WO2020083341A1 - 制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法和应用、制备果糖二磷酸钠注射液的方法 - Google Patents

制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法和应用、制备果糖二磷酸钠注射液的方法 Download PDF

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  • the filtrate flows through the regenerated 732 cation exchange resin to control the PH value at about 1-2.
  • the effluent is diluted with deionized water and enters the 717 anion exchange resin for adsorption. Alkaline washing solution is used to clean the surface of the resin, and then the FDP on the resin is eluted with 10% sodium chloride hydrochloric acid solution; the eluent is concentrated by a scraper film evaporator, the concentration of the concentrated solution reaches about 35%, and 5% is added
  • the 767 needle is decolorized with activated carbon for 1 hour.
  • the progress of the glycolysis reaction is controlled to reduce the production of impurities or irrelevant substances, so that the reaction product contains an appropriate amount of Sodium fructose diphosphate.
  • Subsequent treatment of the yeast reaction solution containing sodium fructose diphosphate can quickly obtain a solution containing sodium fructose diphosphate.
  • the step of extracting the liquid phase with an anion exchange resin in step (2) further includes: adding the liquid phase to an anion exchange resin column for adsorption treatment, and discarding the effluent; Dissolve 3 to 5 kg of ammonium ions and 12 L of ammonia in water and adjust the volume to 5000 L to obtain liquid A with a pH of 8 to 10.
  • step S6 the primary filtration is implemented with a microporous filter with a particle size of 0.45 to 1.0 ⁇ m, and the primary sterilization-grade filtration is implemented with a filter with a pore size of 0.22-0.45 ⁇ m.
  • Ultrafiltration is achieved with ultrafiltration membranes with a molecular weight of 5000 to 20000, secondary sterilization grade filtration is achieved with 0.22 to 0.45 ⁇ m microporous filter, and three sterilization grade filtration is achieved with 0.22 to 0.45 ⁇ m sterilization grade security filter.
  • the obtained chemical solution is ultrafiltered through an ultrafiltration membrane with a pore size of 5000 molecular weight, and then subjected to a second sterilization grade filtration through a sterilization grade microporous filter with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • the temperature of the chemical solution is kept at about 0 ° C during the preparation process ;
  • step S4 Decolorization and filtration, add activated carbon to the resin extraction solution prepared in step S3, the amount of activated carbon is 15 ⁇ of the resin extraction solution, then stir and decolorize for 30 minutes, then filter and decarbonize through a titanium rod filter to obtain a decolorization filtration solution , Adjust the pH value of the decolorized filter solution to 4.2, which can be adjusted by alkaline solution (NaOH or KOH solution, Ca (OH) 2 solution, etc.) or mineral acid solution (hydrochloric acid, dilute nitric acid, dilute sulfuric acid, phosphoric acid, etc.);
  • step S3-1 Add the raw material liquid adjusted in step S2 to the anion exchange resin column at a flow rate of 100 L / h to fully adsorb, and the effluent is discarded;

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Abstract

提供一种制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法和应用，以及制备果糖二磷酸钠注射液的方法。制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法是通过将含有果糖二磷酸钠的酵母反应液进行固液分离处理，阴离子交换树脂提取，脱色，以及反渗透处理和除菌处理获得，其中酵母反应液是通过将含有葡萄糖和磷酸的含糖物料与酵母接触而获得的。应用该方法可进一步制备果糖二磷酸钠注射液或者果糖二磷酸钠口服液等其他剂型。具有大大降低有机溶剂的使用量，降低生产成本的优点。

Description

制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法和应用、制备果糖二磷酸钠注射液的方法
优先权信息
本申请以申请号为201811250946.8，申请日为2018年10月25日的中国专利申请作为优先权申请文件，并将该优先权申请文件的全部内容引入本文。
技术领域
本发明涉及医药制备技术领域，更具体地说，它涉及制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法和应用，以及制备果糖二磷酸钠注射液的方法。
背景技术
1,6二磷酸果糖(FDP)，是糖酵解中间产物，在细胞中通过激活磷酸果糖激酶，丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶等来调节几个酶促反应。FDP在不同细胞的浓度是不一样的，人红细胞中FDP的浓度为6～10mg/L细胞。体内外生化学研究显示药理剂量的FDP可作用于细胞膜。促进细胞对循环中钾的摄取及刺激细胞内高能磷酸和2，3—二磷酸甘油的产生。另外，FDP可减少机械创伤引起的红细胞溶血和抑制化学刺激引起的氧自由基的产生。
外源性的二磷酸果糖可作用于细胞膜，通过激活细胞膜上的磷酸果糖激酶，增加细胞内高能磷酸键和三磷酸腺苷的浓度，从而促进钾离子内流，恢复细胞静息状态，增加红细胞内二磷酸甘油酸的含量，抑制氧自由基和组织胺释放，有益于休克、缺血、缺氧、组织损伤、体外循环、输血等状态下的细胞能量代谢和对葡萄糖的利用，起到促进修复、改善细胞功能的作用。由于1，6-二磷酸果糖的药理作用，临床上常用来治疗低磷酸血症以及急性脑梗死等引起的脑缺血缺氧的症状。目前市场上多采用其钠盐，即果糖二磷酸钠形式，由于其水溶性好，多将其制备成注射液，方便临床使用，即果糖二磷酸钠在临床上常用作急性治疗药物。
申请号为201010614729.X，申请公布号为CN102154399A的中国专利申请公开了一种果糖二磷酸钠的生产工艺流程，其步骤为：将葡萄糖700kg、磷酸二氢钠375kg、纯碱75kg、氯化镁27kg、氯化铵16kg、氯化钾14kg、新鲜啤酒酵母2.5吨、甲苯80kg、工艺用水2吨，在PH为6.0左右，反应温度为36℃-38℃的反应釜中进行反应；反应结束后，反应液通过板框固液分离，收集滤液，滤液流经再生好的732阳离子交换树脂，控制PH值在1-2左右，流出液用去离子水稀释后进入717阴离子交换树脂进行吸附，用配制好的碱洗液清洗树脂表面的杂离子，然后用10％氯化钠盐酸溶液将树脂上的FDP洗脱下来；洗脱液经过刮板式薄膜蒸发器浓缩，浓缩液浓度达到35％左右，加入5％767型针用活性炭脱色1小时，去炭过滤后，得脱 色液，用氢氧化钠溶液调PH5左右；在脱色液中加入92％乙醇，控制体系乙醇含量65％，利用FDP在乙醇中的不溶特性，将FDP糖浆液析出，同时洗去浓缩液中的大部分的杂质阴离子，然后将FDP糖浆用适量去离子水稀释，加入92％乙醇结晶，保证体系乙醇含量在70-72％，温度在25℃-28℃，调节PH5.5左右；温度控制采用夹套加热或降温，加入适量的合格FDP产品作为晶种，4-5小时完全结晶，冷却后洗料，用72％乙醇清洗FDP二次，每次40分钟，用离心机将FDP晶体甩干，湿品移至真空双锥干燥机干燥，控制干燥温度45℃以下，完毕后过筛整粒，进行包装。其在制备果糖二磷酸钠的过程中，无论是在酵母发酵还是在后续的纯化洗脱工艺中都用到了有机溶剂，尤其是用到了甲苯；有机溶剂的使用，一方面使得后续工艺中增加了去除有机溶剂的步骤，使得工艺更为繁琐；另一方面，残留的有机溶剂会影响到果糖二磷酸钠用药的安全性。
授权公告号为CN103735498B的中国专利公开了一种果糖二磷酸钠注射液的制备方法，其具体步骤为：1)注射用水降温至40℃以下备用；2)称取pH值调节剂，加注射用水搅拌溶解；3)量取处方量20-80wt％的注射用水，水中充氮气，称取处方量的果糖二磷酸钠，加入搅拌溶解，用pH值调节剂溶液调节pH值为3-4，加入辅料，配得药液；4)在药液中加入活性炭，搅拌吸附10-40分钟，过滤脱炭，加注射用水至处方量并同时用pH值调节剂溶液调至步骤3)调至的pH值；5)取样检测，合格后再以0.22微米的微孔滤膜过滤，灌装到经高温烘干灭菌的玻璃瓶中，加塞，灭菌，轧盖，包装得成品。
上述专利在制备果糖二磷酸钠注射液的过程中，使用的果糖二磷酸钠为固体，现有技术中固体果糖二磷酸钠制备过程中通常采用精烘包工艺，精烘包工艺操作中通常要用有机溶剂结晶法，即加入乙醇等有机溶剂，以使得药物从溶液中结晶出来。使用有机溶剂的缺点是：一方面增加生产工艺步骤与生产成本，增加能源消耗；另一方面，有机溶剂的使用也不利于环保，且残留在药物中的有机溶剂对人体有害，需要去除。
另外，申请公布号为CN1650871A的中国专利公开了一种果糖二磷酸钠颗粒剂及其制备方法，该颗粒剂含有果糖二磷酸钠、稀释剂、助悬剂，其中含有果糖二磷酸钠2.5-10％，稀释剂85-97.4％，助悬剂0.1-5％，制备时，将果糖二磷酸钠、助悬剂和稀释剂分别过80目筛后，混合均匀，加入75％的乙醇溶液制软材，20目筛制粒，60℃干燥，18目筛整粒，即得果糖二磷酸钠。
总之，不管是借助酵母发酵获得果糖二磷酸钠，或者通过精烘包工艺制作固体果糖二磷酸钠，还是采用申请公布号为CN1650871A的中国专利中的方法制作固体果糖二磷酸钠，在过程中都需要用到大量的有机溶剂；此外，在制备果糖二磷酸钠注射液的过程中还需要将制成的固体果糖二磷酸钠进行溶解以及后续操作才制得目标产物——果糖二磷酸钠注射液，这个过程需要一定的周期，而且通常需要将制成的固态果糖二磷酸钠运输至果糖二磷 酸钠注射液的加工地，过程中运输成本大。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的至少一个目的在于提供一种含有果糖二磷酸钠的溶液及制备该含有果糖二磷酸钠的溶液的方法。应用该方法制备含有果糖二磷酸钠的溶液，制备过程中大大降低有机溶剂的使用量，而且还可以降低生产成本。所制备得到的含有果糖二磷酸钠的溶液可以进一步用于制备果糖二磷酸钠注射液或者果糖二磷酸钠口服液等其他合适的剂型。由此所制备得到的果糖二磷酸钠注射液或者其他剂型等降低了有机溶剂的使用，更加安全，且避免了引入有机溶剂后的复杂的去除工艺，降低了生产成本，更符合生产用药的需求。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，所述方法不使用有机溶剂，所述方法包括：(1)将含有果糖二磷酸钠的酵母反应液进行固液分离处理，并收集液相；(2)利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理，以便获得树脂提取液；(3)对所述树脂提取液进行脱色处理，以便获得脱色后液；(4)对所述脱色后液依次进行反渗透处理和除菌处理，以便获得所述含有果糖二磷酸钠的溶液，其中，所述酵母反应液是通过将含糖物料与酵母接触反应而获得的。
本发明提供的制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，在发酵和纯化过程全程不使用有机溶剂，其利用含糖物料和酵母接触反应后的产物作为原料进行处理，反应原料中不使用常规使用的甲苯等有机溶剂，然后包括利用阴离子交换树脂进行提取处理，脱色处理，反渗透处理和除菌处理，获得目标溶液，即含有果糖二磷酸钠的溶液。该制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法大大减少了有机溶剂的引入和使用，所获得的含有果糖二磷酸钠的溶液避免了有机溶剂去除所带来的繁琐工艺，简化了操作，节省了时间，可直接应用于制备果糖二磷酸钠口服液或者果糖二磷酸钠注射液；而且，该制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法采用含糖物料和酵母接触反应后的产物作为原料，处理获得，相较于利用成本高、工艺复杂的果糖二磷酸钠固体作为原料配制而得，本发明所提供的方法显著节约了成本，且避免了有机溶剂的使用，提高了品质。
进一步地，以上制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述含糖物料中含有200～600重量份的葡萄糖和10～20重量份的磷酸；每毫升所述酵母反应液中无机磷的含量不超过300微克。本发明所提供的制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，含糖物料在酵母的催化下的反应产物作为原料，含糖物料中含有合适量的葡萄糖和磷酸，酵母细胞中的酶促进葡萄糖进行糖酵解反应，消耗磷酸，生成果糖二磷酸钠，通过监控酵母反应液中磷酸含量，控制糖酵解反应的进程，减少 杂质或者不相关物质的产生，使得反应后的产物中含有合适量的果糖二磷酸钠。对该含有果糖二磷酸钠的酵母反应液进行后续处理，可以快速获得含有果糖二磷酸钠的溶液。
在本发明的一些实施例中，所述含糖物料还含有100～500重量份磷酸氢二钠和100～200重量份的磷酸二氢钠。由此可以为获得果糖二磷酸钠提供钠源，使得反应后的产物中含有果糖二磷酸钠，减少杂质或者不相关物质的产生。
在本发明的一些实施例中，所述酵母为啤酒酵母，所述啤酒酵母以啤酒酵母混悬液的形式提供，以所述葡萄糖的重量份为200～600份计，所述啤酒酵母混悬液为1000～3000份，所述啤酒酵母混悬液中啤酒酵母固形物的含量为40～70％。由此可以啤酒酵母中的酶促进葡萄糖发生糖酵解反应，使得反应后的产物中含有合适量的果糖二磷酸钠。
在本发明的一些实施例中，所述含糖物料与所述酵母的接触温度为34～40摄氏度，优选37摄氏度，pH值为2.0～7.0。在34～40摄氏度条件下，优选在37摄氏度条件下，可以发生酶促反应，获得果糖二磷酸钠。当温度过低时，影响酶促反应的进程，温度过高时，可能会使得酶失活以及副产物增多。
在本发明的一些实施例中，所述酵母反应液中果糖二磷酸钠的质量分数为2～10％，所述酵母反应液的pH值为1.0～3.5。由此可以快速制备获得含有果糖二磷酸钠的溶液。
在本发明的一些实施例中，所述固液分离处理进一步包括：(a)将所述酵母反应液与硅藻土混合，(b)将所得到的混合物进行板框过滤，获得滤后液，(c)将所述滤后液的pH调节至2.5～3.7。硅藻土具有很强的吸附能力，具有良好的过滤性和化学稳定性，通过硅藻土吸附，并借助于板框过滤可以快速去除酵母反应液中的一些大颗粒物质或者杂质。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取进一步包括：(2-1)利用所述阴离子交换树脂对所述液相进行吸附处理，获得吸附后树脂；(2-2)利用含铵离子的碱性溶液对所述吸附后树脂进行第一清洗；(2-3)利用含氯离子的低浓度酸性溶液进行第二清洗，然后利用含氯离子的高浓度酸性溶液进行第三清洗，收集后部分流出液，获得所述树脂提取液，所述含氯离子的高浓度酸性溶液中氯离子是所述含氯离子的低浓度酸性溶液的1.5～3倍。液相中的果糖二磷酸离子(即1,6-二磷酸果糖离子)在上述条件下可吸附在阴离子交换树脂上，然后利用含铵离子的碱性溶液、低氯离子浓度的溶液将弱结合的杂质洗脱下来，最后利用高氯离子浓度的溶液进行洗脱，利用高浓度的氯离子置换果糖二磷酸离子，获得树脂提取液。
在本发明的一些实施例中，步骤(2-2)中所述含铵离子的碱性溶液的含有铵离子和氨水，所述含铵离子的碱性溶液的pH值为8～10；步骤(2-3)中所述含低浓度氯离子酸性溶液的氯离子的质量分数为1.5～2％，所述含高浓度氯离子酸性溶液中氯离子的质量分数为3～4％，所述酸性溶液的pH值为1～3。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理进一步包括：将所述液相加入到阴离子交换树脂柱上进行吸附处理，弃去流出液；将3～5kg铵离子和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到pH值为8～10的A液，将A液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液，然后用纯化水清洗阴离子交换树脂柱，弃去流出液；将150～190kg氯离子和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液，用部分B液与纯化水等体积混合，所获得的混合液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液；然后将所述B液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去部分流出液后进行收集，得到所述树脂提取液。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中利用活性炭进行所述脱色处理，所述活性炭的用量为所述树脂提取液质量的5‰～15‰，所述脱色处理的时间为5～30分钟。由此可以利用活性炭脱色去除溶液中的杂质。
在本发明的一些实施例中，步骤(4)中所述反渗透处理进一步包括：(4-1)对所述脱色后液进行水洗脱盐，使得纯化水的加入流量与水洗脱盐过程中产生的废液流量相当，所述水洗脱盐过程中溶液的pH值为3.0～4.5，待溶液中磷酸根([PO 4 3－])的含量小于0.1％和氯离子的含量小于100μg/ml，停止水洗脱盐；(4-2)加压浓缩，待溶液比重浓缩至1.05g/ml以上停止。经过反渗透处理，减少了溶液中的无机盐离子的浓度，减少了溶液中的杂质含量。
在本发明的一些实施例中，步骤(4)中所述除菌处理包括：采用粒径为0.45～1.0微米的滤膜进行初级过滤，然后采用孔径为0.22-0.45微米的滤膜进行一次除菌级过滤。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种含有果糖二磷酸钠的无菌制品，根据本发明的实施例，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品不含可检测的有机溶剂。根据本发明的实施例，该含有果糖二磷酸钠的无菌制品不含可检测的有机溶剂，从而有效的直接用于制备多种果糖二磷酸钠制剂，例如注射液或者口服液等。另外，根据本发明的实施例，由于该含有果糖二磷酸钠的无菌溶液不含可检测的有机溶剂，从而能够有效地避免在为使用对象例如人体进行给药，例如通过注射给药时对人体的负面影响。进一步，利用根据本发明实施例的有果糖二磷酸钠的无菌溶液制备果糖二磷酸钠制剂时，不需要采用繁琐复杂的除去有机溶剂的步骤，从而能够有效地提高果糖二磷酸钠制剂的制备效率，降低生产成本。
进一步地，该含有果糖二磷酸钠的无菌制品可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述无菌制品呈溶液形式。
在本发明的一些实施例中，所述溶液为经过反渗透处理的溶液。
在本发明的一些实施例中，所述无菌制品含有浓度为至少11重量％的果糖二磷酸钠。
在本发明的一些实施例中，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品是利用本发明第一方面任一所述的制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法制备而成。
在本发明的一些实施例中，所述含有果糖二磷酸钠的溶液中游离磷酸盐的含量不超过0.2重量％，氯化物的含量不超过0.03重量％。由此所制备的含有果糖二磷酸钠的溶液无论是游离磷酸盐的含量还是氯化物的含量均很低，溶液在长期保存过程中稳定存在，不会发黄变质。
在本发明的第三方面，本发明提供了上述所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品在制备果糖二磷酸钠注射液或者在制备果糖二磷酸钠口服液中的用途。应用本发明所提供的含有果糖二磷酸钠的溶液可以作为原料制备符合临床用药的不同的剂型，例如可以直接用来制备果糖二磷酸钠注射液或者用来制备果糖二磷酸钠口服液，节省生产工序，节省人力成本、时间成本运输成本等，具有重要的生产意义。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种制备果糖二磷酸钠注射液的方法，包括：基于含有果糖二磷酸钠的无菌制品，获得含有果糖二磷酸钠的溶液，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品为上述所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品；将所述含有果糖二磷酸钠的溶液与注射用水混合精滤，去除粒径在0.45微米以上的杂质，获得精滤后药液，所述精滤后药液的pH值为3.0～4.5；将精滤后药液依次进行超滤处理、二次除菌级过滤和三次除菌级过滤，以便获得果糖二磷酸钠注射液。在制备果糖二磷酸钠注射液的过程中，通过多级除菌过滤的方式能够全部去除产品中的微生物，从而达到产品的无菌。而逐级除菌过滤的生产工艺可在较低的温度下实现产品除菌，从而提高了产品的质量，减少了药物的不良反应，而且使得经过除菌后的果糖二磷酸钠注射液中游离磷酸盐的含量不会超标，使得注射液能够稳定保存。
进一步地，以上所述制备果糖二磷酸钠注射液的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，利用孔径为5000～20000分子量的超滤膜进行所述超滤处理。
在本发明的一些实施例中，采用0.22～0.45微米的微孔过滤器进行所述二次除菌级过滤，采用0.22～0.45微米的除菌级保安过滤器进行所述三次除菌级过滤。
在本发明的一些实施例中，在将所述含有果糖二磷酸钠的溶液与所述注射用水混合精滤之前，进一步包括：利用活性炭对所述含有果糖二磷酸钠的溶液处理5～30分钟，所述活性炭的用量为所述含有果糖二磷酸钠的溶液质量的0.5％～1.5％，然后采用0.45～30微米的过滤器进行第一次过滤；采用1.0微米的过滤器进行第二次过滤。由此可以通过活性炭吸附进一步去除溶液中的杂质。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：(b-1)确定所述注射液的比重；(b-2)基于所述比重确定所述注射液中所述果糖二磷酸钠的含量；在步骤(b-2)中，基于公式y＝2171.4x-2188.9，其中，x是药液比重，y是药液含量确定所述注射液中所述果糖二磷酸钠的含量。利用药液含量与药液比重的关系，在药液配制过程中使用药液比重估算药液含量， 从而方便监控，减少生产过程中的等待时间。
在本发明的又一方面，本发明提供了一种果糖二磷酸钠注射液，所述果糖二磷酸钠注射液根据上述任一所述的果糖二磷酸钠注射液的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种果糖二磷酸钠注射液的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取果糖二磷酸钠原料液，原料液中果糖二磷酸钠占原料液的质量百分比范围为2-10％，pH值至1.0～3.5；
S2、原料液过滤，在步骤S1中原料液中加入硅藻土，搅拌均匀后，过滤进行固液分离，然后调节pH值至2.5～3.7；
S3、树脂提取，将步骤S2中固液分离后的原料液提纯，得到含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，然后调树脂提取液pH值至2.8～4.0；
S4、脱色过滤，通过活性炭对树脂提取液进行脱色后进行过滤脱碳，得到脱色过滤液，调节脱色过滤液pH值在3.0～4.2之间；
S5、反渗透浓缩，对步骤S4中得到的脱色过滤液进行反渗透处理，具体操作如下：对脱色过滤液进行初步浓缩，得到浓缩液；
然后对浓缩液进行水洗脱盐，水洗脱盐具体操作为：在初步浓缩后的浓缩液中加入纯化水进行水洗，纯化水加入流量与水洗过程中产生的废液流量一致，以保持药液液位稳定，水洗过程中，控制药液pH值至3.0～4.2；
6小时后取样测[PO 4 3－]和[Cl –]，当[PO 4 3－]<0.1％和[Cl –]<100μg/ml，视为合格，停止加纯化水，水洗脱盐结束；
最后进行浓缩，具体操作为：逐渐增压，将药液比重浓缩至1.05g/ml以上为止，增压浓缩过程中药液pH值保持在3.0～4.5之间；
浓缩及水洗脱盐过程中，控制药液温度在0～10℃之间；
S6、反渗透浓缩后药液过滤，对步骤S5中反渗透浓缩后的药液进行初级过滤后，再一次除菌级过滤，得到滤液为RO液，将RO液密封并在0～10℃保存；
S7、配制注射液，向步骤S6得到的RO液中按0.5％～1.5％的比例加入活性炭，搅拌5～30分钟后将药液进行第一次过滤以除去药液中活性炭颗粒，然后进行第二次过滤以除去粒径≥1.0μm的杂质；将滤液进行收集后进行稀配，稀配的具体操作为：加入注射用水，定容，将定容后的药液进行精滤，除去粒径≥0.45μm的杂质，最终得到药液含量控制在标示含量即5g/50ml的90.0～110.0％之间、pH值在3.0～4.5之间的药液；
将所得药液依次进行超滤和二次除菌级过滤，最后经过三次除菌级过滤后进行灌装，得到无菌的果糖二磷酸钠注射液，配制、灌装过程中药液温度在0～10℃之间。
通过采用上述技术方案，将原材料葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸等物料， 经啤酒酵母将葡萄糖转化为果糖二磷酸钠，制得果糖二磷酸钠原料液后，通过吸附、过滤、提纯等操作后将原料液再进行反渗透浓缩，然后紧接着就进行药液配制，灌装得到目标产物——果糖二磷酸钠注射液，不需要经过精烘包过程，也不需要将原材料制成果糖二磷酸钠固体后溶解，减少有机溶剂的使用，而且也节省了时间，简化操作，降低生产成本，而且因为果糖二磷酸钠热稳定性较差，高温容易降解、产生游离磷酸盐，导致灭菌后注射液中游离磷酸盐的含量超标，影响了注射液的质量。因此，传统的湿热灭菌工艺不适合用作果糖二磷酸钠注射液的灭菌方式。本发明采用多级除菌过滤方式降低生产过程中的微生物负荷，使其达到注射液无菌保障水平。与传统的湿热灭菌工艺相比，本发明中使用的除菌过滤可以减少有关物质的产生，提高了产品的质量，减少了药物的不良反应。
进一步地，步骤S1中获取果糖二磷酸钠原料液的具体操作如下：将100～500kg磷酸氢二钠、100～200kg磷酸二氢钠、200～600kg葡萄糖以及10～20kg磷酸溶于水制成反应液，反应液的pH在5.0～7.0之间；
将配制好的反应液与1000～3000L的啤酒酵母混合为料液，搅拌使葡萄糖转化为果糖二磷酸钠，搅拌过程中，控制温度为35～40℃之间，pH值为2.0～7.0之间，直至料液中无机磷浓度为≤300μg/ml(w/v)。
进一步地，步骤S1中搅拌终止后，调节料液pH值至1.0～3.5，得到所述果糖二磷酸钠原料液，然后进行步骤S2，加入100～300kg硅藻土。
进一步地，步骤S2中加入硅藻土后的药液过滤方式为板框过滤。
进一步地，步骤S3中树脂提取的具体操作为：
S3-1、将步骤S2中固液分离后的原料液以100L/h的流速加入到阴离子交换树脂柱上，充分吸附，流出液弃去；
S3-2、第一次提取，具体操作为：将12kg铵盐和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到A液；将A液以500L/h的流速通过经S3-1处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去，然后用纯化水以500L/h流速清洗阴离子交换树脂柱，流出液弃去。
S3-3、第二次提取，具体操作为：150kg氯化物和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液；用B液与纯化水各500L制得混合液，以500L/h的流速清洗经S3-2处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去；剩余B液以500L/h的流速清洗阴离子交换树脂柱，前500L流出液弃去，随后将流出液全部收集，得到所述含有果糖二磷酸钠的树脂提取液。
进一步地，步骤S4中加入活性炭的用量为树脂提取液的5‰～15‰，然后搅拌状态下脱色5～30分钟后进行过滤脱碳。
进一步地，步骤S6中初级过滤采用粒径为0.45～1.0μm微孔过滤器实现，一次除菌级过滤采用孔径为0.22-0.45μm的过滤器实现。
进一步地，步骤S7中第一次过滤采用粒径为0.45～30μm的钛棒过滤器或其他过滤器实现，第二次过滤采用1.0μm微孔过滤器或其他过滤器实现；
精滤的具体操作为：将定容后的药液在孔径为0.45μm微孔过滤器中精滤5～30分钟；
超滤采用孔径为5000～20000分子量的超滤膜实现，二次除菌级过滤采用0.22～0.45μm微孔过滤器实现，三次除菌级过滤采用0.22～0.45μm除菌级保安过滤器实现。
进一步地，步骤S7中药液含量的指标以药液比重替代，药液含量与药液比重在检测范围内呈线性关系，线性方程为y＝2171.4x-2188.9，其中，x是药液比重，y是药液含量，相关系数R 2为0.986，测量时直接测量药液比重，得到药液含量。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明中将反渗透浓缩后的药液直接配制，减少现有技术中的将果糖二磷酸钠精烘包的过程，避免了有机溶剂的使用，而且反渗透浓缩后的药液直接配制为果糖二磷酸钠注射液，不需要经过精烘包工艺来制成果糖二磷酸钠的固体形式，然后再将固态果糖二磷酸钠进行溶解，节省减小中间工序，节省人力成本、时间成本以及运输成本，具有很重要的实际生产意义；
2、本发明中发酵过程中避免了有机溶剂的引入，从而减少了有机溶剂去除的繁琐步骤，而且不引入有机溶剂，使得制备的果糖二磷酸钠产品中不含有有机溶剂，更符合安全用药的需求；
3、本发明中反渗透工艺还减少了无机盐离子，减少药液中的杂质；
4、本发明中多次采用钛棒过滤、微孔过滤、超滤等过滤方式既降低生产过程中的微生物负荷，使其达到注射液无菌保障水平，提高了产品的质量，减少了药物的不良反应，而且还基于果糖二磷酸钠热稳定性较差的情况下不会导致灭菌后注射液中游离磷酸盐的含量超标；
5、药液配制过程中使用药液比重估算药液含量，减少生产过程中的等待时间；
6、整个制备过程采用冷链低温生产，减少微生物的产生，提高产品质量。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的制备果糖二磷酸钠注射液的方法的流程图。
图2是根据本发明的实施例所提供的药液比重与药液实际含量趋势图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明提供了一种制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，通过该方法制备含有果糖二 磷酸钠的溶液，由于制备工艺降低了有机溶剂的使用，因此简化了有机溶剂去除的复杂工艺，节约了成本。所制备的含有果糖二磷酸钠的溶液可以直接用于制备不同的剂型，例如制备口服液或者制备注射液等。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，该方法不使用有机溶剂，该方法包括：(1)将含有果糖二磷酸钠的酵母反应液进行固液分离处理，并收集液相；(2)利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理，以便获得树脂提取液；(3)对所述树脂提取液进行脱色处理，以便获得经过脱色后液；(4)对所述脱色后液依次进行反渗透处理和除菌处理，以便获得所述含有果糖二磷酸钠的溶液，其中，所述酵母反应液是通过将含糖物料与酵母接触反应而获得的。
在本发明的至少一些实施方式中，所述含糖物料中含有200～600重量份的葡萄糖和10～20重量份的磷酸；每毫升所述酵母反应液中无机磷的含量不超过300微克。借助于糖酵解途径，根据含糖物料中葡萄糖和磷酸反应，通过监测酵母反应液中无机磷含量的变化，监控反应的进程，获得含有果糖二磷酸钠的溶液。
在进行固液分离处理时，可以借助于硅藻土进行处理，然后通过板框过滤的方式去除杂质和硅藻土。在至少一些实施方式中，固液分离处理包括：(a)将所述酵母反应液与硅藻土混合，(b)将所得到的混合物进行板框过滤，获得滤后液，(c)将所述滤后液的pH调节至2.5～3.7。硅藻土有较小的颗粒度、较大的比表面和表观能，表面呈多孔状，极易吸附溶液中较小的固体颗粒，经过滤处理，就能使菌体杂质与硅藻土一起除去。通过这种处理可以去除酵母反应液的固体颗粒。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取进一步包括：(2-1)利用所述阴离子交换树脂对所述液相进行吸附处理，获得吸附后树脂；(2-2)利用含铵离子的碱性溶液对所述吸附后树脂进行第一清洗；(2-3)利用含氯离子的低浓度酸性溶液进行第二清洗，然后利用含氯离子的高浓度酸性溶液进行第三清洗，收集后部分流出液，获得所述树脂提取液，所述含氯离子的高浓度酸性溶液中氯离子是所述含氯离子的低浓度酸性溶液的1.5～3倍。液相中的果糖二磷酸离子(即1,6-二磷酸果糖离子)可吸附在阴离子交换树脂上，然后利用含铵离子的碱性溶液、低氯离子浓度的溶液将弱结合的杂质洗脱下来，最后利用高氯离子浓度的溶液进行洗脱，利用高浓度的氯离子替换果糖二磷酸离子，获得树脂提取液。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(2-2)中所述含铵离子的碱性溶液的含有铵离子和氨水，所述含铵离子的碱性溶液的pH值为8～10；步骤(2-3)中所述含低浓度氯离子酸性溶液的氯离子的质量分数为1.5～2％，所述含高浓度氯离子酸性溶液中氯离子的质量分数为3～4％，所述酸性溶液的pH值为1～3。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理进一步包括：将所述液相加入到阴离子交换树脂柱上进行吸附处理，弃去流出液；将3～5kg铵离子和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到pH值为8～10的A液，将A液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液，然后用纯化水清洗阴离子交换树脂柱，弃去流出液；将150～190kg氯离子和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液，用部分B液与纯化水等体积混合，所获得的混合液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液；然后将所述B液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去部分流出液后进行收集，得到所述树脂提取液。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种果糖二磷酸钠注射液的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、以重量份数计，将磷酸氢二钠100kg、磷酸二氢钠100kg、葡萄糖200kg以及磷酸10kg溶于300L水，搅拌至全部溶解，配制成反应液，控制反应液pH为5.0；
将配制好的反应液与1000L的啤酒酵母(其中含有啤酒酵母固形物含量为70％)混合为料液，搅拌，在啤酒酵母作用下发生酶促反应使得葡萄糖转化为果糖二磷酸钠，搅拌过程中，控制温度为35℃，料液pH值为2.0；
搅拌开始1小时后，每隔一个小时取料液测定pH值和无机磷浓度，当无机磷浓度≤300μg/ml(w/v)时，搅拌终止，然后调整料液pH值为1.0，得到果糖二磷酸钠原料液，原料液中果糖二磷酸钠占原料液的质量百分比为2％，其中，调整料液可以通过盐酸、稀硫酸、稀硝酸或者磷酸等无机酸进行调整；
其中，无机磷的检测方法为：精密量取过滤后的样品0.5ml置50ml量瓶中，加水15ml混合均匀，另取标准磷酸盐溶液(精密称取经105℃干燥2小时的磷酸二氢钾0.1433g，置1000ml量瓶中，加硫酸溶液(3→10)10ml与水适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，临用前再加水稀释10倍，即每ml相当于10ug的
Figure PCTCN2019113049-appb-000001
)25ml，置另一50ml量瓶中，各精密加钼酸铵硫酸试液5.0ml，1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液(取无水亚硫酸钠5.0g，亚硫酸氢钠94.3g与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，临用前取此混合物1.5g，加水10ml使溶解，必要时滤过)2ml，加水至刻度，摇匀，在20℃左右放置30～50分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部通则0401)，在740nm的波长处测定吸收度，按下式计算游离磷酸盐的浓度。(≤3000ppm)
Figure PCTCN2019113049-appb-000002
S2、在步骤S1中制得的果糖二磷酸钠原料液中加入100kg硅藻土，搅拌均匀，然后经过板框过滤技术进行固液分离，然后用碱液调节原料液pH值至2.5，其中调节pH碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液；
其中，在板框过滤技术之前加入硅藻土是因为硅藻土有较小的颗粒度、较大的比表面和表观能，表面呈多孔状，极易吸附溶液中较小的固体颗粒，经过滤处理，就能使菌体杂质与硅藻土一起除去；
S3、树脂提取，将步骤S2中调节pH后的原料液通过阴离子树脂提取得到含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，然后调树脂提取液pH值至2.8，此处调节pH至可以通过碱液调节，也可以通过酸溶液进行调节，其中碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液，酸溶液可以是稀盐酸溶液，也可以是稀硫酸溶液、稀硝酸溶液、磷酸溶液等无机酸溶液；
其中，通过阴离子树脂提取得到树脂提取液的具体操作如下：
S3-1、将步骤S2中调节pH后的原料液以100L/h的流速加入到阴离子交换树脂柱上，充分吸附，流出液弃去；
S3-2、第一次提取，具体操作为：将12kg铵盐(氯化铵)和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到A液；将A液以500L/h的流速通过经S3-1处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去，然后用纯化水以500L/h流速清洗阴离子交换树脂柱，流出液弃去，其中，当然配制A液过程中用到的铵盐除了氯化铵，也可以利用硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵等铵盐；
S3-3、第二次提取，具体操作为：150kg氯化物和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液；用B液与纯化水各500L制得混合液，以500L/h的流速清洗经S3-2处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去；剩余B液以500L/h的流速清洗阴离子交换树脂柱，前500L流出液弃去，随后将流出液全部收集，得到所述含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，其中配制B液过程中用到的氯化物可以是氯化钠，无机酸可以是盐酸，也可以是磷酸、稀硫酸、稀硝酸等无机酸；
S4、脱色过滤，在步骤S3中制得的树脂提取液中加入活性炭，活性炭的用量为树脂提取液的5‰，然后搅拌脱色5分钟，然后经钛棒过滤器过滤脱炭，得脱色过滤液，调节脱色过滤液pH值在3.0，可以通过碱液(NaOH或KOH溶液、Ca(OH) 2溶液等)或无机酸溶液(盐酸、稀硝酸、稀硫酸或磷酸等)予以调整；
S5、反渗透浓缩，对步骤S4中得到的脱色过滤液进行反渗透处理，具体操作如下：步骤S4中调节pH后的脱色过滤液通过反渗透机进行初步浓缩，直至脱色过滤液体积浓缩至 1000L得到初浓液；
然后对初浓液进行水洗脱盐，水洗脱盐具体操作为：在初步浓缩后的浓缩液中加入纯化水进行水洗，纯化水加入流量调至与水洗过程中产生的废液流量一致，以保持药液液位稳定，水洗过程中，控制药液pH值为3.0；
6小时后取样测[PO 4 3－]和[Cl –]，当[PO 4 3－]<0.1％和[Cl –]<100μg/ml，视为合格，停止加纯化水，水洗脱盐结束；
最后进行增压浓缩，具体操作为：逐渐增加膜内压力，将药液比重浓缩至1.05g/ml以上为止，增压浓缩过程中药液pH值应保持在3.0左右；
增压浓缩及水洗脱盐过程中，控制药液温度在0℃左右；
S6、反渗透浓缩后药液过滤，经步骤S5中反渗透浓缩后的药液在粒径为0.45μm微孔过滤器进行初级过滤，再经0.22μm除菌级筒式滤芯进行一次除菌级过滤，得到滤液为RO液，将RO液密封并在0℃保存；
S7、配制注射液，将步骤S6得到的RO液加入浓配罐中，加入浓配罐中的药液量0.5％比例的活性炭，搅拌5分钟后，将药液经过粒径为0.45μm钛棒过滤器进行第一次过滤，以除去药液中活性炭颗粒，然后再经过粒径为1.0μm微孔过滤器第二次过滤，以除去粒径≥1.0μm的杂质；
将滤液进行收集后输送到稀配罐进行稀配，稀配具体操作为：向稀配罐中加入注射用水，定容，药液经0.45μm微孔过滤器循环精滤5～30分钟，除去粒径≥0.45μm的杂质，最终得到药液含量控制在标示含量即5g/50ml的90.0～110.0％之间、pH值为3.0的药液；
将所得药液通过孔径为5000分子量的超滤膜进行超滤，然后经过孔径为0.22μm的除菌级微孔过滤器进行二次除菌级过滤，配制过程中药液温度保持在0℃左右；
二次除菌级过滤后的药液，最后经孔径为0.22μm的除菌级保安过滤器进行三次除菌级过滤后输送入灌装机，灌装得到果糖二磷酸钠注射液，灌装过程中药液温度保持在0℃左右。
实施例2
一种果糖二磷酸钠注射液的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、以重量份数计，将磷酸氢二钠500kg、磷酸二氢钠200kg、葡萄糖600kg以及磷酸20kg溶于900L水，搅拌至全部溶解，配制成反应液，控制反应液pH为7.0；
将配制好的反应液与3000L的啤酒酵母(含有啤酒酵母固形物的含量为40％)混合为料液，搅拌，在啤酒酵母作用下发生酶促反应使得葡萄糖转化为果糖二磷酸钠，搅拌过程中，控制温度为38℃，料液pH值为7.0左右；
搅拌开始1小时后，每隔一个小时取料液测定pH值和无机磷浓度，当无机磷浓度≤300μg/ml(w/v)时，搅拌终止，然后调整料液pH值为3.5，得到果糖二磷酸钠原料液，原料液中果糖二磷酸钠占原料液的质量百分比范围为6％，其中，调整料液可以通过盐酸、稀硫酸、稀硝酸或者磷酸等无机酸进行调整；
S2、在步骤S1中制得的果糖二磷酸钠原料液中加入300kg硅藻土，搅拌均匀，然后经过板框过滤技术进行固液分离，然后用碱液调节原料液pH值至3.7，其中调节pH碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液；
S3、树脂提取，将步骤S2中调节pH后的原料液通过阴离子树脂提取得到含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，然后调树脂提取液pH值至4.0，此处调节pH值可以通过碱液调节，也可以通过酸溶液进行调节，其中碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液，酸溶液可以是稀盐酸溶液，也可以是稀硫酸溶液、稀硝酸溶液、磷酸溶液等无机酸溶液；
其中，通过阴离子树脂提取得到树脂提取液的具体操作如下：
S3-1、将步骤S2中调节pH后的原料液以100L/h的流速加入到阴离子交换树脂柱上，充分吸附，流出液弃去；
S3-2、第一次提取，具体操作为：将12kg铵盐(氯化铵)和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到A液；将A液以500L/h的流速通过经S3-1处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去，然后用纯化水以500L/h流速清洗阴离子交换树脂柱，流出液弃去，其中，配制A液过程中用到的铵盐除了上述氯化铵之外，也可以是硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵等铵盐；
S3-3、第二次提取，具体操作为：150kg氯化物和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液；用B液与纯化水各500L制得混合液，以500L/h的流速清洗经S3-2处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去；剩余B液以500L/h的流速清洗阴离子交换树脂柱，前500L流出液弃去，随后将流出液全部收集，得到所述含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，其中配制B液过程中用到的氯化物可以是氯化钠，无机酸可以是盐酸，也可以是磷酸、稀硫酸、稀硝酸等无机酸；
S4、脱色过滤，在步骤S3中制得的树脂提取液中加入活性炭，活性炭的用量为树脂提取液的15‰，然后搅拌脱色30分钟，然后经钛棒过滤器过滤脱炭，得脱色过滤液，调节脱色过滤液pH值在4.2，可以通过碱液(NaOH或KOH溶液、Ca(OH) 2溶液等)或无机酸溶液(盐酸、稀硝酸、稀硫酸或磷酸等)予以调整；
S5、反渗透浓缩，对步骤S4中得到的脱色过滤液进行反渗透处理，具体操作如下：步骤S4中调节pH后的脱色过滤液通过反渗透机进行初步浓缩，直至脱色过滤液体积浓缩至2000L得到初浓液；
然后对初浓液进行水洗脱盐，水洗脱盐具体操作为：在初步浓缩后的浓缩液中加入纯化水进行水洗，纯化水加入流量调至与水洗过程中产生的废液流量一致，以保持药液液位稳定，水洗过程中，控制药液pH值为4.2；
6小时后取样测[PO 4 3－]和[Cl –]，当[PO 4 3－]<0.1％和[Cl –]<100μg/ml，视为合格，停止加纯化水，水洗脱盐结束；
最后进行增压浓缩，具体操作为：逐渐增加膜内压力，将药液比重浓缩至1.05g/ml以上为止，增压浓缩过程中药液pH值应保持在4.5；
增压浓缩及水洗脱盐过程中，控制药液温度在10℃；
S6、反渗透浓缩后药液过滤，经步骤S5中反渗透浓缩后的药液在粒径为1.0μm微孔过滤器进行初级过滤，再经0.45μm除菌级筒式滤芯进行一次除菌级过滤，得到滤液为RO液，将RO液密封并在8℃保存；
S7、配制注射液，将步骤S6得到的RO液加入浓配罐中，加入浓配罐中的药液量1.5％比例的活性炭，搅拌30分钟后，将药液经过粒径为30μm钛棒过滤器进行第一次过滤，以除去药液中活性炭颗粒，然后再经过粒径为1.0μm筒式滤芯过滤的第二次过滤，以除去粒径≥1.0μm的杂质；
将滤液进行输送到稀配罐进行稀配，稀配具体操作为：向稀配罐中加入注射用水，定容，药液经0.45μm微孔过滤器循环精滤30分钟，除去粒径≥0.45μm的杂质，最终得到药液含量控制在标示含量即5g/50ml的110.0％之间、pH值为4.5的药液；
将所得药液通过孔径为20000分子量的超滤膜进行超滤，然后经过孔径为0.45μm除菌级微孔过滤器进行二次除菌级过滤，配制过程中药液温度保持在10℃；
二次除菌级过滤后的药液，最后经孔径为0.22μm的除菌级保安过滤器进行三次除菌级过滤后输送入灌装机，灌装得到果糖二磷酸钠注射液，灌封过程中药液温度保持在10℃。
实施例3
一种果糖二磷酸钠注射液的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、以重量份数计，将磷酸氢二钠300kg、磷酸二氢钠150kg、葡萄糖400kg以及磷酸15kg溶于600L水，搅拌至全部溶解，配制成反应液，过程中，控制反应液pH值为6.0左右；
将配制好的反应液与2000L的啤酒酵母(含有啤酒酵母固形物的含量为55％)混合为料液，搅拌，在啤酒酵母作用下通过酶促反应使得葡萄糖转化为果糖二磷酸钠，搅拌过程中，控制温度为40℃，料液pH值为4.5左右；
搅拌开始1小时后，每隔一个小时取料液测定pH值和无机磷浓度，当无机磷浓度≤ 300μg/ml(w/v)时，搅拌终止，然后调整料液pH值为2.2，得到果糖二磷酸钠原料液，其中，调整料液可以通过盐酸、稀硫酸、稀硝酸或者磷酸等无机酸进行调整；
S2、在步骤S1中制得的果糖二磷酸钠原料液中加入200kg硅藻土，搅拌均匀，然后经过板框过滤技术进行固液分离，然后用碱液调节原料液pH值至3.1，其中调节pH碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液；
S3、树脂提取，将步骤S2中调节pH后的原料液通过阴离子树脂提取得到含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，然后调树脂提取液pH至3.4，此处调节pH可以通过碱液调节，也可以通过酸溶液进行调节，其中碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液或者Ca(OH) 2溶液等碱液，酸溶液可以是稀盐酸溶液，也可以是稀硫酸溶液、稀硝酸溶液、磷酸溶液等无机酸溶液；
其中，通过阴离子树脂提取得到树脂提取液的具体操作如下：
S3-1、将步骤S2中调节pH后的原料液以100L/h的流速加入到阴离子交换树脂柱上，充分吸附，流出液弃去；
S3-2、第一次提取，具体操作为：将12kg铵盐(氯化铵)和12L氨水溶于水中，定容至5000L，得到A液；将A液以500L/h的流速通过经S3-1处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去，然后用纯化水以500L/h流速清洗阴离子交换树脂柱，流出液弃去，其中，配制A液过程中用到的铵盐除了上述氯化铵之外，也可以是硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵等铵盐；
S3-3、第二次提取，具体操作为：150kg氯化物和200kg无机酸溶于水中，定容至5000L，得到B液；用B液与纯化水各500L制得混合液，以500L/h的流速清洗经S3-2处理的阴离子交换树脂柱，流出液弃去；剩余B液以500L/h的流速清洗阴离子交换树脂柱，前500L流出液弃去，随后将流出液全部收集，得到所述含有果糖二磷酸钠的树脂提取液，其中配制B液过程中用到的氯化物可以是氯化钠，无机酸可以是盐酸，也可以是磷酸、稀硫酸、稀硝酸等无机酸；
S4、脱色过滤，在步骤S3中制得的树脂提取液中加入活性炭，活性炭的用量为树脂提取液的10‰，然后搅拌脱色15分钟，然后经钛棒过滤器过滤脱炭，得脱色过滤液，调节脱色过滤液pH值在3.6，可以通过碱液(NaOH或KOH溶液、Ca(OH) 2溶液等)或无机酸溶液(盐酸、稀硝酸、稀硫酸或磷酸等)予以调整。
S5、反渗透浓缩，对步骤S4中得到的脱色过滤液进行反渗透处理，具体操作如下：步骤S4中调节pH值后的脱色过滤液通过反渗透机进行初步浓缩，直至脱色过滤液体积浓缩至1500L得到初浓液；
然后对初浓液进行水洗脱盐，水洗脱盐具体操作为：在初步浓缩后的浓缩液中加入纯化水进行水洗，纯化水加入流量调至与水洗过程中产生的废液流量一致，以保持药液液位稳定，水洗过程中，控制药液pH值为3.6左右；
6小时后取样测[PO 4 3－]和[Cl –]，当[PO 4 3－]<0.1％和[Cl –]<100μg/ml，视为合格，停止加纯化水，水洗脱盐结束；
最后进行增压浓缩，具体操作为：逐渐增加膜内压力，将药液比重浓缩至1.05g/ml以上为止，增压浓缩过程中药液pH值应保持在3.8左右；
增压浓缩及水洗脱盐过程中，控制药液温度在5℃左右；
S6、反渗透浓缩后药液过滤，经步骤S5中反渗透浓缩后的药液在粒径为0.45μm微孔过滤器进行初级过滤，再经0.22μm除菌级筒式滤芯进行一次除菌级过滤，得到滤液为RO液，将RO液密封并在8℃保存；
S7、配制注射液，将步骤S6得到的RO液加入浓配罐中，加入浓配罐中的药液量1.0％比例的活性炭，搅拌17分钟后，将药液经过粒径为30μm钛棒过滤器进行第一次过滤，以除去药液中活性炭颗粒，然后再经过粒径为1.0μm微孔过滤器第二次过滤，以除去粒径≥1.0μm的杂质；
将滤液输送到稀配罐进行稀配，稀配具体操作为：向稀配罐中加入注射用水，定容，药液经0.45μm微孔过滤器循环精滤17分钟，除去粒径≥0.45μm的杂质，最终得到药液含量控制在标示含量即5g/50ml的100.0％、pH值在3.7的药液；
将所得药液通过孔径为12000分子量的超滤膜进行超滤，然后经过孔径为0.22μm的除菌级微孔过滤器进行二次除菌级过滤，配制过程中药液温度保持在5℃。
二次除菌级过滤后的药液，最后经孔径为0.22μm的除菌级保安过滤器进行三次除菌级过滤后输送入灌装机，灌装得到果糖二磷酸钠注射液，灌装过程中药液温度保持在5℃。
对实施例1～实施例3经过S6步骤制备得到的RO液进行表征，包括：性状，颜色，游离磷酸盐含量，氯化物含量，有关物质含量，铁盐含量，重金属，砷盐含量，蛋白质，微生物限度，以及RO液中所含有的果糖二磷酸钠的含量进行表征。表征方法及表征如下表1所示：
表1 各指标测定方法
Figure PCTCN2019113049-appb-000003
Figure PCTCN2019113049-appb-000004
测定结果如下表2所示：
表2 测定结果
Figure PCTCN2019113049-appb-000005
在上述实施例果糖二磷酸钠注射液制备过程中，步骤S7药液配制过程中，需要对药液含量进行测量进行抽检，现有技术中药液含量的测定为多次测量药液中果糖二磷酸钠的 含量，直至药液含量处于标示含量的90.0～110.0％之间，测量果糖二磷酸钠的含量方法为酶法，需要花费1小时左右的时间，而且酶试剂成本较高，本发明中通过采用药液比重来估算药液含量的方法可以快速知道药液含量，进而判断药液含量是否满足标示含量(5g/50ml)的90.0～110.0％之间的指标，减少生产过程中的等待时间。
具体操作如下：
对生产过程中同一批送检的药液分别进行药液比重的测量与药液实际含量的测量，平行实验5组，求取平均值，得到该批次药液比重A 1与药液实际含量的数值B 1，然后对不同浓度的不同批次的药液重复此操作，得到药液比重系列数值A 1…A 7，药液实际含量的系列数值B 1…B 7，结果如表3所示，将A 1…A 7与B 1…B 7制作曲线，如图2所示，其中，图2中横坐标为液比重系列数值A 1…A 7，纵坐标为药液实际含量的系列数值B 1…B 7，可以看到药液实际含量与药液比重在所需检测范围内呈线性相关关系，相关系数R 2达0.986，满足生产过程中指导药液配制的作用，经生产反复实践，可以将药液比重作为药液含量的替代指标，减少生产过程中的等待时间。
表3：
系列浓度 比重(g/L) 标示含量 实际含量(mg/ml)
1 1.054 100.40％ 100.4
2 1.055 101.90％ 101.9
3 1.056 104.00％ 104
4 1.057 106.00％ 106
5 1.058 108.00％ 108
6 1.059 110.20％ 110.2
7 1.060 113.80％ 113.8
步骤S5中反渗透可以去除药液中的无机盐离子，本发明选取两种代表离子(PO 4 3+、Cl -)在浓缩开始前与结束后分别进行含量测定，测量结果见表4。
表4：
Figure PCTCN2019113049-appb-000006
由表4可知，步骤S5反渗透的操作可以降低药液中无机盐离子浓度。
最后将制得的果糖二磷酸钠注射液取若干样液通过下述两种方式进行培养：①硫乙醇酸盐流体培养基进行培养，培养温度为30～35℃，培养时间为14天；②胰酪大豆胨液体培养 基培养，培养温度为20～25℃，培养时间为14天；通过上述两种方式培养结束后可以看到培养基中没有长菌，说明通过本方法制得无菌的果糖二磷酸钠注射液。
综上所述，现有技术在药剂灭菌方面，传统的灭菌方式为湿热灭菌，但是考虑到果糖二磷酸钠热稳定性较差，高温容易降解、产生游离磷酸盐，导致灭菌后注射液中游离磷酸盐的含量超标，影响了注射液的质量。因此本发明中采用的过滤方式包括通过钛棒过滤、微孔过滤、超滤等方式，在制备过程中通过这些过滤方式进行多次过滤，降低生产过程中的微生物负荷，提高无菌保障水平，使得到无菌的注射液。提高了产品的质量，减少了药物的不良反应。
采用反渗透的方法，将果糖二磷酸钠稀溶液浓缩至所需的高浓度溶液(即RO液)，将RO液直接用于注射液的配制，整个果糖二磷酸钠注射液的生产工艺过程中不使用有机溶剂；而且反渗透浓缩后的药液直接配制为果糖二磷酸钠注射液，不需要经过精烘包工艺来制成果糖二磷酸钠的固体形式，然后再将固态果糖二磷酸钠进行溶解，节省减小中间工序，节省人力成本、时间成本以及运输成本；再结合表4，反渗透过程中还减少了无机盐离子，减少药液中的杂质；
药液配制过程中使用药液比重估算药液含量，减少生产过程中的等待时间；
整个制备过程采用冷链低温生产，减少微生物的产生，提高产品质量；
最后，步骤S7中制得的药液含量控制在标示含量即5g/50ml的90.0～110.0％之间，使得通过本方法制得的果糖二磷酸钠注射液中的果糖1,6-二磷酸三钠盐的含量达到国家药品标准中的要求，在国家药品标准中还规定果糖二磷酸钠注射液中游离PO 4 3+的含量不超过1.25％，本发明提供的制备过程在低温环境下进行，使得制得的果糖二磷酸钠注射液的游离PO 4 3+的含量较低，再结合表4，可以得到通过本发明制得的果糖二磷酸钠注射液符合国家药品标准中的要求，同时，由于在制备过程中全程不引入有机溶剂，减少了有机溶剂去除的复杂工艺，排除了有机溶剂残留的风险。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (27)

  1. 一种制备含有果糖二磷酸钠的溶液的方法，其特征在于，所述方法不使用有机溶剂，所述方法包括：
    (1)将含有果糖二磷酸钠的酵母反应液进行固液分离处理，并收集液相；
    (2)利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理，以便获得树脂提取液；
    (3)对所述树脂提取液进行脱色处理，以便获得脱色后液；
    (4)对所述脱色后液依次进行反渗透处理和除菌处理，以便获得所述含有果糖二磷酸钠的溶液，
    其中，
    所述酵母反应液是通过将含糖物料与酵母接触反应而获得的。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含糖物料中含有200～600重量份的葡萄糖和10～20重量份的磷酸；
    每毫升所述酵母反应液中无机磷的含量不超过300微克。
  3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含糖物料还含有100～500重量份磷酸氢二钠和100～200重量份的磷酸二氢钠。
  4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为啤酒酵母，所述啤酒酵母以啤酒酵母混悬液的形式提供，以所述葡萄糖的重量份为200～600份计，所述啤酒酵母为混悬液为1000～3000份，所述啤酒酵母混悬液中啤酒酵母固形物的含量为40～70％。
  5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母反应液中果糖二磷酸钠的质量分数为2～10％，所述酵母反应液的pH值为1.0～3.5。
  6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含糖物料与所述酵母的接触温度为34～40摄氏度，pH值为2.0～7.0。
  7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含糖物料与所述酵母的接触温度为37摄氏度。
  8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固液分离处理进一步包括：
    (a)将所述酵母反应液与硅藻土混合，
    (b)将所得到的混合物进行板框过滤，获得滤后液，
    (c)将所述滤后液的pH调节至2.5～3.7。
  9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理进一步包括：
    (2-1)利用所述阴离子交换树脂对所述液相进行吸附处理，获得吸附后树脂；
    (2-2)利用含铵离子的碱性溶液对所述吸附后树脂进行第一清洗；
    (2-3)利用含低浓度氯离子酸性溶液进行第二清洗，然后利用含高浓度氯离子酸性溶液进行第三清洗，收集部分流出液，获得所述树脂提取液，所述含高浓度氯离子酸性溶液中氯离子含量是所述含低浓度氯离子酸性溶液中氯离子含量的1.5～3倍。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2-2)中所述含铵离子的碱性溶液的含有铵离子和氨水，所述含铵离子的碱性溶液的pH值为8～10；
    步骤(2-3)中所述含低浓度氯离子酸性溶液的氯离子的质量分数为1.5～2％，所述含高浓度酸性溶液中氯离子的质量分数为3～4％，所述酸性溶液的pH值为1～3。
  11. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中利用阴离子交换树脂对所述液相进行提取处理进一步包括：
    将所述液相加入到阴离子交换树脂柱上进行吸附处理，弃去流出液；
    将3～5千克铵离子和12升氨水溶于水中，定容至5000升，得到pH值为8～10的A液，将A液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液，然后用纯化水清洗阴离子交换树脂柱，弃去流出液；
    将150～190千克氯离子和200kg无机酸溶于水中，定容至5000升，得到B液，用部分B液与纯化水等体积混合，所获得的混合液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去流出液；然后将所述B液通过所述阴离子交换树脂柱，弃去部分流出液后进行收集，得到所述树脂提取液。
  12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中利用活性炭进行所述脱色处理，所述活性炭的用量为所述树脂提取液质量的5‰～15‰，所述脱色处理的时间为5～30分钟。
  13. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述反渗透处理进一步包括：
    (4-1)对所述脱色过滤液进行水洗脱盐，使得纯化水的加入流量与水洗脱盐过程中产生的废液流量相当，所述水洗脱盐过程中溶液的pH值为3.0～4.5，待溶液中磷酸根的含量小于0.1％和氯离子的含量小于100μg/ml，停止水洗脱盐；
    (4-2)加压浓缩，待溶液比重浓缩至1.05g/ml以上停止。
  14. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述除菌处理包括：
    采用粒径为0.45～1.0微米的滤膜进行初级过滤，然后采用孔径为0.22-0.45微米的滤膜进行一次除菌级过滤。
  15. 一种含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品不含可检测的有机溶剂。
  16. 根据权利要求15所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述无菌制品呈溶液形式。
  17. 根据权利要求16所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述溶液为经过反渗透处理的溶液。
  18. 根据权利要求15所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述无菌制品含有浓度为至少11重量％的果糖二磷酸钠。
  19. 根据权利要求16所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品是利用权利要求1～14任一项所述的方法制备而成。
  20. 根据权利要求18所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品，其特征在于，所述含有果糖二磷酸钠的溶液中游离磷酸盐的含量不超过0.2重量％，氯化物的含量不超过0.03重量％。
  21. 权利要求15～20中任一项所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品在制备果糖二磷酸钠注射液或者在制备果糖二磷酸钠口服液中的用途。
  22. 一种制备果糖二磷酸钠注射液的方法，其特征在于，包括：
    基于含有果糖二磷酸钠的无菌制品，获得含有果糖二磷酸钠的溶液，所述含有果糖二磷酸钠的无菌制品为权利要求15～20中任一项所述的含有果糖二磷酸钠的无菌制品；
    将所述含有果糖二磷酸钠的溶液与注射用水混合精滤，去除粒径在0.45微米以上的杂质，获得精滤后药液，所述精滤后药液的pH值为3.0～4.5；
    将精滤后药液依次进行超滤处理、二次除菌级过滤和三次除菌级过滤，以便获得果糖二磷酸钠注射液。
  23. 根据权利要求22所述的制备果糖二磷酸钠注射液的方法，其特征在于，利用孔径为5000～20000分子量的超滤膜进行所述超滤处理。
  24. 根据权利要求22所述的制备果糖二磷酸钠注射液的方法，其特征在于，采用0.22～0.45微米的微孔过滤器进行所述二次除菌级过滤，采用0.22～0.45微米的除菌级保安过滤器进行所述三次除菌级过滤。
  25. 根据权利要求22所述的制备果糖二磷酸钠注射液的方法，其特征在于，在将所述含有果糖二磷酸钠的溶液与所述注射用水混合精滤之前，进一步包括：
    利用活性炭对所述含有果糖二磷酸钠的溶液处理5～30分钟，所述活性炭的用量为所述含有果糖二磷酸钠的溶液质量的0.5％～1.5％，然后采用0.45～30微米的过滤器进行第一次过滤；
    采用1.0微米的过滤器进行第二次过滤。
  26. 根据权利要求22所述的制备果糖二磷酸钠注射液的方法，其特征在于，进一步包括：
    (b-1)确定所述注射液的比重；
    (b-2)基于所述比重确定所述注射液中所述果糖二磷酸钠的含量；
    在步骤(b-2)中，基于公式y＝2171.4x-2188.9，其中，x是药液比重，y是药液含量确定所述注射液中所述果糖二磷酸钠的含量。
  27. 一种果糖二磷酸钠注射液，其特征在于，所述果糖二磷酸钠注射液根据权利要求22～26中任一项所述的果糖二磷酸钠注射液的制备方法制备而成。
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