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Verfahren zur Herstellung einer stabilen hitzeinaktivierbaren Proteinlösung
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung einer stabilen hitzeinaktivierbaren Proteinlösung aus Plasma oder Serum, gekennzeichnet dadurch, dass die labilen Proteine mit Hilfe einbasischer, höherer Fettsäuren (C-C) gefällt und abfiltriert werden und dass gegebenenfalls die so stabilisierte Proteinlösung 10 Stunden bei 60 erhitzt wird, um das Virus der homologen Serumhepatitis zu inaktivieren, ohne dass dabei die Proteine eine nachweisbare Veränderung ihrer Antigenstruktur erleiden. Die Abscheidung erfolgt zweckmässig bei einem pH-Wert tiber 5, sowie bei Temperaturen unter 55 C. Derartige Lösungen werden für therapeutische Zwecke zur Infusion benötigt (Ellis S.
S., Neefe, Stokes, Strong, Janeway & Scatchard, J. Clin. Invest. 27, 239,1948) und konnten bisher nicht in zufriedenstellender Weise hergestellt werden. Nachdem alle Versuche gescheitert sind, im menschlichen Plasma das Virus der homologen Serumhepatitis durch UV-Bestrahlung zu inaktivieren (Dubs P., Fellmann H., Haessig A., Heim U., Portman U. & Schreiner W., Schweiz. Med. Wschr. 84, 1187/1954), und auch eine chemische Sterilisie-
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nicht an Versuchen gefehlt, durch Befreiung des menschlichen Plasmas bzw. Serums von labilen Proteinen eine Plasmaproteinlösung herzustellen, die ein zehnsttindiges Erhitzen auf 60 C zwecks Inaktivierung des Virus der homologen Serumhepatitis ohne Veränderung erträgt. So haben Cohn E. J., Tullis J. L., Surgenor M. D. & D'Hont M. D.
(Science 114, 479/1951) versucht, durch Ausfällung mit Schwermetall- salzen, insbesondere Zinksalzen, die labilen Proteine zu entfernen. Nitschmann Hs. & Kistler P. (Hel-
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R.,Clin. Path. 19,10, 1949) und Reid A. F. & Jones F. (Ind. Eng. Chem. 43, 1074, 1951) unter Verwendung von Ionenaustauschern versucht, die labilen Proteine durch Entsalzen des Plasmas bzw. Serums zu entfernen. Schliesslich konnten Hink J. H. jr., Hidalgo J. Seeberg V. P. & Johnson F. (Vox Sanguinis II, 174, 1957) durch eine Modifikation des Cohn'sehen Verfahrens durch Äthanolfraktionierung eine Plasmaproteinlösung erhalten, aus der sie auch gleichzeitig Gammaglobulin gewinnen konnten. Die bekannten Verfahren weisen jedoch gewisse Nachteile auf, die einer allgemeinen Anwendbarkeit entgegenstehen.
Ein brauchbares Verfahren zur Herstellung einer Plasmaproteinlösung, die durch zehn Stunden auf 600C erhitzt werden kann, muss folgenden Bedingungen entsprechen : a) Während des gesamten Verfahrens soll keine Veränderung jener Proteine verursacht werden, die in der fertigen stabilen Plasmaproteinlösung verbleiben. b) Während der zehnstündigen Erhitzung der stabilen Plasmaproteinlösung auf 600C soll keine messbare physiko-chemische Veränderung vor sich gehen (wie z.
B. Änderung der Viscosität, Extinktion, Turbidität und der partiellen Brechungsindex-Inkremente nach Auftrennung im elektrischen oder im Schwerefeld). c) Freisein der Plasmaproteinlösung von a-'und B - Isoagglutininen sowie von andern gegen menschliche Erythrocyten gerichteten Antikörpern. d) Freisein von Conglutininen, damit bei der Infusion der Plasmaproteinlösung keine Conglutination von sensibilisierten Erythrocyten auftreten kann, wenn der Empfänger in seinem Blut nicht agglutinierte Erythrocyten hat, die mit inkompletten Antikörnern beladen sind. e) Möglichkeiten der Gewinnung des Gammaglobulins, wobei Freisein vom Erreger der homologen Serumhepatitis sichergestellt sein muss.
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Der Nachteil des Verfahrens nach Cohn et al. besteht unter anderem darin, dass keine Gammaglobulinfraktion gewonnen werden kann, die sicher frei ist vom Erreger der homologen Serum-Hepatitis.
Der Nachteil des Verfahrens nach Nitschmann et al. besteht ausserdem noch darin, dass das fertige
Präparat Isoagglutinine enthält, sowie dass bei der Erhitzung auf 600C messbare physiko-chemische und immunologische Veränderungen auftreten.
Beim Verfahren nach Hink et al. gelingt es wohl, einwandfreies Gammaglobulin zu gewinnen. Es ist jedoch nicht sicher, wieweit dies Präparat frei von Isoagglutininen und Conglutininen ist, und wieweit bei der zehnstündigen Erhitzung auf 600C physiko-chemische Veränderungen, bzw. Veränderungen in der Antigen-Struktur auftreten.
Das Verfahren gemäss vorliegender Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass labile Proteine des Serums mit höheren einbasischen Fettsäuren Verbindungen eingehen, die unter bestimmten Bedingungen zur Ausfällung gebracht werden können, ohne dass die Proteine der so erhaltenen stabilen Plasmaproteinlösung eine physiko-chemische oder immunochemische Veränderung erfahren und diese auch nach 10-stündiger Erhitzung auf 600C nicht erleiden.
Erfindungsgemäss wird zu menschlichem Plasma oder Serum dessen Proteingehalt, Isoagglutinintiter und Conglutinintiter, sowie dessen Proteinfraktions-Verteilung bestimmt ist und das vollkommen frei von pyrogenen Substanzen ist, zweckmässig soviel eines Gemisches einbasischer, höherer Fettsäuren zugesetzt, dass der Gehalt an Fettsäuren, gerechnet auf die Ausgangs-Protein-Lösung, 1/10 molar ist. Um eine homogene Lösung zu erreichen, wird der PH-Wert auf 8,0 gebracht. Unter ständiger Bewegung wird dann auf PH = 5,2 gesenkt und während einer bestimmten Zeit, im allgemeinen zirka eine Stunde, bis auf eine Temperatur von 55 C erhitzt. Die im Serum bzw. Plasma vorhandenen labilen Proteine fallen als flockiger Niederschlag aus und werden nach Zusatz eines Filtrierhilfsmittels abgeschieden.
Soll auch Gammaglobulin gewonnen werden, so wird vor Zusatz des Fettsäuregemisches mit Ammonsulfat bei einem pH-Wert von 6, 0 soviel von den im Serum vorhandenen Proteinen gefällt, dass der Stickstoffgehalt um 40% gesenkt wird. Wird dann der pH-Wert unter 5, 2 gebracht, kann die Entfernung der labilen Proteine mit dem Fettsäuregemisch auch im ammonsulfathaltigen Filtrat durchgeführt werden. Es ist jedoch darauf zu achten, dass der pH-Wert nicht unter den isoelektrischen Punkt des Albumins gebracht wird, da sonst Umladungserscheinungen im Albuminmolekül auftreten.
Das Filtrat enthält die stabilen Plasmaproteine und kann in geeigneter Weise auf die gewünschte Konzentration zwischen 0, 1 und 20% eingestellt werden. Falls mit Ammonsulfat gearbeitet wurde, ist der Überschuss in an sich bekannter Weise zu entfernen.
Die erfindungsgemäss hergestellten Plasmaproteinlösungen enthalten keine nachweisbaren Mengen von Isoagglutininen und Conglutininen und können erhitzt werden, ohne dass messbare physiko-chemische Veränderungen auftreten. Auch kommt es zu keiner Veränderung der antigenen Struktur der gelösten Proteine.
Ausführungsbeispiel :
55 1 natives humanes Serum, dessen Total-Stickstoffkonzentration Isoagglutinintiter, Conglutinintiter, sowie dessen Proteinfraktions-Relation und Pyrogenfreiheit in an sich bekannter Weise bestimmt wurden, wird unter Rührung mit 45 1 sterilem, pyrogenfreiem bidestilliertem Wasser verdünnt. Hierauf
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Jpli = 5, 2 gesenkt wird. Nach einstündiger Erwärmung bei 550C wird Hyflo-Supercel (5 1 Schüttvolumen) eingerührt und filtriert. Das klare, leichtgelbliche Filtrat wird mit Ammonsulfat versetzt, bis kein weiterer Niederschlag mehr entsteht, sodann im Kühlraum über Nacht stehen gelassen und filtriert.
Der Niederschlag wird durch Dialyse oder mittels Ionenaustauschern von Ammonsulfat befreit, die dabei erhaltene Proteinlösung durch Konzentrierung auf den gewünschten Proteingehalt gebracht, sodann über Klärschichten mit abgestufter Porenweite filtriert und schliesslich nach Einstellung der Blutisotonie und des Blut-pH und nach Zusatz eines geeigneten Stabilisators wie z. B. 0, 04 molar Acetyltryptophan, der Ste- rilfiltiation unterworfen. Die auf Viskosität, Freisein von Isoagglutininen, Conglutininen und Pyrogenen und auf Sterilität bei Raumtemperatur und bei 370 geprüfte Plasmaproteinlösung wird, wenn alle Proben einwandfrei verlaufen sind, in entsprechende Behälter unter sterilen Bedingungen definitiv verfüllt und in diesen Behältern durch 10 Stunden in einem Wasserbad auf 600 erhitzt.
Nach nochmaliger Prüfung der Sterilität sowie der Unschädlichkeit an Maus und Kaninchen werden Proben zur klinischen Auswertung gezogen. Die klinische Auswertung erfolgt auf Verträglichkeit - wobei insbesondere die Temperatur des Empfängers der Plasmaproteinlösung über 4 Stunden registriert wird-sowie mittels der intracutanen In-
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jektiol1 von 0, 1 ml der Plasmaproteinlösung an unvorbehandelten Patienten, sowie an Patienten, die 3 Wochen vorher mindestens eine Infusion von einer 8 g Protein entsprechenden Menge Plasmaproteinlösung erhalten haben. Die intracutanen Reaktionen dürfen von keinem der beiden Fälle stärker sein, als diejenigen der gleichzeitig gesetzten intracutanen Quaddeln mit 0, 9% steriler, pyrogenfreie Kochsalzlösung.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, hitzeinaktivierbaren virusfreien Proteinlösung aus Plasma oder Serum, dadurch gekennzeichnet, dass die labilen Proteine mit Hilfe einbasischer, höherer Fettsäuren (C.-C..) gefällt und abfiltriert werden und dass gegebenenfalls die so hergestellte Proteinlösung unter Verwendung eines geeigneten Stabilisators, beispielsweise 0,02 m Acetyltryptophan + 0, 02 m Natriumcaprylat oder 0,04 m Natriumcaprylat, 10 Stunden bei 600 erhitzt wird, um das Virus der homologen Serumhepatitis zu inaktivieren, ohne dass dabei die Plasmaproteine eine nachweisbare Veränderung ihrer Antigenstruktur erleiden.