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Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden
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oxylgruppe befreiten Rest einer a - Aminocarbonsäure bedeuten, wobei mindestens einer der R-Reste eine Aminogruppe enthält und mindestens eine Aminogruppe des Moleküls einen langkettigen Alkoxycarbonyl-oder Alkenyloxycarbonylrest trägt, und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen. Diese Peptide und deren Säureadditionssalze zeichnen sich durch ihre Wirksamkeit gegen pathogene und apathogene Mikroorganismen, wie grampositive und gramnegative Bakterien oder Hefen aus. Die Verbindungen sind sehr wenig toxisch. Sie zersetzen sich unter Einwirkung von proteolytischen Enzymen, wobei Spaltprodukte gebildet werden, die keinerlei antibakterielle Wirksamkeit mehr entfalten. Die Verbindungen besitzen daher Bedeutung als Konservierungsmittel, z.
B. in der Lebens- oder Futtermittelindustrie, sowie als Desinfektionsmittel für ärztliche und nichtärztliche Zwecke.
Die Verbindungen der Formel I und deren Säureadditionssalze besitzen zum Teil auch coccidiostatische Wirkung und können dementsprechend zur Verhütung, Eindämmung und Heilung der Coccidiose Verwendung finden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Peptide der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel :
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mit einer Verbindung der allgemeinen Formel :
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worin a, b, c und d für 0 oder 1 stehen und die Summe dieser Indices 0, 1 oder 2 beträgt, Y ein Halogenatom, eine Hydroxy- oder Azidogruppe, eine gegebenenfalls nitrierte Phenoxygruppe, eine Phenylmercaptogruppe oder den Rest eines Anhydrides mit einer anorganischen oder organischen Säure, X'eine Alkoxy-, Amino-, Monoalkylamino-,
Dialkylaminogruppe oder eine Hydroxygruppe in Form eines Salzes mit einer anorganischen oder tertiären organischen Base und die Symbole R je einen von der a - Amino- und der Carboxygruppe befreiten Rest einer a - Aminocarbons ure bedeuten, wobei mindestens einer der R-Reste eine Aminogruppe enthält und wobei ferner alle in den Verbindungen II und III vorhandenen Aminogruppen mit Ausnahme der in der Formel III am linken Kettenende befindlichen a-Aminogruppe durch abspaltbare Schutzgruppen und/oder langkettige Alkoxycarbonyl-oder Alkenyloxycarbonylreste geschützt sind, unter Abspaltung von HY zu einem Di-, Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel umsetzt :
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Peptides mit Phthalsäureanhydrid. Nach erfolgter Kondensation erhält man nach Zusatz von Hydraziden und durch Behandeln mit Salzsäure eine Freisetzung der Aminogruppen. Die Aminogruppen können auch durch Formylreste geschützt werden, wozu man auf die Aminosäuren bzw. Peptide Ameisensäure in Gegenwart von Essigsäureanhydrid einwirken lässt.
Bei Vorliegen von sowohl durch Formyl- als auch Carbobenzoxyreste geschützten Aminogruppen im Molekül lässt sich eine selektive Abspaltung erzielen, indem man z. B. nur die Carbobenzoxygruppen durch katalytische Hydrierung oder mit Bromwasserstoffsäure/Essigsäure abspaltet und dabei die Formylgruppen unbeeinflusst lässt. Man kann jedoch auch die Formylgruppen selektiv abspalten, z. B. durch Mineralsäuren in der Kälte, wobei die Carbobenzoxygruppen unbeeinflusst bleiben. Auf diese Weise ist
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wie Cetyloxycarbonylchlorid.
Im nachfolgenden sollen einige Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläu- tert werden : Carbodiimidmethode :
Diese Methode kann dann angewendet werden, wenn man eine Verbindung der Formel II mit Y =-OH, also eine Aminocarbonsäure bzw. ein Di- oder Tripeptid mit freier endständiger Carboxylgruppe als Ausgangsmaterial verwendet. Sie besteht darin, dass man die Kondensation der beiden Peptidaufbaustücke der Formeln II und III in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimides, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, oder Carbonyldiimidazol, vornimmt. Die Reaktion wird vorteilhaft bei niedriger Temperatur in einem Lösungsmittel, wie z. B.
Chloroform, Dimethylformamid, Essigester, ausgeführt, wobei der entstandene Harnstoff durch Filtration entfernt wird, das Peptid, aber in Lösung bleiben soll, das dann aus dem Filtrat isoliert werden kann.
Azidmethode :
Bei dieser Methode wird die Peptidbindung durch Wechselwirkung eines Säureazides (Y = **N.) mit einer Aminogruppe gebildet. Das Azid erhält man durch Einwirken von salpetriger Säure auf das entsprechende Säurehydrazid. Die Reaktion wird zweckmässigerweise in Lösung, z. B. in Essigester, Dimethylformamid usw., gegebenenfalls in Gegenwart von Essigsäure, bei tiefer Temperatur durchgeführt.
Säurechloridmethode :
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Diese Methodebenzoxyaminosäurechloriden auszugehen, die mit einem Aminosäureester (X'= Alkoxy-) in Gegenwart einer Base unter Kühlung umgesetzt werden.
Synthese unter Verwendung gemischter Anhydride :
Diese Synthese besteht darin, dass die bei der Kondensation die Peptidbindung eingehende Carboxylfunktion-COY in Form eines in der Peptidchemie üblichen gemischten Anhydrides mit einer organischen oder anorganischen Säure vorliegt. Man geht dabei zweckmässigerweise so vor, dass man eine Verbindung der Formel II mit Y=-OH in einem inerten Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, mit einer Base, z. B. Triäthylamin, behandelt, auf das so gebildete Salz bei tiefer Temperatur einen Chlorkohlensäureester einwirken lässt und das entstandene gemischte Anhydrid, ohne Isolierung, mit einer Verbindung der Formel III, z. B. mit einem Aminocarbonsäureester (X'= Alkoxy-) oder mit dem NaSalz einer Aminocarbonsäure (X* =-ONa), umsetzt. Als Chlorkohlensäureester können z.
B. der Methyl-, Äthyl- oder tert. Butylester verwendet werden. Zur Herstellung von reaktiven Anhydriden kommen unter anderem auch Schwefeltrioxyd in Dimethylformamid sowie Diäthylchlorphosphit [ (C HgOP- Cl] oder Tetraäthylpyrophosphit [ (C HgO) P-O-P (OC Hg) ] in Betracht.
Synthese unter Verwendung aktivierter Ester :
Diese Synthese besteht darin, dass die Carboxylfunktion (-COY) der Verbindung der Formel II als sogenannter aktivierter Ester vorliegt, z. B. als p-Nitrophenylester. Dieser kann aus einer geschützten Aminocarbonsäure in Gegenwart von Pyridin mittels Di-p-nitrophenylsulfit (NO2-C5H4-SO-C6H4-NO2) gewonnen werden und geht durch Umsatz mit einem Aminosäureester (X'der ForrÍ1el III = Alkoxy-) bei Zimmertemperatur die Peptidbindung ein. Das Reaktionsprodukt kann durch Kristallisation aufgearbeitet werden. Als aktivierte Ester können beispielsweise der p-Nitrophenyl-, 3, 5-Dinitrophenyl- oder Thiophenylester Verwendung finden.
In den folgenden Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet :
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im Vakuum ein und nimmt den Rückstand in Essigester auf. Die Essigesterlösung wird dreimal mit ln-Salzsäure, zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Die 26 g Rückstand liefern beim Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther 15, 1 g Nα-Cetyloxycarbonyl-(N#-Z)-L-Lys-(N#-Z)-L-Lys-OCH3 vom Schmelzpunkt 93-1010C. Weiteres Umkristallisieren erhöht den Schmelzpunkt auf 105-1060C ; M = - 10, 10 (c = 1, 0 in Methanol).
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Eisessig mit 3,5 g 5%iger Palladiumkohle hydrogenolysiert.
Nach Aufnahme von 930 ml Wasserstoff wird kein weiterer Wasserstoff mehr aufgenommen, und die Mischung wird filtriert. Nach Eindampfen im Vakuum verbleibt ein wasserlöslicher Rückstand, der in 22 ml 2, 3n-Salzsäure/Methanol gelöst und
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halten werden : 121 g (0,5 Mol) Cetylalkohol werden in 1000 ml Benzol gelöst. Unter Rühren wird so lange Benzol abdestilliert, bis kein Wasser mehr mit übergeht. Danach senkt man die Temperatur auf 55 - 600C und lässt 70 ml (99 g = 1 Mol) kondensiertes Phosgen eindestillieren, was etwa 6 h dauert.
Dann wird die Hälfte des Benzols abdestilliert, wobei ein leichter Stickstoffstrom über die Lösung geblasen wird. Der phosgen-und salzsäurefreie Rückstand wird im Vakuum noch völlig vom Benzol befreit, wobei man etwa 150 g Cetyloxycarbonylchlorid erhält.
28,0 g (0, 1 Mol) (N-Z)-L-Lys-OH werden fein pulverisiert in 120 ml ln-Natronlauge und 50 ml Aceton gegeben und zu diesem Gemisch bei etwa 50C unter Rühren gleichzeitig 30,5 g (0, 1 Mol) Cetyloxycarbonylchlorid und 100 ml ln-Natronlauge tropfenweise zugegeben, was etwa 35 min dauert.
Das Gemisch wird noch 20 min gerührt, dann mit 3n-Salzsäure auf Kongo angesäuert und zweimal mit Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wird zweimal mit In-Salzsäure, zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Va-
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(N Beispiel 2: Na-Octyloxycarbonyl-(N6-Z)-L-Orn-NH-NH2.
31,7 g (0, 1 Mol) (N -Z)-L-Orn-OCH. HCl werden fein pulverisiert in 300 ml Benzol suspendiert und azeotrop vom Wasser befreit. Dann wird unter Rückfluss und Rühren so lange Phosgen eingeleitet, bis alles in Lösung gegangen ist (etwa 5 h). Anschliessend werden im Stickstoffstrom 2/3 des Benzols abdestilliert und der Rest im Vakuum eingedampft. Man erhält 26, 4 g Carbonyl-(N-Z)-L-Orn-OCH (a- Isocyanato-6-carbobenzoxyamino-valeriansäuremethylester) in öliger Form.
Von 400 ml Benzol werden 100 ml abdestilliert, und zum Rückstand werden 15, 1 ml (96 Mol) n-Octanol gegeben. Dann tropft man unter Rühren bei 20C 26, 4 g (86 mMol) Carbonyl- (N -Z)-L-Orn- -OCH3 in 50 ml absolutem Benzol zu und lässt dann bei Raumtemperatur 16 h stehen. Nach Verdampfen im Vakuum verbleiben 38, 8 g Nα-Octyloxycarbonyl-(N#-Z)-L-Orn-OCH3 als farbloses Öl, das nicht kristallisiert.
Dieses Öl wird in 200 ml Methanol gelöst und mit 8,5 ml (175 mMol) Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 20 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Alkohol/Wasser umkristallisiert. Man erhält 32, 2 gN"-Octyloxycarbonyl- (N -Z)-L-
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ester gerührt und mit 15 ml Eisessig in Lösung gebracht. Bei 50C lässt man dann unter Rühren soviel tige Natriumnitritlösung zutropfen, bis ein Kaliumjodidstärke-Papier nach 5 min nicht mehr entfärbt wird (etwa 10 ml). Die wässerige Phase wird dann abgetrennt. Die organische Phase wird mit Eiswasser und zweimal mit piger Kaliumhydrogencarbonatlösung und Eis gewaschen, dann filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 20, 5g(72,3 mMol) H-(N#-Z)-L-Orn-OCH3 gegeben.
Das Gemisch wird 18 h bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann zweimal mit 3n-Salzsäure, zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, hierauf getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand wird aus Benzol/Petroläther umkristallisiert. Man erhält 30 g (61%) Nα-Octyloxycarbonyl - (N#-Z)- L - Orn - (N#-Z) - L-Orn-OCH3 vom Schmelzpunkt 83 - 930c ;
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Eisessig mit 5 g 10%iger Palladiumkohle hydrogenolysiert. Nach Aufnahme von 2, 11 Wasserstoff bleibt die Hydrierung stehen. Die Hydrierungsmischung wird filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in 100 ml 2n-methanolischer Salzsäure gelöst und die Lösung im Vakuum erneut eingedampft. Nach Umkristallisation aus Methanol/Äther erhält man 9, 2 g N-Octyloxycarbonyl-L-Orn-
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L-Orn-OCHg-2HCI vom28, 7 g (0, 154 Mol) Laurylalkohol werden in 250 ml Benzol gelöst und durch azeotropes Abdestillieren vom Wasser befreit. Dann werden bei 600C unter Rühren 21, 2 ml (0, 3 Mol) verflüssigtes Phosgen eindestillieren gelassen, und anschliessend wird das Gemisch noch 4 h bei derselben Temperatur gerührt.
Im Stickstoffstrom wird dann die Hälfte des Benzols abdestilliert, um überschüssiges Phosgen und Salzsäure zu entfernen, und schliesslich wird der Rest im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz eingedampft.
Man erhält 36, 2 g Lauryloxycarbonylchlorid als öligen Rückstand, der nicht weiter gereinigt wird.
36, 6 g (145 mMol) H- (NY-Z)-D-Dab-OH, gelöst in 160 ml Natronlauge und 50 ml Aceton, werden unter Rühren bei etwa 50C gleichzeitig mit 36, 2 g (145 mMol) Lauryloxycarbonylchlorid und 145 ml
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schliesslich im Vakuum eingedampft. Der Eindampfrückstand kristallisiert beim Verreiben mit etwas Wasser und wird aus Hexan umkristallisiert. Man erhält 53, 5 g Na-Lauryloxycarbonyl- (NY-Z)-D-Dab- - OH vom Schmelzpunkt 69-720C ; [a ]24 = +7, 88 (1, 00 in Methanol).
Nα-Lauroyloxycarbonyl-(Nγ-Z)-D-Dab-(Nγ-Z)-D-Dab-OCH3.
23 g (76 mMol) H- (NY -Z)-D-Dab-OCH,'HCl werden fein gepulvert in 50 ml Chloroform suspendiert und mit 11, 2 ml (76 mMol) Triäthylamin versetzt, kräftig geschüttelt und mit 200 ml Äther versetzt. Man hält das Gemisch 20 min im Eisbad und nutscht dann das ausgeschiedene Triäthylammoniumchlorid ab.
35 g (76 mMol) Nα-Lauryloxycarbonyl-(Nγ-Z)-D-Dab-OH löst man in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran, kühlt die Lösung auf 5 - 100C und setzt unter Rühren 13 g (76 mMol) 95% igues Carbonyldi-
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imidazol zu. Nach 30 min Rühren gibt man die gemäss dem vorangehenden Absatz erhaltene Lösung zu und lässt das Gemisch 4 h bei Raumtemperatur stehen. Nach dem Eindampfen im Vakuum wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und die Essigesterlösung dreimal mit In-Salzsäure und einmal mit Wasser gewaschen (unter Beifügen von etwas Methanol zur besseren Phasentrennung). Nun wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Bei der Umkristallisation aus Chloroform/Petrol- äther erhält man 18, 9 g Nα-Lauryloxycarbonyl-(Nγ-Z)-D-Dab-(Nγ-Z)-D-Dab-OCH. vom Schmelz-
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hydrogenolysiert, bis nach Aufnahme von 1, 2 l Wasserstoff die Hydrierung stehen bleibt. Man filtriert vom Katalysator ab, dampft das Filtrat im Vakuum ein, setzt zum öligen Rückstand 60 ml 2n-methanolische Salzsäure und dampft wieder ein. Aus Methanol/Äther kristallisieren 8, 1g chromatographisch reines Nα-Lauryloxycarbonyl-D-Dab-D-Dab-OCH.#2HCl vom Schmelzpunkt 188 - 1940C ;
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40 (1,Tetrahydrofuran gelöst und bei -100C unter Rühren mit 13, 8 g Carbonyldiimidazol versetzt.
Nach 30 min gibt man eine Lösung von H- (N -Z)-L-Lys-OCH (aus 28 g Hydrochlorid mit Triäthylamin freigesetzt) in 50 ml Tetrahydrofuran zu und rührt noch 4 h bei Raumtemperatur weiter. Man dampft das Gemisch im Vakuum ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und wäscht die Essigesterlösung mit eiskalter Imolarer Weinsäurelösung, Eiswasser, 10% iger Kaliumhydrogencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung. Dann wird die Essigesterlösung über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Aus Aceton/Äther schmilzt das erhaltene Nα-Formyl-(N#-Z)-L-Lys-(N#-Z)-L-Lys-OCH3
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sung wird auf Raumtemperatur abgekühlt, mit etwa 300 ml Salzsäuregas/Methanol (4n) versetzt und 6 h stehen gelassen.
Dann wird die Lösung bei 400C eingedampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die Lösung wieder eingedampft. Diese Operation wird noch dreimal wiederholt. Man erhält schliesslich ein öliges Rohprodukt, das direkt weiterverarbeitet wird.
Nα-Myristyloxycarbonyl-(N#-Z)-L-Lys-(N#-Z)-L-Lys-OCH3
40,5 g des erhaltenen Rohproduktes werden in etwa 200 ml Tetrahydrofuran gelöst und zwecks Freisetzung der Base mit 22 ml Triäthylamin versetzt. Vom ausgefallenen Triäthylamin-hydrochlorid wird nach kurzem Kühlen abgesaugt. Das Filtrat wird erneut mit 22 ml Triäthylamin versetzt und auf -10 C gekühlt. Unter Rühren tropft man eine Lösung von 18,7 g Myristyloxycarbonylchlorid in 20 ml Tetrahydrofuran hinzu. Nach weiterem Rühren bei etwa OOC wird die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit 0, In-Salzsäure gewaschen.
Die getrocknete Essigesterlösung wird eingedampft, wobei N-Myristyloxycarbonyl- (N -Z)-L-Lys- (NS-Z)- - L-Lys-OCH ausfällt. Nach dem Umkristallisieren aus Essigester schmilzt diese Substanz bei 110-113 C.
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