BG107831A

BG107831A - Комбинация от лекарства, по-специално хлорпромазин и пентамидин, за лечение на неопластични заболявания

Info

Publication number: BG107831A
Application number: BG107831A
Authority: BG
Inventors: Alexis Borisy; Curtis Keith; Michael A. Foley; Brent R. Stockwell
Original assignee: Combinatorx, Incorporated
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2003-05-20
Publication date: 2004-02-27
Also published as: TWI259077B; CN1484525A; EP1339399B1; US20070099906A1; SK5452003A3; WO2002058684A3; NZ525773A; US6569853B1; US7148216B2; IS6806A; HUP0400529A2; MXPA03003960A; ES2258566T3; AU2002246636B2; CY1105501T1; KR20030048460A; PT1339399E; KR100720205B1; RU2286769C2; US6846816B2

Description

Изобретението се отнася до лечение на неопластични заболявания, като напр. рак.

Предшествуващо състояние на техниката

Ракът е заболяване, проявяващо се в неконтролирано нарастване на ненормални клетки. Ненормалните клетки не изпълняват вече функцията на нормалните клетки, те растат и разрушават здравата тъкан.

Ракът на белите дробове е най-честата причина за смърта на мъже и жени. Той е вторият най-често срещащ се вид рак и сред мъжете и сред жените. Смята се, че ще има повече от 164,000 нови случая на рак на белите дробове в САЩ само за 2000-та година. Докато броят на случаите на заболявания от рак на белите дробове при мъжете в САЩ намалява, то той продължава да расте при жените. Ракът на белите дробове често причинява смърт. Съгласно данни на Американската асоциация по белодробни заболявания се смята, че през 2000-та година от рак на белите дробове ще починат 156,900 американци.

03-386-01/ВН

Раковите заболявания, които започват развитието си в белите дробове се разделят главно на два типа: белодробен рак на немалки клетки и белодробен рак на малки клетки, в зависимост от това, как изглеждат клетките под микроскоп. Белодробният рак на немалките клетки (люспеста карцинома на клетката, аденокарци нома, карцинома на голяма клетка) обикновено се разпространява в други клетки по-бавно, в сравнение с белодробния рак на малките клетки. Белодробният рак на малките клетки е по-рядко срещащ се тип, той представлява около 20 % от всички видове белодробен рак.

Други ракови заболявания включват рак на мозъка, рак на гърдата, цервикален рак, рак на дебелото черво, рак на стомаха, рак на бъбреците, левкимия, рак на черния дроб, лимфома, рак на яйчниците, рак на панкреаса, рак на простатата, рак на ректума, саркома, рак на кожата, рак на тестисите, рак на матката. Тези видове рак, както и ракът на белия дроб понякога се третират чрез химиотерапия.

Химиотерапевтичните лекарства, използвани понастоящем или които са в клинични изпитания включват следните: паклитаксел, доцетаксил, тамоксифен, винорелбин, гемцитабин, цисплатина, етопозид, топотекан, иринотекан, анастрозол, ритуксимаб, трастузумаб, флударабин, циклофосфамид, гентузумаб, карбоплатина, интерферон и доксорубицин. Най-често използваното противораково средство е паклитаксел, който се използва самостоятелно или с други химиотерапевтични средства, като 5-FU, доксорубицин, винорелбин, цитоксан и цисплатина.

Техническа същност на изобретението

Сега съгласно изобретението е установено, че комбинацията от антипсихотичното лекарство хлорпромазин и антипротозойното

03-386-01/ВН • · · · • · • · · ·

лекарство пентамидин притежава значителна антипролиферативна активност спрямо ракови клетки. Познати са структурни и функционални аналози на всяко от тези съединения и всеки от тези аналози може да бъде използван в комбинацията с антипролиферативно действие съгласно изобретението. Известни са също метаболити на хлорпромазина и пентамидина. Много от тези метоболити имат една или повече биологични активности, като тези на съединението, от което произхождат, и съответно също могат да се използват в антипролиферативната комбинация съгласно изобретението. Съответно съгласно изобретението е създаден метод за лечение на пациенти, които имат рак или друго новообразувание, чрез прилагане върху пациента на хлорпромазин и пентамидин, едновременно или в рамките на 14 дни едно след друго, в количество, достатъчно за да инхибира растежа на новообразуванието.

За предпочитане, двете съединения се прилагат в рамките на десет дни едно след друго, по-добре на пет дни едно след друго, и най-добре в рамките на 24 часа едно след друго, или даже се прилагат едновременно. Раковото заболяване, лекувано по всеки един от методите, описани по-долу, може да бъде рак на белия дроб (люспеста карцинома на клетката, аденокарцинома, карцинома на голяма клетка), рак на мозъка, рак на гърдата, цервикален рак, рак на дебелото черво, рак на стомаха, рак на бъбреците, левкимия, рак на черния дроб, лимфома, рак на яйчниците, рак на панкреаса, рак на простатата, рак на ректума, саркома, рак на кожата, рак на тестисите, рак на матката.

В подобен аспект, изобретението се отнася до лечение на пациент, който има новообразувание, като напр. рак. При този метод на пациента се прилага:

03-386-01/ВН ·· ·· ·· ··♦· ·· ··· 4···· ··· ··

- ········ · · · ·· · · · · · · · · ···· · · · · ··· · · · · (а) първо съединение, избрано от прохлорперазин, перфеназин, мепазин, метотримепразин, ацепромазин, тиопропазат, перазин, пропиомазин, путаперазин, тиетилперазин, метопромазин, хлорфенетазин, циамемазин, перфеназин, енантат, норхлорпромазин, трифлуоперазин, тиоридазин (или сол на всяко едно от съединенията, изброени по-горе) и антагонисти на допамин D2 (по-специално сулприд, пимозид, спиперон, етопропазин, клебоприд, бупропион и халоперидол), и

Ь) второ съединение, избрано от пропамидин, бутамидин, хептамидин, нонамидин, стилбамидин, хидроксистилбамидин, диминазен, бензамидин, 4,4’-(пентаметилендиокси) ди-, дихидрохлорид, фенамидин, дибромпропамидин, 1,3-бис(4амидино-2-метоксифенокси)пропан, фенамидин и амикарбалид (или сол на всяко едно от съединенията, изброени по-горе). Алтернативно, второто съединение може да бъде функционален аналог на пентамидин, като нетропсин, дистамицин, блеомицин, актиномицин или даунорубицин. Първото и второто съединения се прилагат за предпочитане едновременно или в рамките на 14 дни едно след друго в количество, достатъчно да инхибира растежа на новообразуванието.

В друг сроден аспект, изобретението се отнася до метод за лечение на пациенти, които имат новообразувание, напр. раково заболяване, чрез прилагане на следните съединения:

а) първо съединение с формула(I)

(I)

03-386-01/ВН в която R₂ е избран от групата на:

« · • · · • · • · • · • · · · • · ·· • · · · · ·· • ·· • ·

-CF,

А-1 —-CI

А-2

А-3

- осн₃

А-4 —-S

А-5

-сн₃

А-9 — OCF₃

N А-6

А-10

Rio е избран от групата на:

о ^0—^СН₃

03-386-01/ВН

всеки от заместителите R_b R₃, R₄, R₅, Re, R7, Rs и R₉, независимо от другите означава Н, F, OH, OCF₃, или OCH₃; и W е избран от групата на:

0	N	'хг
	Н	н₂
С-4	С-5	С-6

НС=СН

С-7 и Ь) второ съединение с формула (II):

(II)

03-386-01/ВН ·· ·· ·· ···· ·· ···

7···· ··· · ·

- ········ · · · ·· · · · · · · · · • ·· ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ·· в която Y и Z, независимо един от друг означават О или N, всеки заместител Rn и R12, независимо от другите означава Н, ОН, CI, Br, ОСН3, OCF3, NO2 или ΝΗ₂; η е цяло число от 2 до 6 и всеки заместител R13 и R14, независимо от другите е в мета- или парапозиция и е избран от групата на:

ΝΟΗ

νη₂

D-2

D-4 СН₃

при което първото и второто съединения се прилагат едновременно или в рамките на 14 дни едно след друго в количество, достатъчно да инхибира растежа на новообразуванието.

При всяко едно от описаните по-горе лечения, всяко съединение, което е част от комбинацията, се прилага върху пациента за предпочитане като част от фармацевтичен състав, който включва също и фармацевтично приемлив носител. Хлорпромазинът се прилага за предпочитане в дози от 10 до 2500 милиграма и пентамидинът се прилага за предпочитане в дози от 1 до 1000 милиграма. Предпочитани начини за приложение са интравенозно, интрамускулно, инхалационно и орално приложение.

Антипролиферативните комбинации съгласно изобретението могат да бъдат във вид на една фармацевтична опаковка. За предпочитане хлорпромазинът и пентамидинът се приготвят в обща форма за приложение или поотделно и имат индивидуални количества във формата за дозиране.

За специалиста в тази област е ясно, че съединенията са полезни също, ако са във вид на соли във формата за приложение. Така напр., както е описано тук изетионатната сол на пентамидина

03-386-01/ВН притежава синергична антипролиферативна активност, когато е в комбинация с хлорпромазина. Други соли на пентамидина включ ват платиновата сол, дихидрохлоридната сол и диметансулфонатната сол (вж. напр. Mongiardo et al., Lancet 2:108, 1989). По подобен начин, хлорпромазиновите соли включват напр.

хидрохлоридната сол и малеатната сол.

Съгласно изобретението са създадени също методи за идентифициране на съединения, полезни за лечение на пациенти имащи новообразувание. Методът включва етапи на контактуване на ракови клетки in vitro с (i) пентамидин или хлорпромазин и (ii) “кандидат” съединение, и се определя дали раковите клетки растат по-бавно, в сравнение с (а) случаи, в които раковите клетки са в контакт с хлорпромазин или пентамидин, но не са в контакт с “кандидат” съединението, и (Ь) случаи, в които раковите клетки са в контакт с “кандидат” съединението, но не са в контакт с хлорпромазин или пентамидин. “Кандидат” съединение, което при комбиниране с хлорпромазин или пентамидин редуцира пролиферацията на клетки, но в отсъствие на хлорпромазин или пентамидин не редуцира пролиферацията на клетки е съединение, което може да бъде полезно за лечение на пациенти с новообразувание.

Терапия с комбинацията съгласно изобретението може да се проведе по начина, по който се провежда химиотерапията, а именно в къщи, в кабинета на доктора, в клиника, в амбулаторно отделение на болница или в болница. Обикновено лечението започва в болница, за да може лекарят да наблюдава ефекта от терапията по-отблизо и да направи необходимите корекции в дозирането. Продължителността на комбинираното лечение зависи от вида на раковото заболяване, което се третира, от възрастта и състоянието на пациента, от етапа на развитие и вида на заболява03-386-01/ВН нето на пациента и от това как тялото на пациента отговаря на лечението.

Приложението на лекарството може да се осъществи в различни интервали (напр. един път на ден, един път на седмица или един път на месец) и приложението на всяка от съставките може да се определи индивидуално. Терапията с комбинацията може да се проведе чрез включване и изключване на цикли, така че да включва период за почивка, когато тялото на пациента има шанс да изгради здрави нови клетки и да възстанови силите си.

В зависимост от вида на рака и от неговия етап на развитие, терапията с комбинацията може да се използва за лечение на рака, за забавяне на разпространението на рака, за забавяне на растежа на рака, за убиване или ограничаване на раковите клетки, които могат да се разпространят в други части на тялото от мястото на първичния тумор, за облекчение на симптомите, причинени от рака или на първо място за предотвратяване на раково заболяване. Терапия с комбинацията може също да помогне на хората да живеят по-спокойно, чрез елиминиране на ракови клетки, които причиняват болка и дискомфорт.

Други качества и предимства на изобретението ще станат ясни от следващото по-подробно описание и от претенциите.

Подробно описание на изобретението

Беше описано, че комбинацията от антипсихотичното лекарство хлорпромазин и антипротозойното лекарство пентамидин притежава значителна антипролиферативна активност срещу ракови клетки. Концентрациите, които притежават максимална антипролиферативна активност срещу ракови клетки не са токсични срещу нормалните клетки. Така че, тази

03-386-01/ВН • · · · ····· ··· комбинация от лекарства е полезна за лечение на рак и на други новообразувания.

На базата на познатите свойства, на хлорпромазина и неговите аналози и метаболити и пентамидина и неговите аналози и метаболити, може да се предположи, че структурно сродни съединения могат да заместят хлорпромазина и/или пентамидина в антипролиферативните комбинации съгласно изобретението. Информация по отношение на всяко от лекарствените средства и техните аналози и метаболити е дадена по-долу.

Фенотиазини

Фенотиазини, които са полезни в антипролиферативната комбинация съгласно изобретението, са съединения с обща формула (I)

(I) в която R₂ е избран от групата на:

А-8

А-10

03-386-01/ВН ·· ·· ·· ··♦· ·♦ ··· -11_ ······· ·· ii ····«··· · · · • · ··· · ··· · • ·· ·· · **·> всеки от заместителите Ri, R3, R4, R₅, R₆, R₇,’1ft.8 и R9, независимо от другите означава Н, OH, F, OCF3, или ОСН3; W е избран от групата на:

'S '''	S ''	S''
С-1	zS> О ^U С-2	0 C-з

0	'⁴N^Z Н	С Н₂
С-4	С-5	С-6

03-386-01/ВН • · ··

/^снз

N ^ХСНз

В-4

N

V_CH₃

Предпочитани съединения са тези, в които R₂ е CI, всеки от заместителите Ri, R₃, R₄, R5, R6, R7, Rs ^и независимо от другите означава Н или F. За предпочитане всеки от заместителите Ri, R₄, R5, Re и R9 означава Н.

Най-често предписван за лечение член на семейството на фенотиазините е хлорпромазинът, който има следната структурна формула:

Хлорпромазинът е достъпен понастоящем в следните форми за приложение: таблети, капсули, супозитории, концентрати и сиропи за орално приложение и инжекционни форми.

Фенотиазини, които се смятат за аналози на хлорпромазина са флуфеназин, прохлорперазин, тиоридазин и трифлуоперазин. Много от тях имат равностойна антипсихотична или антиеметична активност с тази на хлорпромазина.

03-386-01/ВН ····

Смята се, че фенотиазините дължат своята антипсихотична и антиеметична ефективност на интерференцията с централните допаминергични проводящи пътища в мезолимбичната и медуларна химиорецепторна тригерна зона в областта на мозъка. Екстрапирамидалните странични ефекти са в резултат на взаимодействието с допаминергичните проводящи пътища в основните ганглии. Макар че често се наричат допаминови блокери, точният механизъм на допаминергичната интерференция, причина за антипсихотичната активност на лекарствата все още не е определен. Хлорпромазинът има силна алфа-адренергична блокираща активност и може да предизвика ортостатична хипотензия. Хлорпромазинът има също умерена антихолинергична активност, проявяваща се в пресъхване на устата отвреме на време, замъгляване на зрението, задържане на урината и запек. Хлорпромазинът повишава секрецията на пролактин, вследствие на неговото блокиращо действие върху допаминовите рецептори в хипофизата и хипоталмуса.

Хлорпромазинът се абсорбира лесно от гастроинтестиналния тракт. Неговата биологична достъпност се променя поради значителен метаболизъм при първото преминаване в черния дроб. Течните концентрати могат да имат по-голяма биодостъпност в сравнение с таблетите. Храната не изглежда да влияе върху биодостъпността. При интрамускулно приложение се постига повече от ефекта на първото преминаване и по-висока плазмена концентрация. Началото на действието при интрамускулно приложение е обикновено след 15 до 30 минути, а при орално приложение след 30 до 60 минути. При ректално приложение хлорпромазинът обикновено започва да действа по-бавно отколкото при орално приложение.

03-386-01/ВН • «

·· ···· • · « · V · • · ·· ··· ···· • · • · · ·· ··

Метаболити на хлорпромазина

Поради това, че хлорпромазинът претърпява екстензивна метаболитна трансформация в няколко метаболити, които могат да са терапевтичноактивни, тези метаболити могат да заместят хлорпромазина в антипролиферативната комбинация съгласно изобретението. При метаболизма на хлорпромазина протича напр. окислително N-деметилиране до получаване на първични и вторични амини; окисление на ароматната част до получаване на фенол; N-окисление до получаване на N-оксиди; S-окисление до получаване на сулфоксид или сулфон; окислително деаминиране на аминопропиловата странична група до получаване на фенотиазиново ядро и глюкуронизиране на фенолните хидроксилни групи и третичната аминогрупа до получаване на кватернерен амониев глюкуронид.

Други примери за метаболити на хлорпромазина, полезни за използване в антипролиферативната комбинация съгласно изобретението са тези метаболити, при които всяка от позициите 3, 7 и 8 на фенотиазина, независимо от другите, може да бъде заместена с хидроксилна или метокси група.

Пентамидин

Пентамидинът напоследък се използва за третиране на инфекции от Pneumocystis carinii, Leishmania donovani, Trypanosoma brucei, T. gambiense и T. rhodesiense.

Структурната формула на пентамидина е:

NH

ΝΗ₂

F-1 fe·

03-386-01/BH ♦ ··· • · · ·· · • · • · • ·

Той е достъпен във вид на форми за инжектиране или инхалации. За инжектиране пентамидинът е пакетиран като апирогенен лиофилизиран продукт. След отваряне той се прилага ·· «

• · · ·· ·· интрамускулно или интравенозно.

Изетионатната сол на пентамидина е бяло кристално прахо образно вещество, разтворимо във вода и глицерин и неразтворимо в етер, ацетон и хлороформ. Тя представлява химически 4,4’-диамидино-дифеноксипентан ди(Р-хидроксиетансулфонат).

Молекулната й формула е C23H36N4O10S2 и молекулното тегло е 592.68.

Начинът на действие на пентамидина не е напълно изяснен. Изследвания in vitro с тъкани от бозайници и протозои от вида Crithidia oncopelti показват, че лекарството влияе на ядрения метаболизъм, предизвиквайки инхибиране на синтезата на ДНК, рибонуклеинова киселина, фосфолипиди и протеини.

Малко се знае също и за фармакокинетиката на лекарството. При седем пациенти, третирани интрамускулно с дневна доза от 4 mg/kg пентамидин в продължение на 10 до 12 дни, плазмената концентрация е в граници от 0.3 до 0.5 pg/mL. Пациентите продължават да отделят намаляващи количества от пентамидин в урината от шест до осем седмици след прекъсване на третирането. Разпределението на пентамидина в тъканите е изследвано с мишки, на които се прилага чрез еднократно интраперитонеално инжектиране 10 mg/kg пентамидин. Установява се, че най-висока е концентрацията му в бъбреците и след това в черния дроб. При мишките пентамидинът се отделя непроменен, предимно чрез бъбреците и малко количество се отделя в изпражненията. Съотношението на количествата, изхвърлени чрез урината и чрез изпражненията (4:1) се запазва константно за периода на изследването.

03-386-01/ВН ··»·

Аналози на пентамидина

Ароматни диамидиносъединения могат да заместят пентамидина в антипролиферативната комбинация съгласно изобретението. Ароматни диамидиносъединения, като пропамидин, бутамидин, хептамидин и нонамидин имат подобни

свойства на тези на пентамидина, а именно те имат антипатогенни свойства или свойството да свързват ДНК. Други аналози (напр. стилбамидин и индолови аналози на стилбамидин, хидроксистилбамидин, диминазен, бензамидин, 4,4’-(пентаметилендиокси) ди-, дихидрохлорид, фенамидин, дибромпропамидин, 1,3-бис(4-амидино-2-метокси)пропан (DAMP), нетропсин, дистамицин, фенамидин, амикарбалид, блеомицин, актиномицин и даунорубицин) също имат подобни свойства на тези на пентамидина. Предполага се, че тези съединения ще имат антипролиферативна активност, когато се приложат в комбинация с хлорпромазин (или с аналог или метаболит на хлорпромазина).

Предпочитани аналози са описани напр. чрез формула (II)

в която Y и Z, независимо един от друг означават О или N, всеки заместител Rn и Ri₂, независимо от другите означава Н, ОН, CI, Вг, ОСНз, OCF3, NO₂ или ΝΗ₂; и е цяло число от 2 до 6 и всеки заместител R13 и R14, независимо от другите е в мета- или парапозиция и е избран от групата на:

03-386-01/ВН

NOH nh₂

D-1

D-2 π

·· ···· ·»··

Други аналози включват стилбамидин (G-1) и хидроксистилбамидин (G-2) и техни индолови аналози (напр. G-3).

G-3

Всяка амидинова група може да бъде заменена с една от групите, обозначени като D-2, D-3, D-4 или D-5 по-горе. Както в случая с фенотиазините и пентамидина, соли на стилбамидина и негови сродни съединения могат също да бъдат полезни по метода съгласно изобретението. Предпочитани соли са напр. дихидрохлоридната и метансулфонатната соли.

Метаболити на пентамидин

Метаболитите на пентамидина са полезни също в антипролиферативните комбинации съгласно изобретението.

03-386-01/ВН • · · · · · • е · · · ·

Пентамидинът се метаболизира лесно в тялото Х0*нЬ*й-м^Лк15’седйй ’* първични метаболита. Някои от тези метаболити проявяват една или повече от активностите на пентамидина. Възможно е някои от пентамидиновите метаболити да притежават антипролиферативна активност, когато се използват в комбинация с хлорпромазин или негов аналог.

По-долу са показани седем метаболита на пентамидина:

О(СН₂)₄СООН

G-1

О(СН₂)₄СН₂ОН

G-6

G-5

03-386-01/ВН

Терапия

Комбинации от съединения съгласно изобретението са полезни за лечение на новообразувание. Терапия с комбинацията може да се проведе самостоятелно или заедно с друга терапия (напр. хирургична, радиационна, химиотерапия, биологична терапия). Освен това, човек, за когото има голям риск от развитие на новообразувание (напр. човек, който генетично е предразположен към това заболяване или който предварително е имал неоплазма) може да се подложи на профилактично лечение, за да се избегне или да се отложи образуването на неопластично образувание.

Дозата на приложение и честотата на приемане на всеки компонент може да се контролира индивидуално. Така напр.

едното съединение може да се прилага орално три пъти на ден, докато второто съединение може да се прилага интрамускулно един път на ден. Съединенията могат да се приготвят във форма за приложение заедно, така че при едно приложение да се доставят и двете съединения. Формите за приложение и дозите са описани по долу.

Приготвяне на фармацевтични състави

Прилагането на всяко съединение от комбинацията може да стане по подходящ начин, който да осигури такава концентрация от съединението, която в комбинация с другия компонент има специфично анти-неопластично действие при достигане на желания регион. Съединението може да се съдържа във всяко подходящо количество, заедно с който и да било подходящ носител, и е налично обикновено в количество от 1-95 тегл. % спрямо общото тегло на състава. Съставът може да се осигури във форма за еднократно дозиране, която е подходяща за орално,

03-386-01/ВН

ОП ·· ·· ·· ···· ······

- ZU - ······· · ·· • · · · ···· · · · • · · ·· · ···· парентерално (напр. интравенозно, интрамускуУГй*о)’,*рекТк^АЪ, ···· локално, назално, вагинално, инхалентно, кожно (във вид на пластир) или окуларно приложение. Така че, съставът може да бъде под формата напр. на таблети, капсули, хапчета, пудра, гранулат, суспензия, емулсия, разтвор, гел, включително хидрогел, пасти, мазило, крем, пластир, дренаж, устройство за доставяне, супозитории, клизма, инжекции, имплантат, спрей или аерозол. Фармацевтичните състави могат да се приготвят съгласно обичайната фармацевтична практика (вж. напр. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19^th ed.) ed. A.R. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA. и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 19881999, Marcel Dekker, New York.

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да се приготвят в такава форма, че да освобождават активното съединение по същество веднага след приложението, или за предварително определено време или период от време след приложението. Последният вид състави са познати главно като форми с контролирано освобождаване, които включват (i) форми, които осигуряват по същество константна концентрация на лекарството в тялото за един продължителен период от време; (И) форми, които след предварително определено време на закъснение осигуряват по същество константна концентрация на лекарството в тялото за един продължителен период от време; (iii) форми, които запазват действието на лекарството по време на предварително определен период от време, чрез запазване на относително постоянни ефективни нива на лекарството в тялото със съпътстващо минимизиране на нежеланите странични ефекти, свързани с флуктуацията в плазменото ниво на активното лекарствено вещество (кинетичен модел “sawtooth”),

03-386-01/ВН

(iv) форми, които локализират действието на лбИ^рСТвотСГ, й*Япр. ·· ·· чрез пространствено разполагане на състава за контролирано освобождаване, чрез прикрепяне към или в болната тъкан или орган, (v) форми, които насочват действието на лекарството чрез използване на носители или химични производни за доставяне на лекарството в специално целения тип клетки.

Прилагането на съединенията във вид на форма за контролирано освобождаване се предпочита специално в случаи, в които съединението, само или в комбинация има (i) тесен терапевтичен индекс (т.е. разликата между плазмената концентрация, водеща до опасни странични ефекти или до токсична реакция и плазмената концентрация, която води до терапевтичен ефект е малка; обикновено терапевтичният индекс TI се дефинира като съотношение на средната летална доза (LD50) със средната ефективна доза (ED₅₀); (ii) тесен абсорбционен прозорец в гастроинтестиналния тракт; или (iii) много кратък биологичен период на полуразпадане, така че е необходимо често дозиране през деня, с цел да се поддържа плазменото ниво на необходимото терапевтично ниво.

Всяка от известните стратегии може да се приложи с цел да се постигне контролирано освобождаване на формата за приложение, при която скоростта на освобождаване превишава скоростта на метаболизъм на съединението, за което става дума. Например, контролирано освобождаване се получава чрез подходящ подбор на различни параметри и ингредиенти за получаване на формата, включително т.н. различни типове съединения за контролирано освобождаване и покрития. За целта, лекарственото вещество се приготвя с подходящи добавки във фармацевтичен състав, така че при приложение в организма астивното вещество да се освобождава по контролиран начин.

03-386-01/ВН ·· ·· ····

Примери представляват еднокомпонентни или мн6г<5ком!/оп1?нтнй· '* състави във вид на таблети или капсули за еднократно дозиране, маслени разтвори, суспензии, емулсии, микрокапсули, микросфери, наночастици, пластири и липозоми.

Твърди форми за дозиране за орално приложение

Формите за орално приложение включват таблети, съдържащи активният компонент(компоненти) в смес с нетоксичен фармацевтично приемлив инертен пълнител. Този пълнител може да бъде напр. инертен разредител или носител (напр. сукроза, сорбитол, захар, манитол, микрокристална целулоза, нишесте, като картофено нишесте, калциев карбонат, натриев хлорид, лактоза, калциев фосфат, калциев сулфат или натриев фосфат); гранулиращи и разпределящи средства (напр. производни на целулозата, като микрокристална целулоза, нишесте, като картофено нишесте, натриева кроскарамелоза, алгинати или алгинова киселина); свързващи средства (напр. сукроза, глюкоза, сурбитол, акация, алгинова киселина, натриев алгинат, желатин, нишесте, предварително желатинирано нишесте, микрокристална целулоза, магнезиевоалуминиев силикат, натриева карбоксиметилцелулоза, метилцелулоза, хидроксипропилметилцелулоза, етилцелулоза, поливинилпиролидон или полиетиленгликол); смазващи средства, хлъзгащи средства и антиадхезиви (напр. магнезиев стеарат, цинков стеарат, стеаринова киселина, силикати, хидрогенирани растителни масла или талк). Други фармацевтично приемливи пълнители могат да бъдат оцветители, ароматизиращи средства, пластификатори, овлажнители, буфериращи средства и други подобни.

Таблетите могат да бъдат без покритие или с покритие, нанесено по познатата техника, по-специално да осигури

03-386-01/ВН

0*5 ·· ·· ·· ·*·· ······

- Z_5 - ······· · ·· • · · · · · · · · · разпадане и абсорбция в гастро-интестиналнияЧфГай! и п*0 ···· начин да осигурава поддържащо действие за по-дълъг период от време. Покритието може да бъде пригодено така, че да освобождава активното лекарствено вещество по предварително определен модел (напр. с цел да се осъществи контролирано освобождаване) или може да бъде пригодено така, че да не

освобождава активното лекарствено вещество, докато не премине стомаха (ентерично покритие за освобождаване в червата). Покритието може да бъде захарно покритие, филм-покритие (т.е. на базата на хидроксипропилметилцелулоза, метилцелулоза, метилхидроксиетилцелулоза, хидроксипропилцелулоза, карбоксиметилцелулоза, акрилатни съполимери, полиетиленгликоли и/или поливинилпиролидон) или ентерично покритие (т.е. на базата на съполимер на метакрилова киселина, целулозен ацетатфталат, фталат на хидроксипропил метилцелулоза, ацетатсукцинат на хидроксипропил метилцелулоза, поливинилацетатфталат, шеллак и/или етилцелулоза). Освен това може да се използва отлагащ във времето материал, като напр. глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Съставите, приготвени като твърди таблети могат да съдържат покритие, пригодено да защити състава от нежелани химични промени (напр. химично разпадане преди освобождаване на активното лекарствено вещество). Покритието може да бъде нанесено върху твърдата форма за дозиране по подобие на метода, описан в Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, вж. по-горе.

Двете лекарствени вещества могат да се смесят в таблетата или могат да се разделят. Примерно, първото лекарство може да се разположи във вътрешността на таблетата, а второто лекарство от външната й страна, така че основната порция от второто вещество

03-386-01/ВН ·· • 9 ·· ···· • « · · ·· да се освобождава преди да започне освобождаването на* първото” вещество.

Формите за орално приложение могат да бъдат във вид на таблети за дъвчене или във вид на твърди желатинови капсули, в които активният компонент е смесен с инертен твърд разредител (напр. картофено нишесте, лактоза, микрокристална целулоза, калциев карбонат, калциев фосфат или каолин, или като меки желатинови капсули, в които активният компонент е смесен с вода или маслена среда, напр. фъстъчено масло, течен парафин или маслинено масло. Прахообразни форми и гранулати могат да се получат при използване на компонентите, споменати по-горе за получаване на таблети и капсули по обичаен начин, при използане напр. на миксер, апарати в кипящ слой или апарати за сушене при пулверизиране.

Орални форми за дозиране с контролирано освобождаване Орални форми за дозиране с контролирано освобождаване могат напр. да бъдат изградени така, че да освобождават активното лекарствено вещество чрез контролиране на разтворимостта и/или дифузията на активното вещество.

Контролиране на освобождаването чрез разтворимостта или дифузията може да се осъществи чрез нанасяне на подходящи покрития върху таблети, капсули, хапчета или гранулатни форми на съединенията, или чрез вграждане на активното вещество в подходяща матрица.

Покрития за контролирано освобождаване могат да включват едно или повече от веществата за покритие, посочени по-горе и/или напр. шеллак, пчелен восък, гликовосък, рицинов восък, карнаубски восък, стеарилов алкохол, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, глицеролпалмитостеарат, етилцелулоза,

03-386-01/ВН

- ZD - ······· • · · · · · · акрилови смоли, dl-полимлечна киселина, целул<5§е1Т aiieVal• · ·· • · бутират, поливинилхлорид, поливинилацетат, винилпиролидон, полиетилен, полиметакрилат, метилметакрилат, 2-хидроксиметакрилат, метакрилатни хидрогелове, 1,3-бутиленгликол, етиленгликолметакрилат и/или полиетиленгликоли. За контролирано освобождаване на форми с матрица може да се използва материал на матрицата като напр. хидратирана метилцелулоза, карнаубски восък и стеарилалкохол, карбопол 934, силикон, глицерилтристеарат, метилакрилат-метилметакрилат, поливинилхлорид, полиетилен и/или халогенирани флуоровъглероди.

Съставите за контролирано освобождаване, съдържащи едно или повече от съединенията, посочени в комбинациите съгласно патентните претенции, могат да бъдат също под форма на таблети или капсули, способни да се държат на повърхността (напр. таблета или капсула, която след орално приложение плува на повърхността на стомашното съдържание за известен период от време. Таблетни форми на активното съединение (съединения), които могат да стоят на повърхността, могат да се приготвят чрез гранулиране на сместа от лекарството (лекарствата) с пълнители и 20-75 % тегл./тегл. от хидроколоидни вещества, напр. хидроксиетилцелулоза, хидроксипропилцелулоза и хидроксипропилметилцелулоза. Получените гранули след това могат да се пресоват до получаване на таблети. При контакт със стомашния сок, таблетните форми образуват по същество водонепропускаема бариера от гел върху повърхността си. Тази гелна бариера играе роля за задържане на гъстотата по-ниска от едно, при което позволява таблетите да останат да плуват над повърхността на стомашния сок.

03-386-01/ВН •ft ft···

Течни форми за орално приложение .....* .......

Прахове, разхръскващи се прахове или гранулата, подходящи за получаване на суспензии при прибавяне на вода са удобни форми за орално приложение. Формата във вид на суспензия осигурява активният компонент в смес с диспергиращи или омокрящи средства, суспендиращи средства и един или повече консерванти. Подходящи диспергиращи или омокрящи средства са напр. природни фосфатиди (като лецитин или кондензационни продукти на етиленоксид с мастна киселина, алифатни алкохоли с дълга въглеродна верига или частични естери, производни на мастни киселини) и хекситол или хекситоланхидрид (като полиоксиетилен стеарат, полиоксиетилен сорбитолмоноолеат, полиоксиетилен сорбитан моноолеат и други подобни). Подходящи суспендиращи средства са напр. натриева карбоксиметилцелулоза, метилцелулоза, натриев алгинат и други подобни.

Състави за парентерално приложение

Фармацевтичните състави могат да се приложат също парентерално чрез инжектиране, инфузия или имплантация (интравенозно, интрамускулно, подкожно или по подобен начин) на форми за еднократно дозиране, формулировки или чрез подходящи доставящи устройства или имплантанти, съдържащи обичайни нетоксични фармацевтично приемливи носители и добавки. Получаването на форми за приложение на такива състави е добре познато на специалиста в тази област. Специфични форми за приложение са описани в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, както по-горе.

Съставите за парентерално приложение могат да бъдат във вид на форма за еднократно дозиране (като ампули, съдържащи еднократна доза), или във вид на флакони съдържащи няколко

03-386-01/ВН ·· ·· ·· ···· ·< ···· • · · · · · * ·· · ·· · · · - · · * · · • · · · · · · · ♦ · дози, в които може да се добави подходящ консервант (вж.*по- ” ” долу). Съставът може да бъде под формата на разтвор, суспензия, емулсия, приспособление за инфузия, или уред за доставяне чрез имплантация, или може да бъде във вид на прах, който да бъде разтворен във вода или в друг подходящ носител преди употреба.

Освен активното лекарствено вещество (вещества) съставът може да съдържа подходящ за парентерално приложение носител и/или добавка. Активното лекарствено вещество (вещества) може да бъде вградено в микросфери, микрокапсули, наночастици, липозоми или други с цел контролирано освобождаване. Освен това, съставите могат да съдържат суспендиращи, повишаващи разтворимостта, стабилизиращи, нагласяващи pH-стойността и/или диспергиращи средства.

Както е посочено по-горе, фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да бъдат под форма, подходяща за стерилно инжектиране. За получаване на такива състави, подходящо активно лекарствено вещество (вещества) се разтваря или суспендира в приемлив за парентерално приложение течен носител. Между приемливите носители и разтворители, които могат да се използват са вода, вода, на която е нагласена стойността на pH чрез прибавяне на подходящо количество солна киселина, натриев хидроксид или подходящ буфер, 1,3-бутандиол, разтвор на Ringer и изотоничен разтвор на натриев хлорид. Водните форми могат да съдържат също един или повече консерванти (напр. метил, етил или η-пропил р-хидроксибензоат). В случаи, когато едно съединение е само умерено или слабо разтворимо във вода, може да се добави повишаващо разтворимостта или разтварящо средство, или разтворителят може да съдържа 10-60 % тегл./тегл. от пропиленгликол или подобни.

03-386-01/ВН

- 28 Състави за парентерално приложение с контролирано*’* освобождаване

Съставите за парентерално приложение с контролирано освобождаване могат да бъдат под формата на водни суспензии, микросфери, микрокапсули, магнитни микросфери, маслени разтвори, маслени суспензии или емулсии. Алтернативно, активните лекарствени вещества могат да бъдат вградени в биосъвместими носители, липозоми, наночастици, имплантати или приспособления за инфузия.

Материали, подходящи за използване при получаване на микросфери и/или микрокапсули, са напр. биоразлагащи се/биоерозиращи полимери, като полиглактин, поли(изобутилцианоакрилат), поли(2-хидроксиетил-Ь-глутамин) и поли(млечна киселина).

Биосъвместими носители, които могат да се използват при получаване на парентерални форми за контролирано освобождаване, са въглеводороди (напр. декстрани), протеини (напр. албумин), липопротеини или антитела.

Материалите, които могат да се използват като имплантати, са небиоразграждащи се (напр. полидиметилсилоксан) или биоразграждащи се (напр. поли(капролактон), поли(млечна киселина), поли(гликолова киселина) или поли(орто-естери).

Състави за ректално приложение

Подходящи за ректално приложение форми на състава са супозитории (от емулсионен или суспензионен тип), ректални желатинови капсули (разтвори или суспензии). При типичния случай на приготвяне на супозитории, активното вещество (вещества) се смесва с подходяща фармацевтично приемлива база, като какаово масло, естерифицирани мастни киселини, глицери03-386-01/ВН • · · : : . . .

·*·· ·· ·· ··· — ο ниран желатин, различни водоразтворими или диспергируеми бази, ·· като полиетиленгликоли и естери на полиоксиетилен сорбитанмаслени киселини. Може да се прибавят също различни добавки, подобряващи средства, повърхностноактивни вещества и други.

Състави за инхалации

За приложение чрез инхалации обичайнити форми за дозиране включват спрейове и аерозоли за впръскване пред носа. Типична форма за впръскване през носа съдържа активният компонент (компоненти), разтворен или диспергиран в подходящ носител. Фармацевтично приемливите носители и разредители (както и други фармацевтично приемливи материали, налични в състава, като резредители, сгъстители, подобряващи, ароматизиращи средства и консерванти) се избират в съответствие с обичайната фармацевтична практика, по начин, познат за специалиста в областта на получаване на форми за фармацевтично приложение.

Перкутанни и локални състави

Фармацевтичните състави могат също да се приложат локално върху кожата чрез перкутанна абсорбция във форми за дозиране или формулировки, съдържащи обичайните нетоксични фармацевтично приемливи носители и пълнители, включително микросфери и липозоми. Формулировките включват кремове, мазила, лосиони, мехлеми, гелове, хидрогелове, разтвори, суспензии, стикове, спрейове, пасти, пластири и други видове трансдермални системи за доставяне на лекарството. Фармацевтично приемливи носители и пълнители могат да включват емулгиращи средства, антиоксиданти, буферни средства, консерванти, овлажнители, повишаващи проникването вещества,

03-386-01/ВН хелатообразуващи средства, гелобразуващи средства, ма*зилни

9999

бази, ароматизиращи средства и средства, предпазващи кожата. Примери за емулгиращи средства са природни смоли (напр. акациева смола, трагант) и природни фосфатиди (напр. соев лецитин и производни на сорбитан моноолеат). Примери за антиоксиданти са бутилиран хидроксианизол (ВНА), аскорбинова киселина и нейни производни, токоферол и негови производни, бутилиран хидроксианизол и цистеин. Примери за консерванти са парабени, като метил- или пропил р-хидроксибензоат и бензалкониев хлорид. Примери за овлажнители са глицерин, пропиленгликол, сорбитол и карбамид. Примери за повишаващи проникването вещества са пропиленгликол, диметилсулфоксид, триетаноламин, Ν,Ν-диметилацетамид, Ν,Ν-диметилформамид, 2-пиролидон и техни производни, тетрахидрофурфурилов алкохол и Azone.RTM. Примери за хелатообразуващи средства са натриева сол на етилендиаминтетраоцетна киселина, лимонена киселина и фосфорна киселина. Примери за гелобразуващи средства са карбопол, целулозни производни, бентонит, алгинати, желатин и поливинилпиролидон. Примери за мазилни бази са пчелен восък, парафин, цетилпалмитат, растителни масла, сорбитанови естери на мастни киселини (Span), полиетиленгликоли и кондензационни продукти между сорбитанови естери на мастни киселини и етиленоксид (напр. полиоксиетилен сорбитан моноолеат (Tween)).

Фармацевтичните състави описани по-горе за локално приложение върху кожата могат да се използват също във връзка с локално приложение върху или близо до тази част от тялото, която подлежи на лечение. Съставите могат да бъдат пригодени за ди ректно приложение или за въвеждане в отделни отвори на тялото (напр. ректално, уретрално, вагинално или орално). Съставите могат да се прилагат с помощта на специални приспособления за

03-386-01/ВН

• · · •··♦ ·· въвеждане на лекарството, като напр. превръзки или алтернативни пластири, тампони, гъби, ленти или други форми от подходящи еластични материали.

Състави за перкутанно и локално приложение с контролирано освобождаване

Има няколко начина за осигуряване на контрол върху скоростта на освобождаване при трансдермално преминаване на лекарството, включително: системи за мембранно забавяне, адхезивна дифузионно контролирана система, система от типа матрична дисперсия и система с микрорезервоари. Контролираното освобождаване на състави за перкутанно и/или локално приложение могат да се получат при използване на подходящи смеси по споменатите по-горе начини.

При системите за мембранно забавяне, активното лекарство се намира в резервоар, който е капсулован напълно в плитка камера, оформена от непроницаем за лекарството слоест материал, като напр. металопластичен ламинат, и контролираща скоростта полимерна мембрана, като микропорьозна или непорьозна полимерна мембрана (напр. етилен-винилацетатен съполимер). Активното съединение може да се освободи само през контролиращата скоростта полимерна мембрана. В резервоара лекарството може да бъде или диспергирано в твърда полимерна матрица или суспендирано във вискозна течна среда, напр. силиконова течност. На външната повърхност на полимерната мембрана е приложен тънък слой от адхезивен полимер, за да осигури интимен контакт на трансдермалната система с кожната повърхност. Адхезивният полимер е за предпочитане хипоалергенен полимер, който е съвместим с активното вещество.

03-386-01/ВН ♦· ···· ·* »·»· ·♦··♦··· • · · · · «

При адхезивната дифузионно контролирана система има

9 • · • · « ·· ·· резервоар за активното лекарство, оформен чрез директно диспергиране на активното вещество в адхезивен полимер и след това адхезивът, съдържащ активното вещество се разстила върху плоско фолио от по същество непропускаща лекарството метална пластмасова подложка, до получаване на тънкослоен резервоар с лекарството. Системата от типа матрична дисперсия се характеризира с това, че резервоарът съдържащ активното лекарство се получава чрез хомогенно диспергиране на активното лекарствено вещество в хидрофилна или липофилна полимерна матрица и след това съдържащият лекарството полимер се оформя във вид на диск с по същество добре оформена повърхностна площ и дебелина. Адхезивният полимер се разстила по продължение на кръга до получаване на ивица от адхезив около диска.

При системата с микрорезервоар, резервоарът за активното вещество се получава чрез суспендиране на лекарството в твърдо състояние във воден разтвор на водоразтворим полимер и след това суспензията на лекарството се диспергира в липофилен полимер до получаване на множество микроскопични сфери, които са резервоари за лекарството.

Дозиране

Дозирането на всеки компонент от комбинацията съгласно претенциите зависи от няколко фактора, включително: метод на приложение, заболяването, което се лекува, сериозността на заболяването, дали целта на третирането е лечение или профилактика, както и възрастта, теглото и състоянието на пациента, който се лекува.

Съединенията се прилагат за предпочитане в количество от около 0.1 до 30 mg/kg телесно тегло дневно и по-добре в

03-386-01/ВН

- Αή - ·♦···* «· * J · ♦ · ·· · ··♦·* « ·i * * * * * * * количество от около 0.5 до 15 mg/kg телесно те‘гло дневно, както’ е описано по-горе, активното съединение може да се приложи орално във вид на таблети, капсули елексири или сиропи, или ректално под формата на супозитории. Изгодно е парентералното приложение на съединението да се проведе във вид на физиоло гичен разтвор или със съединение, вградено в липозоми. В случаи, когато съединението не е достатъчно разтворимо, за да бъде разтворено може да се използва разтворител, като напр. етанол. По-долу, с цел да се илюстрира е описано дозирането на хлорпромазина и пентамидина. За специалиста е ясно, че ако хлорпромазинът или пентамидинът бъде заменен с друго съединение, коректната доза на това съединение може да се определи при изследване на ефикасността на това съединение, чрез опити за пролиферация на клетки, както и за неговата токсичност в човешкия организъм.

Орално приложение

Дозата от хлорпромазин, пригоден за орално системно приложение, е обикновено от около 1 mg до 1000 mg в прилаганата форма за еднократно дозиране (за предпочитане около 5 mg до 500 mg, и по-добре 10 mg до 300 mg), която се взима от 1 до 10 пъти дневно (за предпочитане 5 пъти дневно), в продължение на от един ден до една година и дори може да се взема до края на живота на пациента. Тъй като комбинациите съгласно изобретението действат предимно по-скоро като цитостатични, отколкото като цитотоксични средства, те притежават ниска токсичност и в много случаи индикацията е за хронично, продължително лечение. При лечението могат да бъдат необходими дневни дози до 8 g.

Дозата от пентамидин е обикновено от около 0.1 mg до 300 mg в прилаганата форма за еднократно дозиране (за предпочитане

03-386-01/ВН

Ф-Ф фф »• · · · · ^τί 1 · · i J I ·.

»* · *« · · IMv* ⁹ * * * около 1 mg до 100 mg), която се взима от 1 до 4 пъти дневно, в продължение на от един ден до една година и дори както при хлорпромазина може да се взема до края на живота на пациента. Приложението може също така да става на цикли, такива, че да има периоди през които да не се прилага пентамидин. Тези периоди могат да бъдат напр. от един ден, седмица, месец или година, или повече.

Ректално приложение

В съставите, пригодени за ректално приложение с цел профилактика, обичайно се предпочита наличие на малко поголямо количество от съединението. Така, дозата от хлорпромазин е обикновено от около 5 mg до 2000 mg в прилаганата форма за еднократно дозиране (за предпочитане около 10 mg до 1000 mg, и по-добре 25 mg до 500 mg), която се взима от 1 до 4 пъти дневно. Продължителността на лечението е същата, както е описано за оралната форма за приложение. Дозирането на пентамидина е същото, както е описано за оралното приложение на пентамидина.

Парентерално приложение

За интравенозно и интрамускулно приложение на хлорпромазина се препоръчват дози от 0.1 mg/kg до около 100 mg/kg телесно тегло дневно, като се предпочитат дози от 1 mg/kg до около 25 mg/kg и най-добре от 1 mg/kg до около 10 mg/kg. Пентамидинът се прилага в дози от 0.1 mg/kg до около 20 mg/kg телесно тегло дневно, за предпочитане от 0.5 mg/kg до около 10 mg/kg и най-добре от 1 mg/kg до около 4 mg/kg.

Обикновено всяко съединение се прилага ежедневно в продължение на 6 до 12 месеца или по-дълго. Може да е желателно съединението да се прилага през период от един до три часа. Този период може да се продължи до 24 часа или повече. Както беше

03-386-01/ВН

посочено при указанията за орално приложение*,’може да има • · · : I ·.

• · « · • · · · период от около един ден до една година или по-вече, през който най-малко едното от лекарствата не се прилага.

Инхалации

За лечение чрез инхалация хлорпромазинът се прилага в доза около 1 mg до 1000 mg, за предпочитане около 10 mg до 500 mg дневно. За пентамидина дозата за дневно приложение е около 10 mg до 1000 mg, за предпочитане около 30 mg до 600 mg.

Перкутанно приложение

За локално приложение се предпочита всяко от съединенията да се прилага в доза около 1 mg до 5 g един до десет пъти дневно в продължение на една седмица до 12 месеца.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери служат за илюстрация на изобретението. Те не трябва да ограничават изобретението по никакъв начин.

Пример 1

Получаване на матрица с разтвори на хлорпромазин/пентамидин изетионат

Приготвят се изходни разтвори на хлорпромазин и пентамидин изетионат (Sigma catalog, номера С8138 и съответно Р0547) в диметилсулфоксид (DMSO) с концентрации от 11.25 mM и съответно 6.74 шМ. Прави се 8Х изходен разтвор (128 μΜ) от всяко индивидуално съединение в среда Dulbecco,s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco 11995-040), съдържаща 10 % ембрионален волски серум (FBS), 200 mM L-глутамин и 1 % антибиотичен/антимикотичен разтвор. От тях чрез двукратно разреждане се правят серии в DMEM. Тези серии осигуряват 9 концентрации с

03-386-01/ВН количества в граници от 64 μΜ до 240 пМ и една концентрация о’т

М. Приготвя се матрица от смеси на съединението чрез запълване на колоните на плоча с 384 гнезда със сериите от разтвори на хлорпромазин (първата колона: 32 μΜ; втора колона: 16 μΜ; трета колона: 8 μΜ; четвърта колона: 4 μΜ; пета колона: 2 μΜ; шеста колона: 1 μΜ; седма колона: 500 пМ; осма колона: 250 пМ; девета колона: 125 пМ; десета колона: липсва активно

съединение) и редиците се пълнят с разредените серии от пентамидин (първата колона: 32 μΜ; втора колона: 16 μΜ; трета колона: 8 μΜ; четвърта колона: 4 μΜ; пета колона: 2 μΜ; шеста колона: 1 μΜ; седма колона: 500 пМ; осма колона: 250 пМ; девета колона: 125 пМ; десета колона: липсва активно съединение), при използване на 16-канална пипета (фина пипета). Тази плоча със смеси на съединенията осигурява 4Х концентрации от всяко съединение, които се преместват върху плочите за провеждане на опита. Така че, по този начин матрицата с разтвори съдържа 100 различни позиции - 81 гнезда, в които са налични вариращи количества от хлорпромазин и пентамидин, както и 10 позиции със серии на разреждане (2-кратно) за всяко индивидуално съединение.

Пример 2: Опит за антипролиферативна активност

Матрицата с разтвори на съединението се изследва при използване на метода за получаване на цитопетна с А549 бромодеоксиуридин (BrdU). Четиридесет и пет микролитра от суспензия, съдържаща А549 белодробни клетки от аденокарцинома (ATCC# CCL-185) се посяват в клетъчна култура върху стерилна плоча с 384 гнезда от бял непрозрачен полистирен (NalgeNunc#164610), при използване на мултикапкомер (Labsystems) до получаване на гъстота от 3000 клетки на гнездо. Петнадесет микролитра от 4Х матрични смеси на съединението се прибавят към всяко гнездо на

03-386-01/ВН плочата, съдържащо клетки. Матрицата от смеси на съединението се прехвърля, при използване на 16 канална пипета (фина пипета). Допълнително, към всяка плоча се добавят контролни гнезда с паклитаксел (крайна концентрация 4.6 μΜ), подофилотоксин (9.6 μΜ) и квинакрин (8.5 μΜ). Всеки експеримент се провежда чрез утрояване на плочите.

След инкубация в продължение на 48 часа при 37°С към всяко гнездо се прибавя BrdU с концентрация 10 μΜ. След 16 часа средата се аспирира и клетките се фиксират чрез прибавяне на 70 % етанол и фосфат-буфериран физиологичен разтвор (PBS) при стайна температура в продължение на 1 час. Фиксаторът се аспирира, към всяко гнездо се поставя 2Ν HCI с Tween 20 (полиоксиетилен сорбитан моноолеат) и плочите се инкубират в продължение на 20 минути при стайна температура. Солната киселина се неутрализира с 2N NaOH и клетките се промиват двукратно с разтвор Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) и веднаж c PBS, съдържащ волски серумен албумин (BSA) и 0.1 Tween 20. Промивният разтвор се отстранява и миши анти-BrdU първични антитела (PharMingen#555627) се разреждат 1:1000 в PBS, съдържащ BSA, Tween 20 и вторични антитела при разреждане 1:2000 (Amersham#NA931). Вторичното антитяло разпознава мишите антитела и то се свързва към ензимът хрян-пероксидаза (HRP). След инкубация в продължение на един час, разтворът с антитела се отстранява и клетките се промиват еднократно с PBS. След промиването с PBS към всяко гнездо се прибавя HRPсубстрат (който съдържа луминол, водороден пероксид и усилвател, като пара-йодофенол). Резултатите от опитите върху плочите се отчитат при използване на LJL-анализ. Всички аспирации, както и промивките с PBS и HBSS се провеждат при използване на уред от вида TECAN Power Washer 384. Количе38

03-386-01/ВН ството на светлинна емисия от всяко гнездо е индикатор за?··* количеството на ДНК-синтез, който е протекъл в това гнездо. Понижаването на светлинна емисия е индикатор за антипролиферативното действие на съединенията.

Луминисценцията на всяка позиция в матрицата от разтвори на хлорпромазин/пентамидин се разделя на луминисцентни стойности за А549 клетки, третирани само с диметилсулфоксиден носител, осигуряващи антипролиферативна степен за всяка позиция в матрицата от разтвори на хлорпромазин/пентамидин. Антипролиферативната степен се изчислява също и за използваните за сравнение лекарства паклитаксел, подофилотоксин и квинакрин.

Таблица - Антипролиферативна степен

Концентрации на пентамидин (μΜ)

	8	4	2	1	0.5	0.25	0.13	0.06	0.03	0
8	6.8	6.3	5.1	3.7	2.7	3.1	2.4	2.3	2.3	2.6
4	7.8	9.7	5.9	5.5	4.0	4.3	4.1	3.2	2.8	2.9
2	8.4	9.0	4.8	4.5	5.0	3.6	3.2	3.0	2.3	2.4
1	8.0	6.9	5.1	5.6	4.7	3.3	2.8	2.3	1.9	1.8
0.5	7.6	7.0	4.4	4.9	2.9	3.3	1.9	1.8	1.6	1.7
0.25	6.6	6.1	3.7	6.2	3.7	3.8	1.6	1.6	1.3	1.3
0.13	6.2	4.7	3.0	5.2	2.8	2.4	1.4	1.3	1.1	1.2
0.06	5.0	5.0	3.1	3.0	2.3	2.0	1.3	1.1	1.2	1.0
0.03	4.3	4.1	3.2	3.0	2.6	1.9	1.2	1.1	1.0	1.1
0	4.9	3.9	3.0	2.9	3.0	2.3	1.4	1.2	0.9	1.0

При концентрация 4.0 μΜ пентамидин изетионатът, когато е сам, се осигурява антипролиферативна степен от 3.9 и тя се

03-386-01/ВН повишава до 4.9, когато концентрацията се удв<5#’д<5*8.0 рГМ.’При··’ ··’ концентрация на хлорпромазин от 4.0 μΜ се получава степен на антипролиферация от 2.9, която не се повишава повече при удвояване на концентрацията до 8.0 μΜ. Когато се прави изпитание на състав с концентрация 4.0 μΜ от пентамидин в комбинация с 4.0 μΜ хлорпромазин (8.0 μΜ общо съдържание на съединенията), се постига антипролиферативна степен от 9.7.

При други анализи се установява, че силата на действие на

единичните компоненти се усилва под действието на другото съединение. Максималната антипролиферативна степен, постигната от пентамидинът приложен самостоятелно е 4.9 (при 8.0 μΜ) и същата степен се наблюдава при използване на 1 μΜ пентамидин, в комбинация с хлорпромазин с концентрация 125 пМ, като значително се понижава тоталното количество на лекарствените съединения, необходими за постигане на този ефект.

Сега демонстрираме, че комбинацията от хлорпромазин и пентамидин изетионат спира растежа на А549 клетки, без да ги унищожава. А549 клетки се засяват без сливане върху проча с 6 гнезда и се третира с 4 μΜ от всяко лекарствено вещество за 72 часа. Средата се заменя и клетките се култивират в продължение на седем дни (с една смяна на средата), през което време клетките се броят и се определя тяхната жизнеспособност. Докато нетрети рани клетки нарастват до сливане след седем дни, третираните с хлорпромазин/пентамидин изетионат клетки не растат, но запазват приблизително гъстотата с която са били засяти. Освен това, 95 % от третираните с хлорпромазин/пентамидин изетионат клетки са все ощи жизнеспособни, само малко по-слабо в сравнение с тези, които не са третирани.

03-386-01/ВН ·· ·· • · « · · • · · · ·· ···· • % • ··· • · * · · · · · · «

Комбинациите съгласно изобретението им^Т*мй*лък νφίΠ?τ иЛ*й ** не въздействат изобщо върху жизнеспособността на нормални фибробласти (MRC9). Контролни опити, демонстриращи това, са описани по-долу. MDC9 клетки се засяват върху плоча с 384 гнезда до сливане. Прибавя се матрица от разтвори на хлорпрома зин/пентамидин изетионат до получаване на препокриващи се серии с двукратно разреждане в 12 X 12 матрица, като максималната доза от всяко съединение е 16 μΜ. Клетките се

инкубират със съединенията в продължение на 48 часа, след което към всяко гнездо се прибавя 6 pL багрило от вида Alamar Blue за определяне на жизнеността. След това клетките се инкубират още 4 часа с багрилото. Количеството на редуцираното багрило се определя чрез флуоресценция, при използване на уред от вида Analyst AD. Нефлуоресцентната (окислена) форма на багрилото се редуцира до флуоресцентна форма от живите клетки. Така, съотношението на флуоресценция между гнездата, в които не е прибавяно от съединенията, в сравнение с тези, в които е прибавяно от съединенията, е пропорционално на количеството убити от съединенията клетки. При този опит не се наблюдава токсичен ефект до концентрации на всяко от активните съединения от 16 μΜ, докато антипролиферативният ефект се наблюдава при ниски концентрации.

Антипролиферативният ефект, демонстриран с А459 клетки може да бъде демонстриран по подобен начин при използване на други ракови клетъчни линии, като клетъчни линии от MCF7 аденокарцинома на гърдата, РА-1 тератокарцинома на яйчника, НТ29 аденокарцинома на дебелото черво, Н1299 едроклетъчен карцином, U-2 OS остеогенна саркома, U-373 MG глиобластома, Нер-ЗВ хепатоцелуларна карцинома, ВТ-549 карцинома на гърдата, Т-24 рак на пикочния мехур, С-ЗЗА цервикална карцинома, НТ-3

03-386-01/ВН ·· ·· • 999 9

9 9 9 ·· ···· • · • ··· ···* ····· 9 · 9 · · метастатична цервикална карцинома, SiHa люсй^‘с*т^*церйй^1Лна ·· ** карцинома, CaSki епидермоидна цервикална карцинома, NC1-H292 мукоепидермоидна карцинома на белия дроб, NC1-2030 недребно клетъчна карцинома на белия дроб, HeLa епителиална цервикална аденокарцинома, КВ епителиална карцинома на устата, НТ1080

епителиална фибросаркома, Saos-2 епителиална остеогенна саркома, РСЗ епителиално аденокарцинома на простатата, SW480 карцинома на дебелото черво, CCL-228 и MS-751 епидермоидна цервикална карцинома. Специфичността може да се изследва при използване като контролни клетки на клетки, като NHLF белодробни фибробласти, NHDF дермални фибробласти, НМЕС гръдни епителиални клетки, РгЕС епителиални клетки на простатата, HRE ренални епителиални клетки, NHBE бронхиални епителиални клетки, CoSmC клетки от гладкия мускул на дебелото черво, СоЕС ендотелиални клетки на дебелото черво, NHEK епидермални кератиноцити и клетки от костния мозък.

Други изпълнения

Всички публикации и патенти, споменати в описанието погоре се включват в описанието чрез цитирането им. Различни модификации и вариации на описания метод и система, съгласно изобретението ще бъдат очевидни за специалиста в тази област и не трябва да се отделят от обхвата и идеята на изобретението. Макар че изобретението е описано във връзка със специфични предпочитани изпълнения, трябва да се разбира, че изобретението, както е описано в патентните претенции не трябва да се ограничава до тези специфични изпълнения. Затова се подразбира, че различни модификации на описаните начини за провеждане на изобретението, които са очевидни за специалиста в молекуларната биология или в сродни области, трябва да бъдат в обхвата на изобретението.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Метод за лечение на пациенти, които имат новообразувание, характеризиращ се с това, че върху пациента се прилага хлорпромазин и пентамидин, едновременно или в рамките на 14 дни едно след друго, в количество, достатъчно за да инхибира растежа на новообразуванието.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хлорпромазинът и пентамидинът се прилагат в рамките на десет дни едно след друго.
3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че хлорпромазинът и пентамидинът се прилагат в рамките на пет дни едно след друго.
4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че хлорпромазинът и пентамидинът се прилагат в рамките на двадесет и четири часа едно след друго.
5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че новообразуванието е рак.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че новообразуванието е рак на белия дроб.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че ракът на белия дроб е избран от групата на люспеста карцинома на клетката, аденокарцинома, карцинома на голяма клетка.
8. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че ракът е от групата на рак на мозъка, рак на гърдата, цервикален рак, рак на дебелото черво, рак на стомаха, рак на бъбреците, левкимия, рак на черния дроб, лимфома, рак на яйчниците, рак на панкреаса, рак на простатата, рак на ректума, саркома, рак на кожата, рак на тестисите, рак на матката.

03-386-01/ВН • · · · · · • · · · • · _л . ···· ·· ..... .. ··
9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хлорпромазинът и пентамидинът се прилагат върху пациента интравенозно, интрамускулно, инхалационно, ректално или орално.
10. Метод за лечение на пациент, който има новообразувание, характеризиращ се с това, че върху пациента се прилага:

(а) първо съединение, избрано от прохлорперазин, перфеназин, мепазин, метотримепразин, ацепромазин, тиопропазат, перазин, пропиомазин, путаперазин, тиетилперазин, метопромазин, хлорфенетазин, циамемазин, перфеназин, енантат, трифлуоперазин, тиоридазин и норхлорпромазин, и

Ь) второ съединение, избрано от пропамидин, бутамидин, хептамидин, нонамидин, стилбамидин, хидроксистилбамидин, диминазен, бензамидин, 4,4’-(пентаметилендиокси) ди-, дихидрохлорид, фенамидин, дибромпропамидин, 1,3-бис(4амидино-2-метоксифенокси)пропан, нетропсин, дистамицин, фенамидин, амикарбалид, блеомицин, актиномицин и даунорубицин, като първото и второто съединения се прилагат едновременно или в рамките на 14 дни едно след друго, при което първото и второто съединения се прилагат в количество, достатъчно да инхибира растежа на новообразуванието.
11. Метод за лечение на пациент, който има новообразувание, характеризиращ се с това, че върху пациента се прилага:

а) първо съединение с формула (I)