DE2633932A1 - Verfahren zur gewinnung eines humanen anti-hb tief s -gamma-globulins - Google Patents

Verfahren zur gewinnung eines humanen anti-hb tief s -gamma-globulins

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DE2633932A1 DE19762633932 DE2633932A DE2633932A1 DE 2633932 A1 DE2633932 A1 DE 2633932A1 DE 19762633932 DE19762633932 DE 19762633932 DE 2633932 A DE2633932 A DE 2633932A DE 2633932 A1 DE2633932 A1 DE 2633932A1
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Description

11 Verfahren zur Gewinnung eines humanen Anti-HB -Gamma
Globulins »
Prioritäts 28. Juli 1975, V.St.Ä., Nr. 599 619
Es ist bekannt, daß praktisch alle normalen humanen Iramunglobuline zur Prophylaxe der infektiösen Hepatitis verwendet werden können, die durch das" Hepatitisvirus A hervorgerufen wird; vgl. J. Stokes jr. und J.R. Keefe, J. Amer. Med. Ass., Bd. 127 (1945), Seiten 144 bis 145. Normales Globulin wurde zur routinemäßigen Prophylaxe von Sekundärfällen empfohlen, z.B. für Personen, die in einem Haushalt mit Hepatitis-Patienten
leben. Hur gelegentlich schienen Präparate in ihrer Wirkung dem Standard nicht zu genügen.
Demgegenüber ist der Wert solcher normalenGlobulinpräparate zur Prophylaxe der durch das Hepatitis-B-Virus verursachten Serurahepatitis seit langem fraglich; vgl. beispielsweise J.W. Mosley und J.T. Galarabos, Diseases of the Liver, Herausgeber L. Schiff, S. 410, Philadelphia, 1969 und National
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Academy of Sciences - National Research Council Committee on Viral Hepatitis, Morbidity and Mortality Weekly Report, 1972, 21, S. 133. Die unterschiedlichen Schlußfolgerungen aus den verschiedenen Untersuchungen über die Wirksamkeit normaler Globulinpräparate zur Prophylaxe der Serumhepatitis B können die Folge einer Anzahl von Faktoren sein, einschließlich Schwankungen in der Konzentration spezifischer Antikörper
(Anti-HBe) in den verwendeten Präparaten und der Unzuverläss
sigkeit der Diagnose in Untersuchungen mit dem Hepatitis B Oberflächenantigen (HBgAg). Es besteht jedoch weitgehend Übereinstimmung, daß eine wirkungsvolle Prophylaxe mit normalem Globulin zu widerspruchsvoll ist, um irgendeine Empfehlung zu rechtfertigen, sie zur Prophylaxe der Serumhepatitis B einzusetzen.
Die Möglichkeit, speziell die Serumhepatitis/zu diagnostizieren, brachte die Erkenntnis, daß ein kontinuierlicher enger Kontakt mit Trägern in einem Haushalt zu einer übertragung führen kann. Diese Erkenntnis hat das Interesse angeregt, ein Immunglobulin zu gewinnen, das zur passiven Immunisierung der Serumhepatitis B geeignet ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein humanes Hepatitis B Immunglobulin aus humanem Blutplasma zu schaffen, das auch als humanes Anti-HB -Gamma-Globulin bezeichnet wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
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Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Das erfindungsgemäß gewonnene neue humane Anti~HBs-Gainma-Glo-* bulin ist rein und praktisch frei von Fibrinogen, 19 S-Globulin, Plasminogen und Lipiden. Es wird aus humanem Blutplasma
hergestellt, das vorzugsweise einen hohen Antikörpertiter
besitzt. Die Identifizierung und Gewinnung des Ausgangsplasmas ist bekannt. Bekanntlich enthält humanes Blutplasma zahlreiche Bestandteile, wie Albumin, Plasminogen,
Alpha-r, Beta- und Gamma-Globuline und verschiedene Lipide.
Die Fraktionierung dieses Blutplasmas zur Gewinnung des Immunglobulins der Erfindung hängt von der Löslichkeit verschiedener Bestandteile des Blutplasmas auf verschiedenen Stufen und unter verschiedenen Bedingungen ab.
Auf jeder Stufe der Fraktionierung wird die Trennung der Fraktion und die Abtrennung derjenigen Bestandteile, die in dem
Anti-HB -Gamma-Globulin unerwünscht sind, durch die kritische Kontrolle des pH-Werts, der Temperatur, der Konzentration des Fällungsmittels und der Ionenstärke des Systems bestimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt eine Reihe von Verfahrensschritten zur Abtrennung dieser unerwünschten Bestandteile
durch die Steuerung von Bedingungen, die die Löslichkeit dieser Bestandteile ändern.
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Γ -4-
Zur Fraktionierung von Blutplasma wurden bereits die verschiedensten organischen Lösungsmittel mit niedriger Dielektrizitätskonstante, wie Ketone und Alkohole, zur Ausfällung von Proteinen verwendet. Das im erfindungsgeniäßen Verfahren verwendete organische Lösungsmittel ist vorzugsweise Methanol, doch können auch andere niedere aliphatische Alkohole, wie Äthanol und Propanol, eingesetzt werden. Die Möglichkeit der Aufrechterhaltung der kritischen Ionenstärken in den verschiedenen stufen der Fraktionierung wird durch die Verwendung von Methanol erleichtert. Bei Verwendung anderer Lösungsmittel müssen entsprechende Änderungen in den Verfahrenste dingungen durchgeführt werden,wenn sie die Löslichkeit "beeinflussen.
Zur Vermeidung der Denaturierung der Proteine während der Fraktionierung wird die Fällung bei niedrigen Temperaturen durchgeführt. Da die Löslichkeit der Proteine temperaturabhängig ist, wird die Temperatur in jeder Stufe der Fraktionierung auf einen möglichst niedrigen Wert eingestellt, der die erforderliche Trennung gestattet, um eine Denaturierung zu vermeiden.
In Figur 1 ist ein Fließschema des erfindungsgemäßen Fraktionierverfahrens wiedergegeben. Das Verfahren geht von humanem Blutplasma aus. Das Blutplasma wird auf etwa 0 bis 5°C abgekühlt und sodann zentrifugiert. Hierbei scheidet sich eine in der Kälte unlösliche Fällung ab. Der Überstand wird weiter fraktioniert. Es wird eine Fällung I und ein Überstand I erhalten. Die Fällung I1 die im wesentlichen aus Fibrinogen be-
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r - "ι
steht, wird verworfen. Der Überstand I wird weiter fraktioniert und liefert den Überstand II und III und die Fällung II und III. Der Überstand II und III, der verworfen wird, enthält Alpha- und Beta-Globuline und Lipide. Die Fällung II und III besteht im wesentlichen aus Beta- und Gamma-Globulinen und Isoagglutininen, sie enthält Jedoch auch Prothrombin, Plasminogen, Cholesterin und andere Lipide. Die Fällung II und III liefert bei der weiteren Fraktionierung den Überstand II und III ¥ sowie die Fällung II und III W. Die Beta-Globuline, Cholesterin und andere Lipide sind im überstand II und III Wf der verworfen wird, zum größten Teil entfernt. Die Fällung II und III W besteht im wesentlichen aus Gamma-Globulinen, Isoagglutininen, Plasminogen und Prothrombin sowie einer geringen Menge Beta-Globulin, Cholesterin und anderen Lipiden. Bei der weiteren Fraktionierung liefert die Fällung II und III W einen Überstand III und eine Fällung III, Die Fällung III, die verworfen wird, enthält Isoagglutinine, Plasminogen und Etothrombin. Der Überstand III besteht im wesentlichen aus Gamma-Globulinen und geringeren Mengen Fibrinogen und Lipiden. In der letzten Stufe der Fraktionierung wird die Fällung II erhalten, die im wesentlichen aus reinem Anti-HB -Garama-Globulin besteht, das nahezu vollständig frei von 19 S Globulin, Plasminogen und Lipiden ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
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_j
Beispiel
Humanes Blutplasma mit einem Anti-ffiJ -Titer von etwa 6000 wird
auf 1° + 10C abgekühlt. Das Blutplasma wird in einer Durchlauf-Super-Zentrifuge (Sharpies Super-Centrifuge, 3-w±ng bowl)
bei 1° £ 10C zentrifugiert, wobei das Blutplasma in einer Menge von 1000 + 50 ml/min zugeführt wird. Die unlösliche Fällung wird verworfen. Der pH-Wert des Überstands wird auf 7,2 £ 0,2 eingestellt. Der Methanolgehalt des überstands wird durch Zusatz von 177 ml 71volumprozentigem Methanol/Liter Blutplasma auf einen Wert von 10,7 £ 0,1 Volumprozent eingestellt. Die Lösung wird 1 Stunde langsam bei -5 £ 0,5°C gerührt und 15 Stunden bei -5 £ 0,50C stehengelassen. Danach wird die Lösung in einer Durchlauf-Super-Zentrifuge
bei -5 £ 0,50C zentrifugiert, wobei die Lösung in einer Menge von 1000 £ 100 ml/min zugeführt wird. Der Überstand I wird in einer mit einer Kühlvorrichtung ausgerüsteten Schale aufgefangen.
Jeweils 1 Liter des Überstands I werden unter Kühlung mit 601 ml 71 volumprozentigem Methanol, 0,88 ml 10 η Essigsäure und 0,44 ml einer 4 η Natriumacetatlösung versetzt. Hierdurch wird die Methanolkonzentration auf einen Wert von 33,3 %f die Ionenstärke auf 0,086 gi /Liter und der pH-Wert auf 6,9 eingestellt. Die Lösung wird auf -5 £ 0,50C gekühlt und 2 Stunden langsam gerührt. Danach wird die Lösung 16 Stunden bei -5?5 £ 0,50C stehengelassen.
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Hierauf wird die Lösung in einer Durchlauf-Super-Zentrifuge
bei -5 +, 0,50C und bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von 1000 +.100 ml/min zentrifugiert. Die Fällung II und III wird aus der Schale entnommen, gewogen und bei -20°C aufbewahrt.
. Die Fällung II und III wird bei O0C in 2 Volumteilen (das zweifache ursprüngliche Gewicht der Fällung II und III) Wasser von O0C im Gleichgewicht mit Eis suspendiert. Zu diesem Zweck wird die Paste mit einem Edelstahlspatel in einem Edelstahltopf
zerschnitten und verrührt, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Sodann wird die Suspension unter Rühren mit 3 Volumteilen (dem dreifachen ursprünglichen Gewicht der Fällung II und III) einer 0,0187 molaren Dinatriumphosphatlösung versetzt. Hierauf werden 20 Volumteile (die 20-fache ursprüngliche Gewichtsmenge der Fällung II und III) Wasser bei 00C zugegeben, und das Rühren wird bei O0C während 30 bis 60 Minuten fortgesetzt. Der pH-Wert beträgt 7,2 +, 0,2. Sodann werden 15 Volumteile (die 15-fache ursprüngliche Gewichtsraenge der Fällung II und III) einer 71 volumprozentigen Methanollösung bei -1O0C zugegeben. Hierdurch wird die Methanolkonzentration auf 26,7 + 0,2 % eingestellt. Die Ionenstärke der Lösung beträgt 0,0052 + 0,0005 gi/Liter.
Sodann wird-die Lösung auf -50C gekühlt und in einer Durch lauf-Super-Zentrifuge bei einer Temperatur von -5,5 +_ Of5C und bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von
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500 +. 50 ml/min zentrifugiert. Die Fällung II + III W wird aus der Schale entfernt und gewogen.
Die Fällung II und III W wird in 2 Volumteilen (zweifache Gewichtsmenge der Fällung II + III W) Eiswasser suspendiert, Die Suspension wird mit 2 Volumteilen (zweifache Gewichtsmenge der Fällung II + III W) 0,175 molarer Natriumacetatlösung versetzt. Sodann wird ein weiteres Volumen (einfache Gewichtsmenge der Fällung II und III W) Eiswasser mit 0,216 ml Acetatpuffer pro g Fällung II und III W Paste zugegeben. Der Acetatpuffer wird durch Verdünnen von 40 ml einer 10 η Essigsäure und 20 ml einer 4 η Natriumacetatlösung mit destilliertem Wasser auf 100 ml hergestellt. Der pH-Wert der Lösung beträgt 5,2 +, 0,2. Die Lösung wird 1 Stunde langsam gerührt. Sodann werden 13,5 Volumteile (die 13?5-fache Menge des ursprünglichen Gewichts der Fällung II und III W) Eiswasser und 8,66 Volumteile (die 8,66-fache Menge des ursprünglichen Gewichts der Fällung II und III W) einer 71volumprozentigen Methanollösimg zugegeben, wobei die Temperatur bei -6 +_ 0,50C gehalten wird. Die Lösung wird 1 Stunde langsam gerührt und sodann etwa 15 Stunden stehengelassen. Die Lösung enthält 22,7 % Methanol, sie hat einen pH-Wert von 5,2 und eine Ionenstärke von 0,015 gi/Liter.
Die Lösung wird in einer Durchlauf-Super-Zentrifuge bei einer Temperatur von -6 +, 0,50C und einer Zufuhrgeschwindigkeit von 500 +, 50 ml/min zentrifugiert. Das Volumen des
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Überstands III wird bestimmt. Die Fällung III wird verworfen. Der Oberstand III wird mit 0,4 Gewichtsprozent/Volumen CeIite 512 behandelt und 20 Minuten gerührt. Danach v/ird das Gemisch durch eine Eitel-Filterpresse mit Ώ-8 Kissen filtriert.
Ein Acetatpuffer vom pH-Wert 5,2 wird folgendermaßen hergestellt?
25 ml einer 4 η Natriumacetatlösung und 3 ml einer 10 η Essige säure v/erden mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Der Acetatpuffer wird mit 22,7prozentigem Methanol auf das 100-fache verdünnt. Diese Lösung hat eine Ionenstärke von 0,01 gi/Liter. Eine Bitel-Filterpresse wird mit dem Acetatpuffer und Gelite 512 unter Verwendung von 40 ml Acetat-Methanolpuffer pro 6,45 cm Kissenoberfläche vorbeschichtet. Es v/erden 0,5 g/6,45 cm Kissenoberfläche Gelite 512 verwendet. Der Überstand III v/ird filtriert und das Filtrat wird mit 2,923 g (50 mMol) Natriumchlorid und 7,65 ml einer 1 molaren Natriumbicarbonatlösung/Liter filtrierter Überstand III versetzt. Der pH-Wert des Filtrats beträgt 7,2 +, 0,2.
Das Filtrat wird mit 160 Volumteilen lOOprozentigem Methanol bei einer Temperatur unterhalb -5 C versetzt. Das Gemisch v/ird 1 Stunde bei -6,5 + 0,50C langsam gerührt. Danach wird das Gemisch etwa 15 Stunden stehengelassen. Hierauf wird die Lösung in einer Durchlavif-Super-Zentrifuge bei einer Temperatur von
-6 +, 0,50C und einer Zuführgeschwindigkeit von 500 ± 50 ml/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
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Die Fällung II wird abgetrennt, in 4 Voluiateilen Eiswasser suspendiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird gev/ogen und unterhalb -5°C aufbewahrt.
Die erhaltene Fällung II besteht aus 99prozentig reinem Anti-HB »Gamma-Globulin, das frei von Plasminogen, Fibrinogen,
Lipiden-und 19 S Globulinen ist. . >
Beispiel 2
Gemäß Beispiel 1 werden humane Immunglobuline als 13,5 + 1,5 g/dl Lösungen hergestellt. Das Verfahrensgemäß eingesetzte humane Blutplasma stammt aus Plasmaeinheiten, die Virus Hepatitis B Antikörper in mäßigen bis hohen Titern, bestimmt nach dem passiven Hemagglutinationstest, enthalten. Das Kontrollglcbulin stammt aus Pla&maeinheiten, die im passiven Hemagglutinationstest keine erkennbaren Virus Hepatitus B Antikörper enthalten. Beide Immunglobulinpräparate werden in einer Menge von 5 ml in gleiche Gefäße abgefüllt, die mit willkürlich zugeordneten, aus zv/ei Zahlen bestehenden Codenummern versehen werden. Beide Präparate erfüllen sämtliche anwendbaren Standards für humanes Immunglobulin des Bureau of Biologies, Food and Drug Administration, U.S. Department of Health, Education and Welfare. Das Hepatitis B Inimunglobulin
durch einen
enthält 442 ug spezifisches Anti-HBg/ml bestimmt /quantitativen Festphasenradioimimintest. Sein Anti-HBg-Titer im passiven Hemagglutinationstest beträgt 1 : 200 000 bzw. 1 : 150 000 gegenüber Zellen, die mit den HB5Ag Subtypen adw und ayw beschichtet sind.
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Während eines Zeitraumes von 29 Monaten wurden 96 Patienten
ikterischer mit / Hepatitis identifiziert. Die Symptome, Anzeichen
und Laborergebnisse sprechen für eine akute-Virushepatitis, sie wurden durch den positiven Test auf -HB Ag mit Hilfe von Subtypi-
zierung bestätigt.3 sierung oder Spezifi/ Während dieses Zeitraums wurden diese Patienten insgesamt 100 Partnern exponiert, mit denen sie während eines Zeitraums von 2 Wochen bis zu 2 Monaten vor Beginn der.Krankheit zusammenlebten. Zwei Behandlungsgruppen wurden von den Partnern dieser Patienten gebildet, die jeweils eine einzige intramuskuläre Injektion von 5 ml des erfindungsgemäß hergestellten Anti-HBS-Immunglobulins erhielten. Weitere Kriterien für den Partner schlossen das Fehlen einer früheren Hepatitis oder Gelbsucht oder einer chronischen Lebererkrankung, den Nichtgebrauch von Injektionspräparaten, das Fehlen einer Transfusion innerhalb der letzten 6 Monate und seine Verfügbarkeit zur Kontrolle \tfährend der nachfolgenden 10 Monate ein. Von den 100 Partnern wurden 47 willkürlich für die
Behandlungs gruppe und 53 für die Kontrollgruppe ausgev/ählt. Wegen der späteren Feststellung andere]: Hepatitis-Typen verblieben in der behandelten Gruppe 33 Patienten
für die Analyse in der Behandlungs gruppe und 40 in der Kontrollgruppe. 58 der 73 ausgewählten Partner wurden mindestens 150 Tage nach der Injektion des Immunglobulins der Erfindung untersucht.
Die Zeitabstände vom Erkennen der Gelbsucht bei den Patienten bis zur Injektion der Partner reichten von 7 Tagen vorher bis 30 Tage danach mit einem Mittel von 9 Tagen . Insgesamt wurden
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elf Fälle von Hepatitis bei den Partnern registriert. Neun Falle waren Icterusfälle. Neun Fälle der Virushepatitis B erfolgten in der Kontrollgruppe und kein Fall in der Gruppe der
Partner, die mit dem Hepatitis B Immunglobulin der Erfindung behandelt wurden.
Für die Zwecke der vorliegenden Untersuchung wurde die Icterushepatitis als Gelbsuchtverdacht der Haut oder Augen definiert, die durch einen Serumbilirubinspiegel von mindestens 2 mg/dl
sehe
bestätigt wurde. Die anikteri/Hepatitis wurde definiert als
eine symptomatische Hepatitis, die durch entsprechende Spiegel und Muster der Serumaminotransferaseaktivitäten bestätigt wurde, jedoch ohne einen Serumbilirubinspiegel von 2,0 mg/dl. Sowohl die ikterischen als auch die anikterischen Formen der
symptomatischen Hepatitis wurden als Typ B Erkrankungen auf
der Basis folgender Kriterien definiert:
(1) Erscheinen von HB_Ag;
(2) Erscheinen von Anti-HBS in Rezipienten von Kontrollglobulin;
(3) einem abnehmendem Titer von Anti-HB_ nach der Hepatitis B Immunglobulininjektion, gefolgt von einer mindestens vierfachen Zunahme. Symptomatische Fälle, die diese Kriterien nicht erfüllten, wurden als nicht B-Hepatitis Fälle
klassifiziert.
Das erfindungsgemäß hergestellte Immunglobulin wird zur
Prophylaxe vorzugsweise in Mengen von 25 bis 50 pg spezifischem Anti-HBs/ml und pro kg Körpergewicht verabfolgt. Die Verabfolgung kann parenteral und vorzugsweise intramuskulär mit einer Leinzigen Injektion erfolgen.
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Claims (3)

  1. P a t e η t a η s_p rüche
    (■1} Verfahren zur Gewinnung eines humanen Anti-HB -Gamma-Globulins, dadurch gekennzeichnet, daß
    man
    (a.) humanes Blutplasma auf etwa 10C abkühlt und einen ersten
    Überstand von einer ersten Fällung abtrennt,
    (b) den ersten Überstand mit Methanol versetzt und die Temperatur auf etwa ~2°C einstellt, wobei die Methanolmenge
    10,5 bis 10,9 %, der pH-Wert 7 bis 7,4 und die Ionenstärke 0,136 gi/Liter beträgt, und einen zweiten überstand von
    einer zweiten Fällung abtrennt,
    (c) den weiten Überstand mit Methanol versetzt und dio Temperatur auf etwa -50C einstellt,, wobei die Methanolraenge
    33,25 % bis 33,35 %, der pH-Wert 6,7 bis 7f1 und die Ionen« stärke 0,081 bis 0,091 gi/Liter beträgt, und einen dritten Überstand von einer dritten Fällung abtrennt,
    (d) die erhaltene dritte Fällung mit Methanol versetzt und die Temperatur auf etwa -50C einstellt, wobei die Methanolmenge 26,5 bis 26,9 %> der pH-Wert 7,0 bis 7,4 und die Ioneivstärke 0,0047 bis 0,0057 gi/Liter beträgt, und einen vierten Überstand von einer vierten Fällung abtrennt,
    (e) die erhaltene vierte Fällung mit Methanol versetzt und die Temperatur auf etwa -60C einstellt,' wobei die Methanolmenge 22,5 bis 22,9 #, der pH-Vfert 5,0 bis 5,4 und die Ionenstärke 0?008 bis 0,018 gi/Liter beträgt, .und einen fünften Überstand von einer fünften Fällung abtrennt,
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    (f) den erhaltenen fünften Überstand mit Methanol versetzt und die Temperatur auf etwa -6»5°C einstellt, wobei die Methanolraenge 33,0 bis 33,4 %, der pH-Wert 7,0 bis 7,4 und die Ionenstärke 0,055 bis 0,065 gi/Liter beträgt, und einen sechsten Überstand von einer sechsten Fällung abtrennt .
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die sechste Fällung gefriertrocknet.
  3. 3. Arzneimittel zur Prophylaxe der Serumhepatitis B, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem gemäß Anspruch 1 und 2 hergestellten humanen Anti-HB -Gamma-Globulin.
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DE19762633932 1975-07-28 1976-07-28 Verfahren zur gewinnung eines humanen anti-hb tief s -gamma-globulins Withdrawn DE2633932A1 (de)

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