	30	-	-	-	10	-	-	-	-	80	-
	10	10	<10	<10	20	-	50	27	18	160	-
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	250	-
VII	100	<10	<10	<10	-	-	80	27	27	-	-
	30	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	10	10	<10	<10	-	-	80	27	27	-	-
	3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
VIII	100	<10	<10	<10	-	-	80	160	27	-	-
	30	-	-	-	-	-	-	-	-	-	_ 1
	10	<10	<10	<10	-	-	750	80	27	-	-
	3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
IX	100	10	<10	<10	10	-	27	27	18	80	-
	30		-	-	20	-	-	-	-	80	-
	10	100	30	<10	20	-	80	27	18	80	-
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	50	-
X	100	100	<10	20	20	-	27	27	18	250	-
	30	-	-	-	30	-	-	-	-	80	-
	10	<10	10	<10	30	-	18	50	27	50	-
	3	-	-	-	30	-	-	-	-	250	-
XI	100	<10	10	<10	30	-	18	27	27	50	-
	30	-	-	-	10	-	-	-	-	250	-
	10	<10	30	<10	10	-	18	80	80	80	-
	3	-	-	-	20	-	-	-	-	750	-

171 319

Substancje aktywne otrzymane według poprzedzających przykładów 1 do 5 oraz 9 i 10 zastosowane zostały jako dobroczynny dodatek do kompozycji kosmetycznych przeznaczonych do codziennej pielęgnacji włosów i ciała, w których zawartość tych substancji zawierała się w granicach od 0 01 do 10% wagowych w zależności od tynu kompozycji, sposobu i częstotliwości stosowania przewidywanego określonego typu preparatu kosmetycznego.

Claims (18)

1 Sposób wytwarzania kompozycji przydatnej do użytku farmaceutycznego i/lub kosmetycznego, zdolnej do stymulowania układu immunologicznego u ludzi i ssaków i zawierającej co najmniej jeden związek po przegrupowaniu Amadonego, o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym R1 oznacza rodnik 1-dezoksy-2-ketozowy pochodzący od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R 2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy, znamienny tym, że prowadzi się reakcję kilku różnych aminokwasów lub peptydów z jednym cukrem prostym, oligo- lub polisacharydem, albo jednego aminokwasu lub peptydu i kilku cukrów prostych, oligo- lub polisacharydów lub też dowolnej ich kombinacji, w środowisku wodnym w podwyższonej temperaturze około 70 do 121°C, aż do momentu - korzystnie przez około 30 do 120 minut, w którym otrzymane produkty uległy przegrupowaniu Amadoriego i przerywa się reakcję gdy przegrupowanie dobiega końca, co ustala się stosując test redukcji żelazicyjanku i/lub na podstawie obserwacji zmiany koloru mieszaniny reakcyjnej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w obecności pierwiastków śladowych występujących w ekstraktach z naturalnego torfu i ewentualnie pod ciśnieniem i/lub w obecności nizszego alkoholu, przy czym korzystny stosunek molowy cukrów i/lub sacharydów do aminokwasów i/lub peptydów wynosi od 2:1 do 1:1, korzystnie 1,5:1.

3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że mieszaninę reakcyjną suszy się i/lub poddaje oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej, zbierając specyficzne frakcje powodujące redukcję żelazicyjanku potasu.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cukry i/lub sacharydy o niskim cięzarze cząsteczkowym z jednej strony i/lub aminokwasy i/lub peptydy o niskim ciężarze cząsteczkowym z drugiej strony, oraz ewentualnie nieorganiczne pierwiastki śladowe, wprowadza się do reakcji zasadniczo w takim samym składzie i/lub zasadniczo w tych samych stosunkach wagowych jakie występują w ekstraktach z naturalnego torfu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jeden aminokwas ma dwie grupy karboksylowe a reakcję prowadzi się w obecności soli buforującej, korzystnie kwaśnego węglanu sodu w stosunku molowym do aminokwasu 1:1.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję cukru/cukrów i/lub sacharydu/sacharydów z aminokwasem/aminokwasami i/lub peprydem/peptydami prowadzi się w stężonym roztworze wodnym, korzystnie o stężeniu około 0,67 do około 2,75 części wagowych substancji stałych na 1 część wagową wodnego rozpuszczalnika a następujące po niej przegrupowanie Amadoriego prowadzi się z jednoczesnym lub następczym usuwaniem wodnego rozpuszczalnika aż do momentu w którym mieszanina reakcyjna nabiera koloru jasno pomarańczowego.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do kompozycji dodaje się co najmniej jedną dodatkową substancję: farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik 1 ewentualnie substancję pomocniczą i/lub środek poślizgowy, przy stosunku wagowym co najmniej jednego wskazanego związku po przegrupowaniu Amadoriego do tej substancji zawartym w granicach od 1:1 do 1:100, korzystnie 1:8 do 1:20 a najkorzystniej około 1:9.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do kompozycji dodaje się co najmniej jedną dodatkową substancję: farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik i ewentualnie substancję pomocniczą i/lub środek poślizgowy, w takiej ilości, że co najmniej jeden wskazany związek po przegrupowaniu Amadoriego jest zawarty w tej otrzymanej mieszaninie w ilości 0,01-10% wagowych, korzystnie 0,01-1% wagowych, najkorzystniej 0,05-0.10% wagowych.

171 319

9. Sposób według zastrz. 7 lub 8, znamienny tym, że dodaje się środek poślizgowy, przy czym środek poślizgowy dodaje się do kompozycji wraz z laktozą, a stosunek wagowy laktozy do środka poślizgowego zawiera się pomiędzy 20:1 a 100:1, korzystnie 50:1.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosując odpowiedni związek wyjściowy w formie D wytwarza się związek aktywny, w którym rodnik cukrowy korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej rodnik glukozowy, ksylozowy, galaktozowy, ramnozowy, fruktozowy, mannozowy, 2-dezoksyglukozowy, 6-dezoksy glukozowy, glukozoaminowy, galaktozoaminowy.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosując odpowiedni związek wyjściowy w formie L wytwarza się związek aktywny, w którym rodnik aminokwasowy korzystnie wybrany jest z grupy obejmującej rodnik serynowy, glicynowy, prolinowy, histydynowy, argininowy, alaninowy, pochodzący z kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, fenyloalaninowy, treoninowy, cysteinowy, cystynowy, glutaminowy, asparaginowy, metioninowy, tyrozynowy, hydroksyprolinowy, tryptofanowy, walinowy, izoleucynowy, lizynowy, leucynowy.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosując odpowiednie związki wyjściowe wytwarza się związek aktywny, w którym rodniki oligo- lub polisacharydowy i/lub peptydowy mają niski ciężar cząsteczkowy, zwłaszcza mniejszy niż 1000 daltonów.

13. Preparat kosmetyczny posiadający zdolność stymulowania systemu immunologicznego ludzi i ssaków, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie i/lub kosmetycznie dopuszczalny nośnik i/lub dalszy dodatek i co najmniej jeden związek po przegrupowaniu Amadonego o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym R1 oznacza rodnik 1 -dezoksy2-ketozowy pochodzący od cukru, oligo- lub polisacharydu, a R2 oznacza rodnik aminokwasowy lub peptydowy.

14. Preparat według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera wskazaną substancję aktywną, w której rodniki oligo- lub polisacharydowe i/lub peptydowe mają niski ciężar cząsteczkowy, zwłaszcza mniejszy niż 1000 daltonów.

15. Preparat według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że zawiera różne związki przegrupowania Amadoriego otrzymane z kilku różnych aminokwasów lub niskocząsteczkowych peptydów i z jednego cukru prostego, oligo- lub polisacharydu, albo z jednego aminokwasu lub peptydu i kilku cukrów prostych, oligo- lub polisacharydów lub też z dowolnej ich kombinacji, korzystnie zasadniczo w takim samym składzie i/lub zasadniczo w tych samych stosunkach wagowych jakie występują w ekstraktach z naturalnego torfu i ewentualnie dodatkowo zawiera nieorganiczne pierwiastki śladowe występujące w takich ekstraktach.

16. Preparat według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera substancję aktywną, w której rodnik cukrowy korzystnie ma formę D i wybrany jest z grupy obejmującej rodnik glukozowy, ksylozowy, galaktozowy, ramnozowy, fruktozowy, mannozowy, 2-dezoksyglukozowy, 6-dezoksyglukozowy, glukozoaminowy, galaktozoaminowy.

17. Preparat według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera substancję aktywną, w której rodnik aminokasowy korzystnie ma formę L i wybrany jest z grupy obejmującej rodnik serynowy, glicynowy, prolinowy, histydynowy, argininowy, alaninowy, pochodzący z kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, fenyloalaninowy, treoninowy, cysteinowy, cystynowy, glutaminowy, asparaginowy, metioninowy, tyrozynowy, hydroksyprolinowy, tryptofanowy, walinowy, izoleucynowy, lizynowy, leucynowy.

18. Preparat według zastrz. 13, znamienny tym, że wytworzony jest sposobem według zastrzezeń 1-12.