SU1734758A1

SU1734758A1 - Способ регул ции биосинтеза белка в растении

Info

Publication number: SU1734758A1
Application number: SU894770320A
Authority: SU
Inventors: Наиля Назибовна Максютова; Татьяна Борисовна Мартынова; Светлана Исмаиловна Панкратова
Original assignee: Казанский институт биологии
Priority date: 1989-12-26
Filing date: 1989-12-26
Publication date: 1992-05-23

Abstract

Изобретение относитс к физиологии растений и к биохимии, в частности к способам ингибировани и стимулировани биосинтеза белка в растени. Сущность изобретени : дл ингибировани биосинтеза используют раствор белка, выделенного из экскретов личинок Aphrophora costalis Mats, в концентрации 17-10 2-17. мг/мл. Дл стимулировани биосинтеза берут раствор того же белка в концентрации 34-10 4- 34«10 6 мг/мл. 2 ил., 4 табл.

Description

Изобретение относитс к физиологии растений и к биохимии, а именно к способам регул ции биосинтеза белка в растении.

В насто щее врем к вопросам регул ции различных метаболических процессов в растительных клетках, в частности синтезу белка, удел етс большое внимание. Регул ци биосинтеза осуществл етс торможением или стимулированием отдельных этапов синтеза белка, поэтому важен поиск новых регул торов.

Из научной литературы известно физиологически активное соединение интерферон человека, вл ющийс полипептидом и стимулирующим синтез белка в листь х пшеницы. При увеличении концентрации интерферона происходит снижение эффективности синтеза белков в растении (Вли ние интерферона человека и (2-5)

олигоаденилатов на синтез белков в ткан х растений. Каплан И.Б., Малышенко С.И. и др. ДАН СССР, 1987, т. 297, № 4, стр. 1018).

Известен фузикокцин - токсин гриба Fusicoccum, обладающий стимулирующим действием на синтез РНК и белка (Вли ние фузикокцина на синтез РНК в листь х чмен in vivo и in vitro. Новикова Г.В., Д.Г. Муромцева, Романенко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Кулаева О.Н. Физиологи растений, 1987, 34, вып. 6, стр. 1121-1127.

Известно, что абсцизова кислота, фи- тогормон, вл юща с природным ингибитором , в зависимости от физиологического состо ни растени нар ду с ингибировани- ем может стимулировать синтез белка, (Вли ние абсцизовой кислоты на синтез РНК и активность РНК полимераз в листь х чмен . Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Курое А Ј

V,

О

а

дов В.А., Овчаров А,К. и др. Физиологи растений, 1984, 31, вып. 2, стр. 294-300.

Из патентной документации известны регул торы биосинтеза белка, например: полипептид, полученный из специфических аллергенов и обладающий иммунодепрес- сантной активностью (за вка №2134908 Великобритани (В) МКИ А 61 К 39/36, 39/35, С 07 К7/00 Изобретени стран мира, вып. 60,ч. 1,№2, 1987), низкомолекул рный полипептид , выделенный из головного мозга млекопитающих и про вл ющий ингибиру- ющее свойство на рост клеток (за вка № 86/04239 РСТ (WO) МКИ А 61 К 37/00, С 07 К 7/00, Q 01 N 33/53 Изобретени стран мира, вып. 15, Ns 5, 1987), пептид, обладающий активностью ингибитора пролиновой эндопептидазы (за вка № 61-183297 Япони (JP) МКИ С07 К5/08, А 61 К37/02. 37/64, С 12 N 9/99 Изобретени стран мира, вып. 60, № 1, 1988), пептид, полученный из да или секретирующего эпители довитых змей, обладающий способностью ингиби- ровать рост клеток (пат. № 4672107, США (И) МКИ С 07 К 15/00 Изобретени стран мира , вып. 60, Ms 7, 1988).

Прототипом предлагаемого изобретени вл етс рицин, белковый токсин из клещевины обыкновенной. Лектины, куда относитс рицин, содержатс не только в растени х, они встречаютс и в ткан х беспозвоночных . У растений и беспозвоночных животных лектины, веро тно, функционируют как защитные белки, предохран эти лишенные иммунной системы, а следовательно , и антител организмы от вторжени паразитарных микроорганизмов. Рицин - сильно действующий д, вызывает 50% ин- гибирование синтеза белка клеток А 431 при концентрации 1, М, Большинство известных в насто щее врем лектинов токсично дл клеток животных in vitro, но их токсичность в 1000-2000 раз ниже токсичности рицина (А, Ленинджер). Основы биохимии . М., Мир, 1985 г., с. 348; Лектины растений: Предлагаемые функции. Марков Е.Ю., Хавкин Э.Е. Физиологи растений, т. 30, вып. 5,1983, с. 852). Herley R. Herschman The role of binding ligand in toxic hybrid proteins: A comparison cf EGF-ricin, EGF- ricin A-chaln, and rlcin, Biochemical and biophysical research communic, 1984, v. 124, №2, c. 551-557.

Недостатком выбранного нами в качестве прототипа рицина в силу его токсичности вл етс ограниченность функциональных возможностей.

Целью изобретени вл етс расширение функциональных возможностей.

Цель достигаетс тем, что в способе регул ции биосинтеза белка в растении в качестве регул тора используют белок, выделенный из пены личинок цикады-пенницы слюн вой Aphrophora costalis Mats, этим регул тором ингибируют синтез белка в растении в концентрации 17 10 мг/мл - 17 10 мг/мл, а стимулируют в концентрации мг/мл -34 10 мг/мл.

0 Из научной литературы и патентной документации известны способы регул ции синтеза белка в растении за счет применени регул торов различной природы. Не известны авторам (за исключением

5 фитогормонов) регул торы, позвол ющие при одних концентраци х стимулировать процесс биосинтеза, а при других ингибиро- вать. Существенным отличием предлагаемого способа вл етс использование в

0 качестве регул тора синтеза белка растений соединени , выделенного из дешевого природного сырь - экскретов личинок цикады . При этом использование его в разной концентрации позвол ет регулировать про5 цесс биосинтеза белка растений.

На фиг. 1 показана гель-фильтраци на колонке с сефадексом-25.

На фиг. 2 показано хроматографическое разделение белка методом ВЭЖХ.

0 Таблица 1. Характеристика белков - пи- ков-экскрета, полученных ВЭЖХ.

Таблица 2. Ингибирование синтеза белков зерновок пшеницы.

Таблица 3. Регул ци биосинтеза,белка

5 редиса.

Таблица 4, Регул ци биосинтеза белка в листь х пшеницы.

Способ регул ции биосинтеза белка в растении заключаетс в том, что в качестве

0 регул тора биосинтеза используют белок, выделенный из экскретов цикады-пенницы слюн вой Aphrophora costalis Mats. С этой целью к пене добавл ют небольшими порци ми при посто нном перемешивании

5 сульфат аммони в виде сухой соли до полного насыщени . Сформировавшийс сульфат - аммонийный осадок белка отдел ют центрифугированием при 15 000 об./мин в течение 30 минут при t +4°C на центрифуге

0 типа 317 в (Poll and). Осадок раствор ют в минимальном объеме 0,1 М Na-форфатного буфера, рН 6.8, содержащего 0,1 М NaCI. Полученный раствор обессоливают с помощью гель-фильтрации на колонке 1,6x20

5 см с сефадексом G-25 (Pharmacia), уравновешенной исходным буфером. На колонку нанос т по 2 мл белкового раствора и ведут элюцию со скоростью 50 мл/час. По поглощению при 280 нм, регистрируемому уви- кордом фирмы LKB определ ют начало

выхода белка, имеющего максимум поглощени в УФ-области при данной длине волны (пик 1 - фиг. 1). Фракции белка собирают по 2 мл. При по влении в элюенте сульфата аммони (пик 2 - фиг. 1), обнаруживаемого по качественной реакции с BaCl2, сбор белка прекращают. Фракции с раствором белка , свободного от сульфата аммони , объедин ют и используют дл дальнейшей работы (пик 1 - фиг. 1).

Обнаружено, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с полученным белком , погибли через 20 часов после начала опыта (наблюдалс полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани), в то врем как надосадочна жидкость, содержаща все остальные соединени экскрета, не оказала вли ни на прирост биомассы каллуса (102% от контрол ).

Применение полученного белка приводило к ингибированию синтеза белка различных растений (таблица 3, 4), а именно, корней редиса на 60%, листьев редиса на 70%, листьев пшеницы на 62%.

Дл вы снени фракционного состава белков использовалось хроматографиче- ское разделение их методом ВЭЖХ. Было получено п ть фракций с молекул рными массами от 800 кД до 1 кД (фиг. 2). Молекул рные массы белков определ лись с использованием стандартных маркеров фирмы Serva (табл. 1). Концентрации полученных белков определ лись хроматогра- фическим методом (табл. 1). Физиологическа активность белков пиков исследовалась на зерновках пшеницы.

П р и м е р 1. Зерновки пшеницы в фазе молочной спелости помещали в чашки Петри . В каждую чашку заливали по 5 мл раствора белков каждого пика и добавл ли 50 мл раствора 14С-лейцина с радиоактивностью ЗЗ Си/мл. В растворе зерновки находились 1 ч, затем их отмывали несколько раз дистиллированной водой и фиксировали жидким азотом, Образцы лиофильно высушивали . Растворимые белки выдел ли из растительного материала (навеска 20 мг) последовательной экстракцией 2% KCI, 75% спиртом, 0,2% NaOH. Объем каждого растворител был равен 2 мл. Экстракцию проводили при 4°С в течение одного часа. Белки выдел ли центрифугированием в течение 15 мин при 10 тыс. об/мин. Дл полноты извлечени белков экстракцию с каждым раство- рителем проводили 4-5 раз. В надосадочной жидкости определ ли содержание белка по методу Лоури-Фолина и включение 14С-лейцина в белки на жидкостном сцинтилл ционном счетчике Дельта- 300 (США).

Как видно из данных табл. 1, белки 4 пиков (2-5) про вл ли физиологическую активность , а именно, ингибировали включение 14С-лейцина в белки зерновок, в то

врем как белок 1 пика не оказывал вли ни на синтез растворимых белков.

П р и м е р 2. Действие полученного регул тора синтеза белка провер ли на листь х и корн х редиса. Дл этого двух и

0 трех-дневные проростки редиса помещали в чашки Петри на предварительно смоченную фильтровальную бумагу. В каждую чашку Петри раскладывали по 40 растений и заливали 10 мл белка. В растворе белка рас5 тени находились в течение двух часов, затем их отмывали холодной дистиллированной водой. В пробирки с растени ми добавл ли по 2 мл раствора С 14-Д, L-лейцина и выдерживали в течение двух

0 часов. Образцы отмывались холодным раствором немеченного лейцина. Растени редиса расчлен лись на листь и корни. Пробы фиксировались жидким азотом, лиофильно высушивались, растирались в порошок. Дл

5 выделени белка навеску растительного материала по 40 мг растирали в 2 мл 0,1 №- фосфатного буфера, содержащего 0,1- М NaCI,pH 6,8. Экстракцию проводили при t +4°С в течение одного часа и затем центри0 фугировали 15 мин при 10000 об/мин. В надосадочной жидкости определ ли содержание белка по Лоури и включение 14С-лей- цина в него (на жидкостном сцинтилл ционном счетчике Дельта-300,

5 США). Разведение белка в диапазоне концентраций от 17-Ю 2 мг/мл до 17 мг/мл приводит к снижению включени 14С-лейци- на в растворимые белки листьев и корней редиса (табл.3). Происходило ингибирова0 ние синтеза белка корней редиса от 60% до 5%, и листьев от 70% до 8%. Далее разбавл ли белок от концентрации 34 Ю мг/мл до мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером рН 6,8 содержащим 0,1 М NaCI. Как

5 видно из таблицы 3, у корней редиса стимулирующий эффект наблюдалс при концентрации белка от 34 10 мг/мл (110% от контрол ) до мг/мл (106% от контрол ) с максимумом 145% от контрол при

0 концентрации белка мг/мл, у листьев редиса - при концентрации белка от мг/мл (105% от контрол ) до мг/мл (102% от контрол ) с максимумом 164% от контрол при концентрации белка

5 мг/мл.

Примерз. Действие белка как регул тора синтеза белка провер ли на листь х пшеницы. Дл этого листь 4-х дневных растений пшеницы помещали по 20 штук в каждую пробирку и заливали по 2 мл белка.

Дальнейша последовательность обработки растений проводилась, как описано в примере 2. Разведение белка в диапазоне концентраций от 17 мг/мл до 17. мг/мл приводит к снижению включени 14С- лейцина в растворимые белки листьев пшеницы (табл. 4). Происходило ингибирование синтеза белка листьев пшеницы от 62% до 6%. Действие разбавлени белка приводило к стимул ции синтеза белка листьев пшеницы от 148% до 215%, как видно из табл. 4.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что разбавленный белок действует как стимул тор синтеза белка, причем, при уменьшении концентрации белка происходит усиление стимулирующего эффекта .

Дополнительным подтверждением биологической активности белка вл ютс данные , полученные при изучении его вли ни на прирост биомассы каллуса эпикотил сои.

П р и м е р 4. Первичный каллус получали из отрезков стебл асептических выращенных 4-х дневных проростков эпикотил сои сорта Волна. Эксплантанты длиной 3 мм помещали на среду следующего состава: минеральные соли по Мурасиге-Скугу, никотинова кислота (РР) - 0,5 мг/л, пиридок- син-HCI (Be) - 0,5 мг/мл, тиамин - HCI (Bi) - 0,1 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, глицин - 2 мг/л, НУК - 2 мг/л, БАП - 1 мг/л, сахароза - 30 г/л, агар - 9 г/л, рН - 5,6-5,8. Культуру выращивали в темноте при 26°С и пересаживали каждые 3 недели. Разбавленный бе- лок наслаивали на поверхность агаризованной питательной среды (по 2 мл

на 1 чашку Петри d - 90 мм), использу мембранные фильтры. В контрольные варианты наслаивали дистиллированную воду или буфер. Интенсивность роста каллуса определ ли через 21 день по весу сырой массы клеток.

Следует подчеркнуть, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с добавлением исходного белка (17. мг/мл), погибли через 20 часов после начала опыта (наблюдалс полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани).

При разбавлении белка до концентрации 34 10 мг/мл наблюдалс максимальный привес каллусной ткани - 14,24 г на грамм внесенного каллуса, что составило 163% от контрол .

Предложенный способ позвол ет удешевить научные исследовани по изучению

регул ции синтеза белка в растении. Кроме того, новизна регул тора биосинтеза белка в растении в предложенном способе, позволит оптимизировать рост каллусных тканей

Claims

Формула изобретени

Способ регул ции биосинтеза белка в растении путем воздействи на него пептидным соединением природного происхождени , отличающийс тем, что, с целью унификации способа, используют белок , выделенный из пены экскретов личинок Aphrophora costalis Mats, причем дл инги- бировани биосинтеза раствор белка берут

в концентрации 17 10 2-17-10 мг/мл, а дл стимулировани биосинтеза - в концентрации -34-10 ° мг/мл.

Способ регул ции биосинтеза белка в растении

i а б л и ц а 1

Способ регул ции биосинтеза белка в растении

Таблица2

ТаблицаЗ

Способ регул ции биосинтеза белка в растении

Таблица4

го

Г

«ч

ж о cs

и ш

0

с

ь о

с:

5 U

6Q 90 ЭД i,MW«.