AT399339B

AT399339B - Verfahren zur herstellung von teilweise neuen substituierten 7-oxomitosanen

Info

Publication number: AT399339B
Application number: AT0031089A
Authority: AT
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1985-06-17
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1995-04-25
Also published as: ATA31189A; AT400332B; ATA31089A

Description

AT 399 339 B

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung teilweise neuer substituierter 7-Oxomitosane der allgemeinen Formel

{ IX ) 75 in welcher R5 Wasserstoff bedeutet und R6 Ci -s —Alkyl oder substituiertes Ci -s-Alkyi, in welchen das Kohlenstoffatom, das an das Mitosan-7-Sauerstoffatom gebunden ist, 1 bis 2 Wasserstoffatome trägt, bedeutet, und wobei die Substituenten Ci-s-Alkoxy, Ci -s-Alkylthio, einen Heterocyclus mit 1 Ring und 5 oder 6 Ringatomen mit 1 oder 2 Heteroatomen (Stickstoff bzw. Sauerstoff) darstellen und in welchen jeder 20 der Alkoxy- bzw. Alkylthio-Substituenten gegebenenfalls durch Phenyl substituiert sein kann.

Diese Verbindungen sind Mitomycin A-Analoga. Mitomycin A ist ein wertvolles Antibiotikum und die 7-O-substituierten Mitosan-Analoga hievon haben ähnliche Brauchbarkeit.

Der systematische Name für Mitomycin A gemäß Chemical Abstracts auf der Basis einer neueren Korrektur [Shirhata et al., J. Am. Chem. Soc„ 105, 7199 (1983)] ist: [1 aS-(1 ajS,8jS,8aac,8bjS)]-8-[(- 25 (Aminocarbonyl)oxy)methyl]-6,8a-dimethoxy-l,la,2,8,8a,8b-hexahydro-5-methylazirino[2',3’,3,4,]pyrrolo[1,2-ajindol -4,7-dion gemäß welchem das Azirinopyrroloindol-Ringsystem wie folgt beziffert wird:

30 35

Ein Trivialsystem der Nomenklatur, welches in der Mitomycin-Literatur weitverbreitete Anwendung gefunden 40 hat, identifiziert das vorhergehende Ringsystem einschließlich einiger charakteristischen Substituenten des Mitomycins als Mitosan. 10

55 Mitosan

Gemäß diesem System ist Mitomycin A 7,9a-Dimethoxymitosan und Mitomycin C ist 7-Amino-9a-methoxymitosan. Was die stereochemische Konfiguration der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen betrifft, ist beabsichtigt, wenn sie durch den Stammnamen "Mitosan" oder durch Strukturformeln identifiziert 2

AT 399 339 B werden, ihre stereochemische Konfiguration als die gleiche wie jene von Mitomycin A oder C zu identifizieren. o ch2oconh2

Mitomyciη A R = Ri =OCH3 Mitomycin C R = NH2, Ri =OCH3

Mitomycin C ist ein Antibiotikum, welches durch Gärung erzeugt wird und welches derzeit unter Prüfung durch die Food and Drug Administration bei der Therapie von verbreiteten Adenocarcinomen des Magens oder der Bauchspeicheldrüse in erprobten Kombinationen mit anderen bewährten chemotherapeutischen Mitteln und zur lindernden Behandlung, wenn andere Heilmittel versagt haben, vertrieben wird-(Mutamycin® Bristol Laboratories, Syracuse, New York 13221, Physicians' Desk Reference 37.Ausgabe, 1983, S. 747 und 748). Mitomycin C und seine Herstellung durch Gärung ist der Gegenstand der US-PS 3 660 578.

Die Strukturen der Mitomycine A, B und C und von Porfiromycin wurden zuerst durch J. S. Webb etaj. der Lederle Laboratories Division American Cyanamid Company, J. Am. Chem. Soc., 84, 3185-3187 (1962), veröffentlicht. Eine der bei dieser Strukturstudie verwendeten chemischen Umwandlungen zu dem verwandten Mitomycin A und Mitomycin C war die Überführung des ersteren, 7,9a-Dimenthoxymitosan, durch Umsetzung mit Ammoniak in das letztere, 7-Amino-9a-methoxymitosan. Die Verdrängung der 7-Methoxy-gruppe des Mitomycin A hat erwiesen, daß sie bei der Herstellung von Antitumor-wirksamen Derivaten von Mitomycin C eine Reaktion von beträchtlichem Interesse darstellt. Kürzlich wurde gezeigt, daß die stereochemischen Konfigurationen der Stellungen 1,1a, 8a und 8b wie oben in Hinsicht auf die Chemical Abstracts-Nomenkiatur sind [Shirhata et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 7199-7200 (1983)]. Die ältere Literatur bezieht sich auf das Enantiomere.

Die folgenden Literaturstellen und Patentschriften handeln u.a. von der Umwandlung von Mitomycin A in ein 7-substituiertes Amino-Mitomycin C-Derivat mit Antitumor-Wirksamkeit. Das Ziel der Forschung bestand darin, Derivate herzusteilen, welche wirksamer, und insbesondere, welche weniger toxisch sind als Mitomycin C: Matsui et al., J. Antibiotics, XXI, 189-198 (1968);

Konishita et al., J. Med. Chem., 14,103-109 (1971); lyengar et al., J. Med. Chem., 24, 975-981 (1981); lyengar, Sami, Remers and Bradner, Abstracts of Papers, 183rd Annual Meeting of the American Chemical Society, Las Vegas, Nevada, March 1982, Abstract No. MEDI 72;

Cosulich et al., US-PS 3,332,944,

Matsui et al., US-PS 3,420,846,

Matsui et al., US-PS 3,450,705,

Matsui et al., US-PS 3,514,452,

Nakano et al., US-PS 4,231,936,

Remers, US-PS 4,268,676

Die folgenden Patentschriften behandeln die Herstellung von 7-substituierten Amino-mitomycin C-Derivaten, bei welchen der Substituent eine Disulfidbindung umfaßt.

Kono et al., EP-A-116.208 (1984),

Vyas et al., GB-PS 2.140.799 (1984). 7-Alkoxy-substituierte Mitosane, die strukturell mit Mitomycin A verwandt sind, werden als geeignete Antibiotika mit Wirksamkeit bei experimentellen Tiertumoren in einem Artikel von L. Urakawa et al., J. Antibiotics, 33, 804-809 (1980), beschrieben.

Mitomycin C ist das hauptsächliche Mitomycin, das durch Gärung erzeugt wird, und liegt in im Handel erhältlicher Form vor. Die gegenwärtige Technologie für die Überführung von Mitomycin C in Mitomycin A leidet unter einer Anzahl von Mängeln. Die Hydrolyse von Mitomycin C in das entsprechende 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan und sodann die Methylierung dieser Substanz benötigt Diazomethan, eine beim Hantieren in industriellem Maßstab sehr gefährlichen Substanz, und das 7-Hydroxy-Zwischenprodukt ist sehr unstabil [Matsui et al., J. Antibiotics, XXI, 189-198 (1968)]. Ein Versuch, diese Schwierigkeiten zu 3

AT 399 339 B vermeiden, umfaßt die Verwendung von 7-Acyloxymitosanen (Kyowa Hakko Kogyo KK Japanese Patent No. J5 6073-085, Farmdoc No. 56 227 D/31). Die Alkoholyse von Mitomycin C, wie sie von Urakawa et al. in J. Antibiotics, 33, 804-809 (1980) beschrieben wird, ist durch die Verfügbarkeit und Reaktivität der Alkohol-Ausgangsmeterialien auf die Herstellung von nur speziellen 7-Alkoxy-strukturtypen begrenzt. 5 Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der teilweise neuen Verbindungen der eingangs genannten Formel (IX) ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein'Mitosan der allgemeinen Formel:

20 mit einem Triazen der allgemeinen Formel:

Ar-N = N-NH-R6 (XI), in welchen Formeln Rs und R6 die obige Bedeutung haben und Ar der organische Rest eines diazotierbaren 25 aromatischen Amins ist, in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0*C bis 60 · C umsetzt.

Viele der Verbindungen der allgemeinen Formel IX sind bekannte Verbindungen und weisen eine Hemmwirkung gegenüber experimentellen Tumoren in vivo auf. Eine Anzahl von neuen Verbindungen, die der Formel (IX) entsprechen, wurde nach diesem Verfahren ebenfalls hergestellt, Insbesondere sind die hier so als Verbindungen der Beispiele 3, 4, 5 und 7 identifizierten Substanzen neue Verbindungen und weisen ebenfalls eine Antitumor-Wirksamkeit gegenüber experimentellen tierischen Tumoren auf. Sie werden ähnlich dem Mitomycin C angewendet. Die verwendeten Dosierungsmengen werden im Verhältnis zu ihrer Toxizität relativ zu der Toxizität von Mitomycin C abgestimmt. In Fällen, in welchen die neue Verbindung weniger toxisch ist, wird eine höhere Dosis angewendet. 35 Die Ausdrücke "Niederalkyl", "Niederalkoxy" und "Niederaikanoyl" bedeuten hier (falls nicht anders angegeben) geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Alkoxy- oder Alkanoylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Amyl, Hexyl, usw. Vorzugsweise enthalten diese Gruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome und insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoffatome. Wenn im jeweiligen Fall nicht anders angegeben, bedeutet der Ausdruck "Halogen" hier Chlor, Fluor, Brom oder Jod. 40 Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft gemäß folgendem Reaktionsschema: 45 50 4 55

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Schema 1

(X) worin R5 und Rs die obige Bedeutung haben und Ar der organische Rest eines diazotierbaren aromatischen Amins ist.

Die 1-substituierten-3-Aryltriazene der allgemeinen Formel (XI) und insbesondere die 1 -Alkyl-3-aryltria-zene bilden eine Gruppe von Reagentien, von welchen bekannt ist, daß sie zur Reaktion mit Carbonsäuren geeignet sind unter Bildung der entsprechenden Niederalkylester. l-Methyl-3-(4-methylphenyl)triazen kann gemäß den allgemeinen, von E. H. White et al. in Org. Syn., 48, 102-105 (1968) und hier im Verfahren 1 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Jedoch arbeitet dieses Verfahren nur mit wasserlöslichen Aminen gut, und ein zweites Verfahren, das von E. H. White et al., Tetrahedron Letters, No. 21, 761 (1961) und auch hier im Verfahren 2 beschrieben wird, ist für die Herstellung von Triazenen von wasserunlöslichen Aminen besser geeignet.

Das in der obigen Weise hergestellte 1-Methyl-3-(4-methylphenyl) triazen ist früher zur Herstellung von Methyl estern von Carbonsäuren wie 2,4-Dinitrobenzoesäure [E.H. White et al. Org. Syn., 48, 102*105 (1968)] und Cephalosporansäuren, welche die gewünschte A3-Verbindung ohne Isomerisierung zu dem Δ2-Isomeren ergeben [Mangia, Tetrahedron Letters, No. 52, S. 5219-20 (1978)], verwendet worden. Das Reagenz ist auch zur Herstellung eines 3-Methoxy-cephalosporin-derivates durch Umsetzung mit dem entsprechenden 3-Hydroxy-3-cephem-4-carboxylat in Benzollösung bei Rückflußtemperatur verwendet worden. (Wiederkeher et al US-PS 4,069,324)

Andere 1-(Niederalkyl)-3-aryltriazene der allgemeinen Formel (XI) können in ähnlicher Weise durch Umsetzung anderer Niederalkylamine mit Aryldiazoniumsalzen hergestellt werden. Als Quelle für den Arylanteil des 1,3-disubstituierten Triazens kann ein beliebiges Arylamin mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, das leicht ein Diazoniumsalz bildet, verwendet werden. Einige Beispiele für in dieser Weise hergestellte und bei dieser Erfindung verwendete Triazene sind: 1 -(n-Butyl)-3-(4-methylphenyi)triazen ; 1 -(1 -Methylethyl)-3-(4-methylphenyl)triazen ; 3-(4-Methylphenyl)-1 -[2-(4-morpholinyl)ethyl]triazen ; 3-(4-Methylphenyl)-1 -[2-(2-pyridyl)ethyl]triazen ; 1 -(2-Benzylthioethyl)-3-(4-methylphenyl)triazen ; 3-(4- Chlorphenyl)-1-(2-methoxyethyl)triazen ; 3-(4- Chlorphenyl)-1-(1,3-dioxol-2-ylmethyl)triazen ; 3-(4- Chlorphenyl)-1-(tetrahydrofuran-2-ylmethyl)triazen .

In der Literatur wurden andere Triazene beschrieben, die geeignete Reagenzien zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren unter Herstellung von 7-(substituiertem Alkoxy)mitosan der allgemeinen Formel (IX) sind. Die von T.A. Daniels et al., Can. J. Chem., 55, 3751-3754 (1977) beschriebenen Verbindungen seien als Beispiele genannt. 5

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X

N*N-NH-CH2

Y a X = Η, Y = CN b X = N02, Y = CN c X = C02Me, Y = CN d X = Ac, Y = CN e X = N02, Y = C02Et f X = C02 Me, Y = C02Et g X = C02Me, Y = COPh h X = N02, Y = -CH(OCH3)2

Die folgenden sind weitere Beispiele für geeignete Triazen-Ausgangsmaterialien der allgemeinen Formel (XI) zur Verwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren: 1-(n-Butyl)-3-(a-naphthyl)triazen 1 -(n-Hexyl)-3-pheny Itriazen 1-Ethyl-3-(2,4-dimethylphenyl)triazen 1 -(1 -Methy lethy l)-3-(4-methoxyphenyl)triazen

Zur Herstellung von Mitomycin A wird bevorzugt, 1-Methyl-3-(4-methyiphenyl)-triazen als Methylierungsreagenz zu verwenden. Vorzugsweise werden mindestens 2 Molanteile des letzteren pro Molanteil 7-Hydroxy-9a~methoxymitosan verwendet, und die Reaktion wird, vorzugsweise in einem flüssigen organischen Lösungsmittel für das 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan-Ausgangsmaterial, durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind niedrige Alkanoie, Niederalkansäureniederalkylester, die Di-nieder-alkyläther, die cylischen aliphatischen Äther und die niedrigen polyhaiogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoffe. Diese Lösungsmittel enthalten bis zu 6 Kohlenstoffatome, jedoch werden solche, die bei Temperaturen unter 10Q°C sieden, bevorzugt. Speziell bevorzugte Lösungsmittel sind Methylenchlorid, Methanol, Diethylether, Ethyl-acetat und deren Mischungen. Die Reaktion kann bei der Rückflußtemperatur der Reaktionsmischung oder bis zu etwa 60 'C durchgeführt werden. Bei Temperaturen darüber neigt das Mitosan dazu, sich unter Abnahme der Ausbeute zu zersetzen. Es wird bevorzugt, die Reaktion bei Zimmertemperatur oder darunter, beispielsweise innerhalb des Bereiches von 0 * bis 25 · C, durchzuführen.

Ein zweckmäßiger Weg, um zu bestimmen, wann die Reaktion vollständig ist, ist die Dünnschichtchromatographie. Mitomycin A hat eine dunkelpurpurne Farbe und kann leicht vom Ausgangsmaterial und von Nebenprodukten unterschieden werden. In dem Lösungsmittelsystem Methylenchlorid/Methanol (90/10) zeigt Mitomycin A ein Rt = 0,36. Zur Reinigung des Produktes kann Chromatographie auf neutralem Aluminiumoxid verwendet werden.

Die vorhergehenden Reaktionsbedingungen und Vorsichtsmaßnahmen sind auf die Herstellung von anderen 7-R60-Mitosanen der allgemeinen Formel (IX) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren allgemein anwendbar.

Die Brauchbarkeit der Verbindungen der allgemeinen Formel (IX) bei antineoplastischen therapeutischen Methoden wird durch 'die Ergebnisse der in vivo-Abschirmverfahren demonstriert, bei welchen die Verbindungen in variierenden Dosierungsmengen an Mäuse, in denen ein P-388-leukämischer oder B16-melanomischer Zustand induziert wurde, verabreicht wurden.

Es wird angenommen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen antibakterielle Wirksamkeit gegen gram-positive und gram-negative Mikroorganismen in einer Weise besitzen, die jener ähnlich ist, die für die natürlich vorkommenden Mitomycine beobachtet wurde, und sie sind daher auch als therapeutische Mittel bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Mensch und Tier geeignet.

Wirksamkeit gegen P-388-Murin-Leukämie: Tabelle I enthält die Ergebnisse von Laboratoriumstests mit CDFi-Mäusen, weichen intraperitoneal ein Tumor-Impfstoff von 106 Ascites-zellen von P-388-Murin-Leukä-mie implantiert wurde und die mit verschiedenem Dosen von entweder einer Testverbindung der allgemeinen Formel (IX) oder mit Mitomycin C behandelt wurden. Die Verbindungen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Es wurden Gruppen zu sechs Mäusen für jede Dosierungsmenge verwendet, und sie wurden mit einer einzigen Dosis der Verbindung am Tag nach der Beimpfung behandelt. Eine Gruppe von zehn mit Salzlösung behandelten Kontrollmäusen wurde in jede Versuchsreihe einbezogen: die mit Mitomycin C behandelten Gruppen wurden als positive Kontrollgruppen einbezogen. Es wurde ein 30 Tage-Protokoll verwendet, wobei die mittlere Überlebenszeit in Tagen für jede Gruppe von Mäusen bestimmt wurde und die Anzahl der Überlebenden am Ende der 30 Tage-Periode notiert wurde. Die Mäuse wurden 6

AT 399 339 B vor der Behandlung und wiederum am Tag 6 gewogen. Die Massenänderung wurde als Maß für die Drogen-Toxizität genommen. Es wurden Mäuse mit einer Masse von je 20 Gramm verwendet, und ein Massenverlust bis zu etwa 2 Gramm wurde als nicht übermäßig angesehen. Die Ergebnisse wurden in Werten % T/C, welches das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Überlebenszeit der mit Salzlösung behandelten Kontrollgruppe mal 100 ist, bestimmt. Die mit Salzlösung behandelten Kontrolliere starben im allgemeinen innerhalb von neun Tagen. Die "maximale Wirkung" in der folgenden Tabelle wird als % T/C ausgedrückt, und die Dosis, die diese Wirkung ergibt, wird angegeben. Die Werte in Klammern sind die Werte, die mit Mitomycin C als positive Kontrollprobe in dem gleichen Versuch erhalten wurden. Es kann so ein Maß der relativen Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen zu Mitomycin C geschätzt werden. Eine minimale Wirkung in Werten von % T/C wird mit 125 angenommen. Die minimale wirksame Dosis, die in der folgenden Tabelle angegeben wird, ist jene Dosis, die einen Wert % T/C von etwa 125 ergibt. Die beiden Werte, die in jedem Fall in der Kolonne mit der "durchschnittlichen Massenänderung" angegeben werden, sind die durchschnittliche Massenänderung pro Maus bei der maximalen wirksamen Dosis, bzw. bei der minimalen wirksamen Dosis. 7 570 75 20 25 30 35 40 45 50

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Zur Feststellung der Antitumor-Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen bei 55 experimentellen tierischen Tumoren werden die Verbindungen an ein Säugetier, das einen Tumor aufweist, in einer im wesentlichen nicht-toxischen Antitumorwirksamen Dosis systemisch verabreicht.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen sind hauptsächlich zur Verwendung durch Injektion in der gleichen Weise für einige der gleichen Zwecke wie Mitomycin C bestimmt. Es können etwas größere 9

AT 399 339 B oder kleinere Dosen je nach der jeweiligen Tumor-Empfindlichkeit verwendet werden. Sie werden leicht in Form von trockenen pharmazeutischen Mitteln, die Verdünnungsmittel, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisatoren und Bestandteile, die zur pharmazeutischen Gepflegtheit beitragen, verteilt. Diese Mittel werden sodann mit einem injizierbaren flüssigen Medium unvorbereitet knapp vor Gebrauch rekonstituiert. Geeignete injizierbare Flüssigkeiten umfassen Wasser, isotonische Salzlösung u.dgl.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei Herstellungsvorschriften zur Synthese der Ausgangsprodukte vorangestellt sind. In diesen Beispielen und Verfahren werden alle Temperaturen in °C angegeben, und die Schmelzpunkte sind nicht korrigiert. Die kernmagnetischen Protonen-Resonanzspektren wurden auf einem Varian XL100, Joel FX-90- oder Bruker WM 360 Spektrometer in entweder Pyridin-ds oder D2O wie angegeben bestimmt. Wenn Pyridin-ds als Lösungsmittel verwendet wird, wird die Pyridin-Resonanz bei 5 = 8,57 als inneres Bezugssystem verwendet, während mit D2O als Lösungsmittel TSP als inneres Bezugssystem verwendet wird. Chemische Verschiebungen werden in δ-Einheiten und Kupplungskonstanten in Hertz angegeben. Aufspaltungsbilder werden wie folgt bezeichnet: s, Singlett; d, Dublett; t, Triplett; q, Quartett; m, Multipiett; bs, breiten Signal; dd, Dublett von Dublett; dt, Düblet von Triplett. Infrarot-Spektren werden entweder auf einem Beckman Model 4240 Spektrometer oder einen Nicoiet 5DX FT-IR Spektrometer bestimmt und in reziproken Zentimetern angegeben. Ultraviolett (UV)-Spektren werden entweder auf einem Cary Model 290-Spektrometer oder einen Hewlitt Packard 8450-Spektrometer, das mit einem Multidioden-Felddetektor ausgestattet ist, bestimmt. Dünnschichtchromatographie (TLC) wird auf 0,25mm Analtech Silikagel GF Platten durchgeführt. Flash-Chromatographie wird mit entweder Woeim-neutrafem Aluminiumoxid (DCC-Grad) oder Woelm-Silikagel (32-63 um) und den angegebenen Lösungsmitteln durchgeführt. Alle Eindampfvorgänge wurden unter vermindertem Druck und unterhalb von 40 · C durchgeführt.

Die 1-Alkyl-3-aryltriazene bilden eine Gruppe von Reagentien, von welchen es bekannt ist, daß sie zur Umsetzung mit Carbonsäuren unter Bildung der entsprechenden niedrigen Alkylester geeignet sind. 1-Methyl-3-(4-methylphenyl)-triazen kann wie folgt hergestellt werden:

Verfahren 1: E.H. White et al., Org. Syn. 48, 102-195 (1968). 1 -Methyl-3-p-tolyltriazen. 50,2 g (0,47 Mol) p-Toluidin werden in einen 2 Liter-Kolben, der mit einem Tropftrichter von 200 ml und einem wirksamen Rührer ausgestattet ist, gegeben, und der Kolben wird in ein Eis-Salz-Bad bei etwa -10 °C eingetaucht. Eine Lösung von 46,8 g (0,55 Mol) Kaliumnitrit in 150 ml Wasser wird in den Tropftrichter gegeben, und eine Mischung von 250 g zerkleinertem Eis und 140 ml konz. Salzsäure wird unter Rühren zu dem p-Toluidin gegeben. Die Kaliumnitritlösung wird unter ständigem Rühren innerhalb von 1 bis 2 Stunden langsam zugesetzt, bis ein positiver Stärke-Kaliumjodid-Test erhalten wird (Anm. 1), und die Mischung wird eine weitere Stunde gerührt, um die Reaktion des gesamten Toluidins zu gewährleisten.

Sodann wird die Lösung von p-Toluol-diazoniumchlorid mit kaltem, konz. wässerigem Natriumcarbonat auf einen pH-Wert von 6,8 - 7,2 bei 0"C gebracht, worauf die Lösung eine rote bis orange Farbe annimmt und ein kleine Menge von rotem Material sich absetzt. Die kalte, neutrale Lösung wird in einen Tropftrichter überführt und langsam zu einer kräftig gerührten Mischung von 150 g Natriumcarbonat, 300 ml 30- bis 35-%igem wässerigem Methylamin (Anm. 2) und 100 g zerkleinertem Eis in einem 3 Liter-Kolben gegeben. Die Reaktionsmischung wird während der Zugabe bei etwa -10'C gehalten, welches etwa 45 Minuten erfordert (Anm. 3). Die Lösung wird dreimal mit 3 Portionen von je 1 Liter Äther extrahiert. Die ätherischen Extrakte werden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, auf einem Drehverdampfer bei Zimmertemperatur eingedampft, wobei 65 g röhes 1-Methyl-3-p-tolyltriazen erhalten werden (Anm. 4). Dieses wird in einen wassergekühlten Subiimator gegeben, und das Triazen wird bei 50 *C (1 mm) sublimiert; es werden 43,3 g (0,29 Mol, 62 %) eines gelben, kristallinen Sublimats, Fp. 77-80', erhalten (Anm. 5). Das Sublimat kann aus Hexan umkristallisiert werden, wobei das Triazen in Form von weißen Nadeln, Fp. 80,5-81,5', erhalten wird. Zweckmäßiger ist es, es in einer minimalen Menge Äther zu lösen, und die Lösung wird mit 2 Volumina Hexan verdünnt und auf 0' gekühlt, wobei flache Plättchen mit einem schwach gelben Farbton, Fp,79-81 ·, erhalten werden. Die Ausbeute an reinem Triazen beträgt 33-37 g (47-53 %) (Anm. 6).

Anmerkungen: 1. Die einzelnen Tests mit Stärke-Kaliumjodid-Papier sollen 1 - 2 Minuten, nachdem die Zugabe von Kaliumnitrit beendet wurde, durchgeführt werden. 2. Es kann durch 40-%iges wässeriges Methylamin ersetzt werden. 3. Die Reaktion ist vorüber, wenn ein Tropfen der Lösung mit einer Lösung von ß-Naphthol in wässerigem Natriumcarbonat keine rote Farbe mehr gibt. 4. Die hauptsächliche Verunreinigung ist 1,5-Di-p-tolyl-3-methyl-1,4-pentazadien (F.p. 148’). Dies kann durch fraktionierte Kristallisation entfernt werden, jedoch ist es leichter, das Triazen aus dem Reaktions- 10

AT 399 339 B gemisch zu sublimieren. 5. Das Sublimat enthält eine Spur 1,3-Di-p-tolyltriazen, wie durch Dünnschichtchromatographie zu sehen ist. Umkristallisation ergibt das reine 1-Methyl-3-p-tolyltriazen. 6. Dieses Vefahren arbeitet nur mit wasserlöslichen Aminen gut. Das unten angeführte Verfahren 2 ist für die Herstellung von Triazenen von wasserlöslichen Aminen besser geeignet.

Verfahren 2: E.H. White et al., Tetrahedron Leiters Nr. 21, S 761 (1961). 1 -n-Butyl-3-p-chlorphenyltriazen. Eine Lösung von 2,87 g (10,1 mMo!) p-Chlorbenzoldiazonium-hexaflu-orphosphat (umkristallisiert aus Aceton-Methanol) in Dimethylformamid (Dimethylamin-frei) wird langsam zu einer gerührten Mischung von 0,73 g (10,0 mMol) n-Butylamin, 15 g gepulvertem Natriumcarbonat und 30 ml Dimethylformamid, die unter Rühren bei -5* gehalten wird, gegeben. Die Diazoniumsalzlösung kann bei Zimmertemperatur verwendet werden; jedoch wird im allgemeinen ein reineres Produkt erhalten, wenn die Diazoniumsalzlösung in einem gekühlten bei etwa -50' gehaltenen Scheidetrichter hergestellt und aus diesem entnommen' wird. Die Mischung wird auf 0 · erwärmt und gerührt, bis mit 2-Naphthol ein negativer Test erhalten wird (im allgemeinen sind nur wenige Minuten erforderlich). Es wird Äther hinzugefügt, die Mischung wird filtriert, und das Filtrat wird gründlich mit Wasser gewaschen und sodann getrocknet. (Das Triazen kann an dieser Stelle isoliert und aus Pentan bei niedrigen Temperaturen umkristaliisiert werden).

Verfahren 3: 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan. 2,2 g (6,6 mMol) Mitomycin C werden in 140 ml 0,1 N-methanolischer NaOH (50 %) gelöst, und das Reaktionsgemisch wird 30 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Sodann wird die Lösung mit 1 N -HCl auf einen pH-Wert von etwa 4,0 eingestellt und viermal mit je 500 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-extrakte werden über Na2SO* getrocknet und unter vermindertem Druck bei etwa 30 bis 35'C eingedampft, wobei ein fester Rückstand erhalten wird, welcher beim Lösen in Äther und Behandeln mit überschüssigem Hexan einen purpurfarbenen Niederschlag ergibt. Der Niederschlag wird gesammelt und luftgetrocknet, wobei man die Titelverbindung in Form eines feinteiligen, purpurfarbenen Pulvers (1,4 g, 63 %) erhält: 1H NMR (Pyridin -ds, 8): 2.05(s, 3H), 2.14(bs, 1H), 2.74(bs, 1H), 3.13(d, 1H). 3.24(s, 3H), 3.56(d, 1H), 4.00-(dd, 1H), 4.37(d, 1H), 5.05(t, 1H), 5.40(dd, 1H), 5.90(bs, 2H).

Verfahren 4: Mitomycin A: Eine 100 mg (0,30 mMol) betragende Menge von 7-Hydroxy-9a-methoxymit-osan und eine Menge von 100 mg (0,67 mMol) 3-Methyl-1-p-tolyltriazen werden in 2 ml Methylenchlorid und 10 ml Diäthyläther gelöst. Die Lösung wird, nachdem sie 6 Stunden unter gelindem Rückfluß gehalten worden war, 18 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. TLC [Methylenchlorid: Methanol (90:10)] zeigt das Auftreten eines dunkelpurpurfarbenen Flecks bei Rf = 0,36 mit einer Spur einer Verunreinigung bei Rf = 0,41. Die Reaktionsmischung wird zur Trockene eingedampft und auf Woelm- neutralem Aluminiumoxyd unter Verwendung von Methylenchlorid und Methylenchlorid.Methanol (30:1) als Eluierungslösungsmittel chromatographiert. Fraktionen, die die Komponente bei Rf = 0,36 enthalten, werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Ausfällen des trockenen Rückstandes aus Methylenchlorid und Hexan ergibt die Titelverbindung in Form eines feinteiligen purpurfarbenen Pulvers (25 mg, 24 %), Fp. 161 ·.

Anal. Ber. für: Ci ε Hi 9 N3 Ος: C, 54.96: H, 5.44; N, 12.02 gefunden: C, 53.96; H, 5.37; N, 11.99 IR(KBr), r max cm"1: 3400, 3300, 2950, 1700, 1630, 1575, 1200, 1060. 1H NMR (Pyridin -d5, S): 1.82(s, 3H), 2.74(dd, 1H), 3.12(d, 1H), 3.24(s, 3H), 3.54(dd, 1H), 3.96(dd, 1H), 4.02-(s, 3H), 4.22(d, 1H), 4.84(bs, 2H), 5.02(t, 1H), 5.38(dd, 1H).

Die Ausbeute in Verfahren 4 wird durch Verwendung von Methylenchlorid als Reaktionslösungsmittel und einer Dauer der Reaktion von 24 Stunden bei Zimmertemperatur auf 63 % erhöht.

Verfahren 5: In einen Einhalsrundkolben mit 250 ml Inhalt gibt man festes N^C03, eine 35 %ige wässerige Lösung von Amin (Menge wie in Verfahren 1) und Eis, und rührt die Suspension bei -5'C (Eis-Salz-Bad). Zu dieser Suspension gibt man tropfenweise eine kalte Suspension von p-Chlorbenzoldiazonium-hexafluorphosphat (Aldrich Chemical Co.) in Eis, Wasser, Na2C03 (Lösung etwa pH 7). Nachdem die Zugabe beendet ist, wird das Reaktionsgemisch mit Diäthyläther extrahiert. Der vereinigte Diäthyläther-Extrakt wird unter Schütteln mit Wasser gewaschen. Über Na2SO* getrocknet und eingeengt. Der gelbliche feste Rückstand wird durch Säulenchromatographie über Woelm-Aluminiumoxid unter Verwendung von Hexan-Methylenchlorid (1:1) als Eluierungslösungsmittel gereinigt (1H NMR wird festgestellt). 11

AT 399 339 B

Vorschriften 1-10:

Die Triazene 1-6 der folgenden Tabelle II werden gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren 1, in welchem das Triazen der Vorschrift 1 beispielsweise angegeben ist, hergestellt. Die Triazene werden durch Säulenchromatographie auf Woelm-Aluminiumoxid gereinigt.

Die Triazene 7-9 der Tabelle II werden gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren 5 hergestellt. 12 ΑΤ 399 339 Β

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Beispiele 1-7

Allgemeines Verfahren zur Herstellung von 7-Alkoxy-9a-methoxymitosanen

Eine Lösung von 2,4 Äquivalenten Triazen in CH2CI2: Methanol (4:1) wird zu einer Lösung von 7-Hydroxy-9a-methoxymitosan (hergestellt in Verfahren 3) in CH2CI2 Methanol (4:1) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur gerührt, und das Fortschreiten der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie (TLC) (10% MeOH in CH2CI2) überwacht. Das 7-Alkoxy-9a-methoxymitosan-Produkt erscheint in Form eines dunkelpurpurfarbenen Flecks auf der TLC. Das Reaktionsgemisch wird auf Woelm-Aluminiumoxid chromatographiert, wenn die Reaktion auf Basis der TLC als vollständig beurteilt wird, und das 7-Alkoxy-9a-methoxymitosan wird in Form eines amorphen Feststoffes erkalten. Die gebildeten Verbindungen werden als Beispiele 1-7 in Tabelle III bezeichnet. 15 10 15 so 25 ►3ja a< 30 ö

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) in welcher R5 Wasserstoff bedeutet und R1 Ci -e —Alkyl oder substituiertes Ci -Alkyl, in welchen das Kohlenstoffatom, das an das Mitosan-7-Sauerstoffatom gebunden ist, 1 bis 2 Wasserstoffatome trägt, bedeutet, und wobei die Substituenten Ci-e-Alkoxy, Ci-6-Alkylthio, einen Heterocyclus mit 1 Ring und 5 oder 6 Ringatomen mit 1 oder 2 Heteroatomen (Stickstoff bzw. Sauerstoff) darstellen und in welchen jeder der Alkoxy- bzw. Alkylthio-Substituenten gegebenenfalls durch Phenyl substituiert sein kann, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mitosan der allgemeinen Formel:

mit einem Triazen der allgemeinen Formel: Ar-N = N-NH-R1 (XI), in welchen Formeln R5 und R1 die obige Bedeutung haben und Ar der organische Rest eines diazotierbaren aromatischen Amins ist, in einem inerten organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 0 * C bis 60 · C umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Triazen der allgemeinen Formel (XI) 1-Methyl-3-(4-methylphenyl)triazen einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens 2 Molanteile des Triazens, bezogen auf das Mitosan der allgemeinen Formel (X), einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium ein gegenüber der Reaktion inertes organisches flüssiges Lösungsmittel für das Mitosan der allgemeinen Formel (X) einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium ein Niederalkanol, einen Niederalkyl-alkansäureester, einen Di-Niederalkyläther, einen niedrigen polyhalogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff oder einen cyclischen aliphatischen Äther mit bis zu
6 Kohlenstoffatomen einsetzt. 19 1 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reaktionsmedium Methylenchlorid, Methanol, Diethyl-ether, Ethyl-acetat oder eine Mischung von zwei oder mehreren von diesen einsetzt. AT 399 339 B
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Reaktionstemperatur von 0 · C bis 25 · C anwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mitosan der allgemeinen Formel X, in welcher R5 für Wasserstoff steht, mit einem Triazen der Formel XI, in welcher R6 für 2-(Benzylthio)äthyl steht, umsetzt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mitosan der allgemeinen Formel X, in welcher R5für Wasserstoff steht, mit einem Triaxen der Formel XI, in welcher R6 für 2-(Pyridyl)-äthyl steht, umsetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mitosan der allgemeinen Formel X, in welcher R5 für Wasserstoff steht, mit einem Triazen der Formel XI, in welcher Rs für 2-(4-Morpholinyl)äthyl steht, umsetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mitosan der allgemeinen Formel X, in welcher Rs für Wasserstoff steht, mit einem Triazen der Formel XI, in welcher Rs für (1,3-Dioxolan-2-yl)methyl steht, umsetzt. 20