티오레독신 1 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체
본 발명은 티오레독신 1(Trx1) 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 에피토프 및 이에 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 유방암 진단용 키트, 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
티오레독신(Thioredoxin, Trx)은 티오레독신 환원효소에 의해 NADPH 의존 환원을 하는 12kDa 정도의 작은 산화환원 단백질로서, 포유류 티오레독신 1(Trx1) 및 티오레독신 2(Trx2)를 포함한다. 티오레독신은 생장인자로서 작용하며, 세포 내에 독성을 미치는 과산화수소를 제거하고, 박테리아에서 리보뉴클레오티드 환원효소로서의 역할 및 전사활동과 관련되는 중요 요소를 DNA에 결합하는 역할을 하며, 진핵세포에서 전사관련 인자인 NF-kB(nuclear transcription factor kB)의 활성에 영향을 미친다. 따라서, 티오레독신은 세포사멸과 종양에 영향을 주어 암세포 성장을 조절하는데 중요한 역할을 하며, 산화된 다른 단백질의 디설파이드 결합을 끊어주어 다시 환원상태의 활성을 가지게 도와준다. 티오레독신 1과 2 효소는 포유동물 세포 내에서 시스테인 아미노산의 산화질소를 제거하여 세포사멸에 영향을 미치고, 염증 질환, 심장마비, 암을 포함한 많은 질병에서 잠재적인 중요성을 갖는다. 또한, 항-티오레독신 항체를 이용한 면역조직화학적 분석은 간, 결장, 췌장 및 자궁경부를 포함하는 인간 암 조직에서 티오레독신의 발현을 나타내고, 이러한 발현은 종양유발 과정에서 티오레독신의 연류 가능성을 가리킨다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 유방암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있는 유방암 진당용 마커에 대해 연구하던 중, 티오레독신 1이 정상 유방 조직에서는 낮게 발현되지만 유방암 조직에서는 매우 높게 발현됨을 확인하고 티오레독신 1이 유방암 진단용 마커로서 유용함을 입증하였다(대한민국 등록특허 제10-1058230호).
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 기반으로 하는 In vitro diagnostics(IVD)를 높은 정확도와 정밀도를 보이도록 개발하기 위하여 같은 항원 단백질의 각각 다른 부위를 높은 친화도(affinity)를 갖는 항체 쌍(2종)이 요구된다. 더불어, 일정한 친화도를 가지는 항체를 적은 금액으로 매번 생산하는 시스템을 갖추는 것도 필요하다. 이에 본 발명에서는 인간 혈청에 존재하는 티오레독신 1(thioredoxin-1, Trx1)을 검출하기 위하여 고성능의 재조합 단일클론항체 2종을 개발하였고, 상기 항체가 티오레독신 1에 매우 특이적으로 결합하여 유방암 환자를 스크리닝 하는데 유용함을 입증하였다. 또한, 상기 2종의 항체가 인간 Trx1 항원에 결합하는 부위를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 높은 민감도와 특이도로 유방암을 진단할 수 있는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체 또는 이의 결합 단편이 결합하는 인간 티오레독신 1 항원의 에피토프, 이를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 유방암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 IgG1 중쇄 및 카파(κ) 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F (ab'), F (ab')2, Fv 또는 단쇄 항체 분자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 경쇄를 코딩하는 핵산분자는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 37의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 중쇄를 코딩하는 핵산분자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 중쇄를 코딩하는 핵산분자, 상기 경쇄를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산분자 모두를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 32 내지 34 및 172 내지 176으로 이루어진 군으로부터 선택한 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 인간 티오레독신 1 항원의 에피토프 및 이를 코딩하는 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 핵산분자는 서열번호 35 내지 37 및 177 내지 181로 이루어진 군으로부터 선택한 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산분자, 경쇄를 코딩하는 핵산 분자, 또는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산분자 모두를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 유방암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 ELISA는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 전술한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유방암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계; (b) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 생물학적 시료에서 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 유방암 환자로 판정하는 단계; 를 포함하는 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은, (a) 고체 지지체를 항체 B266 또는 B266-1의 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 B266 또는 B266-1의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 B266 또는 B266-1 또는 이의 항원 결합 단편으로 코팅하는 단계; (b) 유방암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 코팅된 고체 지지체에 적용하는 단계; (c) 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계; (d) 항체 B264의 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 B264의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 B264 또는 이의 항원 결합 단편으로 고체 지지체에 적용하는 단계; (e) 결합되지 않은 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제거하는 단계; (f) 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (g) 상기 (f) 단계에서 측정된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 유방암 환자로 판정하는 단계; 를 포함하는 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 티오레독신 1 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 샌드위치 ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 중 어느 하나 이상의 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 분리된 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 유방 조직 및 유방 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본원에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
용어 "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있고, 또한 항원의 에피토프에 결합될 수 있는 항체를 생산하기 위하여 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "항체" 또는 "Ab"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 하나 이상의 항원 인식 부위를 통하여 특이적 표적 또는 항원, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등을 인식하고 이와 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 단일클론항체; 다클론항체; 특정 항원(예를 들어, Trx1)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 항체의 "항원 결합 단편", 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, Fc 등; 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 이중특이적 항체; 이종접합체 항체, 그의 돌연변이체; 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편 (예를 들어, 도메인 항체)을 갖는 융합 단백질; 단일 쇄 (ScFv) 및 단일 도메인 항체 [예를 들어, 상어 및 카멜리드(camelid) 항체]; 맥시보디(maxibody), 미니보디(minibody), 인트라보디(intrabody), 디아보디(diabody), 트리아보디(triabody), 테트라보디(tetrabody), v-NAR 및 비스-scFv; 인간화 항체; 키메라 항체; 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 다른 모든 변형된 입체 배치 (항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유적으로 변형된 항체 포함)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 어떠한 유형의 항체도 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 다른 모든 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다.
특정 표적 또는 항원 (예를 들어, Trx1 단백질)과 "특이적으로 결합"하는 항체 또는 폴리펩티드는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 분자는 이것이 또 다른 세포 또는 물질과의 경우보다 더 자주, 더 신속하게, 더 큰 지속성으로 및/또는 더 큰 친화도로 특별한 세포 또는 물질과 반응하거나 연합되는 경우에 "특이적 결합"을 나타내는 것으로 여겨진다. 특정 항체는 이것이 다른 물질과 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합 활성도로, 보다 신속하게 및/또는 더 큰 지속성으로 결합하는 경우에 특정 표적 또는 항원과 "특이적으로 결합"한다.
본원에 사용된 용어 "결합 친화도" 또는 "KD"는 특별한 항원-항체 상호 작용의 평형 해리 상수를 지칭하고자 한다. KD는 해리 속도 ("이탈 속도" 또는 "kd"로 불리우기도 함) 대 결합 속도, 또는 "작동 속도" 또는 "ka(결합속도상수, Association rate constant)"의 비이다. 따라서, KD는 kd/ka이고, 이는 몰 농도 (M)로서 표현된다. KD가 더 작을수록, 결합 친화도는 더 강력해진다는 결론이 나온다. 따라서, 1 μM의 KD는 1 nM의 KD와 비교해서 약한 결합 친화도를 표시한다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 한 가지 방법은, 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore®) 시스템을 사용하여, 표면 플라스몬 공명을 이용하는 것이다.
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 벡터의 한 형태는 "플라스미드"로, 이는 부가의 DNA 절편이 결합될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스 벡터로, 여기에서 부가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 결합될 수 있다. 어떤 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예: 세균 기원 복제를 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예: 비-에피솜 포유동물 벡터)가 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 어떤 벡터는 그들이 작동적으로 연결된(operatively linked) 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터(또는 간단히, "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(예: 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하고자 한다.
용어 "숙주 세포"는 형질전환되거나, 핵산 서열에 의해 형질전환된 다음 선택된 관심 유전자를 발현시킬 수 있는 세포를 의미하기 위하여 사용된다. 상기 용어는 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손이 본래 부모와 형태적으로 또는 유전적 구성면에서 동일하든지 간에, 모 세포의 자손을 포함한다.
본 발명의 단일클론항체는 티오레독신 1에 대한 결합 친화도 우수하여 티오레독신 1에 매우 특이적으로 결합하고, 또한 민감도와 특이도가 매우 높아 유방암 환자를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 기존의 다른 유방암 진단 바이오마커인 CA15-3을 검출하는 것 보다 본 발명의 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 사용하여 티오레독신 1을 검출하는 것이 민감도와 특이도가 월등히 우수하여 유방암 진단의 정확성 및 신뢰성을 현저히 높일 수 있다. 본 발명의 항체가 결합하는 인간 Trx1 항원의 에피토프 부위는 항-Trx1 항체의 결합 친화도를 향상시키기 위한 개량 항체 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 티오레독신 1 항원을 발현하는 재조합 벡터의 개열지도 및 실시예 1에서 획득한 항체의 아이소타이핑(isotying) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 획득한 9G7(AB1) 항체의 경쇄(A) 및 중쇄(B) 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 획득한 2B4(AB2) 항체의 경쇄(A) 및 중쇄(B) 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 친화도가 좋은 항체 B264의 경쇄(A) 및 중쇄(B)를 발현하는 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 친화도가 좋은 항체 B266의 경쇄(A) 및 중쇄(B)를 발현하는 재조합 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 SDS-PAGE를 이용한 항체의 환원(+) 및 비-환원(-) 상태를 확인한 것으로, (A)는 항체 B264를, (B)는 항체 B266을 나타낸다.
도 7은 SDS-PAGE를 이용한 항체 B266-1의 환원(+) 및 비-환원(-) 상태를 확인한 것으로, 상기 항체 B266-1은 항체 B266의 Fc 부분이 인간 IgG1으로 변경된 것이다.
도 8a 내지 8d는 순서대로 항체 B266-1의 경쇄 및 중쇄, 항체 B264의 경쇄 및 중쇄에 대한 IMTG 갭 정렬의 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 항체 B266-1과 B264의 친화도(affinity)를 분석한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 항체 농도에 따른 반응값과 그에 따른 그래프를 나타낸 것이고, (B)는 프리즘(Prism) 프로그램을 이용한 항체의 친화도를 분석한 결과이다.
도 10은 항체 B266-1과 B264를 이용한 ELISA에 의한 결과를 ROC 분석하여 민감도와 특이도를 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 인간 Trx1과 케이프 황금두더지 Trx1의 아미노산 서열 상동성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 12는 CaTrx1을 클로닝한 플라스미드 및 제한 효소 (Sfi I 및 Xho I) 처리를 통한 클로닝 여부를 전기영동으로 확인한 것으로, 레인 1은 CaTrx1을 클로닝한 플라스미드를 나타내고, 레인 2는 제한효소를 처리한 플라스미드를 나타낸다.
도 13은 CaTrx1 플라스미드를 동물세포에 형질전환하여 세포주로부터 분비된 CaTrx1 단백질의 발현 정도를 분석한 것이다.
도 14는 hTrx1 및 CaTrx1에 대한 항체 B266-1 및 B264의 친화도를 분석하여 나타낸 것이다.
도 15a는 CaTrx1과 hTrx1의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 15b는 CaTrx1과 hTrx1의 아미노산 서열 비교에 따른 돌연변이 위치 설정을 나타낸 것이다.
도 15c는 hTrx1의 돌연변이 유전자를 제작하기 위한 융합 PCR의 모식도를 나타낸 것으로, DNA 단편 증폭 및 오버랩핑 PCR을 순차적으로 수행한다.
도 15d는 돌연변이 위치 설정을 하기 위한 DNA 단편의 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 15e는 제작한 DNA 단편을 이용하여 오버래핑 PCR을 통해 카세트 (cassette)를 제작한 결과를 나타낸 것이다.
도 15f는 hTrx1 돌연변이 유전자를 클로닝한 플라스미드를 각각 293F에 형질전환하여 8종의 hTrx1 돌연변이 유전자의 발현을 확인한 것이다.
도 16은 상기 도 15에서 형질전환을 통해 획득한 유전자를 HEK293 인간세포에 형질도입하여 배양 후 배양액 내 분비된 단백질을 SDS-PAGE 기법으로 확인한 것이다. Trx1의 크기는 약 12kda이므로 해당 크기의 단백질을 확인함으로써 형질전환한 8종의 유전자가 발현하여 단백질로 배양액 내 분비된 것을 확인한 것이다.
도 17은 상기 도 16에서 확인한 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질을 정제하여 단백질의 발현 정도를 분석한 것이다.
도 18은 본 발명의 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질에 대한 항-Trx1 항체의 결합력을 분석한 것이다.
도 19는 실시예 17에 사용된 오버랩핑 펩티드 스캔을 이용한 에피토프 검출의 일반적인 원리를 나타낸 모식도이다.
도 20은 실시예 17에서 항체 샘플 중 하나와 배양된 미니-어레이의 이미지이다.
도 21은 항체 샘플과 반응하는 대조군 및 모든 프로브 펩티드의 반응 정도를 보여주는 히트맵 다이아그램으로, y 축은 라이브러리의 펩티드 서열을 나타내고, x 축은 적용된 항체 샘플의 농도를 특정한다. MMC2 값은 흰색(0 또는 낮은 강도)부터 노란색(중간 강도)을 거쳐 붉은색 (높은 강도)까지의 색상 코드 범위로 나타내었다.
도 22a 내지 22f는 hTrx1 단백질의 3차 입체 구조에서 에피토프의 위치를 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 이전 연구를 통해 티오레독신 1이 정상 유방 조직에서는 낮게 발현되지만 유방암 조직에서는 매우 높게 발현됨을 확인하고 티오레독신 1이 유방암 진단용 마커로서 유용함을 입증한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 추가 연구를 통해 티오레독신 1에 매우 특이적으로 결합하여 유방암 환자를 스크리닝 하는데 유용한 단일클론항체를 개발하였다. 본 발명의 단일클론항체는 티오레독신 1에 대한 결합 친화도 우수하여 티오레독신 1에 매우 특이적으로 결합하고, 또한 민감도와 특이도가 매우 높아 유방암 환자를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 기존의 다른 유방암 진단 바이오마커인 CA15-3을 검출하는 것 보다 본 발명의 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 사용하여 티오레독신 1을 검출하는 것이 민감도와 특이도가 월등히 우수하여 유방암 진단의 정확성 및 신뢰성을 현저히 높일 수 있다. 또한, 상기 항체가 결합하는 인간 Trx1 항원의 에피토프 부위는 항-Trx1 항체의 결합 친화도를 향상시키기 위한 개량 항체 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 인간 티오레독신(Thioredoxin-1, Trx1)에 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 단일클론항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합을 이용한 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체는 당해 기술 분야에서 공지된 기법 등의 하이브리도마 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 본원에서 "단일클론항체"라는 용어는, 하이브리도마 기법을 통해 생산되는 항체만을 한정하는 것은 아니다. 용어 "단일클론항체"는 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 파지 클론 등의 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하며, 이의 생산 방법을 지칭하는 것은 아니다.
하이브리도마 기법을 이용한 특이 항체의 생산 및 스크리닝 방법은 당해 기술 분야에서 일상적이며 잘 공지되어 있다. 비제한적인 예로, 마우스를 목적 항원 또는 이러한 항원을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 마우스 혈청에서 항원에 특이적인 항체가 검출되면, 마우스 비장을 회수하여 비장세포를 분리한다. 그 후, 비장세포를 주지의 기법으로 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어, P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등과 융합한다. 하이브리도마를 선별하고, 제한 희석에 의해 클로닝한다. 그 후, 하이브리도마 클론에 대해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포인지를 평가한다. 일반적으로 항체를 높은 수준으로 포함하는 복수는, 양성의 하이브리도마 클론을 마우스 복강에 접종함으로써 만들 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 도 1(A)의 개열지도를 갖는 재조합 벡터를 대장균에 형질감염시켜 Trx1 항원을 제조하였다. 이후, 항원에 의해 면역화된 쥐의 비장을 분리하고 골수종 세포(myeloma cell; sp2/0)와 융합하여 Trx1과 반응하는 항체를 생산하는 세포를 ELISA법으로 확인하였다.
본 발명의 바람직한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (a) 또는 (b)를 포함할 수 있으며, 본원에서 각각 B264, B266 또는 B266-1로 지칭될 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 또는
(b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역.
본 명세서에서, 용어"CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 바람직한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (c) 또는 (d)를 포함할 수 있으며, 본원에서 각각 B264, B266 또는 B266-1로 지칭될 수 있다:
(c) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 또는
(d) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역.
본 발명의 바람직한 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 (e), (f) 또는 (g)를 포함할 수 있으며, 본원에서 각각 B264, B266 또는 B266-1로 지칭될 수 있다:
(e) 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄;
(f) 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄; 또는
(g) 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 및 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄.
본 발명의 바람직한 단일클론항체는 B264, B265, B266, B266-1, B267, B268 또는 B269로 지칭되며, 가장 바람직하게는 B264 또는 B266-1일 수 있다. B266-1은 B266의 Fc 부분이 인간 IgG1으로 변경된 단일클론항체이다.
자연발생적인 항체 구조 단위는 통상 사합체(tetramer)를 포함한다. 상기 사합체는 각각 통상적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 1개의 전장 경쇄(통상 분자량이 약 15kDa임) 및 1개의 전장 중쇄(통상 분자량이 약 50 내지 70kDa임)를 갖는다. 경쇄 및 중쇄 각각의 아미노-말단 부위는 통상적으로 항원 인지에 관여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부위는 통상적으로 효과기 기능에 관여하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 통상적으로 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 통상적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 입실론으로서 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 이소타입을 정의한다. IgG는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 몇 개의 서브클래스를 갖는다. IgM은, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgM1 및 IgM2를 포함한 서브클래스를 갖는다. IgA는 유사하게, 이로써 제한되는 것은 아니지만, IgA1 및 IgA2를 포함한 서브클래스로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 통상적으로 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 통상 항원-결합 부위를 형성한다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 단일클론항체의 중쇄는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA 또는 IgM 이소타입일 수 있고, 경쇄는 카파쇄 또는 람다쇄일 수 있으며, 바람직하게는 카파 경쇄 및 IgG1 중쇄일 수 있다.
본 발명의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, "이의 항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F (ab'), F (ab')2 및 Fv 또는 단쇄 항체 분자 분자 등을 포함한다. 항체 결합 단편 중, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원결합부위를 가진다. F (ab')는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F (ab')2 는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 말한다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고, 예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F (ab')2 단편을 얻을 수 있으며, 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전한 인간 항체일 수 있다.
키메라 항체는 한 종의 항체 생성 세포로부터 수득된 가변 경쇄 및 중쇄 영역(VL 및 VH)과 또 다른 종으로부터의 불변 경쇄 및 중쇄 영역을 조합시킴으로써 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로, 키메라 항체는 주로 인간 도메인을 갖는 항체를 생성시키기 위해 설치류 또는 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 이용한다. 이러한 키메라 항체의 생성은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 표준 수단에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 또는 IgG19 불변 영역으로부터 선택될 수 있음이 추가로 고려된다.
인간화 항체는 더욱 더 인간과 유사한 면역글로불린 도메인을 함유하도록 공학처리되고, 이는 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역만을 포함한다. 이는 모노클로날 항체의 가변 영역의 과가변 루프의 서열을 주의깊게 검사하고, 상기 서열을 인간 항체 사슬의 구조에 적합화시킴으로써 달성된다.
완전한 인간 항체는 CDR을 포함하여 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 전체 서열이 인간 유전자로부터 발생한 항체 분자이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 단일클론항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고, 중쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 단일클론항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 23의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고, 중쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 단일클론항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 27의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있고, 중쇄를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단일클론항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 분자와 경쇄를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 핵산분자 모두를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E.
coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E.
coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Amersham Pharmacia Biotech, USA); 말토스 결합 단백질(NEB, USA); FLAG(IBI, USA); 6x His(hexahistidine; Qiagen, USA), Pre-S1, c-Myc와 같은 태그 서열; ompA, pelB와 같은 선도서열 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포이다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, 대장균(Escherichia
coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus
subtilis) 및 바실러스 츄린겐시스(B. thuringensis)와 같은 바실러스 속 균주(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas
putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus
mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococus
carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 자낭균문(Phylum Ascomycota)에 속하는 아스페츠길루스 속 (Aspergillus spp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora
crassa) 등의 다세포성 곰팡이 (multicellular fungi)와 피치아 파스토리스(Pichia
pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces
cerevisiae), 스키조사카로마세스(Schizosaccharomyces)와 같은 효모를 포함하는 단세포성 곰팡이(unicellular fungi), 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질감염"은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포에 목적하는 유전자를 도입하는 것을 말하며, "형질전환"과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 숙주세포로의 "형질감염"및/또는"형질전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 32 내지 34 및 172 내지 176으로 이루어진 군으로부터 선택한 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 인간 티오레독신 1 항원의 에피토프를 제공한다.
본 발명자들은 hTrx1과 CaTrx1은 아미노산 상동성이 82 %임에도 hTrx1에 대한 본 발명의 항체 2종은 CaTrx1에 대하여 결합하지 않음을 확인하였다 (도 11 및 도 15a). 이에 hTrx1과 CaTrx1의 아미노산 서열이 다른 8부분을 확인하고 (도 15b), hTrx1에 대한 돌연변이 단백질을 발현하기 위한 유전자 카세트 (cassette)를 제작하여 클로닝하였다 (도 15c 내지 15f). 클로닝 산물을 N293F 세포주에 형질전환하고, 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질의 발현을 확인하였으며 (도 16), 각각의 돌연변이 단백질을 정제한 후 (도 17), 항체 B266-1 (hTrx1-hIgG1)과 항체 B264 (hTrx1-mIgG1)와의 결합력을 확인하였다.
도 18에 나타난 바와 같이, 항체 B266-1은 M4 돌연변이 단백질 (YSNVIFGNMV)과의 결합이 hTrx1에 비하여 감소함을 확인하였고, 항체 B264는 M1 (QIESKTAEIEGKED), M2 (QEALDAHAALSS), M4 돌연변이 단백질과의 결합이 hTrx1에 비하여 감소함을 확인하였다. 따라서, 항체 B266-1과 B264는 결합 부위 중 M4 부분 (YSNVI)을 공유할 가능성이 높음을 확인하였다.
추가로, hTrx1 단백질의 아미노산 서열을 아미노산 잔기 1개씩 오버랩핑하여 제작한 108개의 펩티드를 이용하여 마이크로어레이를 실시하였고(도 19 및 20), 히트맵 평가를 통해 항체 B266-1 및 B264의 에피토프를 표 25와 같이 도출하였다(도 21 및 22a 내지 22f).
본 발명은 또한, 전술한 티오레독신 1 항원의 에피토프를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 티오레독신 1 항원의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 32 내지 34 및 172 내지 176으로 이루어진 군으로부터 선택한 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 에피토프를 코딩하는 핵산분자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포에 대한 설명은, 앞서 본 발명의 항체와 관련하여 기술된 내용과 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편 제조를 위한 숙주세포의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다.
동물세포 배양에 사용하는 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예는, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글라이세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 그리고 아세트산과 같은 유기산을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.
숙주세포를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전 및 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피를 이용하는 방법이 가장 많이 사용되며, 컬럼의 종류와 순서는 항체의 특성, 배양방법 등에 따라 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에서 선택할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 유방암 진단 키트 및 이를 이용하여 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 유방암 발병 여부를 확인하는 것이다.
티오레독신 1 단백질은 유방암 진단 마커로서, 정상 유방 조직에 비해 유방암 조직에서 발현 수준이 높게 나타난다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유방암 진단 키트는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 키트일 수 있으며, 바람직하게는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 직접적 샌드위치 ELISA 및 간접적 샌드위치 ELISA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 샌드위치 ELISA 키트에 포함된 2종의 항체는, 코팅 항체로서 단일클론항체 B266-1, 검출 항체로서 단일클론항체 B264가 포함된다.
본 발명의 유방암 진단 키트는 Trx1에 대한 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 도구 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역 확산법, 면역형광분석법, 면역 블롯, 오우크레로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법, 보체 고정 분석법, 면역크로마토그래피 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제, 및 안정화제 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 및 반응 정지제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는, Trx1에 대한 항체는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며, 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 PBS, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형 (비드), 원통형 (시험관 또는 웰 내면), 평면형 (시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 (호스라디시 퍼옥시다제 등), 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제, 루시퍼라아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
효소 발색 기질로서, 예를 들어 효소 표지로서 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 를 선택한 경우에는 기질로 3-아미노-9-에틸카르바졸, 5-아미노살리실산, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산), 3,3-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, o-디아니시딘, 또는 3,3-디메톡시벤지딘 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한, 효소 표지로서 알칼라인 포스파타아제를 선택한 경우에는 기질로 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 니트로블루 테트라졸륨, 또는 p-니트로페닐 포스페이트 포함 용액을 사용할 수 있다. 또한, 효소 표지로서 β-D-갈락토시다제를 선택한 경우에는 기질로 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드 포함 용액을 사용할 수 있다. 이 외에도 당업계에 알려진 다양한 효소 및 효소 발색 기질을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계로 수행될 수 있다:
(a) 본 발명의 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 1 종을 유방암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 접촉시키는 단계;
(b) 항원-항체 복합체 형성을 통해 상기 생물학적 시료에서 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편에 결합된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 유방암 환자로 판정하는 단계.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 유방암에 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 다음의 단계로 수행될 수 있다:
(a) 고체 지지체를 항체 B266 또는 B266-1의 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 B266 또는 B266-1의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 B266 또는 B266-1 또는 이의 항원 결합 단편으로 코팅하는 단계;
(b) 유방암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 상기 코팅된 고체 지지체에 적용하는 단계;
(c) 결합되지 않은 샘플을 제거하는 단계;
(d) 항체 B264의 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항체 B264의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 B264 또는 이의 항원 결합 단편으로 고체 지지체에 적용하는 단계;
(e) 결합되지 않은 단일클론항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제거하는 단계;
(f) 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(g) 상기 (f) 단계에서 측정된 티오레독신 1 단백질의 발현 수준을 대조군과 비교하여, 대조군에 비해 상기 단백질의 발현 수준이 높으면 유방암 환자로 판정하는 단계.
본 발명에서, 용어 "분리된 생물학적 시료"란, 유방암 마커인 Trx1 단백질의 발현 수준이 차이나는 조직(유방 조직), 세포(유방 세포), 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 활액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 또는 파열된 진핵세포 등을 포함하며, 암의 원발 병소 뿐 아니라 전이 병소에서 유래한 시료를 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 단일클론항체와 반응시켜 Trx1 단백질의 발현 수준을 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유 동물, 조류 등을 포함하며, 유방암이 의심되는 개체는 제한없이 포함된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안될 것이다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[
실시예
1]
인간 티오레독신 1(Trx1) 항원 제조
1-1. Trx1 발현 벡터의 제조
인간 티오레독신 1 단백질을 암호화하는 유전자를 대장균에서 발현하기 위하여 대장균 codon usage에 근거하여 유전자를 합성하였다. 합성된 인간 티오레독신 1 유전자 서열은 다음 표 1과 같다.
|
염기서열
|
Trx
1
유전자
|
ATGGTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG (서열번호 29) |
인간 티오레독신 1 유전자를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머 서열은 다음 표 2와 같다.
hTrx1
-For
|
TAATGGTCAAACAGATCGAATC (서열번호 30) |
hTrx1
-Rev
|
CACCAGTTCGTTAATCGTGGTAATGAAAGCT (서열번호 31) |
플라스미드에 클로닝하기 위하여 유전자를 증폭하고자 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. 주형으로 사용하고자 합성한 유전자, 프라이머 (hTrx1-For, hTrx1-Rev) 각각 10 pmol, dNTP (각각 2.5 mM), Exprime Taq polymerase와 완충용액을 첨가하여 혼합한다. 이 용액을 95℃, 2분 반응 후, 95℃ 30 초, 55℃ 30초, 70℃ 20초 반응을 35회 반복 후, 70℃ 2분 반응하고 반응을 종결하였다. 증폭한 유전자를 정제한 후, pUC57 플라스미드의 multi-cloning site(MCS)에 존재하는 EcoR V 위치에 클로닝하기 위하여 플라스미드에 해당 제한효소를 처리하여 정제한다. 정제한 유전자와 제한효소가 처리된 플라스미드, 리가아제(Ligase)와 완충용액을 혼합하고, 반응하였다. 플라스미드를 E.
coli
DH5α로 형질전환하기 위하여 E. coli DH5α competent 세포주를 4℃에서 녹인 후, 플라스미드 혼합용액과 혼합하고 4℃에서 30분 반응하였다. 반응 후, 42℃에서 30초 열충격을 가한 후, 다시 4℃에서 2분 동안 안정화하고, 항생제 (ampicillin 50 ㎍/㎖)를 포함하는 LB(Luria-Burtani) 고체 배지에 분주하여 고르게 흡수시켜 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 배양한 배지에서 자란 콜로니 중 인간 티오레독신 1 유전자를 가지는 플라스미드를 선별하였다.1-2. Trx1의 발현 및 정제
선별된 인간 티오레독신 1 유전자를 가지는 플라스미드를 정제한 후, 단백질을 발현하기 위하여 E.
coli BL21 균주에 위에 언급한 방법에 따라 형질전환하였다. 형질전환된 균주로부터 티오레독신 1 단백질을 발현하기 위하여, 37℃ 하에서 OD600=0.5까지 항생제를 포함하는 LB 액체배지에서 균주를 배양한 후, 1 mM 농도가 되도록 IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 3시간 더 배양하였다. 이후, 단백질 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 이 단백질을 순수 정제하기 위하여 수득한 세포주를 초음파 세포파쇄기(sonication)을 이용하여 파쇄 수, 원심분리 (12,000 rpm, 30 분, 4℃)하여 상등액을 얻었다. 얻은 상등액에 구매한 항 티오레독신 I 항체(LF-MA0055, Abfrontier)를 첨가하여 발현한 티오레독신 I과 결합한 후, 항체와 결합하는 Protein A/G PLUS-Agarose(sc-2003, Santa Cruz)를 첨가하여 반응하고, 원심분리하여 정제하였다. 이후, 순도 및 정량을 SDS-PAGE 상에서 확인하였다.
[
실시예
2]
Trx1에 특이적인 단일클론항체의 생산 및 정제
2-1. 마우스의 면역화
정제된 인간 티오레독신 1 단백질을 생쥐(BALB/c)에 adjuvant와 혼합하여 주사하고 생쥐의 혈액을 채취하여 항체 생성여부를 ELISA 로 확인하였다. 2회 면역 후 항체의 역가(1:5,000)가 적정하게 증가함을 확인하였다.
2-2. 세포 융합 및 하이브리도마의 제조
면역된 생쥐에서 비장을 떼어내어 B 림프구를 분리한 다음, 배양한 골수종(myeloma) 세포(sp2/0)와 융합시켰다. 융합된 세포를 하이포크산틴(hypoxanthine), 아미놉테린(aminopterine) 및 티미딘(thymidine)이 첨가되어 있는 배지(HAT medium)에서 배양하여 골수종과 B 림프구만 융합된 세포(hybridoma)를 선택적으로 선별하여 배양하였다.
2-3. Trx1에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별
얻어진 하이브리도마(hybridoma) 세포 중에서 인간 티오레독신 1 단백질과 반응하는 항체 3종을 ELISA를 이용하여 확인하였다. ELISA 양성반응인 세포를 한계희석법(Limiting dilution method)을 이용하여 항원에 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)를 선별하였다.
2-4. 단일클론항체의 생산 및 정제
획득한 3종의 하이브리도마(hybridoma)를 생쥐에 주입하여 복수를 획득하고, 이를 Protein A affinity chromatography를 이용하여 순수 정제하였다. 정제된 항체는 SDS-PAGE로 확인하였다.
[
실시예
3]
단일클론항체의 이소타입 확인
Rapid ELISA Mouse mAbs Isotyping Kit(Pierce, Cat. 37503) 키트를 사용하여 상기 실시예 2에서 획득한 3종의 항체의 이소타입을 확인하였다.
그 결과, 도 1(B)에 나타난 바와 같이, 단일클론항체 2B4의 중쇄는 IgG1, 단일클론항체 8F3의 중쇄는 IgG12a, 단일클론항체 9G7의 중쇄는 IgG2b로 확인되었으며, 경쇄는 모두 카파(κ)임을 확인하였다.
[
실시예
4]
단일클론항체 9G7(AB1)과 2B4(AB2)의 아미노산 서열 분석
상기 실시예 2에서 획득한 3종의 단일클론항체 중 9G7(AB1)과 2B4(AB2)의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 분석하였다. 역번역(backtranslation)과 재조합 발현(recombination expression)에 적합한 Fc 영역과의 융합이 가능한 서열로서 아미노산 서열을 결정하였다. IMTG 갭(gap) 배열을 통해 결정된 서열을 배열하고, 과돌연변이(hypermutation) 표를 이용하여 과돌연변이 및 완전한 CDR3 부분을 찾았다. 정확한 질량 펩타이드 맵(accurate mass peptide maps) 등을 통해 서열을 확인하고(도 2 및 3), MS/MS 스펙트럼을 이용하여 과돌연변이와 CDR3를 확인하였다.
[
실시예
5]
ELISA를 이용한 친화도 비교 및 항체 결정
상기 과정을 통하여 획득한 아미노산 서열 중 과돌연변이(hypermutation)가 가능한 위치를 선정하였고, 이에 따라 9G7(AB1)은 4종(B266, B297, B268 및 B269)으로, 2B4(AB2)는 2종(B264 및 B265)으로 염기서열에 변화를 주어 유전자를 합성하였다. 얻어진 6종(B264~B269)을 발현하여 각각의 항체의 항원에 대한 친화도를 ELISA를 통하여 확인하였다 (표 3 내지 표 5에 제시된 T 이후 번호는 각각의 생산 batch 번호를 나타냄).
3 가지 종류의 항원, 즉, 아무것도 결합하지 않은(naked) Trx1, Fc가 결합된 Trx1(Trx1-Fc) 및 His 태그가 결합된 Trx1(Trx1-His) 각각에 대하여 직접(direct) ELISA를 통해 친화도를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3 내지 5에 순서대로 나타냈다. 표 3 내지 5에 나타난 바와 같이, IgG1(κ)는 B264, IgG2b(κ)는 B266이 3가지 항원에 대하여 가장 좋은 친화도를 나타냈다.
아무것도 결합하지 않은 Trx1 항원에 대한 반응 결과
Antibody ID |
5000Х(OD Value) |
AB264-T150514-7 |
2.0575 |
B265-T150514-10 |
1.3225 |
AB264-T150514-8 |
1.1635 |
B265-T150514-9 |
0.9515 |
B267-T150519-5 |
0.8155 |
B269-T150519-9 |
0.735 |
B268-T150519-8 |
0.716 |
B268-T150519-7 |
0.670 |
B266-T150519-3 |
0.6625 |
B266-T150519-4 |
0.6615 |
B269-T150519-10 |
0.626 |
B267-T150519-6 |
0.522 |
Trx1-Fc 항원에 대한 반응 결과
Antibody ID |
5000Х(OD Value) |
AB264-T150514-7 |
1.171 |
AB264-T150514-8 |
0.494 |
B265-T150514-10 |
0.378 |
B265-T150514-9 |
0.273 |
B266-T150519-3 |
0.198 |
B266-T150519-4 |
0.181 |
B267-T150519-5 |
0.043 |
B267-T150519-6 |
0.023 |
B268-T150519-8 |
0.015 |
B268-T150519-7 |
0.003 |
B269-T150519-9 |
0.002 |
B269-T150519-10 |
-0.001 |
Trx1-His 항원에 대한 반응 결과
Antibody ID |
5000Х(OD Value) |
AB264-T150514-7 |
1.996 |
B265-T150514-10 |
1.465 |
AB264-T150514-8 |
1.142 |
B265-T150514-9 |
1.03 |
B267-T150519-5 |
0.857 |
B268-T150519-8 |
0.783 |
B269-T150519-9 |
0.77 |
B268-T150519-7 |
0.761 |
B269-T150519-10 |
0.717 |
B266-T150519-3 |
0.696 |
B266-T150519-4 |
0.667 |
B267-T150519-6 |
0.554 |
친화도가 높은 항체 B264 및 B266의 아미노산 서열은 하기 표 6과 같다.
|
아미노산 서열 |
B264 경쇄 |
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열번호 17) |
B264 중쇄 |
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPTSDYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEGGFLYYFDYWGQGTTLTVSSASTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(서열번호 18) |
B266 경쇄 |
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRISYMYWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(서열번호 19) |
B266 중쇄 |
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALLQYSAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPG(서열번호 20) |
[
실시예
6]
항체 B264 및 B266의 생산
6-1. 항체 B264 및 B266의 발현 플라스미드 제조
상기 표 6과 같이 항체 B264 및 B266의 아미노산 서열이 밝혀졌기 때문에 상기 항체들의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 유전자를 화학적으로 합성하는 것이 가능하다. 합성된 유전자 서열은 하기 표 7에 나타냈다. 합성된 유전자는 pcDNA3.0 에 클로닝하였다.
|
유전자 서열 |
B264 경쇄 |
GACGTGCTGATGACACAGACACCACTCAGCCTCCCTGTGAGCCTGGGCGACCAGGCCTCTATTTCTTGCCGGTCTAGCCAGAGCATCGTGCACTCCAACGGCAACACATACTTGGAGTGGTATCTACAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTAAGCTGCTGATATACAAGGTGTCTAACCGCTTCTCCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTCAAAATATCTAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCTCCCACGTTCCATACACATTCGGCGGCGGCACAAAGTTGGAAATTAAGCGCGCTGACGCAGCCCCAACAGTGAGCATCTTTCCTCCATCCTCTGAACAACTTACCTCTGGAGGAGCCTCTGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTACCCAAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATTGATGGCTCTGAGAGACAGAATGGAGTGCTGAACTCCTGGACAGACCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGTATGAGTAGCACCCTGACCCTGACCAAGGATGAATATGAGAGACACAACTCCTACACTTGTGAGGCTACCCACAAGACCAGCACCAGCCCAATTGTCAAATCCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA (서열번호 21) |
B264 중쇄 |
CTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATAA (서열번호 22) |
B266 경쇄 |
CAGATCGTGCTCACACAGTCTCCAGCCATCATGAGCGCCTCTCCTGGCGAGAAGGTGACAATGACCTGCTCTGCCTCTAGCCGCATTTCTTACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCTAAGAGGTGGATATACGACACATCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCCGGTTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACAAGCTACTCCCTGACAATTAGCACGATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACATACTACTGCCACCAGCGCTCGTCCTACCCAACATTCGGCGCCGGCACAAAATTGGAACTGAAGAGAGCTGACGCAGCCCCAACAGTGAGCATCTTTCCTCCATCCTCTGAACAACTTACCTCTGGAGGAGCCTCTGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTACCCAAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATTGATGGCTCTGAGAGACAGAATGGAGTGCTGAACTCCTGGACAGACCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGTATGAGTAGCACCCTGACCCTGACCAAGGATGAATATGAGAGACACAACTCCTACACTTGTGAGGCTACCCACAAGACCAGCACCAGCCCAATTGTCAAATCCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA(서열번호 23) |
B266 중쇄 |
CAATTTCTAAGATTAAGGGCCTGGTGCGCGCCCCTCAGGTGTACATTCTGCCTCCTCCCGCCGAGCAGCTGAGCCGGAAGGACGTGTCCCTCACATGCCTCGTGGTGGGCTTCAACCCTGGCGACATTAGCGTGGAGTGGACATCTAACGGCCACACAGAAGAAAACTACAAGGACACAGCCCCTGTGCTCGACTCCGACGGCTCTTACTTCATATACTCTAAGCTGAACATGAAAACATCTAAGTGGGAAAAGACCGACTCTTTCTCTTGCAACGTGCGGCACGAGGGCCTGAAGAACTACTACCTCAAGAAAACCATTAGCAGAAGTCCAGGCTAA (서열번호 24) |
6-2. 항체 B264 및 B266의 발현 및 정제
B264 항체를 발현하기 위하여 pcDNA3-SSJ11-L과 pcDNA3-SSJ11-H를, B266 항체를 발현하기 위하여 pcDNA3-SSJ12-L와 pcDNA3-SSJ12-H를 HEK293 세포주에 공동 형질감염(co-transfection)하여 7일 동안 배양하였다. 세포주를 배양하며 배양액으로 분비된 재조합 단일클론항체를 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 수득 및 정제하였다. 재조합 단일클론항체를 포함하는 용리제(eluent)를 한외여과(ultrafiltration)로 농축하고, 0.2 ㎛ 멸균필터를 이용하여 걸러 고순도의 항체를 수득하였다.
순수 정제된 항체는 SDS-PAGE를 통하여 순도와 크기 등을 확인하였다. SDS-PAGE 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 항체 B264 및 B266은 환원(reducing) 조건에서 중쇄가 47 kDa, 경쇄가 25 kDa으로, 비환원(non-reducing) 조건에서 150 kDa 으로 예상한 크기에 부합하게 발현됨을 확인하였다.
[
실시예
7]
샌드위치(Sandwich) ELISA를 통한 획득된 2종의
단일클론항체의
페어링
(pairing) 여부 확인
웰(well) 당 100 ㎕ 코팅 버퍼(coating buffer) (0.015 M Na2CO3, 0.035 M NaHCO3, 0.003 M NaN3, pH9.6)와 100 ng 코팅 항체(coating antibody, B266)를 섞어 분주 후, 4℃, O/N 반응하였다. 1% BSA를 포함하는 PBS(PBSA; 차단 버퍼)를 웰 당 200 ㎕ 분주한 후, 상온에서 60분 반응하였다. 이후 항원(50, 25, 12.5 또는 0 ng) 20 ㎕를 분주하고, 검출 항체(비오틴-표지된 B264; B264-B) 80 ㎕를 분주한 후, 37℃, 90분 반응하였다. 반응용액을 제거한 후, 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS(PBST; 세척 버퍼)를 웰 당 200 ㎕ 분주하여 세척하였다. 상기의 과정을 3회 처리하였다.
1:200으로 희석한 스트렙타비딘-HRP를 웰 당 100 ㎕ 을 처리한 후, 37℃, 30분 반응시키고, 반응용액을 제거한 후, 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS(PBST; 세척 버퍼)를 웰 당 200 ㎕ 분주하여 세척하였다. 상기의 과정을 3회 처리하였다.
웰 당 TMB 용액 100 ㎕를 분주한 후, 암조건, 상온 하에서 10분 반응시키고, 웰 당 2.5 M 황산 용액(H2SO4; STOP buffer) 100 ㎕를 처리한 후, 450 nm에서 결과를 확인하였다.
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 항원에 농도에 따라 반응값이 증가함을 확인함으로써 이들의 항체가 항원을 검출하는 것으로 확인되었다. 단, 항원이 없는 경우의 O.D. 측정치가 높으므로 항체를 이용한 성능 향상 실험이 요구된다.
코팅 항체로 B266, 검출 항체로 B264를 사용한 샌드위치 ELISA
Trx1 (ng/㎖) |
0 |
12.5 |
25 |
50 |
O.D.450nm
|
0.828 |
1.226 |
1.506 |
2.257 |
[
실시예
8]
항체의 성능 향상을 위한
Fc
부분
이소타입
변경
항체의 발현시스템이 하이브리도마를 이용하는 것이 아닌 재조합 플라스미드를 이용한 일시적인 형질감염(transient transfection)이므로, 재조합 플라스미드 중 중쇄를 가진 플라스미드를 다른 이소타입의 중쇄를 가진 플라스미드로 공동 감염시켰다. 즉, 9G7(AB1)을 발현하기 위하여 사용하는 pcDNA3-SSJ12-L와 pcDNA3-SSJ12-H 중 pcDNA3-SSJ12-H가 아닌 다른 중쇄를 암호화하는 유전자를 가진 플라스미드를 공동 형질감염하였다.
이러한 방법을 통하여 B266의 Fc 부분이 인간 IgG1으로 변경된 항체(B266-1)를 획득하였다. 이 항체를 SDS-PAGE를 통하여 성상을 확인하였다(도 7).
최종적으로 선정된 단일클론항체 B264 및 B266-1의 CDR 서열은 역번역(back translation) 및 재조합 발현을 위한 적합한 Fc 영역과의 융합을 통해 결정되었다.
IMTG 갭 정렬(IMTG GAP alignment)은 IMTG 데이터베이스와 "결정된 서열(determined sequence)"정렬이며, 가장 가까운 생식세포계열 (germline) 서열과 초돌연변이(hypermutation)는 데이터베이스 검색을 통해 밝혔다. 항체 B266-1 및 B264 각각의 경쇄 및 중쇄에 대한 IMTG 갭 정렬의 결과는 도 ~~ 내지 ~~에 나타내었고, 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 중쇄 CDR1 내지 CDR3의 아미노산 서열은 표 9에 나타내었으며, 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열은 표 10에 나타내었다, 또한, B266-1 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 및 유전자 서열은 표 11에 나타내었다.
|
아미노산 서열 |
B264 경쇄 CDR1 |
QSIVHSNGNTY (서열번호 1) |
B264 경쇄 CDR2 |
KVS (서열번호 2) |
B264 경쇄 CDR3 |
CFQGSHVPYT (서열번호 3) |
B264 중쇄 CDR1 |
GYTFTSYT (서열번호 4) |
B264 중쇄 CDR2 |
INPTSDYTN (서열번호 5) |
B264 중쇄 CDR3 |
FCASEGGFLYYFDY (서열번호 6) |
B266-1 경쇄 CDR1 |
SRISY (서열번호 7) |
B266-1 경쇄 CDR2 |
DTS (서열번호 8) |
B266-1 경쇄 CDR3 |
CHQRSSYPTF (서열번호 9) |
B266-1 중쇄 CDR1 |
GFNIKDTF (서열번호 10) |
B266-1 중쇄 CDR2 |
IDPANGNT (서열번호 11) |
B266-1 중쇄 CDR3 |
CALLQYSAMDY (서열번호 12) |
|
아미노산 서열 |
B264 경쇄 가변영역 |
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIK (서열번호 13) |
B264 중쇄 가변영역 |
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTSYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPTSDYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCASEGGFLYYFDYWGQGTTLTVSS (서열번호 14) |
B266-1 경쇄 가변영역 |
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRISYMYWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGAGTKLELK (서열번호 15) |
B266-1중쇄 가변영역 |
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALLQYSAMDYWGQGTSVTVSS (서열번호 16) |
|
서열 |
B266-1 경쇄아미노산 서열 |
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRISYMYWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCHQRSSYPTFGAGTKLELKSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 25) |
B266-1 중쇄아미노산 서열 |
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCALLQYSAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 26) |
B266-1 경쇄유전자 서열 |
CAGATCGTGCTCACACAGTCTCCAGCCATCATGAGCGCCTCTCCTGGCGAGAAGGTGACAATGACCTGCTCTGCCTCTAGCCGCATTTCTTACATGTACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCACCTCCCCTAAGAGGTGGATATACGACACATCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCGCCCGGTTCAGCGGCTCTGGCAGCGGCACAAGCTACTCCCTGACAATTAGCACGATGGAGGCCGAGGACGCCGCCACATACTACTGCCACCAGCGCTCGTCCTACCCAACATTCGGCGCCGGCACAAAATTGGAACTGAAGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호 27) |
B266-1 중쇄유전자 서열 |
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 28) |
[
실시예
9]
샌드위치 ELISA를 통한 획득된 B266-1과 B264의
단일클론항체의
페어링
여부 확인
웰 당 100 ㎕ 코팅 버퍼와 100 ng 코팅 항체(B266-1)를 섞어 분주 후, 4℃, O/N 반응시키고, 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼를 분주하여 세척하였다. 이 과정을 2회 처리하였다.
웰 200 ㎕ PBSA를 분주한 후, 상온에서 120분 반응시키고, 항원(25 또는 0 ng) 20 ㎕를 분주하고, 검출 항체(B264-B) 80 ㎕를 분주한 후, 37℃, 90분 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼를 분주하여 세척하였다. 이 과정을 3회 처리하였다.
1:200으로 희석한 스트렙타비딘-HRP를 웰 당 100 ㎕ 을 처리한 후, 37℃, 30분 반응시키고, 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼를 분주하여 세척하였다. 이 과정을 3회 처리하였다.
웰 당 TMB 용액 100 ㎕를 분주한 후, 암조건, 상온 하에서 10분 반응시키고, 웰 당 정지 버퍼 100 ㎕를 처리한 후, 450 nm에서 결과 확인하였다.
그 결과, 표 12에 나타난 바와 같이 항원에 적절하게 반응함을 확인하였고, 실시예 6에서 사용한 항체에 비해 블랭크(blank) 값이 감소함을 확인하였다.
코팅 항체로 B266-1, 검출 항체로 B264를 사용한 샌드위치 ELISA
Trx1 (ng/㎖) |
0 |
25 |
O.D.450nm
|
0.425 |
0.415 |
1.571 |
1.426 |
[
실시예
10]
항원에 대한
단일클론항체의
친화도 분석
항원 Trx1에 특이적으로 작용하는 2종의 단일클론항체는 플라스미드를 이용한 일시적 형질감염 시스템을 이용하여 발현됨으로써 안정적으로 생산된다. 이에 항원에 대한 친화도(affinity)를 확인하기 위하여 ELISA를 이용하여 분석하였다(도 9A).
웰 당 100 ㎕ 코팅 버퍼와 100 ng Trx1을 섞어 분주 후, 4℃, 16시간 이상 반응시키고, 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ PBSA를 분주하여 37℃, 120분 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후, 제작된 항체 B266-1 또는 B264 항체를 0.1 μM 부터 1/5로 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 분주하고, 37℃, 120분 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼를 분주하여 세척하였다. 이 과정을 3회 처리하였다.
항체 B266-1은 인간 IgG-HRP(1:4000으로 희석)를, B264는 마우스 IgG-HRP(1:4000으로 희석)를 각각 100 ㎕ 분주하고, 37℃, 60분 반응시켰다. 반응용액을 제거한 후, 웰 당 200 ㎕ 분주하여 세척하였다. 이 과정을 3회 처리하였다.
웰 당 TMB 용액 100 ㎕를 분주한 후, 암조건, 상온 하에서 10분 반응시키고, 웰 당 정지 버퍼 100 ㎕을 처리한 후, 450 nm에서 결과를 확인하였다. 획득한 결과값은 Prism (Graphpad사)을 이용하여 분석하였다(도 9B).
코팅 항체 B266-1과 검출 항체 B264의 친화도를 분석한 결과, B266-1의 반응력으로 인하여 블랭크(blank) 값이 높으나, B266-1과 B264은 항원의 농도가 증가함에 따라 결합 정도도 증가함을 확인하였다. 이는 B266-1과 B264가 항원과 결합함을 나타낸다. Prism 프로그램을 이용한 분석에 따라 KD (equilibrium dissociation constant)값을 구하면 B266-1은 1.1x10-11, B264는 1.3x10-10였다. KD 값이 10-10에서 10-12 사이일 경우 피코몰(pM) 수준의 항원에 대한 민감도를 가지는 것으로 평가되므로, B266-1과 B264는 높은 수준의 항원에 대한 민감도를 갖는다는 것을 알 수 있다.
[
실시예
11]
유방암 환자의 혈청에서의 샌드위치 ELISA 시험
코팅 항체 (B266-1)를 이용한 샌드위치 ELISA를 다음과 같은 과정으로 준비하였다.
코팅 버퍼 100 ㎖과 1 ㎎/㎖ 농도의 B266-1 0.1 ㎖을 첨가하여 1 ㎍/㎖ 농도의 코팅 항체 용액을 제조하였다. 제조된 코팅 항체 용액을 각 96-웰 플레이트의 웰 당 100 ㎕씩 분주한 후, 4℃, 12시간 반응시켰다. 항체 용액을 제거하고, 웰 당 200 ㎕ 0.05% PBST를 분주하여 세척하였다. 이 세척 과정을 3번 반복하였다. 웰 당 200 ㎕ PBSA를 처리하고, 4℃, 4시간 반응(차단 공정)시켰다. PBSA를 제거하고, 96-웰 플레이트를 항온항습기 (20℃, 30% R.H.)에서 3시간 건조시켰다.
다음으로, 검출 항체 (B264)를 다음과 같은 과정으로 비오틴화(biotinylation)하였다.
20 ㎎/㎖ 비오틴-7-NHS에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 섞어 2 ㎎/㎖ 비오틴-7-NHS를 만들었다. 1㎎/㎖ B264 항체당 2 ㎎/㎖ 비오틴-7-NHS 15㎕(30㎍)를 섞어 15~25℃, 2시간 반응시켰다. 아미콘 울트라-15(Millipore)에 반응용액을 넣고, PBS 용액으로 최종부피까지 채워준 후, 0.5 ㎖가 남을 때까지 3,600xg로 원심분리 하였다. 이 과정을 3번 반복하였다. 아미콘 필터 내부에 남은 항체 용액(비오틴화된 B264; B264-B)을 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴 후, PBSA를 이용하여 최종 농도를 0.3 ㎎/㎖로 만들었다.
다음으로, 유방암 환자의 혈청으로부터 인간 Trx1 항원 검출을 다음과 같은 과정으로 수행하였다.
코팅 항체로 코팅하여 준비한 96-웰 플레이트의 첫 번째 줄(column)에 표준항원용액을 분주하였다. 20 ㎕ 유방암 환자로부터 획득된 혈청을 분주한 후, 80 ㎕(0.3 ㎎/㎖) B264-B 용액을 분주하였다. 이후 37℃, 60분 반응시킨 다음, 항원 및 항체 반응용액을 제거하고, 웰 당 200 ㎕ PBST를 분주하여 세척하였다. 이 세척 과정을 3번 반복하였다. 1:400으로 희석한 스트렙타비딘-HRP(R&D Systems) 100 ㎕를 분주하고 37℃, 30분 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응용액을 제거하고, 웰 당 200 ㎕ PBST를 분주하여 세척하였다. 이 세척 과정을 3번 반복하였다. 100 ㎕ TMB 용액(Sure Blue)를 처리하고 상온, 15분 동안 암조건하에서 반응시켰다. 2N H2SO4 용액 100 ㎕을 분주하고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm 흡광도로 측정하였다.
마지막으로, ROC 분석을 다음과 같은 과정으로 수행하였다.
Trx1에 대한 단일클론항체인 B266-1과 B264를 이용한 ELISA에 의한 결과를 분석하여 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 계산하였다. 컷-오프 값(cut-off value)이 10.8 ng/㎖일 때, 민감도는 93.0%, 특이도는 97.4%임을 확인하였다(도 10).
[
실시예
12]
유방암을 진단하는 다른 ELISA
키트와의
비교 분석
본 실시예에서는 재조합 단일클론항체인 B266-1과 B264의 성능을 평가하기 위하여, 유방암 여부를 진단하는 다른 바이오마커인 CA15-3을 검출하는 다른 ELISA 키트와 비교 분석하였다(표 13).
그 결과, 표 13에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Trx1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 사용 시, 민감도 및 특이도가 CA15-3에 비해 월등히 높았다.
본 발명의 키트와 AxSYM CA15-3 키트 비교
|
Trx1 |
CA15-3 (AxSYM) |
Sensitivity(%) |
93 |
54 |
Specificity(%) |
97.4 |
94 |
Test sample |
Serum |
Serum과 plasma |
[
실시예
13]
케이프
황금두더지
(
Chrysochloris
asiatica
)
Trx1
단백질의 발현
13-1. 인간
Trx1
(
hTrx1
) 및
케이프
황금두더지
Trx1(CaTrx1)의
서열 비교
인간 Trx1과 구조적으로 유사하나 아미노산 서열의 유사성이 낮은 케이프 황금두더지 (Chrysochloris asiatica) Trx1과의 아미노산 서열을 비교한 결과, 82%의 상동성을 나타냄을 확인하였다 (도 10).
공지된 CaTrx1의 염기서열(NCBI Accession Number XM_006863001.1)을 이용하여 유전자를 합성하였고, 이 유전자를 대장균에서 보관하기 위하여 pUCIDT-AMT 플라스미드에 클로닝하였다. 클로닝한 플라스미드는 제한효소 Sfi I과 Xho I를 처리하여 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 제한효소를 처리한 플라스미드 (레인 2)는 플라스미드로부터 잘린 357bp의 DNA 절편이 확인되어, 이를 통해 CaTrx1 유전자가 합성되었음을 확인하였다(도 12의 화살표).
13-2.
CaTrx1
단백질의 발현
상기 실시예 13-1에서 제조된 CaTrx1 플라스미드를 동물세포에 형질전환하여 세포주로부터 분비된 CaTrx1을 정제하였고, 그 단백질을 15% SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 13의 레인 1과 2는 CaTrx1 형질전환체 세포 배양액 내 총 단백질 5 ㎍과 10 ㎍을, 레인 3은 대조군 단백질 (BSA; Bovine Serum Albumin) 3 ㎍을 나타낸 것으로, 정제한 CaTrx1 단백질은 28.75 ㎎/ℓ의 생산성을 나타냄을 확인하였다.
[
실시예
14]
인간
Trx1
(
hTrx1
)에 대한 항체 2종과
CaTrx1의
친화도 확인
본 실시예에서는 B266-1 (Trx1-hIgG1) 및 B264 (Trx1-mIgG1)의 항체 2종과 CaTrx1의 결합 친화도를 확인하였다.
B266-1 (Trx1-hIgG1)과 B264 (Trx1-mIgG1)의 hTrx1 및 CaTrx1에 대한 결합 친화도를 확인하기 위하여, 96-웰 ELISA 플레이트에 hTrx1 200ng 및 CaTrx1 10 ㎍를 각각 코팅하고, 차단 버퍼 (4% Skim milk/1x PBS)를 웰 당 200㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 반응한다. 반응액을 제거하고 B266-1 (Trx1-hIgG1)과 B264 (Trx1-mIgG1)를 각 항원이 코팅되어 있는 웰에 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 2시간 반응한다. 반응액을 제거하고 1x PBST 200㎕로 총 5회 반복하여 세척을 수행한다. B266-1 (Trx1-hIgG1)을 처리한 웰에는 항-인간 Fc-HRP를, B264 (Trx1-mIgG1)를 처리한 웰에는 마우스-HRP를 1:4000의 비율로 희석하여 100㎕씩 분주하고 37℃에서 2시간 반응한다. 반응액을 제거하고 1x PBST 200㎕로 총 5회 반복하여 세척을 수행한다. 발색시약을 웰당 100㎕씩 분주하고 10분간 반응한 후 2.5M H2SO4를 웰당 50㎕씩 분주한다. 발색 완료 후 ELISA 리더기로 측정한다.
B266-1 (Trx1-hIgG1)과 B264 (Trx1-mIgG1)의 hTrx1에 대한 결합 친화도를 확인한 결과, 하기 표 14에 나타난 바와 같이 200ng 항원에 대하여 B266-1은 KD=2.1x10-10 M, B264는 KD=1.7x10-
10 M임을 확인하였다. 또한, 도 14A를 통해 B266-1에 비하여 B264의 결합에 의한 반응 수치 (OD 490)가 50% 정도로 낮음을 알 수 있었다.
CaTrx1 10㎍에 대한 항체 B266-1과 B264의 결합 친화도를 확인한 결과, 도 14B 및 표 14에 나타난 바와 같이 2종의 항체 모두 CaTrx1과 결합하지 않음을 알 수 있었다.
|
hTRX1 |
CaTRX1 |
|
KD (M) |
R2
|
KD (M) |
R2
|
B266-1 |
2.1x10-10
|
0.99 |
결합하지 않음 |
결합하지 않음 |
B264 |
1.7x10-10
|
0.99 |
결합하지 않음 |
결합하지 않음 |
[
실시예
15]
인간
Trx1
(
hTrx1
)에 대한 돌연변이 항원 제작
15-1.
hTrx1과
CaTrx1
간의 아미노산 서열 분석을 통한 돌연변이 위치 설정
공지된 hTrx1 (NCBI Accession Number NP_003320.2)의 아미노산 서열과 CaTrx1의 아미노산 서열(NCBI Accession Number XP_006863063.1)을 비교하였다. 도 15a에 나타난 바와 같이 hTrx1과 CaTrx1의 아미노산 서열 상동성이 82%임에도 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 현저히 다르기 때문에, 아미노산 서열이 다른 부분을 8개의 부분으로 구분하였다 (도 15b).
15-2. 돌연변이 단백질 발현을 위한 융합
PCR
및
클로닝
A) 단편 PCR
상기 실시예 15-1에서 확인한 아미노산 서열이 다른 부분 8곳을 hTrx1의 서열에서 CaTrx1의 서열로 치환하여 돌연변이주 제작을 위한 카세트 (cassette)의 DNA 단편을 증폭하였다 (도 15d).
구체적으로, 각각의 돌연변이 단백질을 발현하기 위한 유전자를 제작하기 위해서는 융합 PCR을 수행하기 위한 2개의 DNA 단편이 증폭되어야 한다. 따라서, 염기서열의 돌연변이가 필요한 부분을 포함하는 프라이머 2종 (F2 및 R1; 도 15c 및 표 15)을 제작하고, 프라이머 F1과 R1, F2와 R2를 각각 쌍으로 하여 DNA 단편을 증폭하였다. DNA 단편을 증폭하기 위하여 25 ㎕ 2xEF-Taq PCR smart mix band (Solgent, SEF02-M50h)에 주형 DNA (100-200 ng)와 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 10 pmol) 1 ㎕씩 첨가하고, 최종 부피를 멸균 증류수로 적정하여, 잘 섞은 후 PCR 기기 (Thermal cycler, T100)로 증폭하였다.
목적 |
프라이머이름 |
서열 (5'->3') |
도 15c에서의 프라이머 역할 |
서열번호 |
단편증폭 |
벡터-F |
GGCGTGTACGGTGGGAGGT |
F1 |
서열번호 46 |
벡터-R |
AGCAGCGTATCCACATAGCG |
R2 |
서열번호 47 |
TRX1-M1 돌연변이 |
TRX M1-F |
CATCACGTCAAAGAGATCGAAGGCAAAGAAGATTTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCT |
F2 |
서열번호 48 |
TRX M1-R |
GGCTTCTTGAAAATCTTCTTTGCCTTCGATCTCTTTGACGTGATGATGATGATGATGAT |
R1 |
서열번호 49 |
TRX1-M2 돌연변이 |
TRX M2-F |
AAAACCGCATTTCATGCTGCCCTGAGCAGTGCTGGTGACAAACTGGTCGTGG |
F2 |
서열번호 50 |
TRX M2-R |
TTTGTCACCAGCACTGCTCAGGGCAGCATGAAATGCGGTTTTTGATTCGATCTG |
R1 |
서열번호 51 |
TRX1-M3 돌연변이 |
TRX-M3-OV-F |
ATTAAACCGTTTTATCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAG |
F2 |
서열번호 52 |
TRX-M3-OV-R |
AGACAGGCTATGATAAAACGGTTTAATCATTTTACACGGGCCGCACCAGG |
R1 |
서열번호 53 |
TRX1-M4 돌연변이 |
TRX-M4-OV-F |
CTGTCTGAAAAATTTGGCAACATGGTGTTCCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGC |
F2 |
서열번호 54 |
TRX-M4-OV-R |
ATCCACTTCCAGGAACACCATGTTGCCAAATTTTTCAGACAGGCTATGGAAAAACGGTTTAATCATTTTACAC |
R1 |
서열번호 55 |
TRX1-M5 돌연변이 |
TRX-M5-OV-F |
GTGAAATGTATGATAACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAAT |
F2 |
서열번호 56 |
TRX-M5-OV-R |
AAACTGGAACGTTATCATACATTTCACTTCGCATTCGCTCGCGACGTCC |
R1 |
서열번호 57 |
TRX1-M6 돌연변이 |
TRX-M6-OV-F |
ACGTTCCAGTTTTATAAAAAAAGGGAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACT |
F2 |
서열번호 58 |
TRX-M6-OV-R |
TTCACCGACTTTTTCCCTTTTTTTATAAAACTGGAACGTCGGCATACATTTCACTTCGCATTCG |
R1 |
서열번호 59 |
TRX1-M7 돌연변이 |
TRX-M7-Xho-R |
GAATTCTCGAGCTATCACACCAGTTCGTTAATCGTGGCTTCCAGTTTTTCTTTGTTAACACCGCTAAATTCACCGACTTTTTGA |
F2 |
서열번호 60 |
TRX1-M8 돌연변이 |
TRX-M8-Xho-R |
GAATTCTCGAGCTATCAACACAGTTCGTTAATGATGGCTTCCAGTTTTTCTTTGTTGGC |
R1 |
서열번호 61 |
콜로니 PCR |
N293F-colo-F |
GGCGTGTACGGTGGGAGGT |
- |
서열번호 62 |
N293F-colo-R |
AGCAGCGTATCCACATAGCG |
- |
서열번호 63 |
PCR 반응 조건은 예비 변성(pre-denaturation)을 위한 95 ℃, 2분, 1 사이클, 증폭 과정인 95 ℃, 20 초; 62 ℃, 40초; 및 72 ℃, 1분의 3 단계를 30 사이클, 후 신장(post-extension)을 위한 72 ℃, 5분, 1 사이클을 수행한 후, 반응을 종결하였다. 증폭한 DNA 단편을 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다 (도 15d). 유전자를 정제하기 위하여 QIAquick gel Extraction Kit (QIAGEN, 28704)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 시험하였다.B) 2종의 DNA 단편을 융합하기 위한 융합 PCR 및 PCR 산물 정제
증폭된 DNA 단편을 융합하기 위하여 두 DNA 단편과 프라이머 F1 및 R2를 이용하여 PCR을 수행하였다 (도 15c). 융합 PCR을 위한 PCR 혼합물은 25 ㎕ 2xEF-Taq PCR smart mix band (Solgent, SEF02-M50h)에 2종의 DNA 단편 DNA 각각 100-150 ng과 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 10 pmol) 1 ㎕씩 첨가하고, 최종 부피를 멸균 정제수로 적정하여, 잘 섞은 후 PCR 기기로 증폭하였다. PCR 반응 조건은 예비 변성(pre-denaturation)을 위한 95 ℃, 2분, 1 사이클, 증폭 과정인 95 ℃, 20 초; 62 ℃, 40초; 및 72 ℃, 1 분의 3단계를 30 사이클, 후 신장을 위한 72 ℃, 5 분, 1 사이클을 수행한 후, 반응을 종결하였다. 반응 종결 후, PCR 산물을 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다 (도 15e).
융합 PCR 반응 종결 후, 생산된 PCR 산물은 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다. 증폭한 PCR 산물에 3 M 아세트산 나트륨 (pH 5.2)을 PCR 산물 총 부피의 1/10, 100 % 에탄올을 PCR 산물 총 부피의 2배만큼 첨가하여 잘 섞은 후, -70 ℃ 초저온 냉동고에서 10분간 반응하였다. 이후, 13,000rpm, 10분 원심분리하고, 상등액을 제거한 뒤, 1 ㎖의 70 % 에탄올을 첨가하여 섞어 13,000rpm, 10분 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 70 ℃ Heat block에서 3분간 반응하여 남은 에탄올을 제거하였고, 증류수 50 ㎕에 DNA 펠릿을 잘 녹였다.
C) PCR 산물의 클로닝
정제된 PCR 산물을 N293F 플라스미드에 클로닝하기 위하여 제한효소를 처리하였다. 구체적으로, 50 ㎕ PCR 산물과 N293F 플라스미드에 각각 7㎕의 Kpn I과 8㎕의 10 x 버퍼를 처리하고, 총 부피를 80 ㎕로 적정하였다. 잘 섞은 후 37 ℃ 워터 배스(water bath)에서 3시간 반응하였다. 반응을 종결한 후, 에탄올 침전법으로 정제하였다. 이후, 7㎕ Xho I과 8㎕ 10 x 버퍼를 처리하고 총 부피를 80 ㎕로 적정하였다. 잘 섞은 후, 37 ℃ 워터 배스에서 3시간 반응하였다. 반응이 종결된 DNA를 정제하기 위하여 QIAquick gel Extraction Kit (QIAGEN, 28704)를 이용하여 제조사의 사용방법에 따라 시험하였다.
정제한 DNA 단편을 N293F에 클로닝하기 위하여 DNA 단편 (100 ng; 1Kb 이하, 300 ng; 3 kb 이상)과 제한효소를 처리한 20 ng N293F, 1 ㎕ T4 DNA 리가아제 (Thermo scientific, EL0011), 1 ㎕ 10 x 버퍼를 처리하고, 정제수를 이용하여 총 부피를 10 ㎕로 적정하였다. 22 ℃에서 16시간 반응하였다. 반응을 종결한 후, 대장균에 형질전환 하기 위하여 DH5 수용성 세포(competent cell)를 꺼내어 얼음 위에서 녹인다. 연결 (Ligation) 반응물 중 2 ㎕를 취하여 DH5α 수용성 세포와 잘 섞은 후, 얼음에서 30분 반응하였다. 이후, 42 ℃ 워터 배스에서 반응물을 90초 동안 반응하고, 얼음으로 옮겨 3분간 다시 반응하였다. 반응물에 500 ㎕ SOC 배지액 (1ℓ 당 20 g 박토 트립톤(bacto-tryptone), 5 g 박토 효모 추출물(bacto-yeast extract), 0.5 g NaCl)을 첨가하고, 37 ℃ 진탕 배양기에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 100 ㎕ 반응물을 취하여 100 ㎍/㎖ 암피실린을 첨가한 LB 배지 (1ℓ 당 10 g 박토 트립톤(bacto-tryptone), 5 g 박토 효모 추출물(bacto-yeast extract), 10 g NaCl) 에 뿌려 도말하고, 37 ℃ 배양기에서 12~16시간 배양하였다.
D) 형질전환 여부 확인을 위한 콜로니 PCR 및 염기서열 분석
클로닝한 플라스미드 유무 여부를 확인하기 위하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 융합 PCR을 위한 PCR 혼합물은 12.5 ㎕ 2xEF-Taq PCR smart mix band (Solgent, SEF02-M50h)에 정방향 및 역방향 프라이머 (각각 10 pmol) 0.5 ㎕씩 첨가하고, 최종부피를 멸균 증류수로 적정하여, 잘 섞은 후 PCR 로 증폭하였다. PCR 반응 조건은 예비 변성(pre-denaturation)을 위한 95 ℃, 2분, 1 사이클, 증폭 과정인 95 ℃, 20 초; 62 ℃, 40초; 및 72 ℃, 1 분의 3단계를 25 사이클, 후 신장을 위한 72 ℃, 5 분, 1 사이클을 수행한 후, 반응을 종결하였다.
반응이 종결된 후, 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다 (도 15f). 증폭된 산물을 정제하여 염기서열 분석 (Sequencing)을 네오프로브 사에 의뢰하였고, 염기서열 정보는 하기 표 16에 나타내었다. 굵은 글씨체로 밑줄 표시된 서열은 돌연변이를 일으킨 서열을 나타낸다.
명칭 |
염기서열 정보 |
서열번호 |
TRX-N-His-M1 |
GTCAAA GAGATCGAAGGCAAAGAAGAT TTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 38 |
TRX-N-His-M2 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTT CATGCTGCCCTGAGCAGT GCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 39 |
TRX-N-His-M3 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCG TTTTAT CATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 40 |
TRX-N-His-M4 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAA TTTGGCAACATGGTG TTCCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 41 |
TRX-N-His-M5 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATG ATA ACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 42 |
TRX-N-His-M6 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTT TATAAAAAAAGGGAA AAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 43 |
TRX-N-His-M7 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGT GTT AACAAAGAAAAACTGGAAGCCACGATTAACGAACTGGTG |
서열번호 44 |
TRX-N-His-M8 |
GTCAAACAGATCGAATCAAAAACCGCATTTCAAGAAGCCCTGGACGCCGCTGGTGACAAACTGGTCGTGGTGGACTTTAGTGCTACCTGGTGCGGCCCGTGTAAAATGATTAAACCGTTTTTCCATAGCCTGTCTGAAAAATACAGTAACGTTATCTTTCTGGAAGTGGATGTTGATGACTGCCAGGACGTCGCGAGCGAATGCGAAGTGAAATGTATGCCGACGTTCCAGTTTTTCAAAAAAGGTCAAAAAGTCGGTGAATTTAGCGGTGCCAACAAAGAAAAACTGGAAGCC ATCATTAACGAACTGTGT
|
서열번호 45 |
E) 플라스미드 준비 (Midi-preparation)염기서열 분석이 완료된 플라스미드를 가지는 콜로니를 100 ㎍/㎖ 암피실린을 포함한 2xYT 배지 (1ℓ당 17 g 트립톤, 10 g 효모 추출물, 5 g NaCl) 100 ㎖에 접종하여 37 ℃, 210 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양한 균을 4,500 rpm, 8분 원심분리하여 수득하였다. 플라스미드를 수득하기 위하여 NucleoBond® Xtra Midi (Macherey-Nagel, Cat. 740410.100)를 이용하였고, 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다.
F) 동물세포 배양
FreestyleTM 293 Expression medium AGTTM 분말 (AG100009, Thermo scientific) 19.4 g을 3차 증류수 1ℓ에 녹여 멸균하였다. 30분간 37 ℃ 워터 ㅂ배스에서 데운 FreestyleTM 293 Expression medium AGTTM media 35 ㎖를 125 ㎖ 에를렌마이어 플라스크 (CC-431143, Corning)에 넣었다. 냉동한 세포주 293F (510029, Invitrogen)를 37 ℃ 워터 배스에서 약 1~2분 해동한 후, 5 ㎖ FreestyleTM 293 Expression medium AGTTM
배지와 섞어 다시 35 ㎖의 배지를 포함한 125 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 분주하고, 37 ℃, 8%, 85 rpm, CO2 진탕 배양기에서 배양하였다. 2~3일 배양 후, 10 ㎕ 세포주와 10 ㎕ 트리판블루를 섞어 Luna 세포 계수 칩(L12002, Biosystems)에 10 ㎕를 넣고, LunaTM 자동화 세포 계수 (L10001, Biosystems)를 이용하여 세포 생존률 및 세포 수를 확인했다. 40 ㎖ 배지에 세포주 수가 4~7x105 세포/㎖가 되도록 풀어준 후, 100 xg, 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 상등액을 제거한 세포 펠릿에 10 ㎖ 배지를 첨가하여 펠릿을 풀어주고, 배지 30 ㎖을 분주된 125 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 접종하였다. 37 ℃, 8%, 85 rpm CO2 진탕 배양기에서 배양하고, 이러한 과정을 2번 이상 수행하였다.
G) 동물세포로의 형질전환 (Transfection)
40 ㎖ 분량의 5.5 x 105 cells/㎖ 세포를 튜브에 넣고, 100xg, 5분간 원심분리하였다. 배양액을 제거한 후, 10 ㎖ FreestyleTM 293 Expression medium AGTTM media를 이용하여 펠릿을 풀고, 125 ㎖ 에를렌마이어 플라스크에 접종하였다. 37 ℃, 8%, 85 rpm CO2 진탕배양기에서 배양하였다. LunaTM 자동화 세포 계수기로 세포 수와 생존율이 각각 1x106 세포/㎖, 90 % 이상인지 확인하였다. 배양액 40 ㎖을 기준으로 하여 형질전환하고자 하는 25 ㎍DNA, 100 ㎍ PEI (23966, Polysciences)를 각각 볼텍스로 섞은 후, 10,000 rpm, 1초 원심분리하였다. 800 ㎕ FreestyleTM 293 Expression medium AGTTM에 혼합한 DNA와 PEI를 섞어주고, 상온에서 20분간 반응하였다. 반응한 DNA-PEI 혼합액을 세포주를 배양한 125㎖ 플라스크에 넣어 반응하였다. 24시간 후, 5 g/ℓ이 되도록 보충물을 첨가했다. 이후, 5일을 더 배양하고 배양액을 회수했다.
H) 배양 배지에서의 발현 확인 시험
5일 배양 후, 회수된 배양액을 500 ㎕씩 분주하였다. 그 중 1개의 튜브를 20분간 세워둔 후, 상등액 (원심분리하지 않은 시료)을 사용하고, 나머지 튜브는 10,000 rpm, 2분간 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액 (원심분리한 시료)만 사용하였다. 10 ㎕ 5x 환원 시료 버퍼와 40 ㎕의 상등액을 섞은 후, 100 ℃에서 5분간 끓였다. 준비된 시료는 Mini-PROTEAN® Tetra Cell (BR165-8029, Bio-rad)를 이용한 15% SDS-PAGE로 확인하였다 (도 16).
I) 친화성 크로마토그래피 (Ni-NTA)를 이용한 정제
형질전환된 세포주를 6일 배양한 후, 4,800 rpm, 30분 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 10 mM 이미다졸 세척 버퍼 (pH 7.4)를 이용하여 폴리프렙 컬럼(731-1553, Bio-rad)을 세척하고, Ni-SepharoseTM 6 Fast Flow bead (17-5318-02, GE Healthcare)를 패킹하였다. 이후, 컬럼을 10 mM 이미다졸 세척 버퍼 (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 컬럼 약 2~3 ㎖의 10 mM 이미다졸 세척 버퍼 (pH 7.4)가 남았을 때, 20 ㎖ 10 mM 이미다졸 세척 버퍼 (pH 7.4)로 재세척하였다. 세척한 컬럼에 배지액을 첨가하였다. 10 mM 이미다졸 세척 버퍼 (pH 7.4)를 이용하여 비드를 세척하였고, 500 mM 이미다졸 용출 버퍼 (pH 7.4)로 용출하였다. 10 ㎕ 시료에 200 ㎕Coomassie PlusTM 단백질 검정 시약 (1856210, Thermo scientific)을 혼합하여 파란색으로 변하지 않을 때까지 용출하였다. 용출된 단백질 정제 용액은 AmiconR Ultra 원심분리기 (UFC901096, Millipore)로 농축하였고, PBS용액으로 2회 이상 재농축 과정을 반복하여 버프를 교환하였다. 나노-드랍(Nano-drop)을 이용하여 단백질 농도를 측정하고, 0.3~0.5 ㎎/㎖이 되도록 희석하였다. 각 단백질 3 ㎍을 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 17).
또한, 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질의 농도 및 생산성을 분석하여 하기 표 17에 나타내었다. 표 17을 통해 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질은 3.15~5.31 ㎎/㎖의 농도로 발현됨을 알 수 있다.
ID |
hTrx1 돌연변이 단백질 |
농도 (㎎/㎖) |
단백질 (㎎) |
생산성 (㎎/ℓ) |
S1790 |
TRX-N-His-M1 |
4.76 |
4.71 |
117.75 |
S1791 |
TRX-N-His-M2 |
4.12 |
4.28 |
107.0 |
S1792 |
TRX-N-His-M3 |
3.81 |
3.73 |
93.25 |
S1793 |
TRX-N-His-M4 |
3.99 |
3.63 |
90.75 |
S1794 |
TRX-N-His-M5 |
3.15 |
3.30 |
82.50 |
S1795 |
TRX-N-His-M6 |
3.98 |
4.33 |
108.25 |
S1796 |
TRX-N-His-M7 |
5.31 |
5.15 |
128.75 |
S1797 |
TRX-N-His-M8 |
3.07 |
3.07 |
76.75 |
[
실시예
16]
결합 친화도 확인을 위한 ELISA 수행
본 실시예에서는 상기 실시예 15에서 제조된 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질에 대하여 B266-1 및 B264 항체 각각의 결합 친화도를 확인하였다.
코팅 버퍼 (DPBS; LB001-02, Welgene)에 상기 실시예 3에서 제조된 8종의 hTrx1 돌연변이 단백질을 2 ㎍/㎖ 농도로 녹여 항원용액을 제조한 후, 96-웰 플레이트에 항원용액을 웰 당 100 ㎕씩 분주하고, 실링 테이프로 플레이트를 덮어 4 ℃ 16시간 이상 반응하였다. 항원용액을 제거한 후, 차단 버퍼 (1xPBS w/ 4% 스킴 밀크)를 웰 당 200 ㎕씩 분주하고, 실링 테이프를 덮어 37 ℃ 배양기에서 1시간 반응하였다. 반응 완료 후, 차단 버퍼를 제거하고, 일정 농도로 희석한 항체 용액을 웰 당 100 ㎕씩 분주하고, 실링 테이프로 플레이트를 덮어 37 ℃ 배양기에서 2시간 반응하였다. 항체용액을 제거하고, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼 (1xPBST) 용액을 처리하고 버리는 과정을 총 5회 반복하였다. HRP-결합 항체 (B266에 대하여 항-인간 Fc-HRP, B264에 대하여 항-마우스 Fc-HRP)를 항체희석용액 (1xPBS w/ 1 % Skim milk)에 1:4000으로 희석한 후, 웰 당 100 ㎕씩 분주하고, 실링 테이프로 플레이트를 덮어 37 ℃ 배양기에서 2시간 반응하였다. 항체용액을 제거하고, 웰 당 200 ㎕ 세척 버퍼 (1xPBST) 용액을 처리하고 버리는 과정을 총 5회 반복하였다. 발색시약 [OPD 태블릿 1개, 10 ㎖ PC 버퍼 (1 ℓ 당 5.1 g C6H8O7
·H2O, 7.3 g Na2HPO4)]에 10 ㎕ H2O2를 첨가한 후, 웰 당 100 ㎕씩 분주하고, 어두운 곳에서 10분 반응하였다. 웰 당 50 ㎕ 정지 버퍼 (2.5 M H2SO4)를 처리하고 490nm의 OD를 측정하였다.
그 결과, 도 18A에 나타난 바와 같이 B266-1 (hTrx1-hIgG1) 항체는 M4 부분에 돌연변이를 지닌 단백질 (YSNVIFGNMV)과의 결합력이 저하되었고, B264 (hTrx1-mIgG1) 항체는 M1, M2, M4 부분에 돌연변이 (M1: QIESKTAEIEGKED, M2: QEALDAHAALSS, 및 M3: YSNVIFGNMV)를 지닌 단백질과의 결합력이 저하됨을 확인하였다.
하기 표 18 및 19에는 hTrx1에서 돌연변이를 일으킨 부위 M1, M2 및 M4의 본래 아미노산 서열과 염기서열을 각각 나타냈다.
hTrx1 부위 |
아미노산 서열 |
서열번호 |
M1 |
QIEGSTA |
서열번호 32 |
M2 |
QEALDA |
서열번호 33 |
M4 |
YSNVI |
서열번호 34 |
hTrx1 부위 |
염기서열 |
서열번호 |
M1 |
CAGATCGAATCAAAAACCGCA |
서열번호 35 |
M2 |
CAAGAAGCCCTGGACGCC |
서열번호 36 |
M4 |
TACAGTAACGTTATC |
서열번호 37 |
이상의 결과를 통해, B266-1 항체와 B264 항체는 항원의 결합 부위 중 M4 부분 (YSNVI)을 공유할 가능성이 높음을 확인하였다.
[
실시예
17]
펩티드
마이크로어레이를
이용한 항체 프로파일링
본 실시예에서는 항체 B266-1 및 B264를 이용하여 Trx1 항원의 에피토프 맵핑 분석을 통해 보다 정확한 아미노산 서열을 확인하였다. 구체적으로, 독일 JPT Peptide Technologies 사의 PepStarTM 펩티드 마이크로어레이 기술을 이용하였으며, 도 19에 나타난 바와 같이, 오버랩핑 펩티드 스캔(overlapping peptide scan)을 통해 에피토프를 검출하였다.
17-1. 서열
항체 프로파일링 실험은 108개의 펩티드로 이루어진 펩티드 라이브러리에서 수행되었다. 펩티드의 완전한 리스트는 하기 표 20 내지 표 22에 나타내었다. 이때, Peptide_001 내지 Peptide_018에 해당하는 서열번호 57 내지 74는 천연형이 아니며, 재조합 인서트 영역을 포함한다. 공지된 hTrx1 단백질의 아미노산 서열은 GenBank Accession No. AAF87085.1을 참고하였다.
마이크로어레이에 고정된 펩티드
서열번호
|
아미노산 서열
|
명칭
|
64 |
VATAADVHSQHHHHH |
Peptide_001 |
65 |
ATAADVHSQHHHHHH |
Peptide_002 |
66 |
TAADVHSQHHHHHHH |
Peptide_003 |
67 |
AADVHSQHHHHHHHH |
Peptide_004 |
68 |
ADVHSQHHHHHHHHV |
Peptide_005 |
69 |
DVHSQHHHHHHHHVK |
Peptide_006 |
70 |
VHSQHHHHHHHHVKQ |
Peptide_007 |
71 |
HSQHHHHHHHHVKQI |
Peptide_008 |
72 |
SQHHHHHHHHVKQIE |
Peptide_009 |
73 |
QHHHHHHHHVKQIES |
Peptide_010 |
74 |
HHHHHHHHVKQIESK |
Peptide_011 |
75 |
HHHHHHHVKQIESKT |
Peptide_012 |
76 |
HHHHHHVKQIESKTA |
Peptide_013 |
77 |
HHHHHVKQIESKTAF |
Peptide_014 |
78 |
HHHHVKQIESKTAFQ |
Peptide_015 |
79 |
HHHVKQIESKTAFQE |
Peptide_016 |
80 |
HHVKQIESKTAFQEA |
Peptide_017 |
81 |
HVKQIESKTAFQEAL |
Peptide_018 |
82 |
VKQIESKTAFQEALD |
Peptide_019 |
83 |
KQIESKTAFQEALDA |
Peptide_020 |
84 |
QIESKTAFQEALDAA |
Peptide_021 |
85 |
IESKTAFQEALDAAG |
Peptide_022 |
86 |
ESKTAFQEALDAAGD |
Peptide_023 |
87 |
SKTAFQEALDAAGDK |
Peptide_024 |
88 |
KTAFQEALDAAGDKL |
Peptide_025 |
89 |
TAFQEALDAAGDKLV |
Peptide_026 |
90 |
AFQEALDAAGDKLVV |
Peptide_027 |
91 |
FQEALDAAGDKLVVV |
Peptide_028 |
92 |
QEALDAAGDKLVVVD |
Peptide_029 |
93 |
EALDAAGDKLVVVDF |
Peptide_030 |
94 |
ALDAAGDKLVVVDFS |
Peptide_031 |
95 |
LDAAGDKLVVVDFSA |
Peptide_032 |
96 |
DAAGDKLVVVDFSAT |
Peptide_033 |
97 |
AAGDKLVVVDFSATW |
Peptide_034 |
98 |
AGDKLVVVDFSATWC |
Peptide_035 |
99 |
GDKLVVVDFSATWCG |
Peptide_036 |
100 |
DKLVVVDFSATWCGP |
Peptide_037 |
101 |
KLVVVDFSATWCGPC |
Peptide_038 |
마이크로어레이에 고정된 펩티드
서열번호
|
아미노산 서열
|
명칭
|
102 |
LVVVDFSATWCGPCK |
Peptide_039 |
103 |
VVVDFSATWCGPCKM |
Peptide_040 |
104 |
VVDFSATWCGPCKMI |
Peptide_041 |
105 |
VDFSATWCGPCKMIK |
Peptide_042 |
106 |
DFSATWCGPCKMIKP |
Peptide_043 |
107 |
FSATWCGPCKMIKPF |
Peptide_044 |
108 |
SATWCGPCKMIKPFF |
Peptide_045 |
109 |
ATWCGPCKMIKPFFH |
Peptide_046 |
110 |
TWCGPCKMIKPFFHS |
Peptide_047 |
111 |
WCGPCKMIKPFFHSL |
Peptide_048 |
112 |
CGPCKMIKPFFHSLS |
Peptide_049 |
113 |
GPCKMIKPFFHSLSE |
Peptide_050 |
114 |
PCKMIKPFFHSLSEK |
Peptide_051 |
115 |
CKMIKPFFHSLSEKY |
Peptide_052 |
116 |
KMIKPFFHSLSEKYS |
Peptide_053 |
117 |
MIKPFFHSLSEKYSN |
Peptide_054 |
118 |
IKPFFHSLSEKYSNV |
Peptide_055 |
119 |
KPFFHSLSEKYSNVI |
Peptide_056 |
120 |
PFFHSLSEKYSNVIF |
Peptide_057 |
121 |
FFHSLSEKYSNVIFL |
Peptide_058 |
122 |
FHSLSEKYSNVIFLE |
Peptide_059 |
123 |
HSLSEKYSNVIFLEV |
Peptide_060 |
124 |
SLSEKYSNVIFLEVD |
Peptide_061 |
125 |
LSEKYSNVIFLEVDV |
Peptide_062 |
126 |
SEKYSNVIFLEVDVD |
Peptide_063 |
127 |
EKYSNVIFLEVDVDD |
Peptide_064 |
128 |
KYSNVIFLEVDVDDC |
Peptide_065 |
129 |
YSNVIFLEVDVDDCQ |
Peptide_066 |
130 |
SNVIFLEVDVDDCQD |
Peptide_067 |
131 |
NVIFLEVDVDDCQDV |
Peptide_068 |
132 |
VIFLEVDVDDCQDVA |
Peptide_069 |
133 |
IFLEVDVDDCQDVAS |
Peptide_070 |
134 |
FLEVDVDDCQDVASE |
Peptide_071 |
135 |
LEVDVDDCQDVASEC |
Peptide_072 |
136 |
EVDVDDCQDVASECE |
Peptide_073 |
137 |
VDVDDCQDVASECEV |
Peptide_074 |
138 |
DVDDCQDVASECEVK |
Peptide_075 |
139 |
VDDCQDVASECEVKC |
Peptide_076 |
마이크로어레이에 고정된 펩티드
서열번호
|
아미노산 서열
|
명칭
|
140 |
DDCQDVASECEVKCM |
Peptide_077 |
141 |
DCQDVASECEVKCMP |
Peptide_078 |
142 |
CQDVASECEVKCMPT |
Peptide_079 |
143 |
QDVASECEVKCMPTF |
Peptide_080 |
144 |
DVASECEVKCMPTFQ |
Peptide_081 |
145 |
VASECEVKCMPTFQF |
Peptide_082 |
146 |
ASECEVKCMPTFQFF |
Peptide_083 |
147 |
SECEVKCMPTFQFFK |
Peptide_084 |
148 |
ECEVKCMPTFQFFKK |
Peptide_085 |
149 |
CEVKCMPTFQFFKKG |
Peptide_086 |
150 |
EVKCMPTFQFFKKGQ |
Peptide_087 |
151 |
VKCMPTFQFFKKGQK |
Peptide_088 |
152 |
KCMPTFQFFKKGQKV |
Peptide_089 |
153 |
CMPTFQFFKKGQKVG |
Peptide_090 |
154 |
MPTFQFFKKGQKVGE |
Peptide_091 |
155 |
PTFQFFKKGQKVGEF |
Peptide_092 |
156 |
TFQFFKKGQKVGEFS |
Peptide_093 |
157 |
FQFFKKGQKVGEFSG |
Peptide_094 |
158 |
QFFKKGQKVGEFSGA |
Peptide_095 |
159 |
FFKKGQKVGEFSGAN |
Peptide_096 |
160 |
FKKGQKVGEFSGANK |
Peptide_097 |
161 |
KKGQKVGEFSGANKE |
Peptide_098 |
162 |
KGQKVGEFSGANKEK |
Peptide_099 |
163 |
GQKVGEFSGANKEKL |
Peptide_100 |
164 |
QKVGEFSGANKEKLE |
Peptide_101 |
165 |
KVGEFSGANKEKLEA |
Peptide_102 |
166 |
VGEFSGANKEKLEAT |
Peptide_103 |
167 |
GEFSGANKEKLEATI |
Peptide_104 |
168 |
EFSGANKEKLEATIN |
Peptide_105 |
169 |
FSGANKEKLEATINE |
Peptide_106 |
170 |
SGANKEKLEATINEL |
Peptide_107 |
171 |
GANKEKLEATINELV |
Peptide_108 |
전장 마우스 IgG는 어세이 대조군으로 마이크로어레이 슬라이드에 공동-고정하고(co-immobilized), 추가의 서열은 내부프로세스 대조군으로 JPT에 의해 펩티드 라이브러리에 포함되었다.17
-2.
어세이
조건
프로파일링 실험은 차단 버퍼(Pierce International, Superblock TBS T20, order# 37536)에 희석한 총 2 개의 항체(각각 B266-1 및 B264) 샘플을 이용하여 수행하였다. 5, 1, 0.2, 0.04, 0.008 및 0.0016 μg/ml의 연속 희석액을 단일 다중웰 마이크로어레이 슬라이드 상에서 30℃에서 1시간 동안 배양하였다. 슬라이드는 21개의 개별적인 미니-어레이를 포함한다(샘플 희석액 당 하나의 미니-어레이).
샘플 배양 후, 1 μg/ml의 형광 표지된 2차 항-마우스-IgG 항체(anti-mouse IgG(H+L) (Thermo 84545))를 대응 웰에 첨가하였고, 1 시간 동안 반응시켰다. 표지는 DyLight 650을 사용하였다. 2차 항체만을 적용한 하나의 추가 대조군 배양을 동일한 마이크로어레이 슬라이드 상에서 수행하여 펩티드에 대한 허위양성 결합을 평가하였다. 각 단계를 수행하기 전 마이크로어레이를 세척 버퍼로 세척하였다.
세척 및 건조 후, 슬라이드를 635 nm의 고해상도 레이저 스캐너(Axon Genepix Scanner 4300 SL50)로 스캔하여 형광 강도 프로파일을 수득하였고, 수득된 이미지를 각 펩티드에 대한 평균 픽셀 값을 산출하기 위해 스팟-인식 소프트웨어인 GenePix를 이용하여 정량화하였다. 각 스팟에 대해, 평균 신호 강도가 추출되었다(0 내지 65535 사이의 라이트 유닛).
17-3. 처리된 어레이의 이미지
*항체 샘플 중 하나와 함께 배양된 미니-어레이의 예시적인 형광 판독 이미지를 도 20에 나타내었다. 모든 샘플에 대해 낮은 백그라운드 수준이 관찰되었다. 검정색은 신호 없음, 붉은색 음영은 감지된 신호의 강도 증가, 흰색은 검출기 포화를 나타내고, 각 개별적인 서브어레이는 녹색으로 윤곽이 잡혀있다.
17-4.
히트맵
평가(
Heatmap
Evaluation)
수득된 결과를 시각화하고 개별 배양에 걸쳐 결합 영역을 비교하기 위해, 도 21에 나타낸 바와 같이 히트맵 다이아그램이 산출되었다. 도 21에서 형광 강도는 색상 코드 방식(color-coded manner)으로 나타내었고, 흰색은 결합 없음, 붉은색은 강한 결합을 나타낸다. 모든 평가에 대해, 각 펩티드에 대한 평균 픽셀 형광의 MMC2-값을 계산하였다.
MMC2는 평균 값으로 나눈 표준 편차인 변동 계수(CV)가 0.5 보다 큰 경우를 제외하고 마이크로어레이 상에서 3 번의 경우 모두의 평균값과 동일하다. 이 경우, 2 개의 가장 가까운 값 (MC2)의 평균이 MMC2에 지정된다.
히트맵의 두꺼운 검정색 선은 2차 항-마우스 IgG 항체만을 사용한 대조군 배양을 구분한다. 개별 항체 샘플의 배양은 얇은 푸른색 선으로 구분된다.
항체 B266-1의 경우, 표 23에 나타낸 바와 같이 평균 백그라운드 수준의 약 8배의 가장 높은 신호가 Peptide_004 및 Peptide_005의 펩티드(서열번호 67 및 68)에 대해 측정되었다. 그러나, Peptide_004와 Peptide_005의 펩티드는 천연형이 아니므로, 이들은 에피토프 후보군에서 제외하였다.
항체 B264는 농도 의존적 신호 프로파일뿐만 아니라 몇몇 펩티드와 상당히 강한 상호작용을 나타내었다. 가장 중요한 결합은 특히 2 개의 가장 높은 배양 샘플 농도에서 다음 표 24에 기재된 펩티드로 수득되었다.
표 24에 나타낸 바와 같이 평균 백그라운드 수준의 약 7배의 가장 높은 신호가 Peptide_012 및 Peptide_018의 펩티드(서열번호 75 및 81)에 대해 측정되었다. 그러나, Peptide_012와 Peptide_018의 펩티드는 천연형이 아니므로, 이들은 에피토프 후보군에서 제외하였다.
그 다음으로 가장 강한 신호가 측정된 Peptide_019 내지 Peptide_025에 해당하는 서열번호 82 내지 88의 펩티드를 항체 B264이 결합하는 부위로 예상하였고, 최종적으로 'VKQIESKTAFQEALDAAGDKL' (서열번호 179) 를 항체 B264의 에피토프로 결론지었다.
그 다음으로 가장 강한 신호가 측정된 Peptide_046 내지 Peptide_057에 해당하는 서열번호 109 내지 서열번호 120의 펩티드를 항체 B264이 결합하는 부위로 예상하였고, 이는 B266-1이 결합한 부위와 동일한 에피토프를 갖는 것으로 확인하였다.
2차 항체 대조군 배양에서 유의적인 결합은 측정되지 않았다. 포화 수준까지의 높은 신호는 모든 배양에서 전장 마우스 IgG를 포함하는 대조군 스팟에서 수득되어 우수한 분석 성능을 보였다.
상기 과정을 통해 도출된 에피토프 부위를 하기 표 25에 나타내었고, PDB(protein database)를 통해 공인된 hTrx1의 NMR 서열을 다운로드하여 3D 파일링으로 3차 입체 구조를 확인한 결과, 도 22a 내지 22f에 나타난 바와 같이 천연형일 때 이들 서열은 외부에 존재하므로 에피토프로 작용할 수 있음을 확인하였다.
3D입체구조 |
아미노산 서열 |
유전자 서열 |
실시예 13과의 비교 |
설명 |
도 22a, 22d |
ATWCGPCKMIKPFFHSLSEK YSNVIF (서열번호 172) |
gctacctggtgcggcccgtgtaaaatgattaaaccgtttttccatagcctgtctgaaaaatacagtaacgttatcttt (서열번호 177) |
M4 영역 포함 |
항체 B264 및 B266-1의 에피토프 |
도 22b |
PTFQ FFKKG QKVGEF(서열번호 173) |
ccgacgttccagtttttcaaaaaaggtcaaaaagtcggtgaattt (서열번호 178) |
M6 영역 포함 |
항체 B266-1의 에피토프 |
도 22c |
VK QIESKTAFQEALDA AGDKL (서열번호 174) |
gtcaaacagatcgaatcaaaaaccgcatttcaagaagccctggacgccgctggtgacaaactg (서열번호 179) |
M1 및 M2 영역 통합 |
항체 B264의 에피토프 |
도 22e |
SECEVKCMPTFQ FFKKG (서열번호 175) |
agcgaatgcgaagtgaaatgtatgccgacgttccagtttttcaaaaaaggt (서열번호 180) |
M6 영역 포함 |
항체 B264의 에피토프 |
도 22f |
PTFQ FFKKG QKVGEFSGANK(서열번호 176) |
ccgacgttccagtttttcaaaaaaggtcaaaaagtcggtgaatttagcggtgccaacaaa (서열번호 181) |
M6 영역 포함 |
항체 B264의 에피토프 |
본 발명의 단일클론항체는 티오레독신 1에 대한 결합 친화도 우수하여 티오레독신 1에 매우 특이적으로 결합하고, 또한 민감도와 특이도가 매우 높아 유방암 환자를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 기존의 다른 유방암 진단 바이오마커인 CA15-3을 검출하는 것 보다 본 발명의 티오레독신 1에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 사용하여 티오레독신 1을 검출하는 것이 민감도와 특이도가 월등히 우수하여 유방암 진단의 정확성 및 신뢰성을 현저히 높일 수 있다. 본 발명의 항체가 결합하는 인간 Trx1 항원의 에피토프 부위는 항-Trx1 항체의 결합 친화도를 향상시키기 위한 개량 항체 개발에 유용하게 활용될 수 있다.