AT205169B

AT205169B - Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin B12

Info

Publication number: AT205169B
Application number: AT485257A
Authority: AT
Inventors: Ernst Dr Brandl; Bela Dr Oberrecht
Original assignee: Biochemie Gmbh
Priority date: 1957-07-22
Filing date: 1957-07-22
Publication date: 1959-09-10

Description

Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin B12
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin Biz durch aerobe Züchtung von B. brevis in Proteine bzw. Proteinabbauprodukte enthaltenden Nährlösungen, vorzugsweise nach dem Oberflächenverfahren, bis zur Erzielung einer erheblichen antibiotischen Wirksamkeit und Abtrennung des gebildeten Tyrothricine.

Es sind bereits mehrere Verfahren bekannt geworden, die für eine Erzeugung von Tyrothricin nach dem Oberflächenverfahren und gegebenenfall s auch nach dem Submersverfahren in Betracht kommen. Mit diesen bekannten Verfahren ist jedoch eine befriedigende Tyrothricinproduktion bei der Anwendung des Oberflächenverfahrens nicht immer sichergestellt.

Vor allem erfordern diese Verfahren Nährlösungen mit Bestandteilen, die teils teuer, teils nicht immer leicht zugänglich sind ; ausserdem gewährleisten sie nur niedrige Ausbeuten an Tyrothricin.
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fahren, eine Verbesserung der Ausbeuten und eine grössere Freizügigkeit bei der Auswahl der Nährmedien erreicht werden kann, wenn man den B. brevis in einer Nährlösung züchtet, die ein Kobaltsalz in einer Konzentration an Kobaltionen von ungefähr 0, 001-0, 05 o gelöst enthält.

Als Kobaltsalze kommen für das erfindungsgemässe Verfahren alle wasserlöslichen Salze und Komplexsalze des Kobalts in Frage, insbesondere Kobalt-n-chlorid und Kaliumkobalt-III-hexacyanid. Bevorzugt werden wasserlösliche Kobaltsalze in solchen Mengen eingesetzt, dass im Nährmedium 0, 005-0, 02loto an Kobaltionen vorliegen.

Die Kultur zur Beimpfung des Mediums kann auf bekannte Weise gewonnen werden. Hiezu sind Sporen oder vegetative Zellen in gleicher Weise geeignet, wobei beliebig feste oder flüssige Zwischenpassagen zur Heranführung des Impfgutes eingeschaltet werden können. So kann man z. B. ausgehend von einer Lyophilkultur über Schrägagar auf Agarnährboden in Roux-Flaschen eine Sporensuspension gewinnen, indem von den Nährböden die Sporen unter sterilen Bedingungen abgeschwemmt werden. Man kann auch ein Impfgut mit vegetativen Zellen verwenden, das über feste oder flüssige Zwischenpassagen zubereitet werden kann. Die Zusammensetzung der Nährböden, die hiebei verwendet werden, wird zweckmässig unter Berücksichtigung des Fermentiermediums gewählt. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren bei der
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derLösungsmittel, z. B. Methanol, aufgenommen.

Aus der methanolischen Lösung wird das Tyrothricin zweckmässigerweise mit einem Überschuss an wässeriger Kochsalzlösung ausgefällt. Das Tyrothricin kann dann zur weiteren Reinigung wieder in Lösung gebracht und neu ausgefällt oder chromatographiert werden.

Es wurde ferner gefunden, dass sich der Zusatz von Kobaltsalzen bei der Erzeugung von Tyrothricin dann besonders günstig auswirkt, wenn im Nährmedium als Stickstoffquelle ein Presshefeautolysat verwendet wird. Ein Presshefeautolysat, welches im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens bevorzugt wird, kann erhalten werden, indem handelsübliche Presshefe mit 330/0 Leitungswasser, 2, 5% Kochsalz und 0, 7% Kaliummetabisulfat (letzteres auf die Gesamtmenge von Hefe und Wasser bezogen) versetzt wird. Es wird ohne Rühren 96 Stunden bei 450 C autolysiert. Nach der Ernte des Autolysates wird dieses in einer Schlammzentrifuge abgeschleudert.

Verwendet wird das klare Zentrifugat. Der Gehalt an Gesamtstickstoffim abgeschleuderten Presshefeautolysat beträgt etwa 15 g Stickstoff je 1. Die Nährlösungsbestandteile

werden in einem hiefür geeigneten Kocher zusammengemischt, wobei neben den üblichen Nährsalzen und Spurenelementen auch noch ein Kobaltsalz zugesetzt wird. Nach Hinzufügen des Presshefeautolysateswid der pH-Wert mit Lauge auf etwa 7 eingestellt. Gemeinsam mit dem Presshefeautolysat kann eine Zuckerquelle, z. B. Glukose, verwendet werden. Diese wird vorteilhaft getrennt sterilisiert und vor dem Vereiri- gen mit dem Presshefeautolysat abgekühlt. Die Beimpfung erfolgt unter den üblichen sterilen Bedingungen mit einer aktiven Kultur von Bacillus brevis.

Nun wird durchgemischt und die beimpfte Kulturflussigkeit in den Tassen verteilt, worin bei einer Temperatur zwischen 30 und 40 C, vorzugsweise bei 370 C, Wachstum und Tyrothricin-Produktion erfolgt. Es empfiehlt sich, die Oberflächengärung so auszuführen, dass der für den aeroben Bacillus brevis erforderliche Sauerstoff in Form von Luft oder einem andern Sauerstoff enthaltenden Gas in steriler Form zugeführt wird, so dass genügend Sauerstoff für Wachstum und Tyrothricin-Bildung vorhanden ist. Eine für die Durchführung besonders geeignete Vorrichtung ist in der österr. Patentschrift Nr. 192055 beschrieben.

Durch den Gehalt an Kobaltsalzen wird aber nicht nur die Tyrothricin-Ausbeute wesentlich gesteigert und das Verfahren dadurch wirtschaftlicher gestaltet, sondern es erfolgt durch den Bacillus brevis auch Bildung bedeutender Mengen an Vitamin Blz. Es sind bereits mehrere Bakterienstämme bekannt geworden. die zur Erzeugung von Vitamin B12 geeignet sind. Es besteht die Möglichkeit, Vitamin B als Nebenprodukt bei verschiedenen Antibiotika-Gärungen, wie bei der Erzeugung von Streptomycin und Neomycin, zu gewinnen. Vor allem richtet sich das Interesse auch auf die Isolierung solcher Stämme, die das Vitamin B12 alsHauptprodukt in möglichst hoher Ausbeute erzeugen.

Als besonders guter Produzent erwies sich Streptomyces olivaceus, der 1-3 mg Vitamin B,, je 1 Nährlösung liefert. Das Verfahren gemäss der Erfindung schafft nun die Möglichkeit, Bacillus brevis als Vitamin B-Produzent zu verwenden und gestattet es, sowohl eine hohe Ausbeute an Tyrothricin wie auch gleichzeitig an Vitamin B12 zu erzielen, wodurch eine wirtschaftliche wahlweise Gewinnung des Antibiotikums oder des Vitamins bzw. beider erfolgen
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reines Cyanocobalamin anfällt ; es sind nur wenig störende Begleitsubstanzen vorhanden, so dass die Extraktion sehr leicht durchführbar ist.

Die Extraktion ist gemäss der Erfindung wesentlich einfacher als etwa im Falle der Gewinnung von Vitamin B12 neben Streptomycin oder Terramycin ; dies ist in besonderem Masse dann der Fall, wenn als Nährlösung u. a. Presshefeautolysat verwendet wird.

Die Extraktion des nach dem erfindungsgemässen Verfahren erzeugten Vitamin 812 kann nach einer bekannten Methode, vorzugsweise aber nach dem nachfolgend Beschriebenen vorgenommen werden.

Abwässer aus der Tyrothricinerzeugung werden mit 20% iger Schwefelsäure auf PH 2, 5 eingestellt und hierauf mit 0, 5% Bentonit (Fullererde) vermischt. Dieses Gemisch wird bei Zimmertemperatur eine Stun-
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eine pH-Kontrolle. Die Fullererde, die das Vitamin Bj. adsorbiert enthält, wird filtriert und mit Wasser gewaschen, bis Säurefreiheit erreicht wird.

Das Fullererde-Adsorbat wird hierauf unter Rühren mit 65%igem wässerigem Methanol versetzt und der pH-Wert mit 20%iger Natronlauge auf 8, 5 eingestellt. Die Elution erfolgt in Gegenwert von Cyan-
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wässerigem Methanol und Cyanionen bei einem pH-Wert von 8,5 viermal wiederholt. Die o vereinigten Eluate werden im Vakuum bei 400 C eingeengt. Hierauf wird mit obiger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt, wobei eine Reihe von Verunreinigungen, z. B. Eiweiss, abzentrifugiert werden. Die völlig klare, rotbraun gefärbte Lösung wird auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, wobei wieder durch Zusatz eines Cyanionen liefernden Stoffes eine entsprechende Cyanionen-Konzentration aufrecht erhalten wird.

Zu dieser klaren Lösung wird nun Ammoniumsulfat zugegeben, bis die Lösung ein spez. Gewicht von 1, 2
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inalkoholphase wird dann ein gleiches Volumen Benzol gegeben und es wird mehrmals mit destilliertem Wasser ausgeschüttelt.

Die so erhaltene wässerige B. -Lösung wird auf einen PH-Wert von 3 eingestellt, worauf ein Teil der Verunreinigungen mit Äther ausgeschüttelt wird. Dann wird die wässerige Lösung in Gegenwart von CyanIonen auf PH 8 gebracht. Im Vakuum wird dann der in der wässerigen Lösung enthaltene Äther entfernt (400 C) und das Vitamin B12 in Aktivkohle (1%) adsorbiert. Die Eluierung von der Kohle erfolgt mit 65%igem wässerigem Äthanol oder Methanol, wobei die Temperatur auf 600 C gehalten wird.

Hierauf wird im Vakuum (400 C) auf etwa 501o des Anfangsvolumens eingedampft, und das Vitamin B12 mit einer Mischung von Tetrachlorkohlenstoff und Phenol (5 : 1) extrahiert. Aus der abgetrennten Tetrachlorkohlenstoffphenolphase wird das B12 durch Behandlung mit der gleichen Menge Aceton-Wasser (6:1) in diese Acetonphase überführt. Durch Zugabe von weiterem Aceton (in der 6-10fachen Menge des Aceton-Was-

ser-Gemisches) wird das kristallisierte Vitamin B12 ausgefällt, abgesaugt und mit wasserfreiem Aceton gewaschen. Hierauf wird getrocknet. Die Lagerung erfolgt in einem trockenen und lichtgeschützten Raum, womöglich bei weitgehender Abwesenheit von Luft.

Wenn besonders hohe Anforderungen an die Reinheit gestellt werden, erfolgt die Umkristallisation so, dass das Vitamin B12 in wenig Wasser aufgelöst wird, wobei dann die Ausfällung der Vitamin 812 -Kristalle durch Zugabe von Aceton erfolgt. An Stelle des Benzylalkohols kann mit gutem Erfolg auch Furfurylalkohol verwendet werden, wobei folgende Vorteile erzielt werden : Es werden geringere Mengen eines Alkohols, verglichen mit Benzylalkohol, benötigt, um den gleichen Effekt zu erzielen. Ferner siedet der Furfurylalkohol um 400 C niedriger als der Benzylalkohol, wodurch Vorteile bei der Regenerierung des Lösungsmittels erzielt werden. Die Ausbeute an Vita-
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sert, weil der Benzylalkohol grössere Mengen an Wasser löst, wodurch bei der Extraktion immer gewisse Verluste an Vitamin B12 entstehen.

Ferner kann man das Lösungsgemisch Aceton-Wasser in der letzten Stufe bei der Extraktion des Vitamin B12 aus der Tetrachlorkohlenstoff-Phenolphase durch Tetrahydrofuran-Wasser ersetzen. Es wird hiebei bevorzugt ein Gemisch von Tetrahydrofuran und Wasser im Verhältnis 4 : 1 angewendet.

Nachfolgend werden Beispiele von Nährlösungen angegeben, die im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens mit Vorteil angewendet werden können ; ihre Anwendung gewährleistet hohe Ausbeuten an Tyrothricin und Vitamin Bu und ermöglicht eine einfache Extraktion des Vitamins.

Nährlösung l : In Roux-Flaschen bzw. in einer für Oberflächengärungen konstruierten, mit flachen Tassen ausgerüsteten Anlage gemäss der österr. Patentschrift Nr. 192055 werden Oberflächenfermen- tationen mit folgender Nährlösung ausgeführt :
0,15 % Na2 HPO4. 12 Hz 0 0, 3 % NaCl 0, 25 0 Na2 S2 O3 . 5H2 O 0, 005% K (Co (CN) 6)
0,01%CaC12
0,02%MgSO4. 7H2O
0,003% MnSO4 . 4 H2 O 3, 0 % Glukose 0, 1750/0 Stickstoff (als Presshefeautolysat) PH-Wert'7 7, 0
Die Sterilisation erfolgt durch 20-Minuten langes Erhitzen bei 1200 C, wobei die Glukose getrennt sterilisiert wird.

Nach Abkühlen und Zusatz der Glukoselösung wird die Nährlösung aseptisch mit 0, 50/0 einer von Dicfo-Agar abgespülten Sporensuspension des Bacillus brevis beimpft und 7 Tage bei 370 C bebrütet, wobei sorgfältig darauf geachtet wird, dass die auf der Oberfläche sich ausbildende Haut nicht zer-
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erhalten, während bei Anwendung von Gärtassen 3, 20 g je l Tyrothricin und 0, 86 mg je l Vitamin B12 isoliert werden können.

Die Nährlösung kann auch zur submersen Gewinnung von Tyrothricin und bzw. oder Vitamin B12 unter Verwendung von Bacillus brevis verwendet werden.

Nährlösung 2 :
0,15%Na2HPO4. 12H2O
0,5%NaC1
0,005%CoC12. 6H2O
0, 002% FeSO4. 7 Hz 0
0,025MgSO4. 7H2O

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4HPH-Wert 7, 5
Die Sterilisation erfolgt während 20 Minuten bei 1200 C, wobei die Glukose getrennt sterilisiert wird.

Nach Zusatz der Glukoselösung wird das Nährmedium unter sterilen Bedingungen mit 0, 5% einer 24 Stunden alten Submerskultur von Bacillus brevis beimpft, die auf demselben Nährmedium herangeführt worden war. Die Inkubation erfolgt bei 370 C auf einer Schüttelmaschine mit etwa 200 Umdr/min und etwa 3 cm Exzentrizität. Nach 2,3 und 4 Tagen werden aseptisch Proben entnommen und auf Tyrothricin sowie Vitamin B12 -Gehalt getestet. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
Tyrothricin und Vitamin B12 -Bildung im Schüttelkolben :
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<tb>
<tb> Tag: <SEP> Tyrothricin <SEP> Vitamin <SEP> B12
<tb> g <SEP> je <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> je <SEP> 1
<tb> 2. <SEP> 0,91 <SEP> 0,21
<tb> 3. <SEP> 1,18 <SEP> 0,43
<tb> 4. <SEP> 1,23 <SEP> 0,67
<tb>
.

Es ist möglich, andere Nährlösungsbestandteile zu verwenden ; so kann z. B. Kalziumkarbonat zur Stabilisierung des pli-Wertes zugesetzt werden.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Tyrothricin und Vitamin B12 durch aerobe Züchtung von B. brevis in Proteine bzw. Proteinabbauprodukte enthaltenden Nährlösungen, vorzugsweise nach dem Oberflächenverfahren, bis zur Erzielung einer erheblichen antibiotischen Wirksamkeit und Abtrennung des gebildeten Tyrothricins, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung von B, brevis in einer Nährlösung erfolgt, die ein Kobaltsalz in einer Konzentration an Kobaltionen von ungefähr 0,001 bis 0, 0.%0, so wie zweckmässig ein Presshefeautolysat gelöst enthalt, und dass nach beendigter Fermentation Tyrothricin und bzw. oder Vitamin B12 in an sich bekannter Weise aus dem Kulturfiltrat gewonnen werden.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kobaltsalz Kaliumkobalt-III-hexacyanid verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kobaltsalz Kobalt-II-chlorid verwendet wird.

4. Verfahren nach den Ansnrüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährlösung Kobaltsalze EMI4.3