CN1075969A

CN1075969A - 阿马多瑞反应化合物及产物，其生产方法和用途

Info

Publication number: CN1075969A
Application number: CN 93101895
Authority: CN
Inventors: J·Z·米奥杜祖斯基; K·维基韦兹; A·英格罗特
Original assignee: Torf Establishment
Current assignee: Torf Establishment
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1993-02-13
Publication date: 1993-09-08
Also published as: PL171319B1

Abstract

式为R₁-NH-R₂(R₁和R₂的定义详见权利要求书)的新的阿马多瑞反应化合物。式为 R₁′-NH-R₂′(R₁′和R₂′的定义详见权利要求书)的化合物及该些化合物的组合物，它们是用于生产药物制剂，该制剂与人的白细胞接触产生干扰素和其他的组织介素(cytokines)。

Description

本发明涉及新的阿马多瑞反应化合物和产物，其生产方法以及这些化合物和产物的新用途。所说化合物和产物至少有部分经过如以下反应系统的阿马多瑞氏重排和/或美拉德反应：

阿马多瑞反应产物是已知的，它们是反应产物，例如，氨基酸或肽与糖、寡糖或多糖经过阿马多瑞氏重排的产物（J.Biol.Soc、215（1955）Henri Borsook等人）。所以，在DE-3-3914354中描述了从燕麦种子提取的氨基酸和糖的水溶性糖蛋白。还有，EP-A-406087描述了衍生自革兰氏阳性细菌的细胞壁的水溶性多糖-糖肽复合物，而且J.Boil.Chem.1985，260/9指出由蛋白质的游离氨基与糖反应生成的阿马多瑞反应产物已用NMR-光谱学作了说明。

本发明现在描述如同权利要求1描述的具体的新的阿马多瑞氏重排的化合物。优选和改进的方案是在权利要求2至4中描述。在生物活性物质试验反应中上述化合物还原铁氰化钾。所说活性物质是由糖和氨基酸反应生成的。

本发明还涉及如权利要求11至17描述的上述化合物的新用途，同时，是一般的糖和氨基酸的阿马多瑞反应产物的新用途。过去没有人就生物活性试验过阿马多瑞产物提取物提纯的各种步骤（为了除去惰性物质（ballast substances和杂质）。

来源于天然的免疫刺激药物，如槲寄生属（mistletoe）提取物，泥炭提取物等，已确知其缺点在于处理大量材料需昂贵的费用，且只获得几克的活性物质;不能控制杂质，因而可能导致毒性和副作用，由于复杂性质和几乎不能重现的组分，当实际使用时还存在给药问题。

来源于人造的同性质的产物或产物混合物，如干扰素或其他遗传工程方法则费用更昂。而且，对于渗入人的细胞壁来说，人的干扰素的分子量通常都太大，因此，所施药剂只有小部能有效地起作用。而遗传工程的产物通常也有副作用，有些甚至有毒性。而且，它们之中有些只在一天能有效地起作用，而第二天则不起作用，其原因至今未明。

现在，意想不到地发现几乎任何经过至少部分阿马多瑞氏重排的简单氨基酸/糖复合物没有显示以上所说的缺点，相反，有意想不到的免疫活性。因此，它们可用于药物的配方和美容剂。这些低分子容易渗入细胞壁，实际上起了营养物的作用。它们诱导包括肿瘤坏死因子的天然干扰素和其他组织介素（cytokines）的形成。即使给药后三天，它们仍然显示生物活性的刺激效果。该效果随着阿马多瑞氏重排的复合物的增加而增大，再随着复合物的分解的增大而减小。

单糖也可用多糖代替，最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的多糖代替，例如葡聚糖，其反应相似。多糖显示生物活性，且它们变成寡糖后可保留一些生物活性。

在此之前，人们对这些化合物的生物活性了解甚少。今发现这些物质的混合物与人的白细胞接触产生干扰素和其他的组织介素。这叫做多细胞激活性（poly clonal activation）。

在这些化合物影响下，试验产生的物质和检验生物活性是可能的。所说生物活性是以与特殊的组织介素有关的国际单位表示的。这些化合物在纯物质浓度在1-100μg/ml的范围内有特别高的生物活性。在分子里，氨基酸的特性比分子里糖部分的性质更重要。

在经过阿马多瑞氏重排的L-天门冬氨酸与葡萄糖或半乳糖的反应产物，当与人的白细胞接触，并在37℃，于5%CO₂的气氛下，在组织培养介质中培育20小时将可产生30-1000抗病毒单位的干扰素。该干扰素是以用人的癌细胞的生物检定测量的。在这些化合物的影响下，肿瘤坏死的化合物也可产生。

具有上述意想不到的用途的产物的通式为：

R₁′代表衍生自单糖、寡糖和多糖的1-氨基-1-去氧-2-酮糖残基，所说多糖最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的;

R₂′代表氨基酸残基或肽残基，所说肽残基，最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的。

因此，生物活性化合物包括上述的特殊的阿马多瑞氏重排的化合物或不同氨基酸化合物的N-取代的衍生物和一种的单糖、寡糖或多糖，或一种氨基酸化合物的N-取代的衍生物和多种的单糖、寡糖和/或多糖，或这些衍生物的其他任何组合，它们中的每一个组合都有足够的生物活性。所说多糖最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的。

在上式中，优选的R₁′可以是选自D-型单糖残基，尤其是（但不是唯一）选自以下化合物的残基：D-型葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、6-去氧-葡萄糖、葡糖胺和半乳糖胺;R₂′可以是选自L-型氨基酸的或所说氨基酸的任何组合的其他的肽的残基，所说氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、蛋氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和亮氨酸。

本发明还涉及如权利要求5所描述的上述的化合物和产物的生产方法，借此产生下式的一种中间体，该式为

其中R′是直碳链的C₁-1-去氧残基或单糖或寡糖或多糖的任一种0-桥型。

R″代表氨基酸残基或肽残基，所说中间体是至少有部分经过阿马多瑞氏重排和/或经过美拉德反应。该反应是连续加热反应混合物，最好在压力下，且同时或随后除去溶剂。该方法的优选方案是在权利要求6至10中描述。

在某些情况下，尤其是当使用含有两个羧基的氨基酸时，在该方法中加入缓冲盐是有利的，所说缓冲盐如碳酸氢钠，其摩尔比最好为1∶1。

已发现阿马多瑞产物较易分解，且分解产物有暗褐色和焦油般的性质，但组成未明的化合物已失去它们的生物活性。所以，最好在反应混合物变为淡橙棕色时就停止阿马多瑞氏重排反应。

值得注意的是，当原不透明的氨基酸溶液变为清澈时（阿马多瑞氏重排之前）生成的中间体反应物易水解，即该反应是可逆的。随着重排的增加，可逆性减小，即产物变为更稳定，且颜色逐渐由淡黄色变为淡橙色，最后，当阿马多瑞氏重排象是完成时则变为橙棕色。由重排反应中取出并试验（按下文所述的各种方法）的样品证实随着阿马多瑞氏重排处理，生物活性增大，而进一步加热导致分解时，生物活性减小。所说分解，其征兆是颜色变为暗褐色。如果反应混合物含有别的酮基和/或含硫的氨基酸，如半胱氨酸时，铁氰化物迅速还原，且会发生颜色变化;否则，它在3至5分钟内就会发生，这是对阿马多瑞氏重排发展程度的一种很好检查方法。未反应的糖只在半个小时或几个小时后将显示颜色变化。

分离纯阿马多瑞氏重排产物是按已知方法进行的，该方法是基于将混合物装于强阳离子交换剂（如Amberlite^（R）或Dowex^（R）），以水连续地洗涤，在减压下蒸发洗出液的已选择的确定部分，将纯化合物置于无水甲醇中结晶（J.E.Hodge and B.E.Fisher，Methods in Carbohydrate Clemistry，Vol.Ⅱ，Reactions of Carbohydrates，1963 Academic Press，N.Y.London，1963，Page 105-106;or Borsook at al.as quotedearlier）。

按照本发明的方法，所有上述的衍生自单糖和氨基酸化合物的优选的残基保持不变。此外，优选的糖作用物的混合物包括D-型的葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和果糖，它们的重量比为20∶10∶4∶1∶1，而优选的氨基酸作用物包括L-型的丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸，它们的重量比为20.4∶35.8∶35.8∶132∶180∶360∶216∶160∶72∶68∶780。

如已述，阿马多瑞氏重排产物能还原铁氰化钾，这种化学试验反应提供了快速检定由糖和氨基酸反应生成的组合物的生物活性的依据。

已发现，在含水溶剂，最好是加低级醇的含水溶剂存在下，于高温（和任意压力下）将按存在于天然泥炭提取物的同样成分和同样重量比的单糖混合物与按存在于天然泥炭提取物的同样成分和同样重量比的氨基酸化合物的混合物及存在于该天然泥炭提取物的任意微量元素反应，随后延长加热以使生成的产物进行阿马多瑞氏重排，同时或随后除去溶剂，当反应混合物变为淡橙棕色时停止重排反应，干燥生成的产物，并以柱色谱纯化该产物，收集引致铁氰化钾最大量还原的部分。

在一个方案中，本发明药物配方含有活性成分和药学上可接受的载体和/或佐药和/或任意的润滑剂，活性成分与其余成分的重量比在1∶1和1∶100之间，较好是1∶8至1∶20，最好是1∶9。所说活性成分是式R′-NH-R′的至少的一种反应产物，或者是式R-NH-R的一种具体化合物。

另一个有效的药物配方中，除含有活性成分，还含有乳糖和润滑剂，乳糖与润滑剂的重量比在20∶1和100∶1之间，最好是50∶1。

这些药物制剂是用于治疗和/或预防血液学的和/或免疫学的疾病和/或通过诱导组织介素的形成以刺激人的和/或哺乳动物的免疫系统。

活性成分的另一种用途是在美容制剂方面。活性成分存在于该制剂中的含量为0.01-10%（重量），最好含量为0.01-1%（重量），尤其是0.05-0.1%的含量。这些美容制剂，除含有活性成分，还含有一般载体、佐药、营养成分和/或芳香料。

以下实施例将进一步说明和证实本发明，但这些实施例并不限制本发明任何方面的范围。

实施例1

放入加热水浴旋转蒸发器中的25ml烧瓶中装入1.47g（0.01M）L-谷氨酸、0.84g（0.01M）NaHCO₃、0.91g D-葡糖、0.91g半乳糖和3.00ml再蒸馏水。

混合物加热到80℃，从而最好在减压下蒸发掉50%水，然后在大气压下加热到80-85℃，在此温度保温120分钟，直至混合物变成橙色。之后，将浆状浓缩水溶液减压蒸干。由此得到的橙红色固体反应产物标为符号D-10并贮存起来备用于生物试验。

实施例2

放入加热水浴旋转蒸发器中的25ml烧瓶中装入1.33g（0.01M）L-天冬氨酸、0.84g（0.01M）NaHCO₃、0.91g D-葡糖、0.91g半乳糖和3.00ml再蒸馏水。

将混合物搅拌着（利用旋转法）加热到80℃，减压浓缩，从而蒸发总体积为1.5ml的水，然后在80-85℃大气压下处理，直至混合物变成浅橙色，历时约60分钟。反应混合物为浆状浓缩水溶液，然后将其减压干燥。所得反应产物为干燥的橙黄色粉末，标为符号D-11并贮存起来备用于生物试验。

实施例3

放入热水浴旋转蒸发器中的25ml烧瓶中装入1.05g（0.01M）L-丝氨酸、0.91g D-葡糖、0.91g半乳糖和2.50ml再蒸馏水。

将混合物搅拌着（利用旋转法）加热到85-92℃。100分钟之后，溶液变成橙色。减压，并将混合物蒸干。烧瓶壁上的反应产物形成了橙色透明层。刮掉反应产物并研成末，标为符号D-12并贮存起来备用于生物试验。

实施例4

放入热水浴旋转蒸发器中的25ml烧瓶中装入0.66g（0.005M）D-天冬氨酸、0.42g（0.005M）NaHCO₃、0.45g D-葡糖、0.45g 半乳糖和3.00ml再蒸馏水。

将混合物加热到80℃，减压蒸发，从而挥发掉总体积为1.5ml的水，然后于85℃大气压下处理。60分钟加热后混合物变成橙色，减压，并将所得浆状浓缩水溶液蒸干。在残余物完全干燥之前，往烧瓶中加入两次10ml无水乙醇并蒸发以消除残余水分。由此得到的干燥的反应产物研成粉末，标为符号D-13并贮存起来备用于生物试验。

实施例5

为了以合成方式得到某种天然泥炭提取物的生物活性部分的同等物，往放入加热水浴旋转蒸发器的烧瓶中装入20.5mg L-丝氨酸、35.8mg L-甘氨酸、35.8mg L-组氨酸、132.0mg L-精氨酸、180.0mg L-丙氨酸、360mg L-脯氨酸、216.mg L-酪氨酸、160 缬氨酸、68.0异亮氨酸、72.0mg L-亮氨酸、780.0mg L-赖氨酸、2000.0mg D-葡萄糖、1000.0mg D-木糖、400.0mg D-半乳糖、100.0mg D-鼠李糖、100.0mg D-果糖和6.0ml再蒸馏水。

利用旋转法搅拌混合物，并加压加热45分钟以使温度由75℃提高到86℃。在此期间，蒸发掉约3ml水，并将基质完全溶解。然后，于85-86℃大气压下处理混合物以进行阿马多瑞氏重排。在此期间，溶液迅速变成红棕色。减压，并持续84℃加热，从而同时蒸发掉溶剂。蒸发结束后加入两次15ml无水乙醇并使反应混合物干燥。将装有干燥过的反应产物的烧瓶置于氯化钙干燥器中干燥18小时，然后将反应产物研成粉末，得到约4.5g粉末状产物，标为符号EK₂-S。

将一份4g的该反应产物溶于20ml蒸馏水并置于尺为为25mm×330mm的色谱柱上，柱中装有吸着剂Amberlite^（R）XAD-2（分析级）。柱子用0.4ml/分蒸馏水洗脱。收集每次10ml体积级分到总体积为450ml。用色谱法监测诸级分含量，合并连串柱11-13的级分并减压蒸发。这些级分的特征在于为高含量的阿马多瑞氏重排反应产物（用氰铁酸钾还原试验得到证实）。产物以符号EK-S-11贮存起来备用于生物试验。

用8-10周龄雄性雌性两种免疫的Balb/c小鼠进行测定生物活性的生物试验。小鼠的免疫是通过腹膜注射0.2ml 10%羊的红细胞（SRBC）悬浮液，即6×10⁸个细胞而进行的。这些红细胞固定在具有以下组成的无菌Alsever（阿尔塞弗氏）溶液中：

葡糖 2.05g

柠檬酸钠 0.8g

氯化钠 0.42g

柠檬酸 0.055g

再蒸馏水 100ml

往这种Alsever溶液中以1∶1的比率加入羊血细胞无菌样品，并将混合物在+4℃保持至少3天。然后，将由此稳定的红细胞无菌制样并加到磷酸盐缓冲溶液（PBS）中以便将它们清洗出。红细胞用PBS清洗两遍，并以2000rpm离心分离10分钟。洗出的细胞以于PBS中的10%悬浮液形式使用。这种悬浮液用于Balb/c小鼠的免疫。

待试验的反应产物以所选剂量腹膜内（i.p）给药或口服（P.O）四次。第一次给药在小鼠用SRBC免疫之前2小时，而剩下三次剂量在免疫之后以24小时间隔给药。

各试验的动物组用不同剂量的被测反应产物处理：10mg/kg，1mg/kg，0.1mg/kg和0.01mg/kg。对照的动物组也用SRBC免疫，但不用被测物质。0.2ml PBS以同样时间间隔给药。

各动物组一对照组和试验组在所有试验均由8-12个小鼠构成。

在免疫之后第四天或（测定7S型抗体而言）第十天，将小鼠用乙醚麻醉并通过眼球摘除而放血。把血液收集到试管中。接着，将脊髓破碎并取出脾脏。用该血液获得测定19S+7S和7S型血凝抗体所需的血清，而脾脏用于制备能形成E-花结的细胞百分率和溶血活性测定用的细胞。对于这种用途而言，将鼠脾脏粉碎。将所得脾细胞悬浮于4℃约2ml Hanks介质中，以1.077密度的Ficoll-Uropolin梯度成层，然后，于+4℃以3000rpm离心分离15分钟。从内相分离后，将淋巴细胞血沉棕黄色层置于Hanks介质中（+4℃）并以1800rpm离心清洗两次，每次7-10分钟。然后将脾细胞以能使其含有1×10⁶个细胞的比率悬浮于1mlHanks介质中。

对于每次试验，通过将一滴试验用脾细胞悬浮液与一滴当场制备的含4份0.2%锥虫蓝溶液和1份4.25%Nacl溶液混合物测定死细胞的百分率。在显微镜下，对每100个细胞测定死脾细胞的百分率。死细胞是海军蓝，而明亮的细胞是活细胞。存在不高于10%的死细胞百分率是临界值;这种样品必须从另外用途中消除。

测定细胞所进行的所有步骤应该在一个放置在冰浴中的无菌的硅化实验室用玻璃设备中进行。

实施例6

第一步，测定试验的反应产物对产生溶血的抗体（PFC-IgM）数量的影响。试验如下：把0.5ml 0.5%琼脂糖溶液放入试管中并保存在45℃热水浴中，掺入0.1ml 10% SRBC悬浮液（制法如上）。之后，加入密度为1×10⁶个细胞/ml的0.1ml脾细胞悬浮液，迅速搅拌混合物，并立即倒在以前披有琼脂糖的载片上。将载片于37℃保温2小时。接着再用2小时，将试样包覆以1∶20的比率稀释的豚鼠补体。试样与该补体一起保温之后，计数空班形成细胞（PFC）的数量并重新计算为1×10⁶脾细胞。各试验进行两次。

在D-11物质以0.1mg/kg的剂量给药之后，观察以产生溶血素IgM（PFC）的脾细胞数增加表达的应答对SRBC的最强放大率。该放大率为119%。当日剂量提高10倍达到1mg/kg时，应答的放大率降到53%。

反应产物D-12表明最强的活性-在1mg/kg的剂量增加58%。

该试验的反应产物EK₂-S-11在0.1mg/kg剂量表现了最强的活性（增加65%）。剂量高10倍，即1mg/kg，增加率稍有下降，即52%。

以1mg/kg剂量试验的反应产物D-13造成增加率为40%。当剂量提高到10mg/kg，即增10倍，应答仅为14%增加率。

实施例7

也进行血凝试验以测定抗-SRBC型19S+7S抗体和7S抗体。为了测定19S-IgM型抗体水平，在用SRBC免疫后第四天制备鼠血清;而对于测定7S-IgG型抗体水平，这种制备是在小鼠用SRBC免疫之后第10天进行的，该天数涉及用SRBC免疫小鼠中所给类型抗体的最大计数的天数。

A.测定19S+7S抗体剂数

将血样以3500rpm离心分离30分钟。从由此制得的各样品收集血清并置于56℃热水浴中30分钟以使补体减活。接着，采用微量滴定剂和各具有容积为250 μl的U-型微孔板来制备每种血清几种不同稀释度的多种溶液（由1∶1-1∶4096）。稀释的血清液于室温保温1小时。每种血清中加入1滴1%SRBC的PBS悬浮液（制法如上）;混合物于37℃再保温2小时，然后贮存在+4℃。第二天取结果。仍造成血凝作用的最大稀释度被认为是抗体剂数。孔板底部的环形物是血凝发生的征兆。孔板底部的扭扣状物形成被认为是负结果，即无血凝发生。

为了统计分析结果，使试验物中血清的稀释度增量与对照组的进行比较。

剂量为1mg/kg的反应产物D-11使IgM计数提高了2.57倍。在剂量10倍提高的情况下，与对照组相比，刺激作用提高了3.5倍。

本试验中，反应产物D-12表现出较弱的活性。在0.1mg/kg剂量，它使IgM计数提高2倍;而在1mg/kg剂量，提高1.4倍。

反应产物EK₂-S-11在本试验中表现出最强的活性。在0.1mg/kg剂量，它使IgM计数提高4.3倍，而在1mg/kg剂量，提高3.6倍。

剂量为1mg/kg的反应产物D-13使IgM计数提高3倍，而高于10倍剂量，提高1.5倍。

B.测定7S抗体计数

将试验的减活血液以1∶1的比率与0.1M的2-疏基乙醇液合并，并将混合于37℃保温30分钟。2-疏基乙醇破坏了19S-（IgM）型免疫球蛋白，而7S-（IgG）型免疫球蛋白对2-疏基乙醇的作用不敏感。

保温30分钟之后，用15分钟的时间将温度冷却到+4℃来中止反应。接着，按上述测定19S-抗体剂数的类似方式制备若干种稀释液并与1%SRBC悬浮液合并;于37℃2 小时保温之后，将样品贮存在+4℃。按照上述测定血凝作用计数的标准第二天评估结果。类似地，以1∶1的比率混合1%SRBC悬浮液与PBS来进行对照试验。

当按上述方法试验物质D-11时，在1mg/kg剂量，该物质使抗体IgG的产率提高3.16倍。在10mg/kg剂量，提高2.2倍。

分别以0.1mg/kg和1mg/kg剂量试验的反应产物D-12刺激抗体IgG的产率提高1.3倍，10mg/kg剂量提高1.5倍。

0.1mg/kg剂量的反应产物EK-S-11刺激IgG产率提高1.9倍，而1mg/kg剂量提高2.89倍（与对照相比）。

对于各批量生产或按照本发明合成并给出上述免疫应答的生物活性反应产物的各组分获得的试验A和B的结果按照T-学生试验法（Tstudent method;α＝0.05）统计分析。各试验剂量获得的结果与平行对照试验进行比较，并显示出生物活性的增加率。

实施例8

按照实施例1-5获得的生物活性反应产物组也进行如此试验，其中测定形成E-花结的脾细胞的百分率。

往550μl Hanks介质中加入250μl的1%SRBC悬浮液和待试验的浓度为1×10⁶个细胞/ml的250μl细胞。在37℃，将每种这样的样品在配有振荡器的热水浴中保温15分钟。然后，将其在+4℃再贮存20小时。在悬浮液用1-3滴晶体紫着色之后测定用SRBC形成E-花结的脾细胞的百分率。

将各样品测定3次脾细胞的百分率（在每种情况下以400个脾细胞计）。

为了进行统计学评估，在待测物质和对照组之间进行具有E-花结的脾细胞数量的百分增量的比较。

在本试验中，显示出最强的刺激作用的是剂量为1mg/kg的反应产物D-11（63%）和EK₂-S-11（70%）。在低10倍剂量（即0.1mg/kg），该值分别降到45%和57%。

与对照组相比，1mg/kg剂量的反应产物D-12使形成E-花结的能力提高了22%。低10倍的剂量（即0.1mg/kg）的各值为29%。

反应产物D-13在1mg/kg剂量显示出最大作用（58%），而在更高剂量，作用稍稍下降。

按照以下试验评估合成的化合物的生物活性：

1.按照Bach和Dardenne的方法（Cell.Immunol.3，1-16，1972）进行形成E-花结的脾细胞百分率测定试验，

2.按照由Mishell和Dutton改进的Jerne法（J.Exp.Med.126，423-442，1967）进行产生Igm型溶血性抗体的细胞数测定试验，以及

3.按照Adler活性血凝法（J.Immunol.95，26-38，39-47，1965），用微孔板进行血凝19S+7S和7S抗体剂数测定法（J.Immunopharmacol.4，43-52，1982）。

实施例9

置于热水浴中的旋转蒸发器烧瓶中装入：

1.33g（0.01 M） L-天冬氨酸

0.84g（0.01M） NaHCO₃

10.00g 平均分子量为3000道尔顿的水解的葡聚糖

10.00ml 再蒸馏水。

将混合物于70℃加压加热，直至固体物完全被溶解并在此期间用蒸馏的方法排出约3ml水为止（加热时间约为30分钟）。装有该溶液的烧瓶松松盖住，置于蒸器灭菌器中并于121℃加压加热40分钟。冷却之后、所得橙黄色溶液用15ml水稀释，利用离心法净化并用入口温度+160℃。出口温度+85℃的空气喷雾干燥。得到易溶于水的10.5g浅米色反应产物。

这种反应产物中存在阿马多瑞氏重排产物得到了Borsook，Abrams和Lowy介绍的铁氰酸钾法[J.Biol，Chem 215，（1955），111-124和色谱法证实。

前面实施例中介绍的生物试验法证实了上述产物的免疫活性与用简单糖得到的制剂所显示出的类似。

实施例10

锥形烧瓶中装入：

5.0g 平均分子量约为5000道尔顿的水解的葡聚糖

1.1g L-脯氨酸

4.0ml 再蒸馏水。

利用搅拌的方法溶解内容物。将由此得到的均匀混合物置于蒸汽灭菌器中并于110℃加压加热40分钟。所得透明的橙色液用20ml再蒸馏水稀释并用离心法净化。将清亮液喷雾干燥。

得到易溶于水的5.3g反应产物。免疫活性与按照前述实施例的其它试验中所观察到的类似。

实施例11

用传统方法测试化合物在小鼠而不是在人中的生物活性。为此，引入了新的生物检定法。该方法测定了用按照实施例1-5，9和10的反应物处理的人体未梢血液白细胞（PBL）中释放出的组织介素的量和活性。这种组织介素是激素状蛋白质，在实际上所有免疫反应以及决定着体内平衡的调节过程中起着重要作用。

细胞毒性检定

在人肺腺癌细胞系A549中（包括ATCC CCL 185在内）测定反应产物的细胞毒性。细胞单层胰蛋白酶化，于Dulbecco改进的Engle最小基本介质（DMEM）加1%牛血清（CS）中的2×10⁵个细胞/ml的悬浮液与不同剂量的药物混合，在塑料微孔板中接种，并于37℃保温48小时。CD₅₀是按照用中性红于DMEM的0.015%溶液着色而测定的、造成约50%细胞培养破坏的化合物的最低浓度。

诱发组织介素

从地方输血中心获得健康供血者的血沉棕黄层。按照Cantell等人的NH₄Cl处理法（Cantell，K.Hirvonen，S.，Kauppinen，H.L.;Production and Partial Purification of Human Immune Interferon Meth.Enzymol.，119，54，1986）溶化红细胞。使用仅由一个供体获得的白细胞（每ml含有约8×10⁶个白细胞），后者置于补充了10%胎牛血清（FCS）、L-谷氨酰胺和抗菌素的RPMI 1640培养基中。预先测试各批量的FCS。只使用PBL培养用的非丝裂FCS。将组织介素诱导体加到1ml容积的培养基中。对照用的组织介素诱导体是植物凝集素（PHA）（Pharmacia Fine Chemicals，Sweden）和得自E.Coli 0111∶B4的LPS（Difco Laboratories）。将诱导的PBL培养物在含有5%CO的空气气氛下于37℃保温20小时并进行离心分离。上清液贮存在+4℃并在1周内检定TNF和IFN活性。

干扰素（IFN）检定

在处于含有10%CS、L-谷氨酰胺和抗菌素（100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素）的DMEM中的微孔板中制备A549细胞的汇合单层。将孔板中稀释的IFN样品加到细胞单层中并在含5%CO₂的空气中于37℃保温20小时。然后，将细胞洗涤，并用脑心肌炎病毒（EMCV）免疫。IFN的滴定度定义为保温48小时之后使病毒细胞病理作用降低50%的IFN样品的稀释度。也可采用为测定ELISA扫描器中细胞致死率的MTT（3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓）法（Hansen，M.B.，Nielsen，S.E.，and Berg，K.：Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth/Cell Kill.J.Immuno.Meth.，1989，119，203-210）。IFNs的试验室标准法也包括在所有检定方法中：重组人体IFN-r（Genentcch Inc.，USA，specific activiy 2×10⁸单位/mg），自然人体白细胞IFN-α（3×10⁶.IU/ml）和IFN-r（2×10⁶IU/ml）（得自Dr.K.Cantell，Helsinki，Finland）。

肿瘤坏死因子（TNF）检定

按照Flick和Gifford法测定L929细胞中的TNF细胞毒性活性（Flick，D.A.，Gifford，G.E.：Comparison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor.JImmunol.Meth.，68，167，1984）。

往单层细胞培养物中加入样品和放线菌素D溶液。在37℃保温20小时后，培养物用晶体紫着色并测定毒性效果。把约50%细胞培养物破坏的量定义为一个TNF活性单位。与TNF-α制剂（Genentech Inc.，USA）相比表明：本发明人的检定法中1个单位等于100-200 pg/ml TNF。

组织介素中性检定

所用的抗血清是：兔抗人体TNF-α，种12958-40和兔抗人体IFN-γ，种2891-56（Genentech Inc.，USA），羊抗人TFN-α，β和羊抗人IFN-γ（得自Dr.k.Cantell，Finland）。组织介素制剂用在培养基中1∶200稀释的血清处理并于室温保温1小时。然后，按上述方法测定残余IFN或TNF活性。

使用由健康供血者的血液制得的不同的五组（L₁-L₅）PBL。经实测，用于鉴定的最佳PBL浓度为8×10⁶个细胞/1ml培养基（补充了10%胎牛血清和抗菌素的RPMI 1640）。

人体PBL与新的反应产物Ⅰ-Ⅺ（表1）一起保温导致IFN和TNF合成。观测的应答是范围在3-100μg/ml化合物（表2）所涉及的剂量。在所指出的浓度内使用的化合物是非细胞毒性。在所有的生物鉴定中，包括了负的和正的对照。负的对照测定了在没加入任何外源刺激物的条件下自动生成的组织介素（IFN和TNF）的量。正的对照指出了随公知的对照诱发剂所生成的组织介素的量;在本案中，该诱发剂为植物凝集素（PHA，pharmacia，Sweden，10 μg/ml）。

应指出，在由不同的个体获得的人体PBL培养物中诱发组织介素一般得到变化相当大的结果。这种现象可根据人口遗传的差异而解释。此外，PBL培养物常常自发地产生IFN和TNF。

换句话说，在PBL的健康供体中一般观察到高应答者和低应答者，甚至是非应答者。

尽管有示出的限制条件，但生物检定的结果表明用反应产物（Ⅰ-Ⅺ）处理的PBL（L₁-L₅）生成了可定量测定的IFN和/或TNF。

就含有高应答者的白细胞的L₁而言，经实测反应产物Ⅱ（含L-形式的天冬氨酸）作为组织介素诱发剂远比反应产物Ⅲ（含D-形式天冬氨酸，它也更廉价达两个数量级）要活性的多。这种观察结果很显著，主要是因为L-型的氨基酸被生化反应中作为天然作用物的细胞识别。

此外，对于反应产物的生物活性的表达，分子的氨基酸部分远比糖的形式更重要。可使用优选低分子量、特别是低于1000道尔顿的多糖（例如葡聚糖，反应产物Ⅹ-Ⅺ）代替单糖，它们反应很类似。

反之亦然。含氨基酸残基的多糖可具有生物活性，而且当它们被分解成具有结合氨基酸的寡糖时，这种活性仍被保持（未示出数据）。

如果取短肽而不是单个氨基酸且用于刺激白细胞生成组织介素，则也可观到类似结果（未示出数据）。

在由不同的供体得到的100多个PBL培养鉴定的未分级分离TTP的七个对照组得到10-1，000单位IFN/ml，和9-750单位TNF（ml。由相当于天然泥炭提取物（实施例5）含量的混合物制得的EK₂-S部分已在由八个不同的供血者得到的八个PBL培养物中的做了鉴定。已发现，它是诱发IFN和TNE最活性的制剂（未示出数据）。

反应产物可能的应用是作为免疫调节剂，这种活性临床上很有用。组织再生是另一经证明的活性。与存在诱发干扰素和肿瘤坏死因素有关的抗癌活性也被观察到。也注意到抗病毒活性。

上述反应产物的主要应用涉及口服，但也可以肠胃外治疗，例如局部给药。产物似乎非常稳定。

表1 反应产物表

编号作用物

Ⅰ(D-10) L-谷氨酸,葡糖,半乳糖

Ⅱ(D-11) L-天冬氨酸,葡糖,半乳糖

Ⅲ(D-13) D-天冬氨酸,葡糖,半乳糖

Ⅳ(D-12) L-丝氨酸,葡糖,半乳糖

Ⅴ EK₂-S(级分11-13)

Ⅵ EK₂-S(级分6-7)

Ⅶ EK₂-S(级分8-10)

Ⅷ EK₂-S(级分28-34)

Ⅸ L-脯氨酸,葡糖

Ⅹ L-天冬氨酸+葡聚糖(变种1)

Ⅺ L-天冬氨酸+葡聚糖(变种2)

实施例12

采用以下反应产物制备含按照实施例1-5，9和10的反应产物作为活性成分的药物配方：

A.片剂胶囊

5.0g 按照实施例1或10得到的反应产物（作为活性成分）

444.0g 药用乳糖

1.0g 润滑剂，如MYVATEX^（R）（Eastman Kodak的商标）

混合诸成分并按照传统方式用30%含水乙醇造粒，然后于40℃干燥。用这些颗粒制成胶囊，其中各含约450mg颗粒，即5mg活性物。另外，也可以用颗粒制片剂，各重约450mg且含5mg活性物质。

B.以同样的传统方式，用合适的载体，将按照前面实施例1-5，9-10得到的活性物质配制成其它药物配方。

实施例13

按照前面实施例1-5，9和10得到的活性物质用作旨在每日护理头发和身体的美容制剂的有益添加剂，该活性物质的含量根据制剂类型、给药方法和具体制剂的使用频率的不同而定，可在0.01-10%（重量）之间。

表2 人体PBL中反应产物I-Ⅺ的生物活性

剂量 IFN 单位/ml TFN 单位/ml

μg/ml L₁L₂L₃L₄L₅L₁L₂L₃L₄L₅

对照 - 10 <10 <10 20 <10 80 9 27 27 <9

PHA 10 100 30 30 60 100 250 80 250 250 250

I 100 100 <10 <10 20 - 250 9 9 160 -

30 - - - 30 - - - - 500 -

10 30 <10 <10 30 - 80 9 18 160 -

3 - - - 10 - - - - 160 -

II 100 100 10 <10 10 <10 250 18 18 250 <9

30 - - - 10 <10 - - - 250 <9

10 1000 10 30 10 10 250 50 27 250 <9

3 - - - 10 <10 - - - 160 <9

III 100 <10 <10 10 10 <10 250 9 18 250 <9

30 - - - 30 <10 - - - 250 <9

10 <10 <10 <10 10 <10 80 27 18 250 <9

3 - - - 10 <10 - - - 80 <9

IV 100 <10 10 10 20 <10 80 60 9 160 <9

30 - - - 20 <10 - - - 27 <9

10 <10 30 <10 20 <10 80 50 18 80 <9

3 - - - 20 <10 - - - 80 <9

V 100 30 <10 <10 60 - 80 50 18 250 -

30 - - - 60 - - - - 80 -

10 <10 <10 <10 10 - 80 27 9 80 -

3 - - - 10 - - - - 80 -

VI 100 <10 <10 <10 20 - 80 27 18 80 -

30 - - - 10 - - - - 80 -

10 10 <10 <10 20 - 50 27 18 160 -

3 - - - 10 - - - - 250 -

VII 100 <10 <10 <10 - - 80 27 27 - -

30 - - - - - - - - - -

10 10 <10 <10 - - 80 27 27 - -

3 - - - - - - - - - -

VIII 100 <10 <10 <10 - - 80 160 27 - -

30 - - - - - - - - - -

10 <10 <10 <10 - - 750 80 27 - -

3 - - - - - - - - - -

IX 100 10 <10 <10 10 - 27 27 18 80 -

30 - - - 20 - - - - 80 -

10 100 30 <10 20 - 80 27 18 80 -

3 - - - 10 - - - - 50 -

X 100 100 <10 20 20 - 27 27 18 250 -

30 - - - 30 - - - - 80 -

10 <10 10 <10 30 - 18 50 27 50 -

3 - - - 30 - - - - 250 -

XI 100 <10 10 <10 30 - 18 27 27 50 -

30 - - - 10 - - - - 250 -

10 <10 30 <10 10 - 18 80 80 80 -

3 - - - 20 - - - - 750 -

Claims

1、下式所示的一种阿马多瑞氏重排的化合物

其中

R₁包括衍生自糖残基的1-氨基-1-去氧-2-酮糖，所说糖残基最好是D-型的糖残基，该糖残基选自以下的糖的残基：葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、2-去氧-葡萄糖、6-去氧-葡萄、葡糖胺和半乳糖胺；

R₂包括氨基酸残基或肽残基，该肽残基最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的，最好是L-型的，选自下列的氨基酸：丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、蛋氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和亮氨酸。

2、根据权利要求1的化合物，其中R₁包括选自D-葡萄糖和D-半乳糖的糖残基。

3、根据权利要求1或2的化合物，其中R包括选自L-谷氨酸、L-天门冬氨酸和L-丝氨酸的氨基酸残基。

4、根据权利要求1的化合物的混合物。

5、生产下式的至少一种反应产物的方法，

其中

R₁′包括衍生自单糖、寡糖或多糖的1-氨基-1-去氧-2-酮糖、所说多糖最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的;

R₂′包括氨基酸残基或肽残基，所说肽残基，最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的;

该方法包括至少一种选自氨基酸和肽的物质和一种选自单糖、寡糖和多糖的第二物质在高温、任意压力下和/或在低级醇存在下相互反应，然后，使中间体进行阿马多瑞氏重排和/或美拉德反应;其中所说的多糖和肽最好是各为低分子量的，尤其是各为分子量小于1000道尔顿的。

6、根据权利要求5的方法，其中反应是在具有两个羧基的氨基酸和缓冲盐存在下进行的，该缓冲盐最好是摩尔比为1∶1的碳酸氢钠。

7、根据权利要求5或6的方法，其中至少一种单糖是与至少一种一元氨基酸反应的，而单糖和氨基酸的摩尔比在2∶1和1∶1之间，最好是1.5∶1。

8、根据权利要求5至7中任一项的方法，其中糖和/或糖化物与氨基酸和/或肽的反应是在温度为75-90℃的浓溶液中进行的，随后在相同的温度，任意压力下进行阿马多瑞氏重排，直至反应混合的颜色变为淡橙棕色，与此同时或随后除去溶剂。

9、根据权利要求5至8中任一项的方法，其中按存在于天然泥炭提取物的同样成分和同样重量比的单糖混合物是与按存在于所说提取物的同样成分和同样重量比的氨基酸混合物及任意地与存在于所说提取物的无机微量元素混合的，生成的作用物混合物在作为溶剂的水存在下，于高温和任意压力和/或低级醇存在下进行反应的，然后，溶解生成物，并继续进行反应，使发生阿马多瑞氏重排和/或美拉德反应，当反应混合物的颜色变为淡橙棕色，停止该反应，然后干燥反应混合物。

10、根据权利要求5至9中任一项的方法，其中干燥的产物是由柱色谱纯化的，收集可使铁氰化钾还原的特殊部分。

11、根据权利要求1至4中任一项的一种化合物，或者式R₁′-NH-R₂′的至少一种N-取代的反应产物的应用，该应用是用于生产诱导人的或哺乳动物的组织介素的产生的药物制剂;上式中R₁′包括衍生自单糖、寡糖和多糖的1-氨基-1-去氧-2-酮糖残基，所说多糖最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的;R₂′包括氨基酸残基或肽残基，所说肽残基，最好是低分子量的，尤其是分子量小于1000道尔顿的。

12、根据权利要求11的应用，其中所说的根据权利要求5至9中任一项的方法合成的，且至少有部分经过阿马多瑞氏重排和/或美拉德反应的反应产物是用于治疗和/或预防血液学的和/或免疫学的疾病和/或刺激人的和/或哺乳动物的免疫系统。

13、根据权利要求11或12的应用，其中R₂′是D-型单糖残基，该残基最好选自以下糖的残基，所说糖为葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、2-去氧-葡萄糖、6-去氧-葡萄糖、葡糖胺和半乳糖胺。

14、根据权利要求11至13中任一项的应用，其中R₂′是L-型的氨基酸残基或肽残基，最好选自以下氨基酸的残基，所说氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、蛋氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和亮氨酸。

15、根据权利要求11至14中任一项的应用，其中反应产物是与药学上可接受的载体和/或佐剂和/或任意的润滑剂按反应产物和其余成分之重量比为1∶1至1∶100混合的，较好是按重量比1∶8至1∶20混合的，最好是按重量比1∶9混合的。

16、根据权利要求15的应用，其中所说反应产物是与乳糖及润滑混合的，乳糖和润滑剂的重量比在20∶1和100∶1之间，最好是接近50∶1。

17、根据权利要求11至16中任一项的应用，其中所说的反应产物是以0.01-10%（重量），较好为0.01-1%（重量），尤其是0.05-0.10%（重量）存在于适合于美容使用的制剂中。