JP6502376B2 - 脱細胞化された胸膜マトリックス - Google Patents
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Description
ブタの胸膜(5匹のブタ由来の約10の胸膜組織)を、特異的病原体を含まない農場を含む様々な動物源から得た。調達した胸膜は、ブタから採取したものであり、機械的に清浄して接着性の脂肪組織を除去し、リン酸緩衝食塩水(PBS)中ですすぎ、次いで、翌日配達によって氷上に置いて出荷した。組織を機械的に清浄する方法は、当業者に知られている。試料調製に使用した1つの方法は、接着性の組織を除去するための鈍いスクレーパであった。胸膜を受け取った後、試料を、0.1パーセントのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有するPBS中で3回すすぎ、次いで、処理するまで摂氏−20度で凍結貯蔵した。胸膜組織は、市販の組織源、Lafayette、INのTissue Source及びWarren、NJのFarm to Pharmから得た。Tissue Sourceからの胸膜組織は、認定された病原体を含まないブタ由来のものであった。
ブタの胸膜及び腹膜組織を、同じ動物源から得た。調達した胸膜及び腹膜を機械的に清浄して、接着性の脂肪組織を除去した。各試料のうちの1つを、0.1パーセントのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有するPBS中で3回すすぎ、次いで、処理するまで摂氏−20度で凍結貯蔵した。試料を解凍し、約1cm×1cmの断片を組織像用に固定した。図2及び図3は、胸膜組織と腹膜組織との間の厚さ、コラーゲン及びエラスチン量、並びに分布の差異を例示する。図2a、2b、及び2cは、胸膜組織を例示し、図3a、3b、及び3cは、腹膜組織を例示する。図2aは、ヘマトキシリンエオシンで染色された胸膜の断面であり、胸膜の厚さを示す。図2b及び2cは、トリクロームで染色された胸膜の断面であり、コラーゲン及びエラスチンの分布を示す。コラーゲンは、青色で示され、エラスチンは、茶色で示される。図3aは、ヘマトキシリンエオシンで染色された腹膜の断面であり、腹膜の厚さを示す。図3b及び3cは、トリクローム染色で染色された腹膜であり、コラーゲン及びエラスチンの分布を示す。コラーゲンは、青色で示され、エラスチンは、茶色で示される。
胸膜は、その構造の性質により、2つの異なる表面、すなわち、漿膜の滑らかな側面及び基底膜(BM)の粗い側面といった側面性を有する。漿膜及び基底膜型構築物の本発明の多層胸膜バイオマトリックスを、漿膜表面を下にして無菌のテフロンシートに向けて、基底膜側を上に向けた状態で、胸膜の第1の層を配置することによって、実施例1に記載される胸膜組織から構築し、第2の胸膜層を、基底膜側を第1の層のBM側を覆った状態でその上に置いた。第3の層を、漿膜側が第2の層の漿膜側を覆うように配置した。第4の層を、漿膜層が第3の層のBM側を覆うように配置し、その結果、片側が漿膜であり、反対側が基底膜である4層構築物がもたらされ、それにより二峰性表面構築物、すなわち、構築物の片側がBMに露出し、もう一方が膜側に露出した構築物がもたらされる。第2の無菌テフロンシートを、構築物を覆うように配置した。次いで、全構築物を2つの無菌紙タオルの間に、かつ2つのステンレス鋼プラテンの間に配置した。次いで、構築物を、室温で6時間、真空(75キロパスカル(22インチ水銀柱))下で、同時に加圧(88964N(20000ポンド))した状態で積層した。
上の実施例3に記載される構築物を、真空下で凍結乾燥機内に配置し、凍結乾燥した。積層胸膜構築物を、以下のプログラムによって乾燥させた:凍結乾燥棚の温度を摂氏マイナス40度まで高め、真空を500mTに設定して、60分間保持した。次いで、棚温度を摂氏マイナス25度まで高め、真空を100mTに設定して、4時間保持した。次いで、温度を摂氏マイナス20度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、9時間保持した。次いで、温度を摂氏マイナス10度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、4時間保持した。次いで、温度を摂氏マイナス5度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、2時間保持した。次いで、温度を摂氏0度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、90分間保持した。次いで、温度を摂氏10度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、90分間保持した。次いで、温度を摂氏20度の棚温度まで高め、真空を50mTに設定して、60分間保持した。
SEMを積層及び凍結乾燥された胸膜構築物の試料に行って、マトリックスの側面性を確認し、マトリックスへの積層及び凍結乾燥の影響を評価した。試料をSEMによって分析した。比較のために市販の小腸粘膜下組織(SIS)の10層積層体及びブタ真皮も含めた。
本発明の積層及び凍結乾燥された胸膜構築物を、10パーセントの中性緩衝ホルマリン中に24時間固定し、すすぎ、組織学的評価のために、無菌PBS(リン酸塩緩衝食塩水)中で輸送した。試料を、当技術分野で知られているように、パラフィン包埋し、処理し、次いで、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)、マッソントリクローム、Verhoeffs Van Gieson(EVG)、並びにアルシアンブルー染色で染色した。図6を参照すると、H&E及びマッソントリクロームで染色されたものは、処理したマトリックスのいずれの領域内でもいかなる細胞又は細胞断片も視認することができなかったので、脱細胞化プロトコルの効果が確認された。更に、ECMの全構造が、処理の後に良好に保存されているように見えた。EVGで染色されたものは、マトリックスの固有の特性を与えるエラスチンの保存が確認された。加えて、穏やかな処理の性質が、プロテオグリカンのアルシアンブルー染色の保持から明らかになった。
積層及び凍結乾燥された胸膜構築物を、特定の用途のために更に処理することができる。胸膜のマトリックスを、流体の輸送を可能にするために、多孔性にすることができる。細孔のサイズ、形状、組織、及び密度は変動し得、機械的手段又は制御されたレーザー微細加工を使用して作製することができる。細孔を凍結乾燥されていない積層体に作製し、後に凍結乾燥することもできる。
細胞の付着性及び増殖を支援する本発明の胸膜バイオマトリックスの機能を、細胞播種実験において評価した。細胞播種実験用の胸膜バイオマトリックスを調製するために、未処理の胸膜及び脱細胞化後の胸膜の両方の10mmの生検パンチを、20分間、抗生物質を含有するPBS中で、3回交換しながらすすいで、細胞培養のために清浄にした。
病原体を含まない農場由来の胸膜を使用して、本発明によって作製された胸膜マトリックス(実施例4)を、引張試験及び曲げ試験の両方で、それらの厚さ及び機械的強度について調査した。機械的試験の場合、インストロン5544(TJ−41)、445N(100ポンド荷重)細胞(LC−147)を使用して、4層積層マトリックスを試験した。実施例3に記載される漿膜及び基底膜型構築の本発明の多層胸膜バイオマトリックスで作製された6×1cmの長方形のマトリックスを、乾燥状態及び湿潤状態の両方の引張強度について試験した(GL=2cm、クロスヘッド速度=8cm/min)。少なくとも6つの試料を利用した。曲げ係数を3点曲げ試験によって決定した。試料を乾燥状態で評価した。縫合糸引き抜き試験も行った。結果は、胸膜マトリックスが、特定の用途に基づいて調整され得る良好な機械的特性を有することを実証した。
評価した材料。上で説明されるように、2つの異なる源から胸膜積層体を作製した。比較のために、同じ源から腹膜積層体を作製した。10層SISマトリックス及びブタ真皮マトリックスに対する比較も行った。厚さを、連邦政府の高さゲージを使用して、複数の部位で測定した。
(1) 脱細胞化された胸膜組織を含む、生物由来の細胞外マトリックス(ECM)。
(2) 前記ECMが、脱細胞化された胸膜組織の複数の層を含む、実施態様1に記載のECM。
(3) 前記ECMが、少なくとも8Nに前記層の数を乗じた破裂強度を有する、実施態様1に記載のECM。
(4) 前記ECMが、少なくとも2Nに前記層の数を乗じた引張強度を有する、実施態様1に記載のECM。
(5) 前記ECMが、0.105mmに前記層の数を乗じたものを超えない厚さを有する、実施態様1に記載のECM。
(7) 前記胸膜組織が、哺乳類起源のものである、実施態様1に記載のECM。
(8) 前記胸膜組織が、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、サル、ヤギ、ウマ、トリ、又はヒト由来である、実施態様7に記載のECM。
(9) 前記ECMが、シート、穿孔シート、積層シート、ストリップ、断片、コイル、シリンダ、織物、真空プレスされた材料、スポンジ、微粉化された粉末、ペースト、注射可能なゲル、噴霧剤、乳剤、又はコーティングとして構成されている、実施態様1に記載のECM。
(10) 前記ECMが、前記ECMの少なくとも1つの表面に堆積した微粉化されたECMを更に含み、前記微粉化されたECMが、前記脱細胞化された胸膜組織で作製された微小粒子を含む、実施態様1に記載のECM。
(12) 前記ECMが、神経組織、真皮組織、心血管組織、心膜組織、筋組織、膀胱組織、眼組織、歯周組織、骨、腱、靭帯、骨盤底組織、又は腹部組織を修復、再構築、封止、又は接合するために使用されるものである、実施態様1に記載のECM。
(13) 生物由来の細胞外マトリックス(ECM)を作製する方法であって、
胸膜組織を提供する工程と、
前記胸膜組織を脱細胞化する工程と、
前記胸膜組織を凍結乾燥する工程と、
前記凍結乾燥された胸膜組織からマトリックスを形成する工程と、を含む、方法。
(14) 生物由来の細胞外マトリックス(ECM)を作製する方法であって、
胸膜組織を提供する工程と、
前記胸膜組織を脱細胞化する工程と、
前記脱細胞化された胸膜組織の複数の胸膜組織層を形成する工程と、
前記複数の胸膜組織層を互いの上に積み重ねてスタックを形成する工程と、
前記スタックを真空下で圧縮する工程と、
前記圧縮されたスタックを凍結乾燥する工程と、を含む、方法。
(15) 前記複数の胸膜組織層を互いの上に積み重ねてスタックを形成する前記工程が、前記胸膜組織層の漿膜側を上に向け、前記胸膜組織層の基底側を下に向けた状態で行われる、実施態様14に記載の方法。
(17) 実施態様13に記載の方法に従って調製された脱細胞化された胸膜組織を含む、生物由来の細胞外マトリックス(ECM)。
Claims (13)
- 生物由来の細胞外マトリックス(ECM)を作製する方法であって、
胸膜組織を提供する工程と、
前記胸膜組織を脱細胞化する工程と、
前記脱細胞化された胸膜組織の複数の胸膜組織層を形成する工程と、
前記複数の胸膜組織層を互いの上に積み重ねてスタックを形成する工程と、
前記スタックを真空下で圧縮する工程と、
前記圧縮されたスタックを凍結乾燥する工程と、を含む、方法。 - 生物由来の細胞外マトリックス(ECM)の構築物を作製する方法であって、
胸膜組織を提供する工程と、
前記胸膜組織を脱細胞化する工程と、
前記脱細胞化された胸膜組織の複数の胸膜組織層を形成する工程であって、前記脱細胞化された胸膜組織の夫々が基底膜表面及び漿膜表面を有する、工程と、
複数の脱細胞化された前記胸膜組織層を互いの上に積み重ねて、多層のスタックを形成する工程と、
多層の前記スタックを真空下で圧縮する工程と、
圧縮された多層の前記スタックを凍結乾燥する工程と、
任意に、凍結乾燥された多層の前記スタックを再水和して、前記構築物を形成せしめる工程と、を含む、方法。 - 前記ECMが、少なくとも8Nに前記胸膜組織層の数を乗じた破裂強度を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、少なくとも2Nに前記胸膜組織層の数を乗じた引張強度を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、0.105mmに前記胸膜組織層の数を乗じたものを超えない厚さを有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、前記脱細胞化された胸膜組織の4つの層を含み、約363MPa以下の曲げ係数を特徴とする弾性を有し、前記曲げ係数が、3点曲げ試験によって測定されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記胸膜組織が、哺乳類起源のものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記胸膜組織が、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、サル、ヤギ、ウマ、トリ、又はヒト由来である、請求項7に記載の方法。
- 前記ECMが、シート、穿孔シート、積層シート、ストリップ、断片、コイル、シリンダ、織物、真空プレスされた材料、スポンジ、微粉化された粉末、ペースト、注射可能なゲル、噴霧剤、乳剤、又はコーティングとして構成されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、前記ECMの少なくとも1つの表面に堆積した微粉化されたECMと、前記微粉化されたECM上に膜とを更に含み、前記微粉化されたECMが、前記脱細胞化された胸膜組織で作製された微小粒子を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、生体吸収性ポリマーの少なくとも1つの層を更に含み、前記生体吸収性ポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、酸化セルロース、酸化再生セルロース、ラクチド含有コポリマー、グリコリド含有コポリマー、又はそれらの組み合わせである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ECMが、神経組織、真皮組織、心血管組織、心膜組織、筋組織、膀胱組織、眼組織、歯周組織、骨、腱、靭帯、骨盤底組織、又は腹部組織を修復、再構築、封止、又は接合するために使用されるものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記スタックを形成する工程が、前記胸膜組織層の漿膜側を上に向け、前記胸膜組織層の基底側を下に向けた状態で行われる、請求項1又は2に記載の方法。
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