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Verfahren zur Herstellung von neuen 2', 3'-Di-O-acylderivaten des 6-Azauridins
Das 6-Azauridin, eine als Cancerostaticum angewendete Substanz, besitzt in seiner Anwendung als Chemotherapeuticum zwei Nachteile : einerseits ist es erforderlich, dieses Heilmittel intravenös zu verabreichen, da es bei der Verabreichung per os toxische Nebenwirkungen aufweist, anderseits wird die Substanz bald nach der Verabreichung aus dem Organismus ausgeschieden und ihre therapeutische Wirkung wird nicht voll ausgenutzt. Es wurde eine Verbindung gesucht, welche die Wirkung des 6-Azauridins verlängern würde und gleichzeitig bei der peroralen Verabreichung keine toxische Nebenwirkung hätte.
Derartige Substanzen sind die 21, 3-Di-O-acylderivate des 6-Azauridins.
Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von neuen 21, 3'-Di-O-acylderivaten des 6-Azauridins der allgemeinen Formel
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worin R Alkyl bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass das 6-Azauridin bzw. verunreinigtes 6-Azauridin aus der fermentativen Erzeugung in an sich bekannter Weise mit Tritylchlorid in Anwesenheit einer organischen tertiären Base, vorzugsweise Pyridin, umgesetzt und das erhaltene 5'-O-Trityl-6-azauridin mit Hilfe eines Acylierungsmittels, wie dem Anhydrid einer organischen Säure oder einem Acylhalogenid in Anwesenheit einer Base in 2', 3'-Di-O-acyl-5'-0-trityl-6-azauridin übergeführt wird, aus welchem die Tritylgruppe durch Säure abgespalten wird.
Erfindungsgemäss kann an Stelle von Tritylchlorid Tritylbromid, Trityljodid oder andere Triarylmethylhalogenide, z. B. Mono-p-methoxytrityl-, Di-p-methoxytrityl-oder Tri-p-methoxytritylhalo- genide verwendet werden.
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Der Vorteil der letztgenannten Gruppen besteht in deren leichterer Abspaltbarkeit (bei niedrigerer Temperatur, kützerer Reaktionsdauer u. a.).
Das bei der Acylierung gebildete 5'-0-Triaryl-methyl-6-azauridin wird durch Einwirkung von Säure oder durch einen Kationenaustauscher im W -Cyc1us in das 2'. 3'-Di-O-acylderivat des 6-Azauridins überführt.
Die Einwirkung von Triarylmethylhalogenid auf 6-Azauridin erfolgt in Pyridinlösung. Auch die Acylierung wird mit einem Acylierungsreagens in Pyridinlösung vorgenommen.
Die Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Abspaltung der Triarylmethylgruppe mit Vorteil mit Essigsäure in Anwesenheit von Wasser oder gegebenenfalls von organischen Lösungsmitteln ausgeführt wird.
InChem. Abstr. 54, 883oa-g [1960] wird zwar die Bildung des 2', 3'-Di-0-benzyl-6-azauridins beschrieben. Es handelt sich jedoch um die Bildung eines Äthers (Alkylderivat), während die Erfindung die Frage der Herstellung von Estern (Acylderivaten) des 6-Azauridins löst.
2', 3'-Di-0-benzyl-6-azauridin zeigt im übrigen keine cancerostatischen Wirkungen und das in der erwähnten Literatur beschriebene Verfahren ist auf Gewinnung dieses Stoffes, welcher als Zwischenprodukt bei der Synthese der Phosphate des 6-Azauridins erhalten wird, ausgerichtet.
Dagegen sind die 2'. 3'-Di-O-acylderivate des 6-Azauridins ganz neue Stoffe-Cancerostatika-. welche die Wirkung des bekannten 6-Azauridins verlängern und gleichzeitig bei peroraler Verabreichung keine toxische Nebenwirkung haben.
Der Hauptvorteil der 2', 3'-Di-O-acylderivate des 6-Azauridins besteht darin, dass man dieses peroral applizieren kann, während es notwendig ist, das 6-Azauridin intravenös zu verabreichen, da es bei der Verabreichung per os toxische Nebenwirkungen aufweist. Anderseits wird das 6-Azauridin bald nach der Verabreichung aus dem Organismus ausgeschieden und seine therapeutische Wirkung nicht voll ausgenutzt.
Die 2'. 3'-Di-0-acylderivate des 6-Azauridins verlängern dagegen ihre therapeutische Wirkung, haben aber gleichzeitig bei der peroralen Verabreichung keine toxischen Wirkungen.
Das 2', 3'-Di-0-acetyl-6-azauridin wurde leukämischen Mäusen verabreicht. Dabei wurde festgestellt. dass sein cancerostatischer Effekt, bei der peroralen Applikation in derjenigen Menge, welche äquimolar mit der niedrigsten therapeutischen Dosis des 6-Azauridins, d. i. 600 mg/kg des Gewichtes (Gesamtdosis 4, 2 g/kg des Gewichtes) ist, I300/o beträgt. Der cancerostatische Effekt wurde als Zeit des Überlebens bewertet (Kontrolle- O).
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abreicht. Diese hat das Überleben von 12Wo verursacht, d. i. mindestens dieselbe Wirkung wie bei
6-Azauridin. In der verabreichten Menge war der Stoff untoxisch.
Die Verabreichung der äquivalenten Dosis des Dipropionyl-6-azauridins bei Mausleukämie AK (per os durch eine Sonde) hatte das Überleben von 129No zur Folge.
Eine ähnliche Wirkung kann man bei höheren Diacylderivaten erwarten. Weiters wurde festgestellt, dass bei den leukämischen Mäusen das Diacetat des 6-Azauridins den cancerostatischen Effekt des Formyl- biuretes um 26tao erhöht.
Zum Unterschied von 6-Azauridin, welches sich bei der peroralen Verabreichung im Darm in
6-Azauracil und Ribose zersetzt und damit seine cancerostatische Wirkung bei gleichzeitiger Hervorru- fung von toxischen Nebenwirkungen, hauptsächlich am Zentralnervensystem, verringert werden die er- findungsgemäss hergestellten Stoffe nicht abgebaut und gelangen über die Darmwand in den lymphatischen und Blutkreislauf, ohne dass sich die Azauridinkomponente des Derivates grundsätzlich zersetzen würde.
Aus allen diesen Tatsachen ist klar ersichtlich, dass diese Art von Derivaten peroral ohne Gefahr der i toxischen Nebenwirkungen bei Erhaltung des therapeutischen Effektes verabreicht werden kann.
Einen ähnlichen Mechanismus der Ausscheidung wie beim Triacetat des 6-Azauridins vorausgesetzt, ist bei Diacylderivaten des 6-Azauridins im Vergleich mit dem 6-Azauridin höhere Depotwirkung im
Organismus zu erwarten, u. zw. neben allen Vorteilen, welche die perorale Applikation bietet.
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Vergleichstabelle :
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<tb>
<tb> perorale <SEP> Verabreichung
<tb> 6-Azauridin <SEP> kein <SEP> Heileffekt, <SEP> da <SEP> peroral
<tb> nicht <SEP> verwendbar
<tb> 2'. <SEP> 3'-Di-0-acetyl-6-azauridin <SEP> 11 <SEP> 00/0 <SEP> *)
<tb> 2'. <SEP> 3'-Di-0-propionyl-6-azauridin <SEP> 1090/0 <SEP> *) <SEP>
<tb>
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Das Darstellungsverfahren für 2', 3'-Di-0-acylderivate des 6-Azauridins beruht darauf, dass man zu- nächst auf 6-Azauridin ein Triarylmethylhalogenid in Pyridin, gegebenenfalls in einem andern organi- schen Lösungsmittel (z. B. Dimethylformamid) in Anwesenheit einer organischen tertiären Base (z. B.
Pyridin oder N-Äthylpiperidin) einwirken lässt. Nach Abschluss der Reaktion bei Raumtemperatur oder er- höhter Temperatur (z. B. 900C) wird aus dem Reaktionsgemisch nach eventuellem Abdampfen der Lösungs- mittel das gewünschte Triarylmethylderivat durch Ausschütteln in ein organisches mit Wasser nicht misch- bares Lösungsmittel (z. B. Chloroform) isoliert, wobei wasserlösliche Substanzen durch Ausschütteln mit
Wasser beseitigt werden. Durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels wird das gewünschte 5'-0- - Triarylmethyl-6-azauridin gewonnen, das eventuell durch Kristallisation gereinigt wird. Man kann auch derart verfahren, dass das Reaktionsgemisch nach eventuellem Verdampfen der Lösungsmittel und Lösen des Rückstandes in einer kleinen Menge eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (z. B.
Aceton) unter Rühren in einen Überschuss an Eiswasser eingegossen wird. Dadurch scheidet sich 5'-0-
Triarylmethyl-6-azauridin ab.
Das nach dem beschriebenen Verfahren hergestellte Triarylmethylderivat des 6-Azauridins wird wei- ter mit dem Anhydrid einer organischen Säure (z. B. Acetanhydrid) oder mit einem Acylhalogenid (z. B.
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falls mit Keten oder dessen Derivaten bei einer Temperatur von-20 bis 1000C acyliert. Die gewünschte Substanz wird aus dem Reaktionsgemisch nach eventuellem Verdampfen der Lösungsmittel durch Ausschütteln in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel isoliert, wobei wasserlösliche Substanzen durch Ausschütteln mit Wasser beseitigt werden. Das gewünschte 2', 3'-Di-0-acyl-5'-0 - - triarylmethyl-6-azauridin wird dann durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels gewonnen.
Man kann auch das Reaktionsgemisch unter Rühren in einen Wasserüberschuss eingiessen ; das 2', 3'- Di-O-acyl-5'-O-triaryl-methyl-6-azauridin scheidet sich als Niederschlag ab. Aus diesem Produkt wird die Triarylmethylgruppe durch Säureeinwirkung (z. B. 800/oige Essigsäure) durch Stehen bei Raumtemperatur oder in eventueller Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels, z. B. Dioxan, durch kurzfristiges Erhitzen, z. B. 10 min zur Siedehitze, abgespalten ; es kann auch z. B. BromwasserstofisäureinEssigsäure- lösung in eventueller Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels verwendet werden.
Das gewünschte 2', 3'-Di-0-acylderivat des 6-Azauridins wird nach eventueller Beseitigung von Triarylmethylcarbinol durch Ausschütteln in Wasser isoliert, wobei die unerwünschten Nebenprodukte mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel (z. B. Benzol) ausgeschüttelt werden. Das gewünschte Diacylderivat des 6-Azauridins wird aus der wässerigen Lösung durch Ausschütteln in ein geeignetes organisches Lösungsmittel (z. B. Chloroform, gegebenenfalls Äthylacetat) oder durch Verdampfen der wässerigen Lösung im Vakuum isoliert. Das gewünschte Diacylderivat des 6-Azauridins kann auch chromatographisch an Cellulose oder Siliciumdioxyd gereinigt werden.
Als Ausgangsprodukt des 2', S'-Di-O-acyl-azauridins kann mit Vorteil unreines 6-Azauridin aus einer der Isolationsstufen der fermentativen Erzeugung des 6-Azauridins angewendet werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird im weiteren an Ausführungsbeispielen veranschaulicht, ohne dass durch diese der Bereich der Erfindung eingeschränkt werden soll.
Beispiel l : 4, 9 g 6-Azauridin werden in 50 ml trockenes Pyridin eingetragen und 6, l g Trityl- chlorid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zum Auflösen des 6-Azauridins gerührt und dann bei Raumtemperatur bis zum Abschluss der Reaktion eine Woche stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann unter Rühren auf 500 ml Eis-Wasser-Gemisch aufgegossen und die wässerige Schicht nach dem AbsetzenvondemsirupösenRückstand abgegossen. Der sirupöse Rückstand wird in 100 ml Chloroform ge-
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löst und dreimal mit je 50 ml Wasser ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird nach dem Filtrieren im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 10 ml Aceton gelöst und der Kristallisation überlassen. die Abscheidung der Substanz wird durch Zusatz von 50 ml Benzol vollendet.
Man gewinnt 8. 7 g (89o) 5'-O-Trityl-6-azauridin.
Zu 0,59 g 5'-O-Trityl-6-azauridin in 5 ml trockenem Pyridin werden 0,5 ml Acetanhydrid zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur'5 h stehen gelassen. Die Reaktionslösung wird im Vakuum zur Trockene verdampft und der Rückstand in 20 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird dreimal mit je 5 ml Wasser ausgeschüttelt und im Vakuum zur Trockene verdampft. Zurückgeblie- bennes Pyridin wird aus der Substanz durch dreimal wiederholtes Abdestillieren mit 5 ml Äthanol beseitigt.
Man erhält 0, 55 g (96 0) 2'. 3'-Di-0-acetyl-5'-0-trityl-6-azauridin. Zu dem Produkt werden20 ml 85% igue Essigsäure zugesetzt und das Reaktionsgemisch bis zum Lösen der Ausgangssubstanz geschüttelt.
Die Abspaltung der Tritylgruppe wird dann chromatographisch verfolgt. Nach Abschluss der Abspaltung der Tritylgruppe wird das Reaktionsgemisch auf 40 ml Eis-Wasser-Gemisch aufgegossen und die wässerige Lösung fünfmal mit je 10 ml Benzol ausgeschüttelt. Die wässerige Lösung wird mit Carboraffin filtriert und dann mit 50 ml Butylacetat oder Äthylacetat extrahiert und die Lösung der gewünschten Substanz im organischen Lösungsmittel im Vakuum zur Trockene verdampft. Man erhält 0. 22 g (69go) Di-O-acetyl- - 6-azauridin in Form eines festen Schaumes. Falls das Präparat nicht genügend rein ist, wird es papierchromatographisch oder in grösserem Massstab an einer Cellulosesäule im System Butanol-Wasser gereinigt.
Beispiel 2 : 4, 9 g 6-Azauridin werden in 50 ml Pyridin eingetragen, 6, 1 g Triphenylmethyl- chlorid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Homogenisierung geschüttelt und dann eine Woche bei Raumtemperatur stehen gelassen, worauf man unter Rühren in 500 ml Eis-Wasser-Gemisch eintropft. Die abgeschiedene kristalline Substanz wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrock-
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stehen, worauf man nach Zusatz von 30 ml Methanol im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 200 ml Chloroform gelöst und dreimal mit je 50 ml Wasser ausgeschüttelt.
Der Chloroformextrakt wird im Vakuum zur Trockene verdampft, der Abdampfrückstand in 200 ml Äthanol gelöst und 2ml eines schwach basischen Anionenaustauschers (im CH--Cyclus) und 2ml Kationenaustauscher (imW- Cyclus) zugesetzt. Nach 15 min Rühren und Filtrieren mit Carboraffin wird die Lösung im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 100 ml 85%figer Essigsäure unter Rühren gelöst und drei Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Hierauf wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene ver-
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eines Schaumes, das gegebenenfalls durch Chromatographie an Cellulose im System Butanol-Wasser gereinigt wird.
Beispiel 3 : In 700 ml Pyridin werden 123 g Azauridin und 139 g Tritylchlorid eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird bis zum Lösen des Azauridins gerührt und dann 70 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Hierauf wird das Pyridin aus dem Reaktionsgemisch im Vakuum abdestilliert. der Rückstand in 300 ml Aceton gelöst und die Acetonlösung unter Rühren in 5 I eines Wasser-Eis-Gemisches eingetropft. Die abgeschiedene Substanz wird abgesaugt und mit 5 I Eiswasser gewaschen. Die Substanz wird nach dem Trocknen bei Siedehitze in 250 ml Aceton gelöst und der Kristallisation überlassen, das Abscheiden der Substanz wird durch Zusatz von 1500 ml Benzol vollendet. Nach dem Absaugen, dem Waschen mit Ben- zol und Trocknen erhält man 216 g kristallines 5'-0-Trityl-6-azauridin. Zu der Lösung von 210 g Tritylazauridin in 350 ml Pyridin werden unter Wasserkühlung 190 ml Acetanhydrid zugesetzt.
Nach 12stündi- gem Stehen bei40C wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, der Rückstand in 11 Chloroform gelöst und fünfmal mit je 200 ml Wasser ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird mit Carboraffin filtriert und im Vakuum verdampft. Man erhält 250 gAbdampfrückstand (2'. 3'-Di-O-acetyl-5'-0-trityl- - 6-azauridin), der unter Rühren in 11 85% tiger Essigsäure gelöst wird, man lässt dann das Reaktionsgemisch 100 h bei 8 C stehen. Die abgeschiedenen Kristalle werden abgesaugt und mit 100 ml 851volger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wird mit 1500 ml Wasser verdünnt, die abgeschiedene unverbrauchte Ausgangssubstanz abgesaugt und der erneuten Spaltung nach dem oben beschriebenen Verfahren unterworfen.
Das vorwiegend 2', 3'-Di-0-acetyl-6-azauridinenthaltende Filtrat wird im Vakuum eingedampft und
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der Abdampfrückstand in einem Gemisch von 600 ml Benzol und 100 ml Wasser gelöst. Die Benzollösung wird dann noch fünfmal mit je 100 ml Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten wässerigen Extrakte werden dann mit Chloroform (zehnmal 200 ml) extrahiert. Die Chloroformlösung wird mitCarboraffin filtriert und das Chloroform im Vakuum verdampft, man erhält 135 g 2', 3*-Di-O-acetyl-6-azauridin, das eventuell durch Chromatographie in Cellulose im System Butanol-Wasser weiter gereinigt wird.
Beispiel 4 : Zu der Lösung von 0, 370 g Di-p-methoxytritylchlorid in 5 ml trockenem Pyridin werden 0, 245 g 6-Azauridin zugesetzt und die Lösung nach dem Auflösen des 6-Azauridins bei Raumtemperatur 48 h stehen gelassen. Hierauf wird die Lösung unter intensivem Rühren in 200 ml Eiswasser eingegossen. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in 50 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird zweimal mit 10 ml Wasser ausgeschüttelt, mit Carboraffin filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand (550 mg 5'-Di-p-methoxy-trityl-6-azauridin) wird in 5 ml trockenem Pyridin gelöst, 0, 5 ml Acetanhydrid zugesetzt und das Reaktionsgemisch 15 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Hierauf wird das Pyridin im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in 30 ml Chloroform gelöst und die Chloroformlösung im Vakuum verdampft. Der Abdampfrückstand (0. 63 g 2', 3'- - Di-O-Acetyl-5'-O-di-p-methoxytrityl-6-azauridin) wird in ein Gemisch von 12 ml Dioxan und 12 ml Roziger Essigsäure gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur 1 h stehen gelassen. Die Lösung wird im Vakuum auf das halbe Volumen eingeengt, der Rückstand mit 25 ml Wasser verdünnt und die abgeschiedene Substanz abgesaugt. Das wässerige Filtrat. das 2', 3'-Di-0-acetyl-6-azauridin enthält, wird im Vakuum verdampft und der Rückstand in einem Gemisch von 20 ml Benzol und 5 ml Wasser gelöst. Die
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falls durch Chromatographie an Cellulose im System Butanol-Wasser gereinigt wird.
Beispiel 5 : Zu der Lösung von 0. 71 g Tritylbromid in 5 ml trockenem Pyridin werden 0. 49 g 6-Azauridin zugesetzt und die Lösung 1 h auf 900 erhitzt. Nach 12stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Pyridin im Vakuum abdestilliert, der Rückstand in 10 ml Aceton gelöst und die Acetonlösung unter Rühren zu 200 ml Wasser-Eis-Gemisch zugetropft. Die abgeschiedene Substanz wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Die getrocknete Substanz wird in 1 ml Aceton gelöst und 6 ml Benzol zugesetzt.
Man erhält 0,95 g kristallines 5'-0-Trityl-6-azauridin, das man in 2 ml Pyridin löst, worauf l, 8 ml Acetanhydrid zugesetzt werden. Nach 12stündigem Stehen bei 4 C wird das Reaktionsgemisch im Vakuum verdampft und der Rückstand in 20 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 5 ml Wasser ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand (1. 05 g 2'. 3'-Di-0- - acetyl-5'-0-trityl-6-azauridin) erneut in 5 ml Chloroform gelöst. Zu der Lösung werden 0, 2ml480/0ige Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zugesetzt.
Nach 4 min Stehen bei 0 C wird die Lösung im Vakuum verdampft und der Rückstand in einem Gemisch von 20 ml Benzol und 5 ml Wasser gelöst. Die Benzollösung wird noch fünfmal mit 5 ml Wasser ausgeschüttelt und die vereinigten wässerigen Lösungen im Vakuum eingedampft. Man erhält 0, 49 g 2', 3'-Di-0-acetyl-6-azauridin, das gegebenenfalls durch Chromatographie an einer Siliciumdioxyd-Säule gereinigt wird.
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