AT274262B - Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden in 1,2-Stellung - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden in 1, 2-Stellung 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden in l, 2-Stellung durch aerobe Fermentation mit einem Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium. 



   Es ist bekannt, dass zahlreiche Mikroorganismen imstande sind, durch Inkubation zusammen mit dem Steroid das entsprechende   1, 2-Dehydro-Derivat   mit guten Ausbeuten zu liefern. 



   Für die Züchtung dieser Mikroorganismen benötigt man im allgemeinen einen kostspieligen Nährboden. Zahlreiche dieser Mikroorganismen dehydrieren nur während einer sehr langen Inkubationsperiode und nur mit sehr niedrigen Ausbeuten. Ein weiterer Nachteil der bekannten Mikroorganismen besteht häufig darin, dass die Dehydrierungsfähigkeit des verwendeten Mikroorganismus nach einer längeren Periode absinkt, was während des Verfahrens einen ständigen Unsicherheitsfaktor bildet. 



   Es ist eine allgemeine Erscheinung, dass die   6. 1-Dehydrogenase-Aktivität   des Mikroorganismus schwach ist und deshalb das umzusetzende Produkt dem Fermentationsmedium nur in niedrigen Konzentrationen (z. B. 200 mg/ml) zugesetzt werden kann. Dies stellt bei der Trennung des reinen Endprodukts ein Problem dar, das oft nur mit Hilfe von fein-präparativen Methoden gelöst werden kann. 



   Es wurde nun gefunden, dass ein neuer Mikroorganismus, der im Institut für Allgemeines Gesundheitswesen am 19. August 1966 unter der Nr. 32 deponiert wurde, imstande ist, in verschiedenen Ver-   bindungen mit Steran-Skeletten eine 6. 1-Doppelbindung zu bilden. Im Verhältnis zu den bekannten Organismen, die eine -Steroid-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen, zeichnet sich dieser Mikro-   organismus durch seine ausserordentlich hohe und seit Jahren als stabil erwiesene Enzymaktivität aus. 



   Dieser Mikroorganismus erhielt die   Bezeichnung"VB".   Er ist grampositiv, besitzt Dimensionen von 
 EMI1.1 
 in kleinen Gruppen, manchmal mit paralleler Orientierung. In zweitägigen flüssigen Züchtungen können auch 6 bis 8   u     lange Stäbchen   beobachtet werden. Der Mikroorganismus kann keulenartig verdickt werden. Es kommen sehr selten kurze rudimentäre Abzweigungen vor. Bei Neisser-Anfärben können keine metachromatischen Pigmente gefunden wurden. In länger inkubierten Züchtungen sind mehrere kurze Stäbchen sichtbar. Der Mikroorganismus ist nicht säurebeständig. 



   Der Mikroorganismus bildet auf   Rindfleischextrakt-Agar-Nährboden   innerhalb von 3 Tagen runde, konvexe, dichte, glänzende, schleimartige, scharfrandige,   blassrosa-gelbliche, butterartig   streichbare Kulturen mit einem Durchmesser von 1 bis 3 mm. Auf Blutagar-Nährboden wächst er ähnlich wie auf einfachem Agar. Er hämolysiert nicht. Auf   Wismutsulfit-Agar   bildet er innerhalb von 3 bis 4 Tagen gehemmt wachsende, nicht reduzierende, schleimige Kulturen ; auf Brillantgrün-Agar innerhalb von 3 bis 4 Tagen farblose, dichte, schleimige Kulturen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 mm. Auf Desoxicholat-Citrat-Agar und auf   Eosinmethylen-blau-Agar   wächst er nicht.

   Auf Clauberg'schem Tellursalz-Agar bildet er innerhalb von 2 Tagen konvexe, runde, bräunlich-schwarze, nach Knoblauch rie- 

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 chende Kulturen mit einem Durchmesser von 1 mm, nach weiterer Inkubation bei Raumtemperatur schleimige Kulturen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 mm. Auf Sabouraud-Nährboden wächst er nicht. In Rindfleischextrakt-Bouillon, bei einer Temperatur von 28oC, wird er nach 24 h trüb, später bildet er einen Bodensatz. Ein sehr gutes Wachstum wurde in Bouillon mit   10% Kaninchenserum   festgestellt.

   Auf   Löffler'schem   Nährboden wächst er gut   und bildet eine schmutzig-weisse, zusammenflie-   ssende, schleimige Kultur ; auf Eiernährboden zeigt sich ein glänzendes, zusammenfliessendes, blassgelb-rosa, auf Glycerin-Kartoffel-Nährboden in 3 bis 4 Tagen ein schleimiges, zusammenfliessendes, gelblich-rosa, dickes Wachstum. Er wächst gut in   Pepton-Wasser ; die optimale   Zuchttemperatur beträgt   etwa 30 C, jedoch ist das Wachstum auch bei einer Temperatur zwischen 20 und 370C zufriedenstellend. Bei einer Temperatur von 100C ist das Wachstum langsam ; bei 450C wächst er während 14 Tagen   nicht. Er vermehrt sich gut in Pepton-Wasser mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9,6. Er vermehrt sich in Gegenwart von 3 bis   4%   NaCl, nicht jedoch bei   6,5So   NaCl.

   Er alkalisiert die Milch mild ; in Semisolid-Agar bewegt er sich nicht. Bei einer Temperatur von   600C   bleibt er 30 min lang am Leben. 



   Biochemische Reaktionen : 
 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> Katalase <SEP> ++
<tb> Oxydase <SEP> +
<tb> Nitrat-Reduktion <SEP> zu
<tb> Nitrit <SEP> +
<tb> Gelatine-Verflüssigung
<tb> Stärke-Hydrolyse
<tb> Kasein
<tb> H2S-Bíldung <SEP> aus <SEP> Thiosulfat
<tb> Indol
<tb> Methylrot <SEP> 28 
<tb> Voges-Proskauer <SEP> 28 
<tb> Urease <SEP> +
<tb> 
 (+ = positive Reaktion ; ++ = stark positive   Reaktion ;-=   negative Reaktion)
Der obige Stamm gehört zur Gattung Corynebacterium der Familie Corynebacteriaceae und verfügt sowohl kulturell als auch biochemisch über die bekannten Eigenschaften des Corynebacterium equi. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden in 1, 2-Stellung durch aerobe Fermentation mit einem Mikroorganismus der   Gattung Coiynebacterium ist dadurch gekennzeichnet,   dass die Fermentation mit dem neuen Stamm Corynebacterium equi VB durchgeführt wird. 



   Der für das Wachstum des Organismus geeignete Nährboden kann als Kohlenstoffquelle Kohlehydrate oder Glycerin und als Stickstoffquelle proteinhaltige Stoffe, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton oder andere Aminosäuren, wie Asparagin, Glutaminsäure, Maisquellwasser, ferner Salzlösung mit Metallionen und gegebenenfalls Phosphat enthalten. 



   Die Zucht des Organismus wird vorteilhaft bei   2SoC   durchgeführt. Nach einer 2tägigen Zucht erreicht die konstitutive Dehydrogenase-Aktivität der Kultur eine solche Höhe, dass die Dehydrierung der Steroide mit einer verdünnten Kulturensuspension ermöglicht wird. Von Fall zu Fall kann dem Oxydationsmedium gleichzeitig mit dem Steroidsubstrat Chloramphenicol zugegeben werden, um eine Infektion im Verlauf der Dehydrierung zu vermeiden. 



   Zwecks Verhinderung der Zersetzung von manchen nach der Dehydrierung schnell weiteroxydierenden, nützlichen Steroidprodukten ist es empfehlenswert, gleichzeitig mit dem Ausgangsprodukt auch   ss-Naphthol   zuzugeben. Dadurch kann eine bessere Ausbeute erzielt werden. 



   In den nachstehenden, zur Veranschaulichung des erfindungsgemässen Verfahrens dienenden Bei-   spielen wurden CSp-, KA12, MSVII-und SA5 Nährböden benutzt. 



  Die Komponenten der einzelnen Nährböden sind die folgenden : CSp-Nährboden : 0, 44 KH2PC 0, 88% Na PO. 7H, 0      2, 00/0   Bierhefeextrakt Trockenstoffinhalt 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 KA12-Nährboden : 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> 0, <SEP> 1% <SEP> Asparagin
<tb> 0, <SEP> 20/0 <SEP> Maisquellwasser
<tb> 0,4% <SEP> Hefeextrakt <SEP> Trockenstoffinhalt
<tb> 0,5% <SEP> Glucose
<tb> 0, <SEP> 1% <SEP> KHtP04
<tb> 1, <SEP> 0% <SEP> Spurenelementlösung
<tb> 
 
 EMI3.2 
 
 EMI3.3 
 
<tb> 
<tb> der <SEP> Sterilisation1 <SEP> g <SEP> Cadiz <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> mg <SEP> Na2B4O7
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> Ca(NO3)2 <SEP> 0,72 <SEP> mg <SEP> MnCl2
<tb> 88 <SEP> mg <SEP> ZnSO4 <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> mg <SEP> (NHMoO
<tb> 3, <SEP> 9mgCuS04 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> mgFeSO4 <SEP> 
<tb> 1 <SEP> mg <SEP> NiSO
<tb> 
 mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt,

   sterilisiert. 



  MSVII-Nährboden : 
 EMI3.4 
 
<tb> 
<tb> 0,5% <SEP> Maisquellwasser
<tb> 2, <SEP> 00/0 <SEP> Glucose
<tb> 0, <SEP> 6% <SEP> Asparagin
<tb> 0, <SEP> 4% <SEP> Glutaminsäure <SEP> 
<tb> PH <SEP> vor <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> : <SEP> 7.
<tb> 



  SA5 <SEP> -Nährboden <SEP> : <SEP> 
<tb> s-g
<tb> 5% <SEP> Pepton
<tb> 1% <SEP> Fleischextrakt
<tb> 
 
Spuren von Bierhefeextrakt Trockenmaterial PH vor der Sterilisation auf 6, 7 bis 7, 0 eingestellt. 



   Zwecks Verfolgung des Oxydationsfortschrittes wurden die in den ungarischen Patentschriften   Nr.   150244 und Nr. 145921 beschriebenen analytischen Verfahren mit Thiosemicarbazon- bzw. Chromogenbildung, ferner die Prednisolon-Besümmungsmethode mit Chromogenbildung (J. Biochem. Microbiol. Techn. Ing. 3, [1961J, S. 119) angewendet. 



   Es wurde auch die Umwandlung der Steroide von Fall zu Fall mittels quantitativer Papierchromatographie wie folgt bestimmt : Aus einer gemessenen Menge des eingeengten Fermentatextraktes wurden 50 bis 100   bel   auf ein vorher in Form eines überfliessenden Chromatogramms mit Äthylalkohol gewaschenes Macherey-Nagel Papier Nr. 214, welches vor der Auftropfung mit 30% Propylenglykol enthaltendem Methylalkohol imprägniert wurde,   aufgetropft.   



   Als mobile Phase wurde ein Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Methylcyclohexan im Verhältnis von 1 : 1, das mit Propylenglykol gesättigt war, verwendet Zur chromatographischen Trennung der polaren Steroide wurden als Imprägnierungsmittel Äthylenglykol und als mobile Phase ein Gemisch von mit Äthylenglykol gesättigtem Tetrachlorkohlenstoff und Dichloräthan im Verhältnis von 1 : 1 verwendet. Nach Absonderung wurden die Steroide mit ultraviolettem Kontaktphoto nachgewiesen, aus dem entsprechend ausgeschnittenen Papierteil wurden die Steroide mit 10 ml p. a. Alkohol eluiert, und die Extinktion des Eluats bei 242   mp   gemessen. Der Steroidgehalt der Lösung wurde von der StandardKurve abgelesen. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert :   Beispiel l :   Aus einer einwöchigen, auf Kartoffel-Schrägagar gewachsenen Kultur des Corynebacterium equi wurde mit 8 ml sterilisiertem destilliertem Wasser eine Suspension zubereitet. Mit je   1 ml dieser Suspension wurden 100 ml einer sterilen KA12 -Nährlösung in Erlenmayer-Kolben von 500 ml Rauminhalt geimpft. Die geimpften Kolben wurden im Thermostatraum bei einer Temperatur von 28 /C   48 h lang unter Schütteln inkubiert.

   Zu 100 ml der auf diese Weise erhaltenen Kultur (in der Folge 
 EMI3.5 
 

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 Tabelle 1 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der
<tb> Fermentation <SEP> Hydrocortison <SEP> Prednisolon
<tb> in <SEP> h <SEP>  g/ml <SEP>  g/ml
<tb> 0 <SEP> 170 <SEP> 20
<tb> 1 <SEP> 90 <SEP> 100
<tb> 2 <SEP> 10 <SEP> 180
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 170
<tb> 4 <SEP> 0 <SEP> 160
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 20
<tb> 
 
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Dehydrierung des Hydrocortisons in der dritten Stunde be- endet ist, und eine weitere Inkubation den Abbau des Steroids ergibt. 



   Beispiel 2 : Aus einer   einwöchigen,   auf Kartoffel-Schrägagar gezüchteten Kultur des Cory-   nebacterium   equi mit 8 ml sterilem destilliertem Wasser wurde eine Suspension zubereitet und mit je
1 ml davon wurden 100-100 ml sterile Nährböden CSp in 500 ml Erlenmayer-Kolben geimpft. Die ge- impften Kolben wurden bei einer Temperatur von   280C   in einem Thermostatraum 48 h lang geschüttelt. 



   Der so gewonnenen Kultur (in der Folge CSp-Kultur genannt) wurden im 1. Kolben in der ursprünglichen Konzentration, im 2. Kolben nach einer 10fachen Verdünnung mit sterilem destilliertem Wasser auf je 100 ml 20 mg Hydrocortison in 2-2 ml   CaCI   enthaltendem Methanol zugesetzt. Nachher wurden die Kolben weiter inkubiert und die Oxydation mit der Chromogen-Prednisolon-Bestimmungsmethode verfolgt.

   Die Resultate sind in Tabelle 2 zusammengefasst : 
Tabelle 2 
 EMI4.2 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> Kolben <SEP> 1 <SEP> Kolben <SEP> 2
<tb> Fermentation <SEP> Prednisolon <SEP> Prednisolon
<tb> in <SEP> h <SEP> g/ml <SEP> g/ml
<tb> 0 <SEP> 35 <SEP> 25
<tb> 1 <SEP> 105 <SEP> 38
<tb> 2 <SEP> 175 <SEP> 50
<tb> 4 <SEP> 100 <SEP> 85
<tb> 6 <SEP> 50 <SEP> 115
<tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 165
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 170
<tb> 
 
Die Daten der Tabelle 2 zeigen, dass durch die Verdünnung der Kultur der Geschwindigkeitsunterschied zwischen der Dehydrierung und dem Prednisolon-Abbau bedeutend erhöht werden kann, wodurch ermöglicht wird, dass die Fermentation bei der maximalen Konzentration des nützlichen Produkts eingestellt wird. 



     Beispiel 3 :   Eine 2tägige Kultur wurde mit destilliertem Wasser auf das 10fache Volumen verdünnt und nachher wurden dem 1. Kolben 20 mg Hydrocortison und dem 2. Kolben 20 mg Hydrocortison und 3 mg Chloramphenicol in   CaCL-hältigem   Methanol zugesetzt. Die Inkubation und analytische Bestimmung erfolgten gemäss Beispiel 2. Die Resultate sind in Tabelle 3 angegeben : 

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 Tabelle 3 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> Kolben <SEP> 1 <SEP> Kolben <SEP> 2
<tb> Fermentation <SEP> Prednisolon <SEP> Prednisolon
<tb> in <SEP> h <SEP>  g/ml <SEP>  g/ml
<tb> 0 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> 4 <SEP> 130 <SEP> 120
<tb> 8 <SEP> 160 <SEP> 150
<tb> 12 <SEP> 140 <SEP> 180
<tb> 
 
 EMI5.2 
 nase-Aktivität des Corynebacterium equi nicht. 



   Beispiel 4: Eine 2tätige KA12-Kultur wurde mit destilliertem Wasser auf das 10fache Volumen verdünnt. Nachher wurde der in einem 5 1-Fermentor verdünnten Kultur 1 g   17a-Methyltestosteron,   in
50 ml Aceton gelöst, zugesetzt. Die Kultur wurde bei   280C   mit einer Drehzahl von 300   Umdr/minge-   rührt und bei Durchströmen von 5   l   Luft/min inkubiert. Das Fortschreiten der Oxydation wurde mit der
Thiosemicarbazon-Methode gemessen. Die Fermentation wurde auf Grund der in Tabelle4 ersicht- lichen Bestimmungsdaten nach 12 h eingestellt. 



   Tabelle 4 : 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> 17&alpha;-Mcthyl- <SEP> 1-Dehydro-methylFermentation <SEP> testosteron <SEP> testosteron
<tb> in <SEP> h <SEP> ftg/ml <SEP> g/ml
<tb> 0 <SEP> 196 <SEP> 0
<tb> 4 <SEP> 112 <SEP> 78
<tb> 8 <SEP> 24 <SEP> 148
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> IM
<tb> 
 Die Fermentbrühe wurde mit 3 X 1/12 Volumen Dichloräthan extrahiert. Die vereinigten Extrakte 
 EMI5.4 
    4-dien-17ss-ol-3-ongewonnen. Fp. 164bis1670C-, [ccl D =Beispiel 5 :   Eine 2tägige Kultur wurde mit destilliertem Wasser auf das 10fache Volumen verdünnt. Der verdünnten Kultur wurde im Fermentor 1 g Hydrocortison in 20 ml Methanol, das 2 g   CaCL   enthielt, zugesetzt. Die Inkubation und die analytische Bestimmung wurden auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise durchgeführt.

   Die Fermentation wurde auf Grund der in Tabelle 5 angegebenen Bestimmungsdaten nach 12 h eingestellt. 



   Tabelle 5 
 EMI5.5 
 
<tb> 
<tb> Zeitdauer <SEP> der
<tb> Fermentation <SEP> Hydrocortison <SEP> Prednisolon
<tb> in <SEP> h <SEP> btglml <SEP> btglml <SEP> 
<tb> 0 <SEP> 190 <SEP> 10
<tb> 4 <SEP> 100 <SEP> 98
<tb> 8 <SEP> 42 <SEP> 148
<tb> 12 <SEP> 0 <SEP> 193
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 
Die Fermentbrühe wurde nach Beendigung der Umwandlung mit 3 X 33 Vol.-% Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. 
 EMI6.1 
 
Beispiel 6 : Aus einer einwöchigen, auf Kartoffel-Schrägagar gezüchteten Kultur von Corynebacterium equi wurde mit 8 ml sterilem destilliertem Wasser eine Suspension zubereitet und mit je   1 ml davon wurden 100-100 ml steriler SA--Nährboden in 500 ml Erlenmayer-Kolben geimpft. Die geimpften Kolben wurden 48 h lang im Thermostatraum bei einer Temperatur von 28 C inkubiert.

   Zu   100 ml der auf diese Weise erhaltenen Kultur wurden dem 1. Kolben 20 mg 17   a-Methyltestosteron,   und dem 2. Kolben 20 mg 17   &alpha;-Methyltestosteron   und 2 mg ss-Naphthol zugesetzt. Die weitere Inkubation und analytische Verfolgung wurden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 6 angegeben. 



   Tabelle 6 
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> 1-Dehydro- <SEP> Kolben <SEP> 1 <SEP> 1-Dehydro
<tb> Zeitdauer <SEP> der <SEP> 17 <SEP> &alpha;-Methyl- <SEP> methyl <SEP> 17&alpha;Methyl- <SEP> methylFermentation <SEP> testosteron <SEP> testosteron <SEP> testosteron <SEP> testosteron
<tb> in <SEP> h <SEP>  g/ml <SEP>  g/ml <SEP>  g/ml <SEP>  g/ml
<tb> 0 <SEP> 187 <SEP> 0 <SEP> 193 <SEP> 0
<tb> 3 <SEP> 32 <SEP> 145 <SEP> 45 <SEP> 129
<tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 112 <SEP> 5 <SEP> 181
<tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 160 <SEP> 
<tb> 
 
Gemäss Tabelle 6 verhindert das ss-Naphthol die Zersetzung des nützlichen Dehydro-methyltestosterons ohne Beeinflussung der Dehydrierung. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden in 1,2-Stellung durch aerobe Fermentation mit einem 
 EMI6.3 
 tation mit dem neuen Stamm Corynebacterium equi VB (deponiert am 19. August 1966 unter Nr. 32 in der Stammsammlung des Institutes für Gesundheitswesen zu Budapest) durchgeführt wird.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährboden mit Wasser auf das 8- bis 10fache Volumen verdünnt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation in Gegenwart von ss-Naphthol durchgeführt wird.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsprodukt Hydrocortison oder 17 a- Methyltestosteron verwendet wird.