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Verfahren zur Reinigung von mikrobiologisch wirksamen Verbindungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von mikrobiologisch wirksamen Ver- bindungen, die durch Umsetzung von Diaminen mit aus Aminodicarbonsäuren aufgebauten Polypeptid- polycarbonsäureestern. vorzugsweise Polyglutaminsäurealkylestern, und anschliessende N-Monoacylierung erhalten werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass diese Produkte in Salze übergeführt, in Wasser ge- löst und anschliessend einer Dialyse unterworfen werden. Mit dieser Methode werden die amidierten Peptid-Derivate gereinigt und mit geeignetem Polymerisationsgrad erhalten, so dass die therapeutische An- wendung des Produktes ermöglicht wird.
Die bisher durch ähnliche Kondensationsverfahren hergestellten Polypeptid-Derivate konnten nicht unmittelbar in reinem Zustand, d. h. frei von Äthylendiamin und von niedrigeren bzw. höheren Polymeren erhalten werden. Deshalb konnte man den bakteriostatischen Effekt der derart herstellbaren nicht ge- nügend reinen Produkte in der Therapie nicht ausnutzen.
Auch die Löslichkeit und Resorbierbarkeit der bisher hergestellten derartigen Produkte war wegen der Anwesenheit von höheren Polymeren unbefriedigend und ihre Toxizität war infolge der Anwesenheit der niedrigeren Polymeren und des Äthylendiamins zu hoch. Das'erfindungsgemässe Verfahren beseitigt alle oben erwähnten Nachteile und ermöglicht die Herstellung der Polypeptid-Derivate in völlig reinem, sämtliche pharmazeutische Erfordernisse befriedigendem Zustand.
Die Salzbildung kann allgemein durch Lösen des Polypeptid-Derivates in einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure erfolgen. So kann man z. B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Ameisensäure, Essigsäure, Glukonsäure, Phthalsäure usw. verwenden. Man arbeitet zweckmässig in einer verdünnten wässerigen Lösung.
Nach erfolgter Dialyse kann die gereinigte Lösung zweckmässig mittels Lyophilisierung in festen Zustand gebracht werden. Als Ausgangsstoffe des Verfahrens können amidierte Peptid-Verbindungen ver-
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oder- [NH-CH-CO-] lypeptid-Amine werden zweckmässig mindestens 5 Moleküle Diamin mit je einer freien CarbonsäureGruppe bzw. Carbonsäure-Derivatgruppe in Reaktion gebracht.
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Die mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens gewonnenen Verbindungen wurden besonders bei Behandlung von Wunden vorteilhaft verwendet.
Beispiel 1 : 8 g pulverförmigerca-Poly-L-glutaminsäure-y-methylester werden mit 50 ml Äthylendiamin-monohydrat bei 1340C eine Stunde lang erwärmt, worauf der Überschuss an Äthylendiamin unter vermindertem Druck entfernt wird. Der Rückstand wird über Schwefelsäure getrocknet, in 4'figer Salzsäure gelöst und dann gegen Wasser und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Hierauf wird die erhaltene Lösung von eventuell Ungelöstem filtriert und lyophilisiert. Das salzsaure Salz des basischen Poly-
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Be is piel 2 : 4 g fein verpulverter α-poly-L-gluraminsäure-γ-methylester werden mit 20 ml wasserfreiem Putrescin eine Stunde lang erwärmt. Der Überschuss an Putrescin wird durch Vakuumdestillation entfernt. Das Produkt wird in einem Exsikkator über Schwefelsäure getrocknet und in verdünnter Salzsäure gelöst. Die Lösung wird dialysiert und schliesslich lyophilisiert. Das Salzsäure Salz wird mit ungefähr piger Ausbeute erhalten.
Beispiel 3 : Ein aus 7, 2 g DL-Anhydro-polyasparaginsäure und 24 ml wasserfreiem Äthylendiamin hergestelltes amidiertes Produkt wird in verdünnter Salzsäure gelöst und 24 Stunden lang dialysiert. Die zurückgebliebene wässerige Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. 4 g eines gelblichen, amorphen. wasseranziehenden Produktes werden erhalten, welches in Wasser leicht löslich ist. Dieses Produkt hindert bei einer Konzentration von 100 y/ml das Wachstum des StaphylococcusWood-Stammes und des Bacillus subtilis.
Beispiel 4 : Ein aus 0,5 g α-Poly-D-glutaminsäure-γ-methylester und 3 ml Äthylendiamin hergestelltes amidiertes Produkt wird in 5 mu 4%figer Salzsäure gelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wird die zurückgebliebene Lösung lyophilisiert, worauf 100 mg eines weissen, amorphen Produktes erhalten werden, welches in Wasser leicht löslich ist.
Beispiel 5: 30ml N,N-Diäthylaminoäthylamin werden mit 10 g a-poly-L-glutaminsäure-y -me- thylester acyliert. Das erhaltene trockene Produkt wird in 4% figer Salzsäure gelöst, dialysiert und lyophi- lisiert. 13 g eines weissen, amorphen, glänzenden Produktes werden erhalten.
Das erhaltene Produkt hindert das Wachstum von Bacillus subtilis bei einer Konzentration von 100 y/ml. Das Wachstum von Mycobacterium friburgiensis wird bei 20 y/ml, dasjenige des Mycobacterium smegmatis bei 10-20 y/ml gehindert.
Beispiel 6 : 15 g N. N-Diäthylaminoäthylamin werden mit 5 g x-poly-L-glutaminsäure-y-me- thylester acyliert. Das trockene Produkt wird in zeiger Salzsäure gelöst, dialysiert, filtriert, im Vakuum eingeengt und lyophilisiert. 3 g eines amorphen Produktes werden erhalten. Dieses Produkt ist gegen Mikrobakterien wirksam. Eine Konzentration von 2,5 y/ml wirkt auf den Staphylococcus-Wood-Stamm hemmend.
Beispiel 7: 25 g α-Poly-L-glutaminsäure-γ-methylester werden in 200 ml N1, N1-Dimethylami- no-äthylamin unter Umrühren suspendiert, worauf das Reaktionsgemisch 3 Stunden lang bei 130 - 1400C auf dem Ölbad erwärmt wird. Der Überschuss an Amin wird unter vermindertem Druck verdampft, worauf der Rückstand mit 3 x 200 ml Äther extrahiert wird. Nach Dekantierung des Äthers wird das Zurückgebliebene in eiskalter Salzsäure gelöst, dialysiert und lyophilisiert. 24 g einer festen hygroskopischen Substanz werden erhalten, welche das Wachstum des Staphylococcus aureus Wood und Bacillus subtilis in einer Konzentration von 20 y/ml hemmen.
Beispiel 8 : 1 g a-poly-L-glutaminsäure-y-methylester wird mit 5 gN-Acetyl-äthylendiamin 2 Stunden lang bei 130 - 1400C erwärmt. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit Methanol und Äther behandelt und filtriert. Der Rückstand wird in verdünnter Salzsäure gelöst, dialysiert und lyophilisiert. 0, 4 - 0, 6 g eines weissen Pulvers werden erhalten, welches wasserlöslich ist und eine neutrale Lösung gibt. Die Biuret-Reaktion ist positiv.
Beispiel 9 : 0, 45 g α-Poly-DL-α-amino-adipinsäure-γ-methylester werden 11/2 Stunden lang bei 1000C unter Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch filtriert und der Überschuss an Äthylendiamin wird bei vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in verdünnter HC1 gelöst, die Lösung dialysiert und schliesslich lyophilisiert. 0, 25 g (40%) eines hygroskopischen Produktes werden erhalten.