CN118005720A - 硫氧还蛋白1表位及与其特异性结合的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及硫氧还蛋白1(Trx1)抗原的表位及其用途,更详细地,提供上述表位及与其结合的抗体或抗原结合片段。在本发明中证实的人类Trx1抗原抗原的表位位点可有效利用于用作改善抗‑Trx1抗体的结合亲和性的改良抗体的开发。并且,本发明的经改良的抗体与现有的抗‑Trx1抗体相比,对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀,灵敏度及特异性非常高,因此有利于改善乳腺癌诊断试剂盒的性能。此外,使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的抗体检测硫氧还蛋白1的灵敏度及特异性显著优于检测现有的作为其他乳腺癌诊断生物标志物的CA15‑3,因此可显著提高乳腺癌诊断的准确性及可靠性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是申请日为2018年10月12日、申请号为201880066028.1(PCT/KR2018/012069)、发明名称为“硫氧还蛋白1表位及与其特异性结合的单克隆抗体”的分案申请。
本申请要求于2017年10月12日提交的韩国专利申请第10-2017-0132536号的优先权和权益。此申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及硫氧还蛋白1(Trx1)抗原的表位及与其特异性结合的单克隆抗体,更详细地,涉及上述表位及与其结合的单克隆抗体或其抗原结合片段、用于编码上述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体、宿主细胞、上述抗体或其抗原结合片段的制备方法、乳腺癌诊断用试剂盒、为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。
背景技术
硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)为借助硫氧还蛋白还原酶进行NADPH依赖还原的12kDa左右的小的氧化还原蛋白质,包括哺乳类硫氧还蛋白1(Trx1)及硫氧还蛋白2(Trx2)。硫氧还蛋白作为生长因子起作用,去除在细胞内产生毒素的过氧化氢,在细菌中用作核糖核苷酸还原酶且起到使与转录活动相关的重要的要素与DNA结合的作用,在真核细胞中,对作为与转录相关的因子的NF-kB(nuclear transcription factor kB)的活性产生影响。因此,硫氧还蛋白由于对细胞凋亡和肿瘤产生影响而具有调节癌细胞生长的重要的作用,通过切断氧化的其他蛋白质的二硫键来帮助其重新具有还原状态的活性。硫氧还蛋白1酶和硫氧还蛋白2酶在哺乳动物细胞内去除半胱氨酸的氧化氮而对细胞凋亡产生影响,在包括炎症疾病、心脏麻痹、癌症在内的多种疾病中具有潜在性的重要性。并且,在利用抗-硫氧还蛋白抗体的免疫组织化学分析中,在包括肝脏、结肠、胰脏以及子宫颈的人类癌组织产生硫氧还蛋白的表达,这种表达意味着可能在肿瘤诱发过程中的硫氧还蛋白牵涉可能性。
在这种背景下,本发明人在研究能够在早期预测乳腺癌的诊断或预后的乳腺癌诊断用标记物的过程中,发现了硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中产生低表达,但在乳腺癌组织中产生非常高的表达,且证实了硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断用标记物而非常有用(韩国授权专利第10-1058230号)。
为了开发具有高准确性和精密度的基于酶联免疫吸附分析法(ELISA,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的体外诊断(In vitro diagnostics,IVD),需要相同抗原蛋白质的各个其他部位具有高亲和性(affinity)的抗体对(两种)。同时,也需要具备每次以低成本生产具有规定的亲和性的抗体的系统。对此,本发明中,为了检测存在于人类血清中的硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx1),开发了两种高性能的重组单克隆抗体,上述抗体有效地与硫氧还蛋白1特异性结合,从而确认了上述抗体有用于筛选乳腺癌患者,并且,确认了上述两种抗体与人类Trx1抗原抗原相结合的位点,由此完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明为了解决如上所述的问题而提出,并且提供可通过高灵敏度和特异性来诊断乳腺癌的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一目的在于,提供用于编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。
本发明的另一目的在于,提供包含上述核酸分子的重组载体。
本发明的还一目的在于,提供包含上述重组载体的宿主细胞。
本发明的又一目的在于,提供与上述单克隆抗体或其结合片段结合的人硫氧还蛋白1抗原的表位、编码其的核酸分子、包含上述核酸分子的重组载体以及包含上述重组载体的宿主细胞。
本发明的又一目的在于,提供包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。
本发明的又一目的在于,提供包含上述的单克隆抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。
本发明的又一目的在于,提供利用上述的单克隆抗体或其抗原结合片段来为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。
解决问题的手段
为了解决如上所述的问题,本发明提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:轻链可变区,包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链CDR2及由序列3的氨基酸序列形成的轻链CDR3;以及重链可变区,由序列4的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列5的氨基酸序列形成的重链CDR2及由序列6的氨基酸序列形成的重链CDR3。
根据本发明一优选实施例,上述抗体可包含由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区。
根据本发明再一优选实施例,上述抗体可包含由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链。
本发明还提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段,其包含:轻链可变区,包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链CDR2及由序列9的氨基酸序列形成的轻链CDR3;以及重链可变区,包含由序列10的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列11的氨基酸序列形成的重链CDR2及由序列12的氨基酸序列形成的重链CDR3。
根据本发明一优选实施例,上述抗体可包含由由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。
根据本发明再一优选实施例,上述抗体可包含由序列19的氨基酸序列形成的轻链以及由序列20的氨基酸序列形成的重链。
根据本发明另一优选实施例,上述抗体可包含由序列25的氨基酸序列形成的轻链以及由序列26的氨基酸序列形成的重链。
根据本发明还一优选实施例,上述抗体可包含IgG1重链及κ轻链。
根据本发明又一优选实施例,上述抗原结合片段可以为Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv或单链抗体分子。
根据本发明又一优选实施例,上述抗体可以为嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
本发明还提供用于编码上述的抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。
根据本发明一优选实施例,用于编码上述轻链的核酸分子可由序列21的核苷酸序列、序列23的核苷酸序列或序列37的核苷酸序列形成。
根据本发明一优选实施例,用于编码上述重链的核酸分子可由序列22的核苷酸序列、序列24的核苷酸序列或序列28的核苷酸序列形成。
本发明还提供包含用于编码上述重链的核酸分子、用于编码上述轻链的核酸分子或用于编码上述重链及轻链的核酸分子的重组载体、以及包含其的宿主细胞。
本发明还提供由选自由序列32至34及序列172至176组成的组中的一种氨基酸序列形成的人硫氧还蛋白1抗原的表位及编码其的核酸分子。
根据本发明一优选实施例,上述核酸分子可由选自由序列35至37及177至181组成的组中的一种核苷酸序列形成。
本发明还提供包含上述核酸分子的重组载体以及包含其的宿主细胞。
本发明还提供与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法,该方法包括培养包括包含用于编码上述抗体的重链的核酸分子、用于编码轻链的核酸分子或用于编码重链及轻链的核酸分子的重组载体的宿主细胞的步骤。
本发明还提供包含上述抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒。
根据本发明一优选实施例,上述试剂盒可以为酶联免疫吸附分析(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay)试剂盒。
根据本发明另一优选实施例,上述酶联免疫吸附分析可以为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。
本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法,该方法包括:步骤(a),使上述单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样接触;步骤(b),通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测;以及步骤(c),将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较,若上述蛋白质表达水平比对照组高,则判定为乳腺癌患者。
进一步地,本发明提供为乳腺癌诊断提供所需信息的方法,该方法包括:步骤(a),利用包含抗体B266或B266-1的轻链CDR1至CDR3及重链CDR1至CDR3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体B266或B266-1的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗体B266或B266-1或其抗原结合片段涂敷固体支撑体;步骤(b),将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体;步骤(c),去除未结合的样品;步骤(d),利用包含抗体B264的轻链CDR1至CDR3及重链CDR1至CDR3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体B264的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗体B264或其抗原结合片段适用于固体支撑体;步骤(e),去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段;步骤(f),检测硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平;以及步骤(g),将在上述步骤(f)所检测的硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平与对照组进行比较,若上述蛋白质表达水平比对照组高,则判定为乳腺癌患者。
根据本发明一优选实施例,上述硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平可通过选自由蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、夹心酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、琼脂双向免疫扩散法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法(FACS)以及蛋白质芯片方法中的一种以上方法组成的组中的一种方法来检测.
根据本发明另一优选实施例,所分离的上述生物学试样可以为选自由全血、血清、血浆、乳腺组织以及乳腺细胞组成的组中的一种以上。
除另有定义,本说明书中所使用的所有技术术语及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义具有相同的含义。一般而言,本发明中所使用的命名方式为在本技术领域中公知且通常所使用的。
本文中所使用的主要术语的定义如下所述。
术语“抗原”可通过抗体而结合,是指为了生产可与抗原的表位结合的抗体而可使用于动物的分子或分子的一部分。抗原可具有一个以上的表位。
术语“抗体”或“Ab”为位于免疫球蛋白分子的可变区的通过一个以上的抗原识别部位来识别如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等特异性靶或抗原并可与其结合的免疫球蛋白分子。如本文所述,术语“抗体”包括但不限定于单克隆抗体;多克隆抗体;如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、Fc等具有可与特定抗原(例如,Trx1)特异性结合的能力的抗体的“抗原结合片段;”单独的互补性决定区(CDR);双特异性抗体;异质接合体抗体、其突变体;具有抗体、或其抗原-结合性片段(例如,结构域抗体)的融合蛋白质;单链(ScFv)及单域抗体[例如,鲨鱼及骆驼科动物(camelid)抗体];最大抗体(maxibo dy)、微型抗体(minibody)、细胞内抗体(intrabody)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、v-NAR以及bis-scFv;人源化抗体;嵌合抗体;以及包含所需的特异性的抗原识别部位的免疫球蛋白分子的其他所有变形的空间构象(包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价性变形的抗体)的任何类型的抗体。抗体可为来源于鼠科动物、大鼠、人类或其他的所有抗体(包括嵌合抗体或人源化抗体)。
在相关技术领域中,与特定靶或抗原(例如,Trx1蛋白)“特异性结合”的抗体或多肽为广泛理解的术语,决定这种特异性结合的方法在相关技术领域中也是广为人知的。相比于特定分子与其他细胞或物质反应或结合的情况,在特定分子以更经常、更迅速、更大的持续性和/或更大的亲和性与特殊的细胞或物质反应或结合的情况下,呈现“特异性结合”。相比于特定抗体与其他物质反应或结合的情况,在特定抗体以更大的亲和性、结合活性、更迅速和/或更大的持续性结合的情况下,与特定靶或抗原“特异性结合”。
本文中所使用的“结合亲和性”或“KD”是指特殊的抗原-抗体相互作用的平衡解离常数。KD为解离速度(也称为“脱离速度”或“kd”)与结合速度、或“启动速度”或“ka(结合速率常数,Association rate constant)”之比。因此,KD为kd/ka,以摩尔浓度(M)来表示。KD越小,结合亲和性越强。因此,1μM的KD比1nM的KD呈现出弱的结合亲和性。与抗体有关的KD值可在相关技术领域中利用公知的方法来决定。用于决定抗体的KD的一种方法为使用如系统等典型的生物传感器系统来利用表面等离子共振仪的方法。
术语“载体”包含可运输连接的其他核酸的核酸分子。载体的一种形态为“质粒,”其是指可结合有附加的DNA片段的圆形双链DNA环。载体的其他形态为病毒载体,其中,附加的DNA片段可与病毒基因组结合。有些载体可在它们被转导的宿主细胞中自主地进行复制(例如,具有细菌起源复制的细菌载体及游离基因哺乳动物载体)。当其他载体(例如,非游离基因哺乳动物载体)转导至宿主细胞时,可合并为宿主细胞的基因组,由此,复制宿主基因组。并且,某些载体可指示它们启动性连接的(operatively linked)基因的表达。上述载体在本说明书中称为“重组表达载体(或简单地称为“表达载体”)”。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体往往以质粒的形态存在。在本说明书中,“质粒”及“载体”为质粒用作最通常所使用的载体的形态,因此可相互交换来使用。但是,本发明包括具有同等功能的其他形态的表达载体,例如,病毒载体(例如,复制缺乏逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)。
术语“宿主细胞”是指能够表达转化或者可表达由核酸序列转化后选定的感兴趣的基因的细胞。只要存在选定的基因,不管子孙与父母在形态上或遗传结构上是否相同,上述术语包括母细胞的子孙。
发明的效果
本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合,并且,由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而,相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的CA15-3,使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。本发明的抗体所结合的人类Trx1抗原的表位位点可有效地适用于用作改善抗-Trx1抗体的结合亲和性的改良抗体的开发。
附图说明
图1示出表达硫氧还蛋白1抗原的重组载体的酶切图及从实施例1中获得的抗体的同种型(isotying)结果。
图2示出从实施例1中获得的9G7(AB1)抗体的轻链(a)及重链(b)氨基酸序列。
图3示出从实施例1中获得的2B4(AB2)抗体的轻链(a)及重链(b)氨基酸序列。
图4示出表达亲和性优秀的抗体B264的轻链(a)及重链(b)的重组载体的酶切图。
图5示出表达亲和性优秀的抗体B266的轻链(a)及重链(b)的重组载体的酶切图。
图6为确认利用SDS-PAGE的抗体的还原(+)及非还原(-)状态的图,图6的(a)部分示出抗体B264,图6的(b)部分示出抗体B266。
图7为确认利用SDS-PAGE的抗体B266-1的还原(+)及非还原(-)状态的图,上述抗体B266-1为抗体B266的Fc部分变为人类IgG1的抗体。
图8a至8d依次示出了针对抗体B266-1的轻链及重链、抗体B264的轻链及重链的IMTG GAP排列的结果。
图9示出了对抗体B266-1和B264的亲和性(affinity)进行分析的结果,图9的(A)部分示出基于抗体浓度的反应值和相应的曲线图,图9的(B)部分为分析利用Prism程序的抗体的亲和性的结果。
图10示出对利用抗体B266-1和B264并通过酶联免疫吸附分析得到的结果进行ROC来计算灵敏度和特异性的结果。
图11示出人类Trx1和金毛鼹Trx1的氨基酸序列相同性的比较。
图12为利用电泳确认了对CaTrx1进行克隆的质粒及是否通过限制酶(Sfi I及Xho I)处理的克隆,泳道1表示对CaTrx1进行克隆的质粒,泳道2表示进行限制酶处理的质粒。
图13示出通过将CaTrx1质粒转化至动物细胞上并分析的从细胞株分泌的CaTrx1蛋白质的表达水平。
图14示出对hTrx1及CaTrx1的抗体B266-1及B264的亲和性的分析。
图15a示出CaTrx1和hTrx1的氨基酸序列的比较。
图15b示出根据CaTrx1和hTrx1的氨基酸序列比较的突变位置设定。
图15c示出用于制备hTrx1的突变基因的融合PCR的示意图,依次进行DNA片段扩增及重叠PCR。
图15d示出用于设定突变位置的DNA片段的扩增结果。
图15e示出利用所制备的DNA片段并通过重叠PCR来制备盒(cassette)的结果。
图15f为通过将对hTrx1突变基因进行克隆的质粒分别转化至293F来证实了8种hTrx1突变基因的表达。
图16为利用SDS-PAGE技术来确认通过上述图15中的转化获得的基因转导至HEK293人细胞并进行培养后从培养液中分泌的蛋白质。Trx1的大小为约12kda,因此确认相应大小的蛋白质,由此确认所转化的8种基因表达并作为蛋白质被分泌到培养液中。
图17为通过纯化上述图16中确认的8种hTrx1突变蛋白质来分析蛋白质的表达水平。
图18a至18c为抗-Trx1抗体对本发明的8种hTrx1突变蛋白质的结合能力的分析。
图19为示出利用实施例17中所用的重叠肽扫描的表位检测的一般原理的示意图。
图20为用实施例17中的抗体样品之一进行培养的微阵列的图像。
图21a至21d为显示与抗体样品反应的对照组及所有探针肽的反应程度的热图,y轴表示库中的肽序列,x轴表示所适用的抗体样品的浓度。MMC2值以从白色(0或低强度)经黄色(中强度)到红色(高强度)的颜色代码范围。
图22a至22f证实了hTrx1蛋白的三级立体结构中的表位的位置。
具体实施方式
以下,更详细地说明本发明。
如上所述,本发明人通过之前的研究发现了硫氧还蛋白1在正常乳腺组织中产生低表达,但在乳腺癌组织中产生非常高的表达,且证实了硫氧还蛋白1作为乳腺癌诊断用标记物而非常有用。
对此,本发明人通过进一步的研究开发了有效地与硫氧还蛋白1特异性结合而有用于筛选乳腺癌患者的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合,并且,由于灵敏度和特异度非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而,相比于检测作为以往的其他乳腺癌诊断生物标记物的CA15-3,使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1能够由于其优秀的灵敏度和特异度而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。并且,上述抗体所结合的人类Trx1抗原的表位位点可有效地适用于用作改善抗-Trx1抗体的结合亲和性的改良抗体的开发。
本发明提供与人类硫氧还蛋白(Thioredoxin-1,Trx1)特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明的单克隆抗体可使用利用杂交瘤、重组以及噬菌体展示技术或它们的组合的方法等的在本技术领域中公知的很多种技术来制备。例如,单克隆抗体可利用在本技术领域中公知的技术等的杂交瘤技术来制备。在本文中,术语“单克隆抗体”不仅限定于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指任意的真核生物、原核生物或噬菌体克隆等的单克隆来源抗体,而并不是指其生产方法。
利用杂交瘤技术的特异抗体的生产及筛选方法是在本技术领域中常规且公知的。作为非限制性的例,可利用靶抗原或表达这种抗原的细胞对小鼠进行免疫化。若检测到免疫反应,例如,从小鼠血清中检测到对抗原具有特异性的抗体,则回收小鼠脾脏来分离脾脏细胞。之后,通过周知的技术使脾脏细胞与如P3U1、P3X63-Ag8、3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8-653等任意的适合的骨髓瘤细胞融合。筛选杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。之后,通过在本技术领域中公知的方法来对杂交瘤克隆评价是否为分泌可与抗原结合的抗体的细胞。通常,包含高水平抗体的腹水可通过将阳性的杂交瘤克隆接种于小鼠腹腔来制备。在本发明一优选实施例中,将具有图1的(a)部分的酶切图的重组载体转染到大肠杆菌来制备Trx1抗原。之后,分离由抗原免疫化的小鼠的脾脏并通过酶联免疫吸附分析法确认了生产通过与骨髓瘤细胞(myeloma cel l;sp2/0)融合来与Trx1反应的抗体的细胞。
本发明优选实施例的单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(a)或(b),在本文中可分别称为B264及B266-1:
(a)包含由序列1的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列2的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列3的氨基酸序列形成的轻链CDR3的轻链可变区以及包含由序列4的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列5的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列6的氨基酸序列形成的重链CDR3的重链可变区;或者
(b)包含由序列7的氨基酸序列形成的轻链CDR1、由序列8的氨基酸序列形成的轻链CDR2以及由序列9的氨基酸序列形成的轻链CDR3的轻链可变区以及包含由序列10的氨基酸序列形成的重链CDR1、由序列11的氨基酸序列形成的重链CDR2以及由序列12的氨基酸序列形成的重链CDR3的重链可变区。
在本说明书中,术语“CDR(complementarity determining region)”是指免疫球蛋白重链及轻链的超变区(hypervariable region)的氨基酸序列。重链(CDRH1、CDRH2以及CDRH3)及轻链(CDRL1、CDRL2以及CDRL3)分别包含3个CDR,这些CDR在抗体与抗原或表位结合中提供主要的接触残基。
本发明的优选单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(c)或(d),在本文中可分别称为B264、B266或B266-1:
(c)由序列13的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列14的氨基酸序列形成的重链可变区;或者
(d)由序列15的氨基酸序列形成的轻链可变区及由序列16的氨基酸序列形成的重链可变区。
本发明的优选单克隆抗体或其抗原结合片段可包含下述的(e)、(f)或(g),在本文中可分别称为B264、B266或B266-1:
(e)由序列17的氨基酸序列形成的轻链及由序列18的氨基酸序列形成的重链;
(f)由序列19的氨基酸序列形成的轻链及由序列20的氨基酸序列形成的重链;或者
(g)由序列25的氨基酸序列形成的轻链及由序列26的氨基酸序列形成的重链。
本发明的优选单克隆抗体称为B264、B265、B266、B267、B268或B269,优选地,可称为B264或B266-1。B266-1为B266的Fc部分变为人类IgG1的单克隆抗体。
自发性抗体结构单位通常包含四聚体(tetramer)。上述四聚体通常分别由两个相同的多肽链的一对构成,各对具有一个全长轻链(分子量通常为约15kDa)及一个全长重链(分子量通常为约50kDa至70kDa)。轻链及重链各自的氨基-末端部位通常包含参与抗原识别的约100至约110或以上的氨基酸的可变区。各链的羧基-末端部位通常限定参与效应器功能的不变区。人类轻链通常分为κ轻链及λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或υ,分别以IgM、IgD、IgG、IgA及IgE定义抗体的同种型。IgG具有包含IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的几个小类,但并不限定于此。IgM具有包含IgM1及IgM2的小类,但并不限定于此。类似地,IgA细分为IgA1及IgA2的小类,但并不限定于此。在全长轻链及重链内,通常,可变区及不变区通过约12个以上的氨基酸的“J”区结合,并且,重链包含约10个以上的氨基酸的“D”区。各个轻链/重链对的可变区通常形成抗原-结合部位。根据本发明一优选实施例,本发明的单克隆抗体的重链可为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM同种型,轻链可为κ链及λ链,优选地,可为κ轻链及IgG1重链。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段中,“其抗原结合片段”是指具有抗原结合功能的片段,包含Fab、F(ab')、F(ab')2以及Fv或单链抗体分子等。抗体结合片段中,Fab为轻链及重链的可变区和轻链的不变区及重链的第一个不变区(CH1)的结构,具有一个抗原结合部位。F(ab')与Fab的区别在于,F(ab')在重链CH1结构域的C-末端包含一个以上的半胱氨酸残基的铰链区(hinge region)。F(ab')2在Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键的过程中生成。Fv是指仅具有重链可变部位及轻链可变部位的最小的抗体片段。这种抗体片段可利用蛋白水解酶来获得,例如,若利用木瓜蛋白酶切断整个抗体,则可获得Fab,若利用胃蛋白酶切断,则可获得F(ab')2片段,优选地,可通过基因重组技术来制作。
本发明的优选抗体可为嵌合抗体、人源化抗体或全人类抗体。
嵌合抗体可通过组合从一种抗体生成细胞获得的可变轻链及重链区(VL及VH)与从另一种获得的不变轻链及重链区并利用重组手段来制备。通常,嵌合抗体主要为了生成具有人类结构域的抗体而利用啮齿类或兔可变区及人类不变区。这种嵌合抗体生成为在本领域中公知的,其能够通过标准手段而实现。还可考虑本发明的嵌合抗体的人类不变区可选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgG6、IgG7、IgG8、IgG9、IgG10、IgG11、IgG12、IgG13、IgG14、IgG15、IgG16、IgG17、IgG18或IgG19不变区中。
为了使人源化抗体含有更接近于人类的免疫球蛋白结构域,而进行工程学处理,其仅包含来源于动物的抗体的互补性决定区。通过多加检查单克隆抗体的可变区的过可变环的序列并将上述序列适用于人类抗体链的结构来实现。
全人类抗体为包含CDR且轻链及重链两者的整个序列从人类基因产生的抗体分子。
并且,本发明提供用于编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的核酸分子。
本发明中所使用的“核酸分子”具有统筹包含DNA(gDNA及cDNA)及RNA分子的含义,在核酸分子中作为基本构成单位的核苷酸不仅包括天然的核苷酸,而且还包括糖或碱基部位变形的相似物(analogue)。本发明的用于编码重链及轻链可变区的核酸分子的序列可变形。上述变形包括核苷酸的增加、缺失或非保守置换或保守置换。
本发明的核酸分子解释为还包含对上述核苷酸序列产生实质性同一性的核苷酸序列。上述实质性同一性是指以最大限度地对应的方式排列(align)上述的本发明的核苷酸序列与任意其他序列,在利用在本领域中通常利用的算法来分析所排列的序列的情况下,呈现最小80%的相同性、在一特定例中呈现最小90%的相同性、在其他特定例中呈现最小95%的相同性的核苷酸序列。
根据本发明一优选实施例,本发明的用于编码单克隆抗体的轻链的核酸分子可由序列21的核苷酸序列形成,用于编码重链的核酸分子可由序列22的核苷酸序列形成。
根据本发明另一优选实施例,本发明的用于编码单克隆抗体的重链的核酸分子可由序列23的核苷酸序列形成,用于编码轻链的核酸分子可由序列24的核苷酸序列形成。
本发明再一优选实施例,本发明的用于编码单克隆抗体的轻链的核酸分子可由序列27的核苷酸序列形成,用于编码重链的核酸分子可由序列28的核苷酸序列形成。
并且,本发明提供包含用于编码上述单克隆抗体的重链的核酸分子及用于编码轻链的核酸分子或所有上述核酸分子的重组载体。
本发明的重组载体系统可通过在本领域中公知的多种方法来构建。本发明的载体可由典型的用于克隆的载体或用于表达的载体构建。并且,本发明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。例如,在本发明的载体为表达载体且将原核细胞作为宿主的情况下,通常包含可进行转录的强烈的启动子(例如,tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子以及T7启动子等)、用于启动解毒的核糖体结合位置及转录/解毒终结序列。在将E.coli(例如,HB101、BL21、DH5α等)利用为宿主细胞的情况下,可将E.coli色氨酸生物合成路径的启动子及操纵因子部位以及噬菌体λ的左向启动子(pLλ启动子)利用为调节部位。在将芽孢杆菌利用为宿主细胞的情况下,可将苏云金杆菌的毒素蛋白基因的启动子或可在芽孢杆菌表达的任何启动子也都利用为调节部位。
另一方面,本发明的重组载体可通过操作在本领域中所使用的质粒(例如,pCL、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列以及pUC19等)、噬菌体(例如,λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1以及M13等)或病毒(例如,SV40等)来制作。
在本发明的载体为表达载体且将真核细胞作为宿主的情况下,可利用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如,金属硫蛋白启动子、肌动蛋白启动子、人球蛋白启动子以及人肌酸启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如,腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV的tk启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒(EBV)的启动子以及呼吸道合胞病毒(RSV)的启动子)作为转录终结序列,通常具有多腺苷酸化序列。
本发明的重组载体为了使从其表达的抗体的纯化变得容易而也可与其他序列融合。例如,融合的序列包括谷胱甘肽S-转移酶(Amersham Pharmacia Biotech,USA);麦芽糖结合蛋白(NEB,USA);FLAG(IBI,USA);如6x His(hexahistidine;Qiage n,USA)、Pre-S1、c-Myc等标签序列;如ompA、pelB等先导序列等。并且,由本发明的载体表达的蛋白质为抗体,因此,即使没有用于纯化的额外的序列,也可以通过蛋白A柱等来容易纯化所表达的抗体。
另一方面,本发明的重组载体包含在本领域中通常所利用的抗生剂耐性基因作为选择性标志,例如,对氨苄西林、艮他霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素以及四环素的耐性基因。
本发明的用于表达抗体的载体可实现轻链和重链在一个载体同时表达的载体系统或使轻链和重链分别在单独的载体表达的系统。在后者的情况下,两个载体通过共转化(co-transfomation)及靶向转化(targeted transformation)而导入到宿主细胞中。共转化为将用于编码轻链及重链的各个载体DNA同时导入到宿主细胞中后筛选均表达轻链和重链的细胞的方法。靶向转化为通过筛选转化为包含轻链(或重链)的载体的细胞并将表达轻链的所筛选的细胞重新转化为包含重链(或轻链)载体来最终筛选均表达轻链及重链的细胞的方法。
并且,本发明提供包含本发明的重组载体的宿主细胞。上述宿主细胞由本发明的重组载体转化的细胞。可稳定且连续地克隆及表达本发明的载体的宿主细胞在本领域中公知,因此可利用任何宿主细胞,例如,包括如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)以及苏云金芽胞杆菌(B.thuringensis)等芽孢杆菌属菌株(Bacillus spp.)、如链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如,恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如,肉葡萄球菌(Staphylococus carnosus))等原核宿主细胞,但并不限定于此。
作为上述载体的适合的真核细胞宿主细胞,可利用属于子囊菌门(Phylum Ascomycota)的曲霉属(Aspergillus spp.)及粗糙链孢菌(Neurospora crassa)等多细胞真菌(multicellular fungi)和包含如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycesce revisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)等酵母的单细胞真菌(unicellularfungi)、低等真核细胞、如来源于昆虫的细胞等高等真核细胞以及来源于植物或哺乳动物的细胞。
本发明中所使用的术语“转染”是指利用本发明的重组载体来导入靶向宿主细胞的基因的过程,与“转化”的含义相同。因此,包括将“转染”和/或“转化”到宿主细胞的核酸导入到有机体、细胞、组织或器官的任意方法,如在本领域中所公知,可根据宿主细胞选择适合的标准技术来执行。这种方法包括电穿孔法(electroporation)、原生质体融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、利用碳化硅纤维的搅拌、由重组质粒转化脓杆菌介导的转化、PEG、右旋糖酐硫酸酯、脂质体以及由干燥/抑制介导的转化方法,但并不限定于此。
本发明还提供由选自由序列32至34及172至176组成的组中的一种氨基酸序列形成的人硫氧还蛋白1抗原的表位。
本发明人证实尽管hTrx1和CaTrx1的氨基酸相同性为82%,但本发明的针对hTrx1的两种抗体不会相对于CaTrx1进行结合。(图11及图15a)。因此,确认出hTrx1与Ca Trx1的氨基酸序列不同的8个部分(图15b),并且制备并克隆了用于表达针对hTrx1的突变蛋白质的基因制备盒(cassette)(图15c至15f)。将克隆产物转化至N293F细胞株,并确认了8种hTrx1突变蛋白质的表达(图16),分别进行突变蛋白质的纯化之后(图17),确认了抗体B266-1(hTrx1-hIgG1)与抗体B264(hTrx1-mIgG1)之间的结合能力。
如图18a至18c所示,确认了抗体B266-1与M4突变蛋白质(YSNVIFGNMV)之间的结合相比于hTrx1降低,抗体B264与M1(QIESKTAEIEGKED)、M2(QEALDA HAALSS)、M4突变蛋白质之间的结合相比于hTrx1降低。因此,确认了抗体B266-1与B264在结合位点中共享M4部分(YSNVI)的可能性较大。
另外,使用通过将hTrx1蛋白的氨基酸序列与一个氨基酸残基重叠来制备的108个肽以进行了微阵列(图19及20),通过热图评估来导出了抗体B266-1及B264的表位,如表25所示(图21a至21d及22a至22f)。
本发明还提供用于编码上述硫氧还蛋白1抗原的表位的核酸分子、包含其的重组载体以及包含上述重组载体的宿主细胞。
本发明的用于编码硫氧还蛋白1抗原的表位的核酸分子可由选自由序列32至34及172至176组成的组中的一种氨基酸序列形成。
针对用于编码上述表位的核酸分子、包含其的重组载体以及包含上述重组载体的宿主细胞的说明与上述所记载的本发明的抗体相关描述内容相同,因此在此省略其说明。
并且,本发明提供包括培养上述宿主细胞的步骤的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。
用于制备抗体或其抗原结合片段的宿主细胞的培养可根据在本领域中公知的适当的培养基和培养条件来进行。只要是本技术领域的普通技术人员,可根据所选择的菌株容易调整并使用这种培养过程。细胞培养根据细胞的生长方式分为悬浮培养和附着培养,根据培养方法分为分批式、流加式以及连续培养的方法。在培养中所使用的培养基需要适当满足特定的要求条件。
在动物细胞培养中所使用的上述培养基包含多种碳源、氮源以及微量元素成分。作为可使用的碳源的例,包括如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉以及纤维素等碳水化合物;如豆油、葵花油、蓖麻油以及椰子油等脂肪;如软脂酸、硬脂酸以及亚油酸等脂肪酸;如丙三醇及乙醇等醇;以及如乙酸等有机酸。这些碳源可单独使用或者可组合来使用。可用作氮源的例包含如胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸渍液(CSL)及大豆小麦之类的有机氮源及尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵之类的无机氮源。这些氮源可单独或组合使用。在上述培养基中,作为磷源可包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及相应的含钠盐。并且,可包含如硫酸镁或硫酸铁等金属盐。此外,可包含氨基酸、维生素以及适当的前体等。
培养过程中,向培养物中以适当方式添加如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸以及硫酸等化合物来调整培养物的pH。并且,培养过程中,可使用如脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制气泡的生成。并且,为了维持培养物的呼吸状态,向培养物内注入氧或含氧气体(例如,空气)。培养物的温度通常为20℃至45℃,优选地为25℃至40℃。
通过培养宿主细胞来获得的抗体能够以未纯化的状态使用,可通过进一步利用如透析、盐沉淀以及色谱法等多种常规的方法并以高纯度进行纯化来使用。其中,最常用的是利用色谱法的方法,柱的种类和顺序可根据抗体的特性、培养方法等而从离子交换色谱法、尺寸排除色谱法、亲和色谱法等中选择。
并且,本发明提供包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的乳腺癌诊断试剂盒以及利用其来为乳腺癌诊断提供所需信息的方法。
本发明中的术语“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。对于本发明的目的,诊断为确认乳腺癌发病与否。
硫氧还蛋白1蛋白作为乳腺癌诊断标记物,相比于正常乳腺组织,在乳腺癌组织中产生高表达。
根据本发明一优选实施例,上述乳腺癌诊断试剂盒可为酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)试剂盒,优选地,可为选自由直接酶联免疫吸附分析、间接酶联免疫吸附分析、直接夹心酶联免疫吸附分析以及间接夹心酶联免疫吸附分析组成的组中的一种以上。在本发明一优选实施例中,夹心酶联免疫吸附分析试剂盒所包含的两种抗体中,单克隆抗体B266-1为包被抗体,单克隆抗体B264为检测抗体。
本发明的乳腺癌诊断试剂盒还可包含除了与Trx1有关的抗体以外还使用于免疫学分析的本领域中个公知的用具或试剂。
只要是可检测抗原与抗体的结合的方法,上述免疫学分析可包含所有办法。这些方法为在本领域中公知的,例如,包括蛋白质印迹法、酶联免疫吸附分析法、放射免疫分析法、放射免疫扩散法、免疫荧光分析法、免疫印迹法、琼脂双向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫组化法、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、免疫色谱分析法、荧光激活细胞分选法以及蛋白质芯片方法等,但并不限定于此。
免疫学分析中所使用的用具或试剂可包含适合的载体或支撑体、能够生成可检测的信号的标志、溶解剂、清洗剂以及稳定剂等。作为适合的载体,在标志物质为酶的情况下,包含可检测酶活性的基质、适当的缓冲液、显色酶以及反应终止剂等,但并不限定于此。
优选地,可利用文献中所揭示的多种方法来将本发明的试剂盒所包含的与Trx1有关的抗体固定于适合的载体或支撑体,作为适合的载体或支撑体的例,包括PBS、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、琼脂糖(agarose)、纤维素、硝化纤维、代血浆、交联葡萄糖、琼脂糖(Sepharose)、脂质体、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、斑粝岩、过滤纸、离子交换树脂、塑料薄膜、塑料管、聚(甲基乙烯基醚/马来酸)共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、金属、玻璃、玻璃珠或磁性粒子等。此外,作为其他固体基质有细胞培养板、酶联免疫吸附分析板、管以及聚合物性膜。上述支撑体可具有如球形(微珠)、圆柱形(试管或孔内面)、平面形(片、试条)等任意形态。
能够生成可检测的信号的标志可定性或定量地检测抗原-抗体复合物的形成,作为其例可使用酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒子(microparticle)、氧化还原分子以及放射性同位素等。作为酶,可使用β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、尿素酶、过氧化物酶(辣根过氧化物酶等)、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、苹果酸酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶、荧光素酶等。作为荧光物质,可使用荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻胆素、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氰酸荧光素等。作为配体,包括生物素衍生物,作为发光物质,包括吖啶酯、虫荧光素等。作为微粒子,包括胶质金、着色乳胶等,作为氧化还原分子,包括二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌等。作为放射性同位素,包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、186Re等。但是,除了上述所例示的之外,只要是可使用于免疫学分析的,没有特别限制。
作为酶显色基质,例如,在选择辣根过氧化物酶(HRP)作为酶标志的情况下,作为基质,可使用包含3-氨基-9-乙基咔唑、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚、邻苯二胺、2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、3,3-二氨基联苯胺、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、联甲氧基苯胺或3,3'-二甲氧基联苯胺的溶液。并且,在选择碱性磷酸酶作为酶标志的情况下,作为基质,可使用包含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、硝基蓝四唑或对硝基苯酚磷酸盐的溶液。并且,在选择β-D-葡萄糖苷酶作为酶标志的情况下,作为基质,可使用包含邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的溶液。此外,可使用在本领域中公知的多种酶及酶显色基质。
根据本发明一优选实施例,本发明的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法可包括:步骤(a),使本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样接触;步骤(b),通过形成抗原-抗体复合物来对在上述生物学试样中与单克隆抗体或其抗原结合片段结合的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平进行检测;以及步骤(c),将在上述步骤(b)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较,若上述蛋白质表达水平比对照组高,则判定为乳腺癌患者。
根据本发明另一优选实施例,本发明的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法可包括:步骤(a),利用根据权利要求2、4或6所述的单克隆抗体或其抗原结合片段涂敷固体支撑体;步骤(b),将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体;步骤(c),去除未结合的样品;步骤(d),将根据权利要求1、3或5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段适用于固体支撑体;步骤(e),去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段;步骤(f),检测硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平;以及步骤(g),将在上述步骤(f)中所检测的硫氧还蛋白1的蛋白质表达水平与对照组进行比较,若上述蛋白质表达水平比对照组高,则判定为乳腺癌患者。
根据本发明再一优选实施例,本发明的为乳腺癌诊断提供所需信息的方法可包括:步骤(a),利用包含抗体B266或B266-1的轻链CDR1至CDR3及重链CDR1至CDR3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体B266或B266-1的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗体B266或B266-1或其抗原结合片段涂敷固体支撑体;步骤(b),将从怀疑患有乳腺癌的个体分离的生物学试样适用于所涂敷的上述固体支撑体;步骤(c),去除未结合的样品;步骤(d),利用包含抗体B264的轻链CDR1至CDR3及重链CDR1至CDR3的单克隆抗体或其抗原结合片段、包含抗体B264的轻链可变区及重链可变区的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗体B264或其抗原结合片段适用于固体支撑体;步骤(e),去除未结合的单克隆抗体或其抗原结合片段;步骤(f),检测硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平;以及步骤(g),将在上述步骤(f)所检测的硫氧还蛋白1蛋白质的表达水平与对照组进行比较,若上述蛋白质表达水平比对照组高,则判定为乳腺癌患者。
在本发明中,术语“所分离的生物学试样”包括作为乳腺癌的标记物的Trx1蛋白质表达水平具有差异的组织(乳腺组织)、细胞(乳腺细胞)、全血、血浆、血清、血液、唾液、滑液、尿、咯痰、淋巴液、脑脊液、组织剖检试样(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液或破裂的真核细胞等,不仅包括来源于癌症的原发性病灶的试样,而且还包括来源于转移病灶的试样。可通过使这些生物学试样以操作或未操作的状态与本发明的单克隆抗体进行反应来确认Trx1蛋白质表达水平。
本发明中的术语“个体”包括如牛、猪、羊、鸡、狗、人类等哺乳动物、鸟类等,对怀疑患有乳腺癌的个体没有特别限制。
以下,为了有助于理解本发明而通过实施例等来详细说明。然而,本发明的实施例能够以多种其他形态变形,而应解释为本发明的范围限定于下述实施例。本发明的实施例是为了更详细地说明本发明而提供给本技术领域的普通技术人员的。
本发明的实施方式
实施例1
人类硫氧还蛋白1(Trx1)抗原制备
1-1.Trx1表达载体的制备
为将用于编码人类硫氧还蛋白1蛋白的基因在大肠杆菌中表达,根据大肠杆菌密码子使用(codon usage)来合成基因。所合成的人类硫氧还蛋白1基因序列如下列表1所示。
表1
为了扩增人类硫氧还蛋白1基因而使用的引物序列如下列表2所示。
表2
hTrx1-For | TAATGGTCAAACAGATCGAATC(序列30) |
hTrx1-Rev | CACCAGTTCGTTAATCGTGGTAATGAAAGCT(序列31) |
为了克隆到质粒并扩增基因而执行PCR(Polymerase chain reaction)。添加10pmo l的所合成的基因、10pmol的引物(hTrx1-For、hTrx1-Rev)、dNTP(分别为2.5mM)、Exprime Taq polymerase以及缓冲液并进行混合来作为模板。使该溶液在95℃的温度下反应2分钟后,在95℃的温度下反应30秒钟,在55℃的温度下反应30秒钟,在70℃的温度下反应20秒钟,反复此过程35次后,在70℃的温度下反应2分钟,从而结束反应。纯化所扩增的基因后,为了克隆到存在于pUC57质粒的multi-cloning site(MC S)的EcoR V位置,对质粒处理对应的限制酶来进行纯化。混合所纯化的基因、经限制酶处理的质粒、连接酶(Ligase)和缓冲液并进行反应。为了将质粒转化为E.coli DH5α,在4℃的温度下溶解E.coli DH5αcompetent细胞株后,与质粒混合溶液混合并在4℃的温度下反应30分钟。反应后,在42℃的温度下施加热冲击30秒钟后,重新在4℃的温度下进行稳定化2分钟,并倒入包含抗生剂(50μg/ml的氨比西林(ampicillin))的LB(Luria-Burtani)固体培养基中以均匀地吸收,在37℃的温度下培养16小时。在所培养的培养基中生长的菌落中筛选具有人类硫氧还蛋白1基因的质粒。
1-2.Trx1的表达及纯化
对具有所筛选的人类硫氧还蛋白1基因的质粒进行纯化后,为了表达蛋白质而按照如上所述的方法转化E.coli BL21菌株。为了从所转化的菌株表达硫氧还蛋白1蛋白,在37℃的温度下在包含抗生剂的LB液体培养基中培养菌株直到OD600=0.5后,添加IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactopyranoside)再培养3小时,以使浓度成为1mM。之后,通过SDS-PAGE确认了蛋白质表达与否。为了纯化该蛋白质,利用超声波降解器(soni cation)来破碎所获得的细胞株并进行离心分离(12000rpm,30分钟,4℃)来获得上清液。向所获得的上清液中添加购买的抗硫氧还蛋白I抗体(LF-MA0055,Abfrontier)来与表达的硫氧还蛋白I结合后,添加与抗体结合的Protein A/G PLUS-Agarose(sc-2003,Santa Cruz)并进行离心分离来纯化。之后,在SDS-PAGE上确认了纯度及定量。
实施例2
对Trx1具有特异性的单克隆抗体的生产及纯化
2-1.小鼠的免疫化
将所纯化的人类硫氧还蛋白1蛋白与佐剂(adjuvant)混合后注射到小家鼠并对小家鼠进行采血,通过酶联免疫吸附分析法确认了是否生成抗体。进行免疫化两次后,确认了抗体的潜在性(1:5000)适当增加。
2-2.细胞融合及杂交瘤的制备
从经免疫化的小家鼠摘取脾脏并分离B淋巴细胞后,与所培养的骨髓瘤(myeloma)细胞(sp2/0)融合。将所融合的细胞在添加有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨喋呤(aminopterine)以及胸苷酸(thymidine)的培养基(HAT medium)中培养来选择性地筛选骨髓瘤和仅融合有B淋巴细胞的细胞(hybridoma)并进行培养。
2-3.生产对Trx1具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选
利用酶联免疫吸附分析法来确认了所获得的杂交瘤(hybridoma)细胞中与人类硫氧还蛋白1蛋白反应的三种抗体。对酶联免疫吸附分析中产生阳性反应的细胞利用极限稀释法(Limiting dilution method)来筛选生产与抗原反应的抗体的杂交瘤(hybridoma)。
2-4.单克隆抗体的生产及纯化
向小家鼠注入所获得的三种杂交瘤(hybridoma)来获得腹水,利用Protein Aaffi nity chromatography来对此进行纯化。通过SDS-PAGE确认了所纯化的抗体。
实施例3
单克隆抗体的同种型确认
使用Rapid酶联免疫吸附分析Mouse mAbs Isotyping Kit(Pierce,Cat.37503)试剂盒确认了在上述实施例2中获得的三种抗体的同种型。
其结果,如图1的(b)部分所示,确认了单克隆抗体2B4的重链为IgG1,单克隆抗体8F3的重链为IgG12a,单克隆抗体9G7的重链为IgG2b。确认了轻链均为κ链。
实施例4
单克隆抗体9G7(AB1)和2B4(AB2)的氨基酸序列分析
分析了在上述实施例2中所获得的三种单克隆抗体中9G7(AB1)和2B4(AB2)的重链及轻链氨基酸序列。将可与适合于backtranslation和重组表达(recombinationexpression)的Fc区融合的序列决定为氨基酸序列。通过IMTG GAP排列来排列所决定的序列,利用高突变(hypermutation)表来查找高突变及完整的CDR3部分。通过精确的质量肽图(accurate mass peptide maps)等确认序列(图2及图3),并利用MS/MS谱图确认了高突变及CDR3。
实施例5
利用酶联免疫吸附分析法的亲和性比较及抗体决定
选定了通过上述过程获得的氨基酸序列中可实现高突变(hypermutation)的位置,由此,通过9G7(AB1)以四种(B266、B297、B268以及B269)且2B4(AB2)以两种(B264及B265)使碱基序列发生改变来合成基因。通过表达所获得的六种(B264~B269)并通过酶联免疫吸附分析法来确认了对各个抗体的抗原的亲和性(表3至表5中所示的T之后的编号表示各个生产batch编号)。
三种种类的抗原,即,通过直接(direct)酶联免疫吸附分析法来对什么都没结合的(naked)Trx1、与Fc结合的Trx1(Trx1-Fc)以及与His标签结合的Trx1(Trx1-His)确认了亲和性,其结果按下列表3至表5的顺序示出。如表3至表5所示,IgG1(κ)中B264、IgG2b(κ)中B266对三种抗原具有最好的亲和性。
表3
对什么都没结合的Trx1抗原的反应结果
抗体(Antibody)ID | 5000×(OD Value) |
AB264-T150514-7 | 2.0575 |
B265-T150514-10 | 1.3225 |
AB264-T150514-8 | 1.1635 |
B265-T150514-9 | 0.9515 |
B267-T150519-5 | 0.8155 |
B269-T150519-9 | 0.735 |
B268-T150519-8 | 0.716 |
B268-T150519-7 | 0.670 |
B266-T150519-3 | 0.6625 |
B266-T150519-4 | 0.6615 |
B269-T150519-10 | 0.626 |
B267-T150519-6 | 0.522 |
表4
对Trx1-Fc抗原的反应结果
抗体ID | 5000×(OD Value) |
AB264-T150514-7 | 1.171 |
AB264-T150514-8 | 0.494 |
B265-T150514-10 | 0.378 |
B265-T150514-9 | 0.273 |
B266-T150519-3 | 0.198 |
B266-T150519-4 | 0.181 |
B267-T150519-5 | 0.043 |
B267-T150519-6 | 0.023 |
B268-T150519-8 | 0.015 |
B268-T150519-7 | 0.003 |
B269-T150519-9 | 0.002 |
B269-T150519-10 | -0.001 |
表5
对Trx1-His抗原的反应结果
抗体ID | 5000×(OD Value) |
AB264-T150514-7 | 1.996 |
B265-T150514-10 | 1.465 |
AB264-T150514-8 | 1.142 |
B265-T150514-9 | 1.03 |
B267-T150519-5 | 0.857 |
B268-T150519-8 | 0.783 |
B269-T150519-9 | 0.77 |
B268-T150519-7 | 0.761 |
B269-T150519-10 | 0.717 |
B266-T150519-3 | 0.696 |
B266-T150519-4 | 0.667 |
B267-T150519-6 | 0.554 |
亲和性高的抗体B264及抗体B266的氨基酸序列如下列表6所示。
表6
实施例6
抗体B264及抗体B266的生产
6-1.抗体B264及抗体B266的表达质粒制备
如上述表6所示,由于抗体B264及抗体B266的氨基酸序列被揭露,可以对与上述抗体的轻链及重链相应的基因进行化学合成。所合成的基因序列如下列表7所示。将所合成的基因克隆到pcDNA3.0。
表7
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6-2.抗体B264及抗体B266的表达及纯化
为了表达B264抗体而将pcDNA3-SSJ11-L和pcDNA3-SSJ11-H且为了表达B266抗体而将pcDNA3-SSJ12-L和pcDNA3-SSJ12-H共转染(co-transfection)到HEK293细胞株并培养7天。培养细胞株并利用蛋白A色谱法来获得及纯化由培养液分泌的重组单克隆抗体。通过超过滤(ultrafiltration)浓缩包含重组单克隆抗体的洗脱剂(eluent),利用0.2μm的灭菌过滤器来过滤,从而获得高纯度的抗体。
通过SDS-PAGE确认了所纯化的抗体的纯度和大小。SDS-PAGE结果,如图6所示,抗体B264及抗体B266在还原(reducing)条件下,重链为47kDa,轻链为25kDa,在非还原(non-reducing)条件下为150kDa,从而确认了以符合所预期的大小的方式表达。
实施例7
通过夹心(Sandwich)酶联免疫吸附分析法的所获得的两种单克隆抗体的配对与否确认
混合100μl的包被液(coating buffer)(0.015M的Na2CO3,0.035M的NaHCO3,0.003M的NaN3,pH9.6)和100ng的包被抗体(coating antibody,B266)并倒入每个孔(well)中后,在4℃的温度、O/N条件下进行反应。向每个孔中倒入200μl的包含1%的BSA的PBS(PBSA;隔离缓冲液)后,在常温下反应60分钟。之后,倒入20μl的抗原(50ng、25ng、12.5ng或0ng),倒入80μl的检测抗体(生物素-标志的B264;B264-B)后,在37℃的温度下反应90分钟。去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的包含0.05%的吐温20的PBS(PBST;清洗缓冲液)并进行清洗。上述过程反复进行3次。
向每个孔处理100μl的以1:200稀释的链霉亲和素-HRP后,在37℃的温度下反应30分钟,去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的包含0.05%的吐温20的PBS(PB ST;清洗缓冲液)并进行清洗。上述过程反复进行3次。
向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后,在暗的条件下,在常温下反应10分钟,向每个孔处理100μl的2.5M的硫酸溶液(H2SO4;终止缓冲液(STOP buffer))后,在450nm确认了结果。
其结果,如表8所示,抗原的反应值随着浓度而增加,从而确认了这些抗体检测出抗原。但是,在没有抗原的情况下,O.D.检测值高,因此,需要进行利用抗体的性能提高实验。
表8
将B266用作包被抗体且将B264用作检测抗体的夹心酶联免疫吸附分析
Trx1(ng/ml) | 0 | 12.5 | 25 | 50 |
O.D.450nm | 0.828 | 1.226 | 1.506 | 2.257 |
实施例8
用于抗体的性能提高的Fc部分同种型变更
抗体的表达系统为利用重组质粒的瞬时转染(transient transfection),而并非是利用杂交瘤的转染,因此,将重组质粒中具有重链的质粒共转染具有其他同种型的重链的质粒。即,对具有为了表达9G7(AB1)而使用的pcDNA3-SSJ12-L和pcDNA3-SSJ12-H中用于编码非pcDNA3-SSJ12-H的其他重链的基因的质粒进行共转染。
通过这种方法来获得了B266的Fc部分变为人类IgG1的抗体(B266-1)。通过SD S-PAGE确认了该抗体的性状(图7)。
最终,通过用于反向翻译(back translation)及重组表达的适当Fc区域融合来确定所选定的单克隆抗体B264及B266-1的CDR序列。
IMTG GAP排列(IMTG GAP alignment)是与IMTG数据库“确定的序列(determ inedsequence)”的排列,最接近的生殖细胞株(germline)序列和超突变(hypermutatio n)通过数据库搜索而显示。抗体B266-1及B264的各个轻链及重链的IMTG GAP排列的结果示于图8a至8d,轻链CDR1至CDR3及重链CDR1至CDR3的氨基酸序列示于表9中,轻链可变区及重链可变区的氨基酸序列示于表10中。并且,B266-1轻链及重链的氨基酸序列及基因序列示于表11中。
表9
氨基酸序列 | |
B264轻链CDR1 | QSIVHSNGNTY(序列1) |
B264轻链CDR2 | KVS(序列2) |
B264轻链CDR3 | CFQGSHVPYT(序列3) |
B264重链CDR1 | GYTFTSYT(序列4) |
B264重链CDR2 | INPTSDYTN(序列5) |
B264重链CDR3 | FCASEGGFLYYFDY(序列6) |
B266-1轻链CDR1 | SRISY(序列7) |
B266-1轻链CDR2 | DTS(序列8) |
B266-1轻链CDR3 | CHQRSSYPTF(序列9) |
B266-1重链CDR1 | GFNIKDTF(序列10) |
B266-1重链CDR2 | IDPANGNT(序列11) |
B266-1重链CDR3 | CALLQYSAMDY(序列12) |
表10
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表11
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实施例9
通过夹心酶联免疫吸附分析法的所获得的B266-1和B264的单克隆抗体的配对与否确认
混合100μl的包被液和100ng的包被抗体(B266-1)并倒入每个孔中后,在4℃的温度、O/N条件下进行反应,去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行2次。
向每个孔中倒入200μl的PBSA后,在常温下反应120分钟。之后,倒入20μl的抗原(25ng或0ng),倒入80μl的检测抗体(B264-B)后,在37℃的温度下反应90分钟。去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。
向每个孔处理100μl的以1:200稀释的链霉亲和素-HRP后,在37℃的温度下反应30分钟,去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。
向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后,在暗的条件下,在常温下反应10分钟,向每个孔处理100μl的终止缓冲液后,在450nm确认了结果。
其结果,如表12所示,与抗原适当的进行反应,并确认了相比于在实施例6中所使用的抗体,空白(blank)值降低。
表12
将B266-1用作包被抗体且将B264用作检测抗体的夹心酶联免疫吸附分析
实施例10
对抗原单克隆抗体的亲和性分析
对抗原Trx1具有特异性的两种单克隆抗体通过利用质粒的瞬时转染系统来表达,从而可稳定地生产。对此,为了确认对抗原的亲和性(affinity),利用酶联免疫吸附分析法进行分析(图8的(a)部分)。
混合100μl的包被液和100ng的Trx1并倒入每个孔中后,在4℃的温度下反应16小时以上,去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的PBSA后,在37℃的温度下反应120分钟。去除反应溶液后,所制作的抗体B266-1或抗体B264从0.1μM以1/5稀释并向每个孔中导入100μl,在37℃的温度下反应120分钟。去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的清洗缓冲液并进行清洗。此过程反复进行3次。
将人类IgG-HRP(以1:4000稀释)作为抗体B266-1且将小鼠IgG-HRP(以1:4000稀释)作为抗体B264并分别倒入100μl,在37℃的温度下反应60分钟。去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl并进行清洗。此过程反复进行3次。
向每个孔中倒入100μl的TMB溶液后,在暗的条件下,在常温下反应10分钟,向每个孔处理100μl的终止缓冲液后,在450nm确认了结果。利用Prism(Graphpad公司)来分析所获得的结果值(图8的(b)部分)。
分析包被抗体B266-1和检测抗体B264的亲和性的结果,确认了因B266-1的反应力而空白(blank)值高,但B266-1和B264的结合程度随着抗原的浓度而增加。这表示B266-1和B264与抗原结合。若根据利用Prism程序的分析计算KD(equilibrium di ssociationconstant)值,则B266-1为1.1×10-11,B264为1.3×10-10。KD值在10-10至10-12之间的情况下,评价为具有对皮可摩尔(pM)水平的抗原的灵敏度,因此,可知B266-1和B264具有对高水准的抗原的灵敏度。
实施例11
乳腺癌患者的血清中的夹心酶联免疫吸附分析法试验
利用包被抗体(B266-1)的夹心酶联免疫吸附分析通过如下所述的过程来准备。
添加100ml的包被液和0.1ml的浓度为1㎎/ml的B266-1来制备浓度为1μg/ml的包被抗体溶液。向各96-孔板的每个孔中倒入100μl的所制备的包被抗体溶液后,在4℃的温度下反应12小时。去除抗体溶液,向每个孔中倒入200μl的0.05%的PBST并进行清洗。此清洗过程反复进行3次。向每个孔处理200μl的PBSA,在4℃的温度下反应4小时(隔离工序)。去除PBSA,将96-孔板在恒温恒湿机(20℃,30%R.H.)干燥3小时。
然后,通过如下的过程对检测抗体(B264)进行生物素化。
向20㎎/ml的生物素-7-NHS中混合DMSO(dimethyl sulfoxide)来制备2㎎/ml的生物素-7-NHS。每1㎎/ml的B264抗体中混合2㎎/ml的15μl(30μg)的生物素-7-NHS并在15~25℃的温度下反应2小时。向Amicon ultra-15(Millipore)中放入反应溶液,将PBS溶液填满至最终体积后,以3600xg进行离心分离,直到剩0.5ml。此反复进行3次。将Amicon过滤器内部中所剩的抗体溶液(生物素化的B264;B264-B)移至1.5ml的试管后,利用PBSA来使最终浓度达到0.3㎎/ml。
然后,通过如下的过程来从乳腺癌患者的血清检测人类Trx1抗原。
向利用包被抗体涂敷来准备的96-孔板的第一个柱(column)中倒入标准抗原溶液。倒入20μl的从乳腺癌患者获得的血清后,倒入,80μl(0.3㎎/ml)的B264-B溶液。之后,在37℃的温度下反应60分钟后,去除抗原及抗体反应溶液,向每个孔中倒入200μl的PBST并进行清洗。此过程反复进行3次。倒入100μl的以1:400稀释的链霉亲和素-HRP(R&D Systems)后,在37℃的温度下反应30分钟,反应结束后,去除反应溶液后,向每个孔中倒入200μl的PBST并进行清洗。此过程反复进行3次。处理100μl的TMB溶液(Sure Blue)并在常温且暗的条件下反应15分钟。倒入100μl的2N的H2SO4溶液,利用酶标仪(microplate reader)来检测450nm吸光度。
最后,通过如下的过程进行ROC分析。
对基于利用作为与Trx1有关的单克隆抗体的B266-1和B264的酶联免疫吸附分析的结果进行分析来计算灵敏度(sensitivity)和特异度(specificity)。当cut-off值(cut-off value)为10.8ng/ml时,确认了灵敏度为93.0%,特异度为97.4%(图9)。
实施例12
与诊断乳腺癌的其他酶联免疫吸附分析试剂盒之间的比较分析
在本实施例中,为了评价作为重组单克隆抗体的B266-1和B264的性能,与检测作为诊断乳腺癌与否的其他生物标记物的CA15-3的酶联免疫吸附分析试剂盒进行比较分析(表13)。
其结果,如表13所示,相比于CA15-3,当使用本发明的与Trx1特异性结合的单克隆抗体时,灵敏度及特异度特别高。
表13
本发明的试剂盒与AxSYM CA15-3试剂盒比较
Trx1 | CA15-3(AxSYM) | |
灵敏度(%) | 93 | 54 |
特异度(%) | 97.4 | 94 |
试样(Test sample) | 血清(Serum) | 血清(Serum)和血浆(plasma) |
实施例13
金毛鼹(Chrysochloris asiatica)Trx1蛋白质的表达
13-1.人类Trx1(hTrx1)及金毛鼹Trx1(CaTrx1)序列比较
从结构上与人类Trx1相似,但与氨基酸序列的相似性低的金毛鼹(Chrysochlorisasiatica)Trx1之间比较氨基酸序列的结果,证实了其显示出82%的相同性(图10)。
利用已知的CaTrx1的碱基序列(NCBI Accession Number XM_006863001.1)合成了基因,然后基因克隆到了pUCIDT-AMT质粒中,以便在大肠杆菌中存储该基因。经克隆的质粒进行限制酶Sfi I和Xho I处理并通过电泳得以确认。其结果,如图12所示,经限制酶处理的质粒(泳道2)证实从质粒切下的357bp的DNA片段,从而证实了Ca Trx1基因的合成(图12的箭头)。
13-2.CaTrx1蛋白质的表达
将在上述实施例13-1中制备的CaTrx1质粒转化到动物细胞中以纯化从细胞株分泌的CaTrx1,利用15%的SDS-PAGE确认其蛋白质的结果示于图3中。图13的泳道1和2表示CaTrx1转化体细胞培养液中的总蛋白质5μg和10μg,泳道3表示对照组蛋白质(BSA;BovineSerum Albumin)3μg,证实了经纯化的CaTrx1蛋白质显示28.75㎎/L的生产率。
实施例14
针对人类Trx1抗原(hTrx1)的2种抗体与CaTrx1的亲和性的确认
在本实施例中证实了B266-1(Trx1-hIgG1)及B264(Trx1-mIgG1)的2种抗体与CaTrx1的结合亲和性。
为了确认B266-1(Trx1-hIgG1)与B264(Trx1-mIgG1)的针对hTrx1及CaTrx1的结合亲和性,96-孔酶标(ELISA)板中分别涂敷200ng的hTrx1及10μg的CaTrx1,向每个孔倒入隔离缓冲液(4%脱脂乳/1x PBS)200μL之后,在37℃温度在反应1小时。去除反应液,向各个涂敷有抗原的孔倒入B266-1(Trx1-hIgG1)和B264(Trx1-mIgG1)各100μL之后,在37℃温度下反应2小时。去除反应液,用200μL的1xPBST反复洗涤5次。将经B266-1(Trx1-hIgG1)处理的孔中用抗-人类Fc-HRP、经B264(Trx1-mI gG1)处理的孔用鼠-HRP以1:4000的比率稀释后各倒入100μL,并在37℃温度下反应2小时。去除反应液,用200μL的1xPBST反复洗涤5次。向每个孔倒入显色试剂各100μL反应10分钟之后,向每个孔倒入2.5M的H2SO4各50μL。显色结束之后,用ELI SA读数仪测量。
确认了B266-1(Trx1-hIgG1)与B264(Trx1-mIgG1)的针对hTrx1的结合亲和性结果,如下表14中所示,证实出相对于200ng的抗原,B266-1为KD=2.1x10-10M,B264为KD=1.7x10-10M。并且,通过图14A,与B266-1相比,通过B264的结合的反应数值(OD490)为低50%左右。
证实了针对10μg的CaTrx1的抗体B266-1和B264的结合亲和性的结果,如图14B及表14中所示,可知2种抗体均不与CaTrx1结合。
表14
实施例15
针对人类Trx1抗原(hTrx1)的突变抗原的制备
15-1.通过hTrx1与CaTrx1之间的氨基酸序列分析的突变位置设定
对已知的hTrx1(NCBI Accession Number NP_003320.2)的氨基酸序列与CaTrx1的氨基酸序列(NCBI Accession Number XP_006863063.1)进行了比较。如图15a所示,尽管hTrx1与CaTrx1的氨基酸序列相同性为82%,但对于抗原的抗体的结合亲和性明显不同,因此将氨基酸序列不同的部分区分为8个部分(图15b)。
15-2.用于突变蛋白质表达的融合PCR及克隆
A)片段PCR
在上述实施例15-1中证实的氨基酸序列不同的8个部分中,将hTrx1的序列替换为CaTrx1的序列,以扩增了用于突变体制备的盒(cassette)的DNA片段(图15d)。
具体地,为了制备用于表达各个突变蛋白质的基因,需要扩增用于进行融合PCR的2个DNA片段。因此,制备了包含需要碱基序列的突变的部分的2种引物(F2及R1;图15c及表15),以引物F1及R1、F2及R2各为一对来扩增了DNA片段。为了扩增DNA片段,向25μL的2xEF-Taq PCR smart mix band(Solgent,SEF02-M50h)中模板DNA(100-200ng)和正向及反向引物(各10pmol)各添加1μL,用无菌蒸馏水滴定至最终体积,充分混合并用PCR仪(Thermalcycler,T100)扩增。
表15
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PCR反应条件为:进行用于预变性(pre-denaturation)的95℃、2分钟、1个循环,作为扩增过程的95℃、20秒钟;62℃、40秒钟;以及72℃、1分钟的该3个步骤的30个循环,用于后延伸(post-extension)的72℃、5分钟,1个循环之后,结束反应。利用1%的琼脂糖凝胶来确认了扩增的DNA片段(图15d)。为了纯化基因,利用QIAq uick gel Extraction Kit(QIAGEN,28704)根据制造商的使用方法来进行了试验。
B)用于融合2种DNA片段的融合PCR及PCR产物纯化
为了融合扩增的DNA片段,利用两个DNA片段及引物F1及R2来进行了PCR(图15c)。就用于融合PCR的PCR混合物而言,向25μL的2xEF-Taq PCR smart mix ba nd(Solgent,SEF02-M50h)中添加2种DNA片段DNA各100-150ng和正向及反向引物(各10pmol)各1μL,用无菌蒸馏水滴定至最终体积,充分混合并用PCR仪扩增。PCR反应条件为:进行用于预变性(pre-denaturation)的95℃、2分钟、1个循环,作为扩增过程的95℃、20秒钟;62℃、40秒钟;以及72℃、1分钟的3步骤的30个循环,用于后延伸的72℃、5分钟、1个循环,并结束了反应。反应结束后,利用1%的琼脂糖凝胶确认了PCR产物(图15e)。
融合PCR反应结束后,利用乙醇沉淀法纯化了产生的PCR产物。向扩增的PCR产物中以PCR产物总体积的1/10的量加入3M的醋酸钠(pH5.2),以PCR产物总体积的两倍的量加入100%的乙醇,充分混合之后,在-70℃超低温冰箱中反应了10分钟。然后,以13000rpm离心分离10分钟,去除上清液之后,添加1mL的70%的乙醇混合之后,以13000rpm离心分离10分钟。去除上清液,并在70℃的加热块(Heat block)中反应3分钟,去除剩余的乙醇,并将DNA沉淀充分溶于50μL的蒸馏水中。
C)PCR产物的克隆
处理限制酶以将纯化的PCR产物克隆到N293F质粒中。具体地,分别用7μL的Kp n I及8μL的10×缓冲液处理50μL的PCR产物和N293F质粒,并将总体积滴定至80μL。充分混合之后,37℃水浴(water bath)中反应了3小时。反应完成后,用乙醇沉淀法纯化。然后,处理7μL的Xho I和8μL的10×缓冲液并将总体积滴定至80μL。充分混合之后,在37℃水浴中反应了3小时。为了纯化反应终止的DNA,利用QIAquick gel Extraction Kit(QIAGEN,28704)根据制造商的使用方法进行了试验。
为了将纯化的DNA片段克隆到N293F,处理DNA片段(100ng;1Kb以下,300ng;3kb以上)及限制酶的20ng的N293F,处理1μL的T4 DNA连接酶(Thermo scientifi c,EL0011),1μL的10×缓冲液,利用纯净水将总体积滴定至10μL。在22℃温度下反应了16小时。反应结束之后,将DH5可溶性细胞(competent cell)取出并在冰上融化以转化至大肠杆菌中。取2μL的连接(Ligation)反应物,与DH5α可溶性细胞充分混合之后,在冰上反应了30分钟。然后,使反应物在42℃水浴中反应90秒钟,转移至冰中再反应3分钟。反应物中添加500μL的SOC培养基(每1L20g的胰化蛋白胨(ba cto-tryptone)、5g的酵母菌提取物(bacto-yeastextract),0.5g的NaCl),在37℃的振荡培养箱中培养了30分钟。培养之后,取100μL的反应物并将其撒在添加有100μg/mL的氨苄西林的LB培养基(每1L10g的胰化蛋白胨(bacto-tryptone)、5g的酵母菌提取物(bacto-yeast extract)、10g的NaCl)中,并在37℃培养箱中培养了12~16小时。
D)用于确认是否转化的菌落PCR及碱基序列分析
进行了菌落PCR以确认是否有经克隆的质粒。就用于融合PCR的PCR混合物而言,向12.5μL的2xEF-Taq PCR smart mix band(Solgent,SEF02-M50h)中添加正向及反向引物(各10pmol)添加各0.5μL,并用无菌蒸馏水滴定至最终体积,充分混合后用PCR进行了扩增。PCR反应条件为:进行用于预变性(pre-denaturation)的95℃、2分钟、1个循环,作为扩增过程的95℃、20秒钟;62℃、40秒钟;以及72℃、1分钟的3个步骤的25个循环,用于后延伸的72℃、5分钟、1个循环,然后结束了反应。
反应结束之后,利用1%的琼脂糖凝胶进行了确认(图15f)。纯化扩增的产物并将碱基序列分析(Sequencing)委托给Neuro Probe公司,碱基序列信息示于下表16中。以粗体字下划线标记的序列表示引起突变的序列。
表16
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E)质粒准备(Midi-preparation)
将具有结束碱基序列分析的质粒的菌落接种到含有100μg/mL的氨苄西林的2×YT培养基(每1升17g的胰蛋白、10g的酵母提取物、5g的NaCl)100mL中,并在37℃下以210rpm培养了16小时。以4500rpm离心分离8分钟获得了培养的细菌。为了获得质粒,使用了Xtra Midi(Macherey-Nagel,Cat.740410.100),并根据制造商的使用手册进行了实验。
F)动物细胞的培养
将19.4g的FreestyleTM 293Expression medium AGTTM粉末(AG100009,Ther moscientific)溶解在三级蒸馏水1L中,并灭菌。将在37℃水浴中加热30分钟的35mL的FreestyleTM 293Expression medium AGTTM media放入125mL的锥形瓶(CC-431143,Corning)中。在37℃水浴中,将冷冻的细胞株293F(510029,Invitrogen)解冻约1~2分钟之后,与5mL的FreestyleTM 293Expression medium AGTTM培养基混合,再倒入包含35mL的培养基的125mL的锥形瓶,并在37℃、8%、85rpm、CO2振荡培养箱中进行了培养。培养2~3天之后,将10μL的细胞株和10μL的台盼蓝混合,并向Luna细胞计数芯片(L12002,Biosystems)中添加10μL,利用LunaTM自动细胞计数(L10001,Biosystems)确认了细胞存活率及细胞数。40mL的培养基中将细胞株数释放至4~7×105细胞/mL后,以100xg离心分离5分钟以除去上清液。除去上清液的细胞沉淀中加入10mL的培养基以释放沉淀,并将30mL的培养基接种到分配的125mL的锥形瓶中。在37℃、8%、85rpm的CO2振荡培养箱中进行培养,并将此过程进行了2次以上。
G)向动物细胞的转化(Transfection)
将40mL的等分的5.5×105cells/mL的细胞放入试管中,以100xg离心分离5分钟。除去培养液之后,利用10mL的FreestyleTM 293Expression medium AGTTM media来释放沉淀,并接种到125mL的锥形瓶中。在37℃、8%、85rpm的CO2振荡培养箱中进行了培养。利用LunaTM自动细胞计数仪来确认了细胞数及存活率是否分别为1×106细胞/mL,90%以上。以40mL的培养液为基准,将需要转化的25μg的DNA,100μg的PEI(23966,Polysciences)分别用涡旋混合之后,以10000rpm离心分离1秒钟。使混合在800μL的FreestyleTM 293Expressionmedium AGTTM中的DNA和PEI混合,并在常温下反应了20分钟。将反应的DNA-PEI混合液放入培养有细胞株的125mL的烧瓶中进行了反应。24小时之后,添加了补充物至5g/L。然后,再培养5天,并回收了培养液。
H)培养培养基中的表达确认试验
培养5天之后,倒入各500μL的所回收的培养液。将其中1个试管静置20分钟之后,使用上清液(未离心分离的试样),剩余试管以10000rpm离心分离2分钟以除去细胞而仅使用了上清液(离心分离的试样)。10μL的5x还原试样缓冲液与40μL的上清液混合之后,在100℃下煮沸了5分钟。所准备的试样被确认为利用Tetra Cell(BR165-8029,Bio-rad)的15%的SDS-PAGE(图16)。
I)利用亲和色谱法(Ni-NTA)的纯化
培养转化的细胞株6天之后,以4800rpm离心分离了30分钟以除去了上清液。利用10mM的咪唑洗涤缓冲液(pH7.4)来洗涤亲和层析柱(731-1553,Bio-rad),并填充了Ni-SepharoseTM 6Fast Flow bead(17-5318-02,GE Healthcare)。然后,用10mM的咪唑洗涤缓冲液(pH7.4)洗涤色谱柱2次。当剩余约2~3mL的10mM的咪唑洗涤缓冲液(pH7.4)时,将色谱柱用20mL的10mM咪唑洗涤缓冲液(pH7.4)重新洗涤。将培养基加入经洗涤的色谱柱中。利用10mM的咪唑洗涤缓冲液(pH7.4)洗涤珠,并用500mM的咪唑洗脱缓冲液(pH7.4)进行了洗脱。10μL的试样中混合200μL的Coomas sie PlusTM蛋白质测定试剂(1856210,Thermoscientific)并洗脱至其不变蓝为止。利用AmiconR Ultra离心机(UFC901096,Millipore)浓缩了经洗脱的蛋白质纯化溶液,并用PBS溶液重复2次浓缩过程以进行牛黄素交换。使用纳米滴剂(Nano-drop)测量蛋白质浓度,并稀释至0.3~0.5㎎/mL。用SDS-PAGE确认了3μg的每种蛋白质(图17)。
并且,分析了8种hTrx1突变蛋白质的浓度及生产率,并示于下表17中。通过表17可知,8种hTrx1突变蛋白质可表达为3.15~5.31㎎/mL的浓度。
表17
实施例16
进行酶联免疫吸附分析(ELISA)以确认结合亲和性
在实施例中,针对上述实施例15中所制备的8种hTrx1突变蛋白质,确认了各个B266-1及B264抗体的结合亲和性。
在涂敷缓冲液(DPBS;LB001-02,Welgene)中以2μg/mL的浓度溶解上述实施例3中所制备的8种hTrx1突变蛋白质,以制备抗原溶液,向96-孔板中以每个孔100μL分别注入抗原溶液,并用密封带覆盖板以在4℃温度下反应了16小时以上。除去抗原溶液之后,向每个孔分别注入隔离缓冲液(1xPBSw/4%的脱脂乳)200μL,覆盖密封带并在37℃的培养箱个反应了1小时。反应结束之后,除去隔离缓冲液,向每个孔分别注入稀释成规定浓度的抗体溶液各100μL,并用密封带覆盖板,并在37℃的培养箱中反应了2小时。除去抗体溶液,反复进行5次对每个孔200μL的洗涤缓冲液(1xPBS T)溶液进行处理及丢弃的过程。在抗体稀释溶液(1xPBSw/1%的脱脂乳)中以1:4000稀释HRP-结合抗体(针对B266的抗-人类Fc-HRP,针对B264的抗-小鼠Fc-HRP)之后,向每个孔分别注入100μL,用密封带覆盖板,在37℃的培养箱中反应了2小时。除去抗体溶液,并反复进行5次对每个孔用200μL的洗涤缓冲液(1xPBST)溶液进行处理及丢弃的过程。显色试剂[OPD片剂1个,10mL的PC缓冲液(每1L中5.1g的C6H8O7·H2O,7.3g的Na2HPO4)]中加入10μL的H2O2之后,向每个孔分别注入100μL,并遮光反应10分钟。每个孔用50μL停止缓冲区(2.5M的H2SO4)进行处理,并测量了490nm的OD。
其结果,如图18A所示,确认了B266-1(hTrx1-hIgG1)抗体的M4部分所具有突变的蛋白质(YSNVIFGNMV)之间的结合能力降低,B264(hTrx1-mIgG1)抗体的M1、M2、M4部分所具有的突变(M1:QIESKTAEIEGKED,M2:QEALDAHAALSS及M3:YSNVIFGNMV)的蛋白质之间的结合能力降低。
下表18及19中分别示出了hTrx1中引起突变的位点M1、M2及M4的原来的氨基酸序列及碱基序列。
表18
hTrx1位点 | 氨基酸序列 | 序列号 |
M1 | QIEGSTA | 序列32 |
M2 | QEALDA | 序列33 |
M4 | YSNVI | 序列34 |
表19
hTrx1位点 | 碱基序列 | 序列号 |
M1 | CAGATCGAATCAAAAACCGCA | 序列35 |
M2 | CAAGAAGCCCTGGACGCC | 序列36 |
M4 | TACAGTAACGTTATC | 序列37 |
通过以上结果,确认了B266-1抗体及B264抗体在抗原的结合位点中共享M4部分(YSNVI)的可能性较高。
实施例17
利用肽微阵列的抗体剖析
在实施例中,利用抗体B266-1及B264,通过Trx1抗原的表位映射分析确认了更准确的氨基酸序列。具体地,利用了德国JPT Peptide Technologies公司的PepStarTM肽微阵列技术,如图19所示,通过重叠肽扫描(overlapping peptide scan)检测了表位。
17-1.序列
抗体剖析实验在由108个肽组成的肽库中进行。肽的完整的列表示于下表20至表22中。此时,Peptide_001至Peptide_018中相应的序列64至81为非天然型,并且包括重组插入区。已知的hTrx1蛋白的氨基酸序列参考了GenBank Accession No.AAF87085.1。
表20
固定于微阵列中的肽
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表21固定于微阵列的肽
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表22固定于微阵列的肽
/>
将全长小鼠IgG共固定(co-immobilized)在微阵列载玻片上作为测定对照组,附加的序列通过JPT包含在肽库中作为内部过程对照组。
17-2.测定条件
剖析实验利用了稀释在隔离缓冲液(Pierce International,Superblock TBST20,or der#37536)中的共2个抗体(分别为B266-1及B264)样品来进行。5、1、0.2、0.04、0.008及0.0016μg/ml的系列稀释液在单个多孔微阵列载玻片上于30℃下培养了1小时。载玻片包括21个单独的微阵列(每个样品稀释液一个微阵列)。
培养样品之后,将1μg/ml的荧光标记的抗-小鼠-IgG二抗(anti-mouse IgG(H+L)(Thermo 84545))添加至相应的孔中,反应1小时。标记使用了DyLight650。在同一微阵列载玻片上仅用二抗单独进行另一种对照培养,以评估了与肽的假阳性结合。在进行各个步骤之前,用洗涤缓冲液洗涤了微阵列。
洗涤及干燥之后,用635nm的高分辨率激光扫描仪(Axon Genepix Scanner4300SL50)扫描载玻片以获得荧光强度分布图,并将获得的图像用作为斑点识别软件的GenePix来定量每种肽的平均像素值。对于每个点,提取平均信号强度(0至65535之间的发光单元)。
17-3.处理的阵列图像
用与抗体样品之一种共同培养的微阵列的示例性荧光读取图像示于图20中。对于所有样品均观察了低背景水平。黑色表示没有信号,红色阴影增加了检测到的信号的强度,白色表示检测器饱和,并且每个单独的子阵列都以绿色勾勒出轮廓。
17-4.热图评估(Heatmap Evaluation)
为了可视化获得的结果并比较各个培养物中的结合区域,如图21a至21d所示,计算出了热图。在图21a至21d中,荧光强度以颜色代码方式(color-coded manner)表示,白色表示无结合,红色表示强结合。对于所有的评估,计算了每种肽的平均像素荧光的MMC2-值。
除了标准偏差除以平均值的变异系数(CV)大于0.5的情况之外,MMC2与微阵列上所有三种情况的平均值相同。在这种情况下,会将两个最接近的值(MC2)的平均值分配给MMC2。热图的粗黑线用于区分仅使用抗-小鼠IgG二抗的对照组培养。单个抗体样品的培养由一条细蓝色线区分。
对于抗体B266-1,如表23中所示,针对Peptide_004及Peptide_005的肽(序列67及68),测量了平均信号水平的约8倍的最高信号。但是,Peptide_004及Peptide_005的肽不是天然型,因此被排除在表位候选组之外。
表23
抗体B264显示出与几种肽的相当强的相互作用以及浓度依赖性信号图。尤其是在两个最高的培养样品浓度下用下表24中列出的肽获得最重要的结合。
如表24所示,对Peptide_012及Peptide_018的肽(序列75及81)测量的最高信号是平均背景水平的约7倍。但是,Peptide_012和Peptide_018的肽不是天然型,因此被排除在表位候选组之外。
将与测量到次强的信号的肽Peptide_019至Peptide_025相对应的序列82至88的肽预期为抗体B264结合的位点,最终,‘VKQIESKTAFQEALDAAGDKL’(序列179)被推断为抗体B264的表位。
将与测量到次强的信号的肽Peptide_046至Peptide_057相对应的序列109至序列120的肽预期为抗体B264结合的位点,已确认其具有与B266-1结合的位点相同的表位。
表24
在二抗对照组培养中未测量到显着结合。在所有培养中均含有全长小鼠IgG的对照组斑点中获得了高达饱和水平的高信号,显示了出色的分析性能。
通过上述过程导出的表位位点示于下表25中,并且通过蛋白质数据库(PDB,protein database)下载公认的hTrx1的NMR序列,并通过3D归档确认了三级立体结构,其结果,如图22a至22f所示,当是天然型时,这些序列存在于外部,因此可充当表位。
表25
产业上的可利用性
本发明的单克隆抗体由于对硫氧还蛋白1的结合亲和性优秀而有效地与硫氧还蛋白1特异性结合,并且,由于灵敏度及特异性非常高而可有用地使用于乳腺癌患者的筛选中。进而,相比于检测作为现有的其他乳腺癌诊断生物标志物的CA15-3,使用本发明的与硫氧还蛋白1特异性结合的单克隆抗体来检测硫氧还蛋白1的方式具有显著优秀的灵敏度及特异性而使乳腺癌诊断的准确性及可靠性明显得到提高。本发明的抗体结合的人类Trx1抗原抗原的表位位点可有效地利用于用于提高抗-Trx1抗体的结合亲和性的改良抗体的开发中。
Claims (6)
1.一种人硫氧还蛋白1抗原的表位,其特征在于,由选自由序列32至34和172至176组成的组中的任一种氨基酸序列形成。
2.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码根据权利要求1所述的表位。
3.根据权利要求2所述的核酸分子,其特征在于,上述核酸分子由选自由序列35至37和177至181组成的组中的任一种核苷酸序列形成。
4.一种重组载体,其特征在于,包含根据权利要求2所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞,其特征在于,包含根据权利要求4所述的重组载体。
6.由选自由序列32至34和172至176组成的组中的任一种氨基酸序列形成的人硫氧还蛋白1抗原的表位在特异性结合单克隆抗体或其抗原结合片段中的用途。
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