WO2021006335A1

WO2021006335A1 - 結合組織体及びその製造方法

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Publication number: WO2021006335A1
Application number: PCT/JP2020/027019
Authority: WO
Inventors: 中山　泰秀; 佐藤　康史; 武寺澤
Original assignee: バイオチューブ株式会社
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2021-01-14
Also published as: CN114025705A; EP3998042A4; EP3998042A1; JP6755052B1; US20220257362A1; JP2021013480A

Abstract

コラーゲンを含む生体由来組織からなる本開示の一態様に従う結合組織体（３０）は、前記結合組織体（３０）の表面に、その内側よりも緻密に形成される緻密表面層（３２）を備える。

Description

結合組織体及びその製造方法

　本発明は、生体由来組織からなる結合組織体、及びその製造方法に関する。

　生体が備える自己防衛機能として、生体の皮下に異物が入ると、皮下に存在する繊維芽細胞が周囲に集積して異物を包み込むようにコラーゲンが産出される。この現象は、一般的にカプセル化反応と呼ばれている。近年、失われた組織や器官を人工的に蘇らせる再生医療が活発に研究されており、カプセル化反応を再生医療に利用することが検討されている。

　例えば、特許文献１には、互いに対向する二面の組織形成面を備える結合組織体形成基材を生体内などに配置させることで、その二面の間の組織形成空間に、カプセル化反応により産出されたコラーゲンなどによって、結合組織体が形成されることが開示されている。

　より詳細には、結合組織体形成基材が、筒状基材と、筒状基材の内部に挿入された芯材とを備え、その間の組織形成空間に、管状の結合組織体が形成することが示される。管状の結合組織体は、人工血管などに使用されることが想定されている。また、互いに対向する２枚の板状基材を備える結合組織形成基材が用いられることで、膜状の結合組織体が形成されることも示される。さらには、心臓弁などへの使用が想定されて、複数の弁葉を有する人工弁が形成されることも示されている。

国際公開第２０１６／０７６４１６号

Journal of Biomedical Materials Research Part B 2011:99B:420-430.

　しかしながら、特許文献１に開示される方法により形成された結合組織体は、表面における強度が不十分であり、例えば、非特許文献１において、人工血管、人工弁などの生体内の組織に使用すると、結合組織体の内部に血液が染み込むことで血栓が形成されやすくなるなどの問題が報告されている。そのため表面に抗血栓性物質をコーティングするなどの処理が必要となる。

　また、形成された結合組織体を体液や消化液、排出液など体内の液体成分と接する人工食道、人工リンパ管、人工横隔膜、人工尿管、人工尿道などの生体内の組織に使用すると、水分が組織内に染み込むことで組織が膨化し、脆弱になるなどの問題がある。さらに、厚い結合組織体は、全体の強度が不十分であり、人工腱や人工靭帯など運動器官などの組織として機能させることはできなかった。組織体の内部にステントなどの人工構造体を内包させる場合に組織の中でズレるなど組織形状が不安定になるなどの問題がある。

　本発明は、以上の問題点に鑑みてなされものであり、カプセル化反応により得られる結合組織体の表面における強度を高めて、例えば、人工血管、人工弁、さらに人工食道、人工リンパ管、人工横隔膜、人工尿管、人工尿道、あるいは結合組織体の全体の強度を高めて人工腱や人工靭帯などの生体内の組織に使用しても、結合組織体の内部に血液や体液が染み込み血栓が形成されることや膨化することを防止することを課題とする。さらに、組織体に内包させる人工構造体を安定化させて、例えば、人工気管、ステントグラフト、カバードステントなどに使用しても、内包させる人工構造体が組織体の内部でズレることを防止することも課題とする。

　本発明者は、鋭意検討の結果、結合組織体の表面に、組織が緻密となった緻密表面層を形成することで上記課題を解決できることを見出し、以下の本発明を完成させた。
　［１］コラーゲンを含む生体由来組織からなる結合組織体であって、
　結合組織体のいずれかの表面を構成する表面層が、該表面層以外の部分よりも、組織が緻密に形成される緻密表面層を備える結合組織体。

　［２］前記コラーゲンが繊維状コラーゲンを含む上記［１］に記載の結合組織体。
　［３］前記繊維状コラーゲンが前記緻密表面層の表面において扁平状で平滑である上記［２］に記載の結合組織体。

　［４］前記繊維状コラーゲンが、前記緻密表面層の表面以外の部分において交差するよう網目状に配置される上記［２］又は［３］に記載の結合組織体。
　［５］厚さ方向に沿って算出した、前記表面層以外の部分の組織緻密度に対する、前記表面層の組織緻密度の比が１．１以上である上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の結合組織体。

　［６］内部に異種部材が埋められる上記［１］～［５］のいずれか１項に記載の結合組織体。
　［７］前記異種部材の周囲に前記緻密表面層が形成される上記［６］に記載の結合組織体。

　［８］前記結合組織体がカプセル化反応により形成される上記［１］～［７］のいずれか１項に記載の結合組織体。
　［９］コラーゲンを含む生体由来組織からなる結合組織体の製造方法であって、
　組織形成面を有し、かつ前記組織形成面の少なくとも一部が高分子材料から構成される結合組織体形成基材を、生体内に配置する工程と、
　生体内の前記結合組織体形成基材が配置された空間から、生体外より経皮的かつ経管的に空気を抜く工程と、
　前記組織形成面上に、結合組織体を形成させる工程と、
　前記結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、生体内から取り出す工程と、
　前記結合組織体を前記結合組織体形成基材から剥離させる工程と、
　を備える結合組織体の製造方法。

　［１０］生体組織材料が存在する環境と結合組織体を形成するための空間とを区切る組織形成面を備えた組織体形成基材であって、前記空間と前記環境とを連通させて前記空間に結合組織を侵入させる孔を備えた前記組織体形成基材を人体以外の生体内の前記環境に配置し、前記組織体形成基材が配置された空間から前記生体外より空気を抜いて形成される結合組織体であって、
　前記組織形成面は、高分子材料または金属材料から構成され、
　前記結合組織体は、コラーゲンを含む生体由来組織からなり、生体内の組織に使用され、
　前記結合組織体のなかで前記組織形成面と接する表面を構成する表面層の全体が、該表面層以外の部分よりも、組織が緻密に形成される緻密表面層であり、
　前記緻密表面層について、厚さ方向に沿って算出した、前記表面層以外の部分の組織緻密度に対する、前記表面層の組織緻密度の比が１．１以上である、結合組織体。

　［１１］コラーゲンを含む生体由来組織からなり、生体内の組織に使用される結合組織体の製造方法であって、
　組織形成面を有し、かつ前記組織形成面の少なくとも一部が高分子材料から構成される結合組織体形成基材を、人体以外の生体内に配置する工程と、
　前記生体内の前記結合組織体形成基材が配置された空間から、前記生体外より経皮的かつ経管的に空気を抜く工程と、
　前記組織形成面上に、結合組織体を形成させる工程と、
　前記結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、前記生体内から取り出す工程と、
　前記結合組織体を前記結合組織体形成基材から剥離させる工程と、を備える結合組織体の製造方法。

　［１２］前記結合組織体がカプセル化反応により形成される［１１］に記載の結合組織体の製造方法。
　［１３］再生医療用の結合組織体であって、
　生体由来の第１の繊維状コラーゲンを備える表面層と、
　生体由来の第２の繊維状コラーゲンを備える非表面層部分とを備え、
　前記表面層の前記第１の繊維状コラーゲンは、第１の微視的構造と第１の緻密度とを有しており、
　前記非表面層部分の前記第２の繊維状コラーゲンは、前記第１の微視的構造とは異なる第２の微視的構造と、前記第１の緻密度よりも小さい第２の緻密度とを有しており、
　前記表面層と前記非表面層部分とは、前記第１の繊維状コラーゲンの前記第１の緻密度と前記第２の繊維状コラーゲンの前記第２の緻密度との違い、及び、前記第１の繊維状コラーゲンの前記第１の微視的構造と前記第２の繊維状コラーゲンの前記第２の微視的構造との違いに由来する壁乖離構造を形成する、結合組織体。

　［１４］前記表面層と前記非表面層部分とは、前記第１の緻密度と前記第２の緻密度との違い、及び、前記第１の微視的構造と前記第２の微視的構造との違いのみによる層境界を形成する、［１３］に記載の結合組織体。

　［１５］前記第１の微視的構造及び前記第１の緻密度は、前記表面層に、第１の血液染み込みにくさを与え、
　前記第２の微視的構造及び前記第２の緻密度は、前記非表面層部分に、第２の血液染み込みにくさを与え、
　前記表面層の前記第１の血液染み込みにくさは、前記非表面層部分の前記第２の血液染み込みにくさよりも高い、［１３］に記載の結合組織体。

　本発明によれば、強度を向上させて、例えば、人工血管、人工弁などの生体内の組織に使用しても、内部に血液が染み込み血栓が形成されることを防止できる結合組織体を提供する。

　また、結合組織体に人工構造体などの異種部材が内包される場合には、異種部材を安定化させて、内部でズレることを防止できる。

結合組織体の一実施形態を示す模式的な断面図を示す。結合組織体の一実施形態を示す模式的な断面図を示す。結合組織体の一実施形態を示す模式的な断面図を示す。結合組織体の一実施形態を示す模式的な断面図を示す。結合組織体の一実施形態を示す模式的な断面図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。芯材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材の一実施形態を示す斜視図を示す。結合組織体形成基材を生体内に配置する工程の一実施形態を示す斜視図である。結合組織体の一実施形態を示す斜視図を示す。実施例１の結合組織体の断面を拡大して撮影した写真である。実施例１の結合組織体の断面を染色したうえで、拡大して撮影した写真である。実施例１の結合組織体の断面を染色したうえで撮影した写真であり、結合組織体の内周面付近の部分を拡大したものである。実施例１の結合組織体の断面を染色したうえで撮影した写真であり、結合組織体の厚さ方向の中央部分を拡大したものである。実施例１の緻密表面層の表面を構成する結合組織体の内周面を拡大して撮影した写真である。実施例１の結合組織体の緻密表面層の内部を拡大して撮影した写真である。実施例１の結合組織体の緻密表面層以外の部分を拡大して撮影した写真である。実施例１の均一化処理後の輝度分布データを示す。実施例１において、犬の全血に浸漬させた際の結合組織体を示す。実施例１が壁乖離構造を有することを示す写真である。比較例１の結合組織体の断面を染色したうえで、拡大して撮影した写真である。比較例１における結合組織体を示す。比較例１において、犬の全血に浸漬させた際の結合組織体を示す。

　　［結合組織体］
　本発明の結合組織体はコラーゲンを含み、生体由来組織よりなるものである。本発明の結合組織体は、通常、カプセル化反応により形成される。カプセル化反応は、生体の皮下など、生体組織材料が存在する環境下に異物（後述する結合組織体形成基材）を配置させることで、線維芽細胞などの生体組織材料を異物の周囲に集積させて異物を包み込むようにコラーゲンを産出させる反応である。

　結合組織体は、カプセル化反応で産出されたコラーゲンを主成分として含有する。また、結合組織体は、線維芽細胞などのその他の生体組織材料を含んでいてもよい。さらに、結合組織体において、コラーゲンは、一部又は全部が繊維状コラーゲンを構成している。

　なお、本明細書において「生体組織材料」とは、所望の生体由来組織を形成するうえで必要な物質のことであり、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の動物細胞、各種たんぱく質類（コラーゲン、エラスチン）、ヒアルロン酸等の糖類、その他、細胞成長因子、サイトカイン等の生体内に存在する各種の生理活性物質が挙げられる。この「生体組織材料」には、ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物に由来するもの、又はこれと同等の人工材料が含まれる。生体組織材料は、これらの中では、哺乳類動物由来が好ましい。また、「生体由来組織」とは上記生体組織材料より形成された組織を意味する。

　本発明の結合組織体は、結合組織体のいずれかの表面を構成する表面層が、該表面層以外の部分よりも、組織が緻密に形成される緻密表面層を備える。組織が緻密となっているとは、結合組織体においてコラーゲンが緻密になっていることを意味する。表面層以外の部分よりも緻密となっている緻密表面層は、結合組織体の表面の少なくとも一部に設けられればよい。緻密表面層によって構成される結合組織体の表面（例えば、後述する管状構造では内周面）は、高い強度を有する。また、緻密性の高い平滑で高い強度を有する面となり、それにより、血液が染み込みにくくなり、血栓ができにくくなる。さらに、得られた結合組織体には、血液凝固塊などもない。

　なお、用語「表面層」とは、結合組織体の外側の表面（外表面）を構成する層に限られず、結合組織体の内部であっても、結合組織体の内部に存在する異種部材などの他の部材との境界面を構成する層も包含する。また、内部に空洞を有する場合には、その空洞との境界面も表面層に包含される。

　すなわち、後述するように、内部に異種部材が埋め込まれる場合、異種部材との境界面に緻密表面層があってもよい。さらに、内部に中空部を有する場合には、その中空部との境界面（例えば、管状構造では内周面）に緻密表面層があってもよい。

　本発明の結合組織体は、好ましくは、その厚さ方向に沿って、緻密表面層と、緻密表面層よりも疎である表面層以外の部分を有することが好ましい。緻密表面層と相対的に疎である部分を有することで厚さを増して取り扱いが容易となり、さらに組織全体の曲げなどに追従しやすい柔軟性を高めることができる。また、本発明の結合組織体は、厚さ方向に沿って、両表面に緻密表面層を有し、その２つの緻密表面層の間に、緻密表面層よりも疎である部分を有することも好ましい。なお、厚さ方向とは、例えば管状構造ではその径方向に一致する方向である。なお、緻密表面層が形成される両表面は、いずれもが結合組織体の外表面であってもよいし、いずれもが空洞及び異種材料のいずれかとの境界面であってもよいし、一方が外表面で他方が上記境界面であってもよい。

　結合組織体の表面層が、緻密表面層を有するか否かは、結合組織体を、薄厚の切片状にスライスしマッソン・トリクローム染色し、その染色された結合組織体に一定の照度で照明を照射させて得た画像における輝度値により確認できる。

　結合組織体は、マッソン・トリクローム染色されると、コラーゲンは青色に染色されるが、組織が密になっている部分が濃染色される。そのため、一定の照度の照明で照射された切片状の結合組織体では、組織が密となった部分が、他の領域に比べて輝度値が相対的に低くなり、輝度値が相対的に低くなる領域を緻密性の高い部分と認識できる。

　すなわち、本発明の結合組織体を、マッソン・トリクローム染色をして撮影すると、その撮影画像では、緻密性の高い表面層の輝度値が、表面層以外の他の部分よりも低くなるので、それにより、緻密表面層を有すると確認できる。

　本発明では、マッソン・トリクローム染色画像において、緻密となる組織の輝度値が低くなることを利用し、結合組織体の表面層の緻密度も算出できる。
　ここで、マッソン・トリクローム染色画像により求められる緻密度は、組織そのもの（すなわち、コラーゲン）の緻密度を表す組織緻密度で定義できる。結合組織体は、一般的に、薄厚状にスライスしてその断面を観察すると、毛細血管構造や空隙（すなわち、組織がない部分）が見られるが、組織緻密度は、画像処理によりそのような空隙部分を除く処理をして算出した緻密度である。

　本発明では、結合組織体を、厚さ方向に沿って薄厚の切片状にスライスしマッソン・トリクローム染色した切断断面を観察して、表面層の組織緻密度を算出するとよい。具体的には、結合組織体の厚さ方向に沿って、表面層以外の部分の組織緻密度に対する、表面層の組織緻密度の比（以下、「組織緻密度比」ともいう）を算出することで、結合組織体の表面層の緻密さの程度も求めることができる。

　ここで、本発明の表面層は、その表面層以外の部分よりも、緻密度が高くなる。したがって、表面層の組織緻密度比は、１より大きくなればよいが、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上である。組織緻密度比の上限は、特に限定されないが、例えば３、現実的には２．５である。

　本発明では、組織緻密度比が１．１以上となると、表面層においてコラーゲン、特に繊維状コラーゲンが密に存在することになるので、強度が高くなる。そのため、生体内において有益に使用できるようになる。また、血液が染み込みにくくなり、それにより、血栓ができにくくなる。

　なお、本発明では、両表面における表面層の組織緻密度比が、上記範囲内であってもよいが、一方の表面における表面層の組織緻密度比が、上記範囲内であってもよい。
　本発明の緻密表面層は、上記のように組織緻密度が他の部分よりも高くなることで、壁乖離構造を有する。なお、壁乖離構造とは、例えばピンセットで緻密表面層の端部をつまんで剥がすと、緻密表面層以外の部分に対して、層状に剥離が可能である構造を言う。

　緻密表面層は、それ以外の部分と比べて、水に浸漬させたときの含水率が低くなる。具体的には、剥離によって分離させた緻密表面層とそれ以外の層の重量を共にＢ（ｇ）、１２時間、２５℃でそれぞれを真空乾燥させた緻密表面層あるいはそれ以外の部分の重量をＡ（ｇ）としたときに、（Ｂ－Ａ）／Ａ×１００で表される緻密表面層の含水率は、好ましくは６０％未満、さらに好ましくは５５％未満となる。一方で、それ以外の部分を同様に測定した含水率は、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上となる。緻密表面層は、含水率が低いことからも明らかなように組織が密であるため、血液の染み込みが防止でき、血栓が形成されるなどの不具合が生じにくくなる。含水率は、緻密表面層、及びそれ以外の部分それぞれの任意の複数箇所（例えば、１０点）の含水率を求めて平均値を算出するとよい。

　本発明の結合組織体は、上記したように繊維状コラーゲンを有するが、繊維状コラーゲンは、上記緻密表面層により構成される表面（例えば管状構造の内周面）において扁平状で平滑であることが好ましい。緻密表面層は、その表面に扁平状で繊維状コラーゲンが平滑に配置され、かつ組織が緻密になることで、血液が結合組織体に染み込みにくくなると推定される。

　一方で、繊維状コラーゲンは、結合組織体の緻密表面層により構成される表面（例えば管状構造の内周面）以外の部分においては、緻密表面層並びに緻密表面層以外の疎な部分の両方において、繊維状コラーゲンが交差するよう網目状に配置される。より具体的には、繊維状コラーゲンの束が一方向に沿って配向して層を形成すると共に、その層のコラーゲンの束と交差するように繊維状コラーゲンの束が別の一方向に沿って配向して別の層を形成し、これら層が網目状に積層されて積層構造を形成するとよい。また、その積層構造は、複数積み重なっているとよい。

　また、結合組織体の緻密表面層により構成される表面（例えば管状構造の内周面）以外の部分の繊維状コラーゲンの束は、緻密表面層では太く、緻密表面層以外の部分では、緻密表面層よりも細い構造を有するとよい。

　本発明の結合組織体は、ヒトコラーゲンと同様に、網目状構造を有することで、人体の失われた組織や器官を人工的に蘇らせる再生医療に適用しやすくなる。
　ここで、繊維状コラーゲンの束が一方向に沿って配向するとは、繊維状コラーゲンが概ね一方向に沿って流れるように並んでいればよく、全ての繊維状コラーゲンが厳密に互いに平行である必要はない。

　本発明の結合組織体は、いかなる形状でもよく、例えば、管状であってもよいし、シート状や棒状、球状などであってもよい。結合組織体は、管状である場合には、例えば、人工血管に使用することが可能である。また、シート状である場合には、人工の心膜、硬膜、皮膚、弁膜、角膜、横隔膜、腹壁などの膜状の組織体として、あるいは血管、食道、気管、消化管、リンパ管、尿道、尿管、膀胱などの管状や袋状の組織体の補填修復材として使用することが可能である。さらに、棒状である場合には、腱や靭帯などの筋状の組織体として使用することができる。

　また、結合組織体は、管状、シート状以外にも、各器官に合わせてあらゆる形状に成形されてもよく、例えば、人工弁に対応した形状に成形されてもよい。人工弁は、一般的に、管部と管部から径方向内向きに膨出した複数の弁葉を有する。

　結合組織体は、管部（管状構造）を有する場合、その両表面（すなわち、外周面と内周面）の少なくともいずれか一方に緻密表面層が形成されるとよい。ただし、図１、２に示すように、管状構造を有する結合組織体３０は、少なくともその内周面３０Ｂに緻密表面層３２が形成されることが好ましい。また、図２に示すように、内周面３０Ｂ及び外周面３０Ａの両方に緻密表面層３２が形成される態様も好ましい。

　さらに、環状構造を有する結合組織体３０は、図１、２に示すように，その内部に１つの中空部３５が設けられることが好ましいが、図３に示すように、複数の中空部３５が設けられてもよい。複数の中空部３５が設けられる場合も、図３に示すように、その中空部３５の外周を構成する管部の内周面３０Ｂに緻密表面層３２が形成されることが好ましく、内周面３０Ｂと外周面３０Ａの両方に緻密表面層３２が形成される態様も好ましい。柔軟な組織の内部に強度の高い円筒状の組織が埋め込まれることで、例えば腱や靭帯などの棒状移植体に使用できる。

　また、図４に示すように、結合組織体３０の内部に金属や高分子などの異種部材３７が埋められていてもよい。異種部材３７が埋められる場合も、図４に示すように、その中空部３５の外周を構成する管部の内周面３０Ｂに緻密表面層３２が形成されることが好ましく、図５に示すように内周面３０Ｂと外周面３０Ａの両方に緻密表面層３２が形成される態様も好ましい。図４、図５に示すように、異種部材３７が埋められた結合組織体３０においては異種部材３７の周囲における表面層も、緻密表面層３２として形成されることが好ましい。異種部材３７との境界をなす周囲部分が緻密表面層３２となることで、異種部材３７が柔軟な組織の内部である程度の可動性を保ちながら強く組織内で固定される。従って、異種部材３７を安定化させて、内部でズレることを防止できる。

　異種部材３７としてはステントを使用することが好ましい。ステントが埋められた結合組織体３０は、管状移植体に使用でき、全体組織を破損させることなく大きな変形に追従でき、収縮、拡張することができる。

　異種部材３７としては、拡張変形できるステント以外にも、直線状やリング状、スパイラル状の構造体などが挙げられる。
　また、異種部材３７としては、生体適合性を有する金属、高分子材料、あるいは生体由来材料などを使用すればよい。金属としては、ステンレス鋼、チタン、コバルトクローム合金、ニッケルチタン合金、マグネシウム合金などが挙げられる。これら金属は、例えばステントに好適に使用できる。高分子材料としては、ナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ウレタン樹脂、エチレン樹脂、スチレン樹脂、プロピレン樹種などの樹脂が挙げられる。これらの高分子材料は金属の表面にコーティングされていてもよい。また、生体由来材料としては、ハイドロキシアパタイトなどの無機材料や軟骨など主として細胞成分からなる有機材料などが挙げられる。

　上記したように管状構造を有する結合組織体を人工血管、人工弁に使用する場合、その内側に血液が流されるが、内周面に緻密表面層が形成されると、その内側に流される血液が、緻密表面層によって結合組織体に染み込みにくくなり、人工血管、人工弁などに血栓ができにくくなる。

　また、結合組織体が、シート状である場合には、そのシート状の結合組織体の一方の表面に緻密表面層が形成されるとよいが、両表面に緻密表面層が形成されてもよい。
　　［結合組織体の製造方法］
　本発明の結合組織体は、結合組織体形成基材を用いてカプセル化反応を利用して製造することができる。具体的には、生体の皮下においては、以下の工程を備える製造方法によって製造可能である。

　工程１：組織形成面を有し、かつ組織形成面の少なくとも一部が高分子材料から構成される結合組織体形成基材を、生体内に配置する工程
　工程２：生体内の結合組織体形成基材が配置された空間から、生体外より経皮的かつ経管的に空気を抜く工程
　工程３：組織形成面上に結合組織体を形成させる工程
　工程４：結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、生体内から取り出す工程
　工程５：結合組織体を結合組織体形成基材から剥離させる工程
　　（結合組織体形成基材）
　まず、上記製造方法で使用する結合組織体形成基材について説明する。

　結合組織体形成基材は、その表面に結合組織体を形成させるための組織形成面を有する。組織形成面は、好ましくは、結合組織体の形状に応じた空間（組織形成空間）を区画するよう構成される。例えば、結合組織体形成基材は、少なくとも互いに対向する一対の組織形成面を有し、その一対の組織形成面の間の組織形成空間に、カプセル化反応により結合組織体を形成させるとよい。

　結合組織体形成基材は、生体内などの生体組織材料の存在する環境下において大きく変形することが無い強度を有しており、化学的安定性があり、滅菌などの負荷に耐性があり、かつ生体を刺激する溶出物が無いまたは少ない材料で構成すればよい。

　結合組織体形成基材は、具体的には、高分子材料、金属材料などで構成される。高分子材料の好ましい具体例として、ナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ウレタン樹脂、エチレン樹脂、スチレン樹脂、プロピレン樹種など体内留置型の医療機器の部材として使用される材料が挙げられる。金属材料の好ましい具体例としてはステンレス鋼、チタン、コバルトクローム合金、ニッケルチタン合金、マグネシウム合金など体内留置型の医療機器の部材として使用される材料が挙げられる。

　また、組織形成面は、少なくとも一部が樹脂などの高分子材料、好ましくはナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ウレタン樹脂、エチレン樹脂、スチレン樹脂、プロピレン樹種など体内接触型の医療機器の部材として使用される材料で構成される。これら樹脂は、その表面に生体組織材料が密に集積されやすく、緻密表面層を形成しやすくなる。したがって、結合組織体形成基材が互いに対向する一対の組織形成面を有する場合、一方の組織形成面が樹脂などの高分子材料で構成されることが好ましく、ナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ウレタン樹脂、エチレン樹脂、スチレン樹脂、プロピレン樹種など体内留置型の医療機器の部材として使用される材料で構成されることがより好ましい。また、他方の組織形成面が、金属材料で構成されることが好ましい。

　組織形成面を上記高分子材料又は金属材料で構成する場合、組織形成面を有する部材全体を高分子材料又は金属材料で構成してもよいが、組織形成面のみを高分子材料又は金属材料で構成してもよい。例えば、金属部材の表面に、高分子材料を被膜することで、組織形成面を高分子材料で構成してもよい。

　結合組織体形成基材の形状は、作製する結合組織体に応じて設計すればよく、例えば、管状の結合組織体を製造する場合には、図６に示すように、結合組織体形成基材１０は、筒体からなるカバー部材１１と、カバー部材１１の内部に挿入される芯材１２とを備えるものを使用すればよい。

　図６に示す結合組織体形成基材１０においては、カバー部材１１の内周面が一方の組織形成面１１Ａを構成し、芯材１２の外周面が他方の組織形成面１２Ａを構成する。組織形成面１１Ａ，１２Ａは、これらの間に組織形成空間１３を形成する。カバー部材１１には、組織形成空間１３と基材の外部とを連通させる孔１７が設けられる。孔１７は、通常、カバー部材１１に複数設けられる。

　カバー部材１１の両端面には、組織形成空間１３の両端部それぞれを塞ぐ蓋体１４、１５が設けられる。蓋体１４、１５は、円環状であり、かつ外周に係止部１４Ａ、１５Ａが設けられる。各蓋体１４，１５において係止部１４Ａ、１５Ａは複数設けられる。各係止部１４Ａは、カバー部材１１の端部が嵌め込まれる溝１４Ｃを有する。各係止部１５Ａにも同様に溝（図示しない）が設けられる。蓋体１４、１５は、芯材１２の端部が環状内部に嵌め込まれ、かつ係止部１４Ａ、１５Ａの溝にカバー部材１１の端部が嵌め込まれることで、カバー部材１１と芯材１２とを連結して固定させる。

　孔１７は、特に限定されず、例えば円、楕円であってもよいし、スリットであってもよい。孔１７が円や楕円である場合、結合組織及び生体組織材料を容易に侵入させることのできる観点から、円や楕円の孔径は１ｍｍ以上に設定するとよく、また、１０ｍｍ以下に設定するとよい。

　孔１７は、図６に示すようにスリットであることが好ましい。孔１７をスリットにすることで、孔１７が結合組織によって閉塞させることなく、組織形成空間１３に結合組織を容易に侵入させることができる。スリットは、結合組織及び生体組織材料を容易に侵入させることのできる１ｍｍ以上のスリット幅を有するとよく、例えば１０ｍｍ以下のスリット幅を有するとよい。また、スリットは、通常、スリット長さがスリット幅の２倍よりも大きいことが好ましく、５倍よりも小さいことが好ましく、３倍よりも小さいことがより好ましい。

　また、カバー部材１１の組織形成面１１Ａに対するスリットの面積比を２／３以下に設定するとよい。スリットの面積比を小さくすることで、組織形成面１１Ａ上に形成される結合組織体表面の表面状態を良好にしやすくなる。また、スリットを介して、結合組織及び生体組織材料が組織形成空間１３に侵入できるように、カバー部材１１の組織形成面１１Ａに対するスリットの面積比は、１／１０以上であることが好ましい。また、孔が円又は楕円などのスリット以外の場合にも同様に、カバー部材１１の組織形成面１１Ａに対する孔の面積比は、１／１０以上とすることが好ましく、また、２／３以下とすることが好ましい。

　また、スリットは、図６に示すように、その長手方向が基材中心軸と平行となるように配置されてもよいが、その長手方向が基材中心軸に対して傾斜するように配置されてもよい。また、スリットは、周方向及び長さ方向それぞれに沿って複数個並べられるとよい。

　芯材１２の外周面は、上記した樹脂などの高分子材料、特にナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂で構成されることが好ましい。これにより、本発明においては、管状の結合組織体の内周面に緻密表面層を形成しやすくなる。芯材１２は、例えば、中心材１２Ｂと、中心材１２Ｂの外周面に被せられたカバーチューブ１２Ｃとを備え、カバーチューブ１２Ｃが上記した高分子材料で構成されるとよい。

　一方で、カバー部材１１は、金属材料で構成し、その組織形成面１１Ａ（すなわち、内周面）を金属材料で構成することが好ましい。金属材料は、上記した高分子材料に比べて、その表面に生体組織材料が集積しにくく、それにより、カバー部材１１の孔１７が生体組織材料によって早期に閉塞されることが防止される。そのため、長期間にわたって組織形成空間１３に生体組織材料が集積される。ただし、カバー部材１１は、上記した高分子材料によって形成してもよい。高分子材料で形成することで、上記した図２に示すように管状の結合組織体の外周面及び内周面の両方に緻密表面層を形成できる。

　結合組織体形成基材は、直線的な形状に限定されず、様々な形状を有することが可能であり、曲線的な形状を有してもよく、例えば、図７、８に示すように、らせん状に巻かれた２重以上の環状を有する結合組織体形成基材４０であってもよい。

　結合組織体形成基材４０は、図７又は図８に示すとおりカバー部材４１を備える。カバー部材４１は、らせん状に巻かれた２重以上の環状を有する。カバー部材４１は、例えば、上下に分割される上側部材４１Ａ及び下側部材４１Ｂにより構成され、それらが突き合わされることで管状構造となる。上側部材４１Ａ及び下側部材４１Ｂは、それぞれ連結部材４３Ａ，４３Ｂが設けられ、その連結部材４３Ａ，４３Ｂが連結されることで互いに固定される。カバー部材４０には、複数の孔４７が設けられ、孔４７が、周方向及び長さ方向に沿って複数個並べられるとよい。孔４７は図７に示すように矩形でもよいし、図８に示すように円形の孔であってもよいし、他の形状の孔であってもよい。

　カバー部材４０の内部には、芯材４２が配置される（図９参照）。芯材４２は、図９に示すように、カバー部材４１の形状に対応して、らせん状に巻かれた２重以上の環状を有する。芯材４１の両端４２Ｅ，４２Ｅは、他の部分よりも幅及び高さが大きく、例えば球状を有している。このような形状を有することで、例えばカバー部材４１の両端に凹部が設けられることで、両端４２Ｅ，４２Ｅを凹部に嵌合させて、芯材４２をカバー部材４１に対して固定できる。ただし、芯材４２の両端は、このような構成に限定されない。

　結合組織体形成基材４０において、カバー部材４１の内周面と、芯材４２の外周面の間に、組織形成空間が形成される。カバー部材４１の内周面と、芯材４２の外周面の材質は上記したとおりである。

　図７～９に示す結合組織体形成基材４０を使用する場合も、上記したとおり組織形成空間に結合組織体が形成される。結合組織体形成基材４０は、２重以上の環状を有することで、結合組織体を長い管状構造にできるので、例えば人工血管用の結合組織体を形成するのに適している。

　さらに芯材は、１つである必要はなく、２つ以上が設けられてもよい。芯材が２つ以上設けられる結合組織体形成基材５０の具体例を図１０に示す。結合組織体形成基材５０は、筒体からなるカバー部材５１と、カバー部材５１の内部に挿入される複数の芯材５２とを備え、複数の芯材５２が蓋体５４、５５に取り付けられるとよい。また、蓋体５４、５５には上記で説明したとおり複数の係止部５４Ａ、５５Ａが設けられ、例えば係止部５４Ａ、５５Ａの溝にカバー部材５１の端部が嵌め込まれることで、カバー部材５１と芯材５２とを連結して固定させる。

　芯材５２が複数設けられる場合、各芯材５２は、棒状であり、その太さは例えば０．２～３ｍｍであり、好ましくは０．５～２．５ｍｍである。また、カバー部材５１の内部空間において、芯材５２が占有する最大断面積は、例えば２０～６０％程度である。なお、最大断面積とは、結合組織体形成基材４０の軸に対して垂直の断面において、最大面積となる部分の断面積である。

　カバー部材には、図１０では、複数の円形の孔５７が設けられるが、孔５７の構成は限定されず、上記で説明したとおりいかなる孔であってもよく、スリットなどであってもよい。また、図１０において円形の孔５７は、千鳥状配置となるが、配置は限定されずいかなる配列でもよい。

　また、結合組織体の内部に異種部材を埋設する場合には、組織形成空間に異種部材を配置すればよい。例えば、図１１に示すように、芯材１２とカバー部材１１とを有する結合組織形成基材には、芯材１２とカバー部材１１の間の組織形成空間１３に異種部材３７を配置すればよい。ただし、異種部材３７は、芯材１２及びカバー部材１１に密着しないようにするとよい。芯材１２及びカバー部材１１に密着させないことで、異種部材３７と芯材１２又はカバー部材１１の間に生体由来組織が入り込み、図５に示すように、結合組織体３０では、内周面３０Ｂ、及び外周面３０Ａの全体にわたって、緻密表面層３２が形成されやすくなる。また、異種部材３７は、結合組織体形成基材の一部をなすものであり、その表面が組織形成面となるとよい。

　また、管状の結合組織体を形成する場合には、結合組織体形成基材は、カバー部材と、芯材とを備える必要はなく、例えばカバー部材が省略されてもよい。カバー部材が省略された結合組織体形成基材６０の一例を図１２に示す。カバー部材が省略されても、芯材６２の表面が組織形成面となり、その芯材６２表面上にカプセル化反応により、結合組織体が形成される。また、カバー部材が省略された結合組織体形成基材６０においても、図１２に示すように、芯材６２の外周面上には、異種部材３７を配置してもよく、異種部材３７は、上記のとおり、芯材６２の外周面に密着させないことが好ましい。図１２に示すように、異種部材３７が組織形成空間１３に配置され、カバー部材が設けられない場合には、例えば図４に示す結合組織体３０が得られる。

　図１１、１２は、異種部材３７がステントである例を示す。ステントは例えば拡径することで芯材６２の外周面に取り付けるとよい。異種部材３７はもちろんステントに限定されず他の材料を使用してもよい。

　シート状の結合組織体を作製する場合には、結合組織体形成基材は、互いに対向する２枚の板状部材を備える基材を使用すればよい。この場合、２枚の板状部材の互いに対向する面を組織形成面とし、一対の組織形成面の間の組織形成空間に生体組織材料を集積させて、結合組織体を形成すればよい。

　このとき、一対の組織形成面のいずれかを、樹脂などの高分子材料、特にナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、又はアクリル樹脂で構成することが好ましい。これら高分子材料で構成することで、その組織形成面上に緻密表面層を形成しやすくなる。また、２枚の板状部材のいずれかにスリットなどの孔を形成すればよい。さらに、一方の板状部材の組織形成面を上記高分子材料で構成するとともに、他方の板状部材に孔を形成することが好ましく、孔を形成した板状部材は、組織形成面を金属材料により構成することがより好ましい。

　さらに、例えば、人工弁などを作製する場合には、結合組織体形成基材は、芯材と、芯材が内部に挿入されるカバー部材とを備え、芯材の外周面と、カバー部材の内周面とを組織形成面として、その一対の組織形成面の間に組織形成空間を区画すればよい。組織形成空間は、人工弁、又は適宜加工することで人工弁とすることが可能な人工弁前駆体に応じた形状となるように区画されていればよい。例えば、組織形成空間は、管部と管部から径方向内向きに膨出した複数の弁葉を含む人工弁又は人工弁前駆体の形状に応じて区画されていればよい。

　このときも、芯材の外周面が、樹脂などの高分子材料、特にナイロン樹脂、ＰＥＥＫ樹脂、シリコーン樹脂、アクリル樹脂で構成されることが好ましい。これにより人工弁の内周面に、緻密表面層を形成しやすくなる。また、カバー部材には、スリットなどの孔が設けられるとよく、その内周面が好ましくは金属材料で構成される。

　次に、上記した結合組織体の製造方法の各工程について説明する。
　　（工程１）
　工程１では、結合組織体形成基材を生体内に配置させる。生体としては、ヒト、或いは、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジなどのヒト以外の他の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物が挙げられる。これらの中では、哺乳類動物が好ましい。結合組織体形成基材が配置される生体内は、例えば皮下又は腹腔内などである。

　結合組織体形成基材を生体内に配置させる方法としては、最小限の切開術を行い、生体表面に挿入口を形成して、その挿入口より結合組織体形成基材を動物内に埋入するとよい。埋入後は傷口を縫合する。結合組織体形成基材の埋入部位としては例えば、結合組織体形成基材を受け入れる容積を有する腹腔内、あるいは四肢部、肩部又は背部、腹部などの皮下が好ましい。具体的には、皮下の場合には、真皮層の下側と、脂肪層あるいは筋層の上側の間に埋入させるとよく、より具体的には、生体内の真皮層の下側と、脂肪層あるいは筋層の上側との間に止血を十分に施して作製した皮下ポケット内に配置する。

　また、埋入には低侵襲な方法で行い、また、十分な麻酔下で最小限の切開術で行うことが好ましい。出血は最小限に抑えることが好ましく、出血を起こした場合には十分な止血が必要である。皮下ポケットは配置させる結合組織体形成基材より大きなスペースを確保することが望ましい。基材より大きな皮下の剥離面を形成させることで、生体反応がより刺激を受けて、剥離面の修復治癒との共同作業が起こり、基材の内部での組織の形成が促進される。

　具体的には、まず、生体の表面に挿入口を形成して、この挿入口から生体内を剥離し、皮下にポケットを作製する。挿入口から生体内組織形成基材を挿入することで、生体内に結合組織形成基材が配置される。挿入口は縫合などにより閉じる。

　また、ガイド棒を用いると、より簡便に皮下出血を抑えながら生体内に結合組織形成基材を配置することができる。図１３に示すように、まず、生体の表面に挿入口１８を形成して、この挿入口１８から生体内に、先端を凸曲面状に形成したガイド棒１９の先端部分を挿入する（図１３の（ａ）状態）。次いで、ガイド棒１９の外側をスライドさせるようにして、挿入口１８から生体内に挿入管２０を挿入する（図１３の（ｂ）状態、（ｃ）状態）。挿入管２０を挿入した後、ガイド棒１９は引き抜くとよい。その後、挿入管２０の内部に結合組織体形成基材１０を挿入して（図１３の（ｄ）状態）、押し込み棒２１で押し込んだ後（図１３の（ｅ）状態）、挿入口１８から挿入管２０を引き抜くことにより、生体内に結合組織体形成基材１０が配置される。挿入管２０を引き抜いた後、挿入口１８は縫合などにより閉じる（図１３の（ｆ）状態）。この場合も、皮下ポケットは基材より大きなスペースを確保することは望ましい。ガイド棒は基材の外径よりもさらに大きな外径を有することで、広い剥離面が形成され、生体反応がより刺激を受けて、剥離面の修復治癒との共同作業が起こり、基材の内部での組織の形成が促進され、特に基材接触面において緻密コラーゲン層が形成される。

　　（工程２）
　工程１が終了した後、次に、生体内の結合組織体形成基材１０が配置された空間２２から空気を抜く。空気の抜く方法は、生体外より経皮的かつ経管的に抜く限り特に限定されないが、例えば、生体外からシリンジの先端を空間２２まで差し込んで、空気を抜くとよい。真空度は０．１から０．５ａｔｍの範囲であることが望ましい。単に皮膚の上から押し付けても基材と皮下組織が密着して皮膚の細胞が基材表面に近づくだけであるが、基材の内部をさらに真空にすることで、皮膚の細胞が基材の内部に吸い寄せられ、基材内部での組織の形成が促進され、特に基材接触面において緻密コラーゲン層が形成される。

　　（工程３）
　工程２において、空気を抜いた後、結合組織体形成基材１０が生体内に配置された状態で、所定期間放置する。放置する期間は、生体の種類に応じて異なるが、組織形成される２０日以上であれば長期間放置しても良く、形成される組織の形状に変化はほとんど無い。例えば２０～９０日、好ましくは３０～６０日である。所定期間放置することで、結合組織体形成基材１０の組織形成空間に結合組織体が形成される。

　本製造方法においては、工程２において空間２２の空気を抜くことで、生体内の組織が結合組織体形成基材１０の外周面に密着される。そのため、結合組織及び生体組織材料が組織形成空間に集積しやすくなり、また、組織形成面の少なくとも一部が高分子材料で構成されることも相俟って、その高分子材料によって構成された組織形成面の上に、結合組織及び生体組織材料が密に集積する。したがって、本製造方法では、高分子材料によって構成された組織形成面の上に上記した緻密表面層が形成される。

　また、高分子材料によって構成された組織形成面の上に形成された結合組織体は、その最表面において扁平状コラーゲンが平滑に配置されやすくなる。さらには、その緻密表面層の最表面以外の部分、及びそのさらに内側では、結合組織が適度に集積して、繊維状コラーゲンが交差するように網目状に配置されやすくなり、上記した積層構造が積み重なった構造を形成しやすくなる。

　　（工程４）
　工程４では、工程３にて結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、生体から取り出す。具体的には、生体表面のうち、生体内に埋入した結合組織体形成基材が位置する部位に取出口を形成し、その取出口を介して結合組織体形成基材を取り出すとよい。

　例えば、結合組織体形成基材が図示しないねじ部（例えば雄ねじ）からなる被着部を有する場合、基材取出具の先端に設けられたねじ部（例えば雌ねじ）に、被着部を螺着させることで、基材取出具の先端に結合組織体形成基材を取り付けて、結合組織体形成基材を生体内から取り出すとよい。

　あるいは、結合組織体形成基材の端部を鉗子などで挟み固定することで、結合組織体形成基材を生体内から取り出すことでもよい。
　　（工程５）
　その後、必要であれば結合組織体形成基材を破壊したうえで、組織形成空間に形成された結合組織体を組織形成面から剥離して取り出すことにより、結合組織体が得られる。ここで、結合組織体形成基材が図６に示すように、スリットからなる孔１７が設けられたカバー部材１１と、芯材１２とを備える場合、結合組織体は図１４に示すように、管状の結合組織体３０となる。また、結合組織体３０の外周面３０Ａには、スリットに対応して複数の突条３１が設けられるとともに、結合組織体３０の内周面３０Ｂには緻密表面層が形成される。

　なお、得られた結合組織体を異種移植する場合には、移植後の拒絶反応を防ぐため、脱細胞処理、脱水処理、固定処理などの免疫源除去処理を施すのが好ましい。
　なお、上記で説明した製造方法は、一例であり上記方法には限定されない。例えば、結合組織体形成基材を生体内に配置させる方法を、図面を参照して具体的に説明したが、その具体例に限定されるわけではない。

　また、上記では、結合組織体を生体内で製造する方法を示したが、結合組織体は、生体内で製造する方法に限定されない。例えば、生体内と同一又は近似する環境下において結合組織体を製造してもよい。

　この場合、結合組織体形成基材を、生体組織材料の存在する環境下に適宜配置して、上記と同様に組織形成空間に結合組織体を形成すればよい。ただし、組織形成空間を区画する組織形成面の一部を高分子材料で構成する。また、生体組織などを結合組織体形成基材の外周面に密着させたりして、高分子材料で構成される組織形成面上に緻密表面層を形成しやすくするとよい。

　本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。なお、以下の説明において特に断りがない限り、「％」は「質量％」を意味する。

　以下、表面層の緻密度の測定方法を具体的に説明する。
　　［緻密度の測定］
　（切片作製）
　各実施例、比較例で得られた結合組織体を以下の１）～７）の手順でパラフィン包埋ブロックを作製した。

　１）結合組織体を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液に２４時間浸漬させた。
　２）結合組織体を取り出し、７０％エタノールに浸漬させた。
　３）結合組織体を９９．５％エタノールに３０分浸漬して取り出す操作を５回行った。

　４）結合組織体を１００％エタノールに３０分浸漬した。
　５）結合組織体をキシレンに３０分間浸漬して取り出す操作を２回行った。
　６）結合組織体を６０℃で溶解したパラフィンに３０分浸漬して取り出す操作を４回行った。

　７）包埋用の型にブロックを入れ、パラフィンを流し込み、固化させることでブロックを作製した。
　パラフィン包埋ブロックを厚さ３μｍにスライスし、切片を作製した。結合組織体は、厚さ方向に沿ってスライスした。次に、切片の脱パラフィン処理を行った。脱パラフィン処理は、キシレンに２回、１００％エタノールに２回、７０％エタノールに１回、蒸留水に１回の順に、切片を各１０分ずつ浸漬させて行った。

　（マッソン・トリクローム染色）
　次に、以下の１）～２１）の手順でマッソン・トリクローム染色処理を行った。
　１）切片を媒染液（武藤化学株式会社製、品番「４００６１」）に３０分浸漬した。

　２）切片を媒染剤から取り出して流水で洗浄した。
　３）切片を鉄ヘマトキシリン溶液（ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液１（武藤化学株式会社製、品番「４０３４１」））とワイゲルト鉄ヘマトキシリン溶液２（武藤化学株式会社製、品番「４０３５１」）の等量混合溶液に１０分浸漬した。

　４）切片を混合溶液から取り出して流水で洗浄した。
　５）切片を１％塩酸アルコール中で数秒程度上下に５回程度振盪させることで洗浄した。なお、１％塩酸アルコールは、塩酸を１％の濃度になるように７０％エタノールで希釈したものである。

　６）色出しのため、切片を１０分間流水で洗浄した。
　７）第二媒染剤（武藤化学株式会社製、品番「８１４１１」）に３０秒浸漬した。
　８）切片を第二媒染剤から取り出し１分間流水で洗浄した。

　９）１％酢酸水中で数秒程度上下に５回程度振盪させた。
　１０）０．７５％オレンジＧ（武藤化学株式会社製、品番「４０２３１」）に１分間浸漬した。

　１１）切片をオレンジＧから取り出し、１％酢酸水中で数秒程度上下に５回程度振盪させて洗浄した。
　１２）マッソン染色液Ｂ（武藤化学株式会社製、品番「４０２５１」）に２０分浸漬した。

　１３）１％酢酸水中で数秒程度上下に５回程度振盪させて洗浄した。
　１４）２．５％リンタングステン酸液（武藤化学株式会社製、品番「４０１８１」）に３０分浸漬した。

　１５）リンタングステン酸液から取り出した後、１％酢酸水中で数秒程度上下に5回程度振盪させて洗浄した。
　１６）アニリン青液（武藤化学株式会社製、品番「４０２０１」）に３０分浸漬した。

　１７）アニリン青液から取り出した後、１％酢酸中で数秒程度上下に５回程度振盪させて洗浄した。
　１８）１００％エタノール中で数秒程度上下に１０回程度振盪させて洗浄した。

　１９）切片を脱水するため、１００％エタノールに５分間浸漬した。
　２０）切片をキシレンに５分間浸漬した後、キシレンから取り出した。この操作は３回繰り返した。

　２１）切片に封入剤（Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｒ）　ｎｅｗ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１．０７９６１．０１００、メルク社製）を滴下し、カバーガラスをのせて、封入剤がガラス上に固化することで封入した。

　（画像観察）
　上記のように封入剤で封止した切片に、顕微鏡（ニコン社製、商品名「ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｅ１０００」）付属の透過ケーラー照明にて、５００ｌｘの照度で照射し、観察倍率１０倍で観察し、３０枚の画像を撮影した。

　各画像に対しては、次の１）～８）の手順で画像解析処理を行い、組織緻密度比を算出した。
　１）ＨＳＶ空間のＨフィルタによって、青色部（コラーゲン部）を抽出した。

　２）グレースケール変換で輝度値を算出した（２５６階調）。図２２には、後述する実施例１における、輝度値によるヒストグラムが輝度ヒストグラムとして示される。
　３）ヒストグラム均一化関数により、ヒストグラム均一化処理を行い、輝度値を強調処理しながら分布させ、正規化強度ヒストグラム（図２２参照）を得た。また、輝度値を反転処理して、輝度が最も高い部分（すなわち、染色が最も薄い部分）を０、輝度が最も低い部分（すなわち、染色が最も濃い部分）を１とした。

　４）結合組織体の厚さ方向に沿う任意の直線Ｌ（図１６参照）上の輝度データを取得した。
　５）３０点移動平均ゼロ位相フィルタにてフィルタリングした。

　６）取得した輝度データの全体平均値を求め、その全体平均値を閾値とした。そして、結合組織体の一方の表面における直線Ｌ上の輝度データ（すなわち、直線Ｌの端部上の輝度データ）が閾値以上か否かを求め、閾値以上のデータならば、その直線Ｌの端部から他方の端部側に移動していき、閾値以上のデータ部分を「閾値以上部分」とし、その「閾値以上部分」を「表面層」とした。その後、同様に他方の端部側に移動していき、データが閾値未満となり、かつその閾値未満のデータ部分を「閾値未満部分」とし、その「閾値未満部分」を「表面層以外の部分」とした。

　また、結合組織体の一方の表面における直線Ｌ上の輝度データ（すなわち、直線Ｌの端部上の輝度データ）が閾値未満ならば、その直線Ｌの端部から他方の端部側に移動していき、閾値未満のデータ部分を「閾値未満部分」とし、その「閾値未満部分」を「表面層」とした。その後、同様に他方の端部側に移動していき、データが閾値以上となり、その「閾値以上」のデータ部分を「閾値以上部分」とし、その「閾値以上部分」を「表面層以外の部分」とした。

　７）次に、直線Ｌにおいて、「表面層」と認定された部分における輝度データの平均値（Ｙ１）と、「表面層以外の部分」と認定された部分における輝度データの平均値（Ｙ２）を求め、Ｙ１／Ｙ２を、一方の表面における表面層の組織緻密度比とした。

　８）残りの２９枚の画像についても、結合組織体の一方の表面における表面層について同様に組織緻密度比を算出し、３０枚の画像で求めた組織緻密度比の平均値を一方の表面における表面層の「組織緻密度比」とする。

　さらに、必要に応じて、他方の表面における表面層についても、同様に組織緻密度比を算出してもよい。
　　［実施例１］
　まず、図６に示す、筒状のカバー部材１１と、芯材１２とを備える結合組織体形成基材１０を用意した。芯材１２は、内部にアクリル棒が埋められたステンレス鋼管からなる中心材１２Ｂと、シリコーン樹脂からなるカバーチューブ１２Ｃを備えるものであった。芯材１２は、外径が１６ｍｍであった。カバー部材１１は、外径１９ｍｍ、内径１８ｍｍであり、１．５×１５ｍｍのスリットが、軸方向に４個、周方向に１１個形成されており、ステンレス鋼製であった。したがって、芯材１２により構成される組織形成面がシリコーン樹脂、カバー部材１１により構成される組織形成面がステンレス鋼であった。

　次に、麻酔下で生後１２ヶ月、体重８.５ｋｇのビーグル犬の背部皮膚に切開術を行い、生体表面に挿入口を形成し、挿入口から皮下組織をハサミなどで切開剥離し、結合組織体形成基材１０が収まる程度の大きさの皮下ポケットを作成した。挿入口から、結合組織体形成基材１０を手で押し込み、結合組織体形成基材１０を埋入し、埋入後、挿入口を縫合した。その後、皮膚から基材上にシリンジの針を差し込み、結合組織体形成基材１０が埋入された周囲から空気を抜き取った。

　次いで、ビーグル犬を通常の飼育環境下で６０日間飼育した後、再び切開術を行い、生体表面に取出口を設けて、生体内から、結合組織体が形成された結合組織体形成基材１０を取り出した。その後、結合組織体形成基材１０から結合組織体を抜き取ることで、図１４に示すような筒状の結合組織体３０を得た。結合組織体形成基材１０から抜き取る前の結合組織体３０の内周面は、結合組織体形成基材１０の芯材１２の組織形成面（シリコーン樹脂）に接触または対面する。結合組織体形成基材１０から抜き取る前の結合組織体３０の外周面は、結合組織体形成基材１０のカバー部材１１の組織形成面（ステンレス鋼）に接触または対面する。

　得られた結合組織体３０を切断して切断面を電子顕微鏡で観察した写真を図１５に示す。図１５においては、上方が内周面側である。また、得られた結合組織体３０を上記方法に従って、切片を作製して、マッソン・トリクローム染色した切片の切断面を顕微鏡で観察した写真を図１６～１８に示す。図１７は、結合組織体３０の内周面付近の部分を拡大したものである。図１８は、結合組織体３０の厚さ方向の中央部分を拡大したものである。

　図１６、１７に示すように、筒状の結合組織体の内周面側においては、空隙が少なく結合組織が密となり、緻密表面層を形成していることが理解できる。
　それに対して、図１６、１８に示すように、緻密表面層以外の部分（例えば、厚さ方向における中央部分）は空隙が多くなり、結合組織体の内部では、表面層に比べて緻密度が低くなることが理解できる。

　また、明細書記載の方法にしたがって、一方の表面（内周面）における表面層の緻密度を測定した。その結果は、以下の表１に示すとおり、組織緻密度が１．５６となった。他方の表面（外周面）における表面層の組織緻密度は１．４８であった。

　また、結合組織体の内周面を電子顕微鏡で観察した写真を図１９に示す。さらに、結合組織体の内周面を層状に剥がして、内周面以外の緻密表面層の表面状態を電子顕微鏡で観察した写真を図２０に、さらに剥がして緻密表面層以外の状態を電子顕微鏡で観察した写真を図２１に示す。

　図１９に示すように、緻密表面層の表面は、コラーゲンが扁平状に平滑に覆っており、また、コラーゲンが一方向に配向せずにランダムに配向していることが理解できる。一方で、緻密表面層の表面以外の部分は、図２０に示すように、繊維状コラーゲンが束状に纏まって概ね一方向に配向していることが理解できる。また、図１５、２０の写真から明らかなように、束状に纏まって一方向に配向する繊維状コラーゲンが、多層状に設けられていることが理解できる。さらに、図１５の写真では粒状の点が横方向に連なるように配置されることから明らかなように、一方向に配向する繊維状コラーゲンの束から形成された層は、繊維状コラーゲンが別の層の繊維状コラーゲンに対して、直交していることが理解でき、繊維状コラーゲンが網目状に配置されることが理解できる。この網目状の配置は、内部まで続き、図２１に示すように緻密度が低い結合組織体の内部でも見られた。

　さらに、図２０に示すように、緻密表面層ではコラーゲンの密度が高く、コラーゲンの繊維が太くなる一方で、図２１に示すように、緻密表面層以外の部分では、繊維状コラーゲンの束は、緻密表面層におけるコラーゲンの束よりも細くなっていた。

　実施例１で得られた結合組織体を犬の全血に浸漬させ、１、３、５分後に取り出して生理食塩水で洗浄を行った後に写真撮影をして観察したところ、図２３に示すように、いずれも血液凝固はほぼなく、血栓が形成されなかった。

　一方で、実施例１で得られた結合組織体の緻密表面層を剥離させ、緻密表面層の表面以外の部分を露出させ、犬の全血に浸漬させ、１、３、５分後に取り出して生理食塩水で洗浄を行った後に写真撮影をして観察したところ、図２３に示すように、１分で表面の一部で血栓が付着し、５分で全面に血栓形成が起こった。なお、緻密表面層は、図２４に示すように、ピンセットで容易に層状に剥離でき、壁乖離構造を有していた。

　さらに、緻密表面層を剥離させて重量（B（g））を測定した。これを、１２時間、２５℃で真空乾燥させて重量（Ａ（ｇ））を測定した。重量変化から、緻密表面層の含水率（（Ｂ－Ａ）／Ａ×１００）を求めると、平均５６％であった。一方、緻密表面層以外の部分で同様に含水率を求めると、平均７３％であった。緻密表面層はそれ以外の部分に比べて水分を吸収し難いことを示した。

　　［実施例２］
　図１０に示す、筒状のカバー部材５１と、４本の芯材５２とを備える結合組織体形成基材５０を用意した。芯材５２は、シリコーン樹脂チューブで皮膜したステンレス鋼の丸棒であり、シリコーン樹脂チューブの内径は１ｍｍ、外径は２ｍｍであり、ステンレス鋼丸棒の外径は１ｍｍであった。カバー部材５１は、外径１０ｍｍ、内径８ｍｍであり、１.５ｍｍの丸孔が約２０％の開口率（カバー部材の組織形成面に対するスリットの面積比）になるように千鳥状配置で均等に形成されており、ステンレス鋼製であった。４本の芯材５２はカバー部材５１の内部にほぼ均等になるように配置させた。したがって、芯材により構成される組織形成面がシリコーン樹脂、カバー部材により構成される組織形成面がステンレス鋼であった。

　次に、麻酔下で生後３ヶ月、体重４０ｋｇの家畜ブタの腹部皮膚に切開術を行い、生体表面に挿入口を形成し、挿入口から皮下組織をハサミなどで切開剥離し、結合組織体形成基材５０が収まる程度の大きさの皮下ポケットを作成した。挿入口から、結合組織体形成基材５０を手で押し込み、結合組織体形成基材５０を埋入し、埋入後、挿入口を縫合した。その後、皮膚から基材上にシリンジの針を差し込み、結合組織体形成基材５０が埋入された周囲から空気を抜き取った。

　次いで、ブタを通常の飼育環境下で６０日間飼育した後、再び切開術を行い、生体表面に取出口を設けて、生体内から、結合組織体が形成された結合組織体形成基材５０を取り出した。その後、結合組織体形成基材５０から結合組織体を抜き取ることで、図３の断面構造を示す、内部に円柱状の空洞孔（中空部）を有する円柱状の結合組織体３０を得た。

　また、明細書記載の方法にしたがって、結合組織体３０の内部の中空部の周囲（内周面）ならびに外周面における表面層の緻密度を測定した。その結果は、内部の空洞の周囲の緻密度は１．４となり、外周面の緻密度は１．２となった。

　　［実施例３］
　図１２に示すように、円柱状の芯材６２の外周に異種部材３７としてステントを装着させた結合組織体形成基材６０を用意した。芯材６２は、ナイロン樹脂の丸棒であり、外径は１５ｍｍであった。ステントは内径１６ｍｍに拡張させたバルーン拡張型のコバルトクローム合金製であった。したがって、芯材６２により構成される組織形成面がナイロン樹脂、異種部材３７により構成される組織形成面がコバルトクローム合金であった。

　次に、麻酔下で生後１０ヶ月、体重３５ｋｇのヤギの背部皮膚に切開術を行い、生体表面に挿入口を形成し、挿入口から皮下組織をハサミなどで切開剥離し、結合組織体形成基材が収まる程度の大きさの皮下ポケットを作成した。挿入口から、結合組織体形成基材を手で押し込み、結合組織体形成基材を埋入し、埋入後、挿入口を縫合した。その後、皮膚から基材上にシリンジの針を差し込み、結合組織体形成基材１０が埋入された周囲から空気を抜き取った。

　次いで、ヤギを通常の飼育環境下で３０日間飼育した後、再び切開術を行い、生体表面に取出口を設けて、生体内から、結合組織体が形成された結合組織体形成基材を取り出した。その後、結合組織体形成基材から結合組織体を抜き取ることで、図４の断面構造を示す、内部に円柱状の空洞孔（中空部）を有する円柱状の結合組織体３０を得た。

　また、明細書記載の方法にしたがって、結合組織体３０の一方の表面（内周面）における表面層ならびに内部のステント周囲における表面層の緻密度を測定した。その結果は、結合組織体３０の内周面の組織緻密度が１．２、ステント周囲の表面層の組織緻密度が１．１となった。

　　［実施例４］
　図１１に示す、筒状のカバー部材１１と、芯材１２とを備える結合組織体形成基材１０を用意し、カバー部材１１と芯材１２との間の隙間に異種部材３７としてのステントを配置した。芯材１２は、ＰＥＥＫ樹脂からなる中心材１２Ｂと、シリコーン樹脂からなるカバーチューブ１２Ｃを備えるものであった。芯材１２は、外径が２０ｍｍであった。カバー部材１１は、外径２５ｍｍ、内径２３ｍｍであり、２ｍｍ×２０ｍｍのスリットが形成されており、ステンレス鋼製であった。ステントはニッケルチタン合金製であり、内径は２２ｍｍであった。したがって、芯材により構成される組織形成面がＰＥＥＫ樹脂、カバー部材により構成される組織形成面がステンレス鋼であり、ステントにより構成される組織形成面がニッケルチタンであった。

　次に、麻酔下で生後１２ヶ月、体重４３ｋｇのヤギの背部皮膚に切開術を行い、生体表面に挿入口を形成し、挿入口から皮下組織をハサミなどで切開剥離し、結合組織体形成基材１０が収まる程度の大きさの皮下ポケットを作成した。挿入口から、結合組織体形成基材１０を手で押し込み、結合組織体形成基材１０を埋入し、埋入後、挿入口を縫合した。その後、皮膚から基材上にシリンジの針を差し込み、結合組織体形成基材１０が埋入された周囲から空気を抜き取った。

　次いで、ビーグル犬を通常の飼育環境下で６０日間飼育した後、再び切開術を行い、生体表面に取出口を設けて、生体内から、結合組織体が形成された結合組織体形成基材１０を取り出した。その後、結合組織体形成基材１０から結合組織体を抜き取ることで、図５に示すような断面構造を有する筒状の結合組織体３０を得た。

　また、明細書記載の方法にしたがって、結合組織体３０の一方の表面（内周面）における表面層、他方の表面（外周面）における表面層、ならびに内部のステント周囲における表面層の緻密度を測定した。その結果は、結合組織体３０の内周面の組織緻密度が１．３、結合組織体３０の外周面の組織緻密度が１．２、ステント周囲の表面層の組織緻密度が１．１となった。

　　［比較例１］
　生体内からシリンジにより空気を抜き取る作業を行わない以外は、実施例１と同様に実施した。比較例１では、図２５に示すように、血液凝固塊（左側の上方部分）が形成されており、結合組織体の形成が不十分であり、緻密表面層も形成されておらず、図２６に示すように、液凝集塊が白いコラーゲン表面層の一部で赤く形成された。また、強度が不足し、表面に亀裂（図２６の中央部分）を有していた。比較例１の内周面側の表面を、犬の全血に浸漬させ、１、３、５分後に取り出して生理食塩水で洗浄を行った後に写真撮影をして観察したところ、図２７に示すように、１分で全面に血栓が形成された。

　・本開示において、空気の抜き取り（工程２）は、生体内の結合組織体形成基材１０の組織形成面と生体細胞との接触の促進または接触性の向上に有利である。空気の抜き取りは、生体内の結合組織体形成基材１０に対するカプセル化反応を促進させるのに有利であり、例えば、カプセル化反応の開始を促進させるのに有利である。生体内の結合組織体形成基材１０の組織形成面からカプセル化反応による結合組織体３０の形成が開始される。

　・本開示において、結合組織体３０の形成または成長が進行する期間（工程３）の初期期間における結合組織体３０の形成速度（成長速度）は、結合組織体３０において組織体形成基材１０の組織形成面に接触または対面する表面を含む表面層の緻密度（及び微視的構造）に影響する一要因である。本開示において例示した高分子材料（または高分子材料と金属材料との組み合わせ）は、結合組織体の形成または成長が進行する期間（工程３）の初期期間における結合組織体の形成速度（成長速度）を意図的にまたは制御的に低下させるのに有利である。本開示において例示した高分子材料（または高分子材料と金属材料との組み合わせ）を結合組織体形成基材１０の組織形成面に採用することは、結合組織体３０に、比較的高く調整された緻密度を有する緻密表面層を持たせるのに有利である。なお、結合組織体の形成が進行するのに伴い、結合組織体の形成速度は組織形成面の材料によって影響を受けにくくなることがある。一つまたは複数の組織形成面の材料選択は、結合組織体において緻密表面層を比較的密にしつつ、緻密表面層以外の部分を比較的疎にするのに貢献し、また、緻密表面層と緻密表面層以外の部分との微視的構造を異ならせるのにも貢献する。いくつかの例では、緻密表面層と緻密表面層以外の部分との間の緻密度の違い、及び緻密表面層と緻密表面層以外の部分との間の微視的構造の連続的な変化であり得る微視的構造の違いは、上述した壁乖離構造として作用的に観測でき、例えば鮮明なまたはぼやけた層境界として顕微鏡的に視認できる。

　・結合組織体３０のうち緻密表面層よりも疎である表面層以外の部分は、結合組織体の非表面層部分、本体部分、またはベース部分と呼称することがある。結合組織体３０の緻密表面層を形成するコラーゲンを第１の繊維状コラーゲンと呼称し、結合組織体３０の非表面層部分を形成するコラーゲンを第２の繊維状コラーゲンと呼称することがある。結合組織体３０の緻密表面層の第１の繊維状コラーゲンの構造及び緻密度を、第１の微視的構造及び第１の緻密度とそれぞれ呼称することがある。結合組織体３０の非表面層部分の第２の繊維状コラーゲン構造及び緻密度を、第２の微視的構造及び第２の緻密度とそれぞれ呼称することがある。第１の繊維状コラーゲンの構造及び緻密度は、緻密表面層に、第１の血液染み込みにくさを与え、第２の繊維状コラーゲンの構造及び緻密度は、非表面層部分に、第２の血液染み込みにくさを与え、緻密表面層が有する第１の血液染み込みにくさは、非表面層部分が有する第２の血液染み込みにくさよりも高い。本開示の壁乖離構造は、表面層の第１の繊維状コラーゲンと非表面層部分２の繊維状コラーゲンとによって形成される生体由来ピーラブル境界と呼称することがある。本開示の結合組織体３０は、生体由来コラーゲンを備えるインプランタプル製品と呼称することがある。本開示の結合組織体３０は、再生医療用人工臓器自体またはその一部であってよい。

　１０　結合組織体形成基材
　１１　カバー部材
　１２　芯材
　１１Ａ，１２Ａ　組織形成面
　１３　組織形成空間
　１４、１５　蓋体
　１７　孔
　３０　結合組織体
　３０Ａ　外周面
　３０Ｂ　内周面
　３２　緻密表面層
　３５　中空部
　３７　異種部材

Claims

　コラーゲンを含む生体由来組織からなる結合組織体であって、
　結合組織体のいずれかの表面を構成する表面層が、該表面層以外の部分よりも、組織が緻密に形成される緻密表面層を備える結合組織体。
　前記コラーゲンが繊維状コラーゲンを含む請求項１に記載の結合組織体。
　前記繊維状コラーゲンが前記緻密表面層の表面において扁平状で平滑である請求項２に記載の結合組織体。
　前記繊維状コラーゲンが、前記緻密表面層の表面以外の部分において交差するよう網目状に配置される請求項２又は３に記載の結合組織体。
　厚さ方向に沿って算出した、前記表面層以外の部分の組織緻密度に対する、前記表面層の組織緻密度の比が１．１以上である請求項１～４のいずれか１項に記載の結合組織体。
　内部に異種部材が埋められる請求項１～５のいずれか１項に記載の結合組織体。
　前記異種部材の周囲に前記緻密表面層が形成される請求項６に記載の結合組織体。
　前記結合組織体がカプセル化反応により形成される請求項１～７のいずれか１項に記載の結合組織体。
　コラーゲンを含む生体由来組織からなる結合組織体の製造方法であって、
　組織形成面を有し、かつ前記組織形成面の少なくとも一部が高分子材料から構成される結合組織体形成基材を、生体内に配置する工程と、
　生体内の前記結合組織体形成基材が配置された空間から、生体外より経皮的かつ経管的に空気を抜く工程と、
　前記組織形成面上に、結合組織体を形成させる工程と、
　前記結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、生体内から取り出す工程と、
　前記結合組織体を前記結合組織体形成基材から剥離させる工程と、
　を備える結合組織体の製造方法。
　生体組織材料が存在する環境と結合組織体を形成するための空間とを区切る組織形成面を備えた組織体形成基材であって、前記空間と前記環境とを連通させて前記空間に結合組織を侵入させる孔を備えた前記組織体形成基材を人体以外の生体内の前記環境に配置し、前記組織体形成基材が配置された空間から前記生体外より空気を抜いて形成される結合組織体であって、
　前記組織形成面は、高分子材料または金属材料から構成され、
　前記結合組織体は、コラーゲンを含む生体由来組織からなり、生体内の組織に使用され、
　前記結合組織体のなかで前記組織形成面と接する表面を構成する表面層の全体が、該表面層以外の部分よりも、組織が緻密に形成される緻密表面層であり、
　前記緻密表面層について、厚さ方向に沿って算出した、前記表面層以外の部分の組織緻密度に対する、前記表面層の組織緻密度の比が１．１以上である
　結合組織体。
　コラーゲンを含む生体由来組織からなり、生体内の組織に使用される結合組織体の製造方法であって、
　組織形成面を有し、かつ前記組織形成面の少なくとも一部が高分子材料から構成される結合組織体形成基材を、人体以外の生体内に配置する工程と、
　前記生体内の前記結合組織体形成基材が配置された空間から、前記生体外より経皮的かつ経管的に空気を抜く工程と、
　前記組織形成面上に、結合組織体を形成させる工程と、
　前記結合組織体が形成された結合組織体形成基材を、前記生体内から取り出す工程と、
　前記結合組織体を前記結合組織体形成基材から剥離させる工程と、
　を備える結合組織体の製造方法。
　前記結合組織体がカプセル化反応により形成される請求項１１に記載の結合組織体の製造方法。
　再生医療用の結合組織体であって、
　生体由来の第１の繊維状コラーゲンを備える表面層と、
　生体由来の第２の繊維状コラーゲンを備える非表面層部分とを備え、
　前記表面層の前記第１の繊維状コラーゲンは、第１の微視的構造と第１の緻密度とを有しており、
　前記非表面層部分の前記第２の繊維状コラーゲンは、前記第１の微視的構造とは異なる第２の微視的構造と、前記第１の緻密度よりも小さい第２の緻密度とを有しており、
　前記表面層と前記非表面層部分とは、前記第１の繊維状コラーゲンの前記第１の緻密度と前記第２の繊維状コラーゲンの前記第２の緻密度との違い、及び、前記第１の繊維状コラーゲンの前記第１の微視的構造と前記第２の繊維状コラーゲンの前記第２の微視的構造との違いに由来する壁乖離構造を形成する、
結合組織体。
　前記表面層と前記非表面層部分とは、
　前記第１の緻密度と前記第２の緻密度との違い、及び、前記第１の微視的構造と前記第２の微視的構造との違いのみによる層境界を形成する、
請求項１３に記載の結合組織体。
　前記第１の微視的構造及び前記第１の緻密度は、前記表面層に、第１の血液染み込みにくさを与え、
　前記第２の微視的構造及び前記第２の緻密度は、前記非表面層部分に、第２の血液染み込みにくさを与え、
　前記表面層の前記第１の血液染み込みにくさは、前記非表面層部分の前記第２の血液染み込みにくさよりも高い、請求項１３に記載の結合組織体。