CN101495628A - 血管及炎性疾病中半胱氨酸蛋白酶豆荚蛋白的表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供与哺乳动物(例如小鼠和人)豆荚蛋白和新型豆荚蛋白剪切变体ZB－I有关的，分离和纯化的多核苷酸、多肽和抗体。本发明进一步涉及这些分离和纯化的多核苷酸、多肽和抗体，以及其它豆荚蛋白和ZB－I激动剂和拮抗剂在调节细胞或细胞群，例如单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、血管内皮细胞、肾近端小管细胞、动脉内皮细胞、炎性细胞侵袭到血管内膜里的部位和动脉新内膜病变区域中豆荚蛋白和/或ZB－I活性、表达和/或分泌中的用途。本发明还提供豆荚蛋白和ZB－I拮抗剂，例如豆荚蛋白和ZB－I的拮抗性小分子、抗体和抗体片段，豆荚蛋白和ZB－I抑制性多肽和豆荚蛋白和ZB－I抑制性多核苷酸。本发明还涉及新的诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防血管疾病和炎性疾病的方法。

Description

血管及炎性疾病中半胱氨酸蛋白酶豆荚蛋白的表达

相关申请

[0001]本申请要求2006年5月25日提交的美国临时专利申请号60/808,381以及2006年8月15日提交的美国临时专利申请号60/837,604的优先权，其内容全部在此引作参考。

发明背景

发明领域

[0002]本发明涉及豆荚蛋白(legumain)以及豆荚蛋白在调节血管疾病和炎性疾病中的用途。本发明另外涉及被指定为ZB-1的豆荚蛋白的新剪接变体。本文公开的方法和药学组合物用于诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防血管疾病和炎性疾病。

相关背景技术

[0003]半胱氨酸蛋白酶(CPs)是哺乳动物中基于酶活性位点的结构组织被分类为蛋白家族的普遍存在的酶的相关类(Dickinson(2002)Crit.Rev.Oral Biol.Med.13：238-75)。哺乳动物CP家族包括，尤其是由与木瓜蛋白酶具有结构和进化共性的蛋白酶成员组成的CA家族，以及含有半胱氨酸蛋白酶和豆荚蛋白(id.)的CD家族。豆荚蛋白也称为天冬酰胺酰基内肽酶(AEP)或破骨细胞抑制肽2(OIP-2)(Choi et al.(2001)J.Bone Miner.Res.16(10)：1804-11)，是由PRSC1基因编码的(Tanaka et al.(1996)Cytogenet.Cell Genet.74：120-23)，是CD家族相对新的成员，具有对底物序列P1位点的天冬酰胺酰基键水解的严格特异性(Chen et al.(1997)J.Biol.Chem.272：8090-98)。豆荚蛋白属于包括半胱氨酸蛋白酶和分离酶(separase)的半胱氨酸蛋白酶的C13家族(Ishii(1994)MethodsEnzymol.244：604-15)。豆荚蛋白是独特的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，与组织蛋白酶所属的溶酶体蛋白酶的木瓜蛋白酶家族没有同源性。在生理条件下，豆荚蛋白出现在酸性核内体/溶酶体区室，并在细胞内蛋白质降解中起作用(Shirahama-Noda et al.(2003)J.Biol.Chem.278：33194-99)。豆荚蛋白可以在抗原提呈中发挥作用(Manoury et al.(1998)Nature 396：695-99)，虽然豆荚蛋白缺陷小鼠在恒定链的抗原提呈或II类MHC产物的成熟中没有表现出缺陷(Maehr et al.(2005)J.Immunol.174：7066-74)。

[0004]豆荚蛋白是哺乳动物中高度保守的溶酶体内肽酶，与小鼠和人类豆荚蛋白显示约83％的氨基酸一致性(Chen et al.(1998)J.Biochem.335：111-17)，与人和猪豆荚蛋白显示约84％的氨基酸一致性(Chen et al.(1997)supra)。

[0005]豆荚蛋白蛋白酶表达和活性已以各种组织的分值进行评估(参见例如PCT公开No.WO 05/075675)，并发现在许多组织中是可检测的；高肽酶活性出现在肾脏(Chen et al.(1998)supra)，特别是肾近端小管细胞中(Shirahama-Noda et al.(2003)supra)。豆荚蛋白另外在单核细胞中表达，人们认为其在抗原和/或组织蛋白酶L加工中起作用(Wolk et al.(2005)Genes Immun.5：452-56；Maehret al.(2005)supra；Watts(2005)Immunol.Rev.207：218-28；Alvarez-Fernandez et al.(1999)J.Biol.Chem.274：19195-203)。有趣的是，豆荚蛋白的表达在人血单核细胞分化为树突状细胞，以及人血巨噬细胞被MCSF激活的过程中被上调(Li et al.(2003)J.Biol.Chem.278：38980-90；Hashimoto et al.(1999)Blood 94：837-44)。另据报道豆荚蛋白在破骨细胞形成和骨重吸收(Choi et al.(1999)J.Biol.Chem.274：27747-53)，内毒素耐受(Wolk et al.，supra)和表皮角化(Zeeuwenet al.(2004)Hum.Mol.Genetics 13：1069-79)中发挥作用。豆荚蛋白的一些蛋白质底物已经确定，包括MMP2(Chen et al.(2001)Biol.Chem.382：777-83)，组织蛋白酶H、B和L(Shirahama-Noda et al.(2003)supra)，以及α胸腺素(Sarandeses et al.(2003)J.Biol.Chem.278：13286-93)。

[0006]豆荚蛋白表达为酶原，是通过不同pH阈值时连续去除C-和N端前肽自动激活的(例如，N端的断裂发生在残基Asp²⁵或Asp²¹，而C端的断裂发生在残基Asn³²³)，被认为是通过内体酸化或通过内体/溶酶体系统的进化控制的(Li et al.，supra；Kato et al.(2005)Nature Chem.Biol.1：33-38；Chen et al.(2000)Biochem.J.352：327-34)。成熟豆荚蛋白再行N糖基化，并表现出很大程度上取决于低pH值，即小于约pH 6.0的蛋白酶活性(Chen et al.(1997)supra)。

[0007]豆荚蛋白被某些某些胱抑蛋白(cystatin)(例如ovocystatin和胱抑蛋白C和M(参见例如PCT公开No.WO00/064945和Vigneswaran et al.(2006)Life Sciences 78：898-907))，以及巯基依赖性酶抑制剂(例如碘乙酸、碘乙酰胺和马来酰亚胺)，但不受木瓜蛋白酶抑制剂E64(反式-环氧基琥珀酰-L-亮氨酰基-(4-胍基)丁烷)、亮抑酶肽和Z-Phe-Ala-CHN₂(id.；Rozman-Pungercar et al.(2003)Cell Death Diff.10：881-88；Vigneswaran et al.，supra；Chen et al.(1998)supra)的影响。某些氟代和氯代甲基酮肽半胱氨酸蛋白酶抑制剂(如在Rozman-Pungercar et al.，supra中公开的那些)，和抗豆荚蛋白抗体(Choi et al.(1999)supra)也抑制豆荚蛋白活性。

[0008]各种合成的化合物也已表现出抑制豆荚蛋白蛋白酶活性，包括aza-肽Micheal受体/抑制剂(Niestroj et al.(2002)Biol.Chem.383：1205-14；Ekici et al.(2004)J.Med.Chem.47：1889-92；

(2004)“Design，Synthesis and Evaluation of Irreversible PeptidylInhibitors for Clan CA and Clan CD Cysteine Proteases”，论文，2004年5月，Georgia Institute of Technology)，aza肽环氧化物(

supra；Asgian et al.(2002)J.Med.Chem.45：4958-60；James et al.(2003)Biol.Chem.384：1613-18；U.S.专利No.7,056,947)，甲基酮(如酰氧基甲基酮，例如Loak et al.(2003)Biol.Chem.384：1239-46中公开的2，6-二甲基苯甲酸-3-苄氧基羰基氨基-4-氨甲酰基-2-氧代丁基酯[MV026630]，和卤代甲基酮，如Niestroj et al.，supra中公开的那些)，以及其他合成物(参见例如U.S.专利No.6,004,933；PCT公开No.WO 03/016335和WO 99/048910；Yamane et al.(2002)Biochim.Biophys.Acta 1596：108-20(公开了对氯汞苯磺酸、Hg2+和Cu2+抑制豆荚蛋白)；以及Li et al.，supra(公开了可逆AEP抑制剂F_moc-AENK酰胺))。

[0009]动脉粥样硬化是动脉血管的全身性和炎性血管疾病，通常被称为动脉的“硬化”，是由血管壁内脂肪沉积所导致的。动脉粥样硬化最初的步骤是脂纹的形成，主要是由泡沫细胞即充满了大量被吞噬的胆固醇的巨噬细胞组成(例如Greaves and Gordon(2005)J.Lipid Res.46：11-20)。据认为这些条纹是由单核细胞粘连到动脉细胞壁中激活的内皮细胞所引发的(id.)。粘连的单核细胞随后在称为外渗的过程中从血管腔迁移到血管内膜的内皮下空间(即新内膜)，在此它们通过清道夫受体如CD36和SRA分化成识别并吞噬低密度脂蛋白(LDLs)的巨噬细胞(Wasserman and Shipley(2006)Mt.Sinai J.Med.73：431-39；Lucas and Greaves(2001)Expert Rev.Mol.Med.5：1-18)。随着时间的推移，血管中膜的平滑肌细胞也开始增殖并迁移新内膜中，在此它们蓄积胆固醇，成为平滑肌源性泡沫细胞(id.)。平滑肌源性和巨噬细胞源性泡沫细胞最终坏死，剩下充满脂质的核，该核充满基质分子和细胞碎片，通过由剩余的平滑肌细胞(id.)分泌的基质帽结构(matrix cap)与动脉腔分隔。由此产生的结构是由纤维性“动脉粥样硬化”或“粥样”斑块所涵盖的动脉粥样硬化性病变。

[0010]因为无弹性的粥样斑块使血管壁变厚，从而减少动脉腔直径，动脉扩大，导致动脉瘤(Wasserman and Shipley，supra；Staryet al.(1995)Circulation 92：1355-74)。如果所述扩大不足以使与动脉壁变厚相关的动脉腔扩大，则导致狭窄(id.)。此外，更薄和更弱的纤维帽(即“脆弱的”或“不稳定的”帽)经常破裂(Wasserman andShipley，supra)。斑块破裂过程中，炎性细胞集中到脆弱斑块的肩区(Lucas and Greaves，supra)。在所述病变的此区域，T淋巴细胞(CD4⁺)分泌削弱血管平滑肌细胞增殖和胶原合成的炎性细胞因子IFNγ，减弱粥样斑块(id.)。此外，病变内激活的巨噬细胞产生降解胶原(id.)的基质金属蛋白酶(MMPs)。这些机制强调了炎性细胞在纤维帽的剥落和破裂中的作用。

[0011]斑块破裂可能导致由破裂部位血小板聚集引起的血栓形成，血管的部分或完全闭塞，以及由血栓掺入粥样斑块引起的动脉粥样硬化性病变的发展。动脉中血栓的形成和累积使已由粥样斑块的存在所诱发的动脉狭窄加剧，从而阻碍血流(即缺血或中风)到下游组织，如心脏病或肾脏(id.)。血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)α和β、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、凝血酶、巨噬细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及血管紧张素II是表征早期动脉粥样硬化、血管炎症以及动脉粥样硬化血栓形成(id.)的内皮细胞破裂部位的活化血小板、巨噬细胞和激活的内皮细胞产生的促分裂素。

[0012]蛋白分解是动脉粥样硬化多个方面涉及的病理活动，包括白细胞浸润到内皮下空间，SMCs迁移到内膜，细胞外基质降解和斑块的去稳定作用，以及新血管形成(Liu et al.(2004)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24：1359-66)。一些蛋白酶已涉及动脉粥样硬化的发展。除了金属蛋白酶(MMPs)和丝氨酸蛋白酶，溶酶体半胱氨酸蛋白酶最近已与动脉粥样硬化有关联。例如组织蛋白酶S、K或L缺失导致LDLR-/-或ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化减少，对动脉粥样硬化中的这些半胱氨酸蛋白酶表现出功能性作用(Sukhova etal.(2003)J.Clin.Invest.111(6)：897-906；Lutgens et al.(2006)Circulation 113(1)：98-107；Kitamoto et al.(2007)Circulation115(15)：2065-75)。最近，豆荚蛋白基因被发现在稳定和不稳定的人动脉粥样硬化斑块中差异表达(Papaspyridonos et al.(2006)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.26：1837-44.)。

发明概述

[0013]本发明提供了各种与哺乳动物豆荚蛋白如人、小鼠、和猪豆荚蛋白，以及哺乳动物豆荚蛋白剪接变体，尤其是新型剪接变体ZB-1有关的方法和组合物。在本研究中，本发明人记载了动脉粥样硬化的小鼠模型中豆荚蛋白的基因和蛋白表达，并在人动脉粥样硬化组织中进一步表征豆荚蛋白表达。此外，本发明人报道巨噬细胞表达的豆荚蛋白通过蛋白酶依赖以及非依赖机理，对动脉粥样硬化起作用。

[0014]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了包含SEQ ID NO：11核酸序列的多核苷酸。在另一实施方案中，所述多核苷酸包含高严格性条件下与SEQ ID NO：11核酸序列或SEQ IDNO：11核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其包含编码选自SEQ ID NO：12的氨基酸序列、SEQ ID NO：12的氨基酸21至323、SEQ ID NO：12的氨基酸25至323，以及SEQ ID NO：12其它活性片段的氨基酸序列的核酸序列。在另一实施方案中，所述多核苷酸包含高严格性条件下与编码选自SEQ ID NO：12的氨基酸序列、SEQ ID NO：12的氨基酸21至323、SEQ ID NO：12的氨基酸25至323，以及SEQ ID NO：12其它活性片段的氨基酸序列的核酸序列或核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。在其他实施方案中，提供了与这些序列的一种或多种具有高序列一致性的多核苷酸。

[0015]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了包含SEQ ID NO：12氨基酸序列、SEQ ID NO：12的氨基酸21至323，或SEQ ID NO：12的氨基酸25至323的多肽。在另一实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：11核酸序列编码的多肽。在另一实施方案中，本发明提供了由高严格条件下与SEQ ID NO：11核酸序列的互补序列杂交的核酸序列编码的多肽。在其它实施方案中，提供了与这些序列的一种或多种具有高序列一致性的多肽。

[0016]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了特异性结合哺乳动物ZB-1多肽或哺乳动物ZB-1多肽片段的抗体或其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述哺乳动物ZB-1多肽或哺乳动物ZB-1多肽片段来自人。在另一实施方案中，所述人ZB-1多肽包含SEQ ID NO：12氨基酸序列或SEQ ID NO：12氨基酸序列的活性片段。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是拮抗的或激动的。

[0017]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供包含治疗有效量的ZB-1和药学上可接受载体的药物组合物。

[0018]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于治疗、减轻或预防血管疾病或炎性疾病的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述疾病是炎性疾病。在另一实施方案中，所述炎性疾病选自关节炎、肺结核、多发性硬化症、Crohn’s病或溃疡性结肠炎。在另一实施方案中，所述疾病是血管疾病。在另一实施方案中，所述血管疾病选自动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、房性心律失常、室性心律失常、狭窄、动脉瘤、周围血管疾病、周围动脉疾病、慢性周围动脉闭塞性疾病、血栓形成、粥状动脉栓塞症、深静脉血栓形成、急性动脉血栓形成、栓塞、炎性血管疾病、雷诺氏现象、血管炎、动脉炎、静脉病、高血压血管疾病、跛行、绞痛、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、中风、周围动脉闭塞性疾病、冠状动脉疾病、急性冠脉综合征、代谢综合征、局部缺血、再灌注，慢性肾脏病、终末期肾脏病、糖尿病肾病、高血脂、高血压和糖尿病。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段，aza-肽Micheal受体/抑制剂，aza-肽环氧化物，氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺和马来酰亚胺。

[0019]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供治疗、减轻或防止哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包括将治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，所述疾病是炎性疾病。在另一实施方案中，所述炎性疾病选自关节炎、结核病、多发性硬化症、Crohn’s病或溃疡性结肠炎。在另一实施方案中，所述疾病是血管疾病。在另一实施方案中，所述血管疾病选自动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、房性心律失常、室性心律失常、狭窄、动脉瘤、周围血管疾病、周围动脉疾病、慢性周围动脉闭塞性疾病、血栓形成、粥状动脉栓塞症、深静脉血栓形成、急性动脉血栓形成、栓塞、炎性血管疾病、雷诺氏现象、血管炎、动脉炎、静脉病、高血压血管疾病、粥状动脉栓塞症、跛行、绞痛、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、中风、周围动脉闭塞疾病、冠状动脉疾病、急性冠脉综合征，代谢综合征、缺血、再灌注、慢性肾病、末期肾病、糖尿病肾病、高血脂、高血压和糖尿病。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段，aza-肽Micheal受体/抑制剂，aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂和氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺和马来酰亚胺。

[0020]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包含使哺乳动物的细胞或细胞群与治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂接触。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群包含巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞，或单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和/或泡沫细胞的混合物。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群分泌豆荚蛋白和/或ZB-1。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群包含动脉内皮细胞或肾近端小管细胞。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群来自炎性细胞浸润到动脉内膜的部位。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群来自动脉新内膜病变区域。

[0021]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了降低细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的方法，其包含使所述细胞或细胞群与足以降低细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂接触。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群包括巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞，或单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和/或泡沫细胞的混合物。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群分泌豆荚蛋白和/或ZB-1。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群包含动脉内皮细胞或肾近端小管细胞。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群来自炎性细胞浸润到动脉内膜中的部位。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群来自动脉新内膜病变区域。

[0022]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了降低哺乳动物中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的方法，其包含向哺乳动物施用足以降低哺乳动物中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段、aza-肽Micheal受体/抑制剂、aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺以及马来酰亚胺。

[0023]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了监测患者血管疾病或炎性疾病治疗过程的方法，其包含：测量患者的细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于患者；以及施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂后，测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1的活性、表达和/或分泌水平，其中与施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂前患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂后患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明治疗患者的血管疾病或炎症疾病有积极的效果。

[0024]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了监测患者血管疾病或炎性疾病的方法，其包含：于第一时间点测量患者的细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；以及于第二时间点测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，其中与第一时间点患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，第二时间点患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明血管疾病或炎症疾病的严重程度已降低。

[0025]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了监测患者血管疾病或炎性疾病的方法，其包含：测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；并把患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平与参比细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平进行比较，其中与参比细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明血管疾病或炎症疾病的严重程度已降低。

[0026]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了预测患者血管疾病或炎性疾病的方法，其包含：于第一时间点测量患者的细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；并于第二时间点测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，其中与第一时间点患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，第二时间点患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明患者或者发展成血管疾病或炎症疾病，或发展成更严重形式的血管疾病或炎症疾病的可能性降低。

[0027]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了预测患者血管疾病或炎性疾病的方法，其包含：测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；并把细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平与参比细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平进行比较，其中与参比细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明患者或者发展成血管疾病或炎症疾病，或发展成更严重形式的血管疾病或炎症疾病的可能性降低。

[0028]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了筛选能治疗、减轻或预防血管疾病或炎性疾病的化合物的方法，其包含步骤：将含有豆荚蛋白和/或ZB-1的样本与感兴趣的化合物接触；并测量相对于没有与所述化合物接触的样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，所述接触过的样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平是否降低，其中所述接触过的样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平降低证明所述化合物为能治疗、减轻或预防血管疾病或炎性疾病的化合物。

[0029]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包含将治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂在制备用于治疗、减轻或预防血管疾病或炎性疾病的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0030]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了抑制哺乳动物中细胞迁移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段、aza-肽Micheal受体/抑制剂、aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺以及马来酰亚胺。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于抑制哺乳动物中细胞迁移的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

[0031]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了促进哺乳动物中细胞迁移的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂在制备用于哺乳动物中细胞迁移的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0032]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了促进哺乳动物伤口愈合的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于促进哺乳动物伤口愈合的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0033]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了抑制哺乳动物血管生成的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段、aza-肽Micheal受体/抑制剂、aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺以及马来酰亚胺。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于抑制哺乳动物血管生成的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

[0034]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了促进哺乳动物血管生成的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂在制备用于促进哺乳动物血管生成的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0035]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了抑制哺乳动物内皮细胞增殖的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段、aza-肽Micheal受体/抑制剂、aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺以及马来酰亚胺。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于抑制哺乳动物内皮细胞增殖的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

[0036]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了促进哺乳动物内皮细胞增殖的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂在制备用于促进哺乳动物内皮细胞增殖的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0037]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了抑制瘤转移的方法，其包含使哺乳动物细胞或细胞群与豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂接触。在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了抑制哺乳动物瘤转移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。在另一实施方案中，所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗抗体及其抗原结合片段。在另一实施方案中，所述抑制性多核苷酸选自反义多核苷酸、siRNA分子、核酶和适体。在另一实施方案中，所述抑制性多肽选自胱抑蛋白或其活性片段、aza-肽Micheal受体/抑制剂、aza-肽环氧化物、氟代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂以及氯代甲基酮肽胱冬蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述小分子选自甲基酮、碘乙酸、碘乙酰胺以及马来酰亚胺。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于抑制哺乳动物瘤转移的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

[0038]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了促进移植手术恢复的方法，其包含使豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂与哺乳动物细胞或细胞群接触。在另一实施方案中，本发明提供了豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂在制备用于促进哺乳动物移植手术恢复的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂，以及药学上可接受的载体。

[0039]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包含将治疗有效量的OIP-2施用于哺乳动物。在另一实施方案中，本发明提供了OIP-2在制备用于治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的OIP-2，以及药学上可接受的载体。

附图简述

[0040]图1为与健康动脉样本(X轴：“正常”)相比，有斑块(X轴：″粥样斑块(Athero Plaque)″)或无斑块(X轴：″粥样血管(Athero Vessel)″)部分的人动脉粥样硬化患者动脉样本中豆荚蛋白mRNA的表达(上图；Y轴：″归一化强度(倍数范围)″)。相对于无斑块部分或无疾病的动脉样本，含有斑块动脉粥样硬化患者的动脉样本中的豆荚蛋白(201212at)的表达增加；数值见下图。

[0041]图2是5-55周龄(X-轴：“年龄(周)”)的ApoE-/-小鼠(“ApoE-/-”)和C57BL/6野生型对照小鼠主(“C57BL/6”)动脉弓中豆荚蛋白mRNA的表达(Y轴：“频率(ppm)”)。豆荚蛋白基因表达随疾病进展而增加。

[0042]图3是实时PCR(RT-PCR)确证的动脉粥样硬化中豆荚蛋白mRNA表达(Y轴：″相对单位(β-肌动蛋白归一化)″)概况图。mRNA从40周龄C57BL/6野生型对照小鼠(“C57BL/6”)和12至54周龄ApoE-/-小鼠(“ApoE-/-”)(X-轴：“年龄(周)”)的主动脉弓分离，并用RT-PCR分析。数据表明豆荚蛋白基因表达随小鼠动脉粥样硬化进展而增加。

[0043]图4表明分化的(巨噬细胞)THP1人单核细胞性白血病细胞中豆荚蛋白mRNA、蛋白和活性增加。(图4A)THP1细胞在含有PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)的培养基中分化0、1、2或3天(X轴：″分化后的天数″)。所述mRNA水平(Y轴：″倍数变化″)用

(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量-PCR测定。(图4B)未分化(左侧电泳泳道)或PMA-分化THP1细胞(右侧电泳泳道)中成熟豆荚蛋白和肌动蛋白(对照)蛋白水平分别用抗豆荚蛋白多克隆抗体和抗肌动蛋白多克隆抗体，通过Western分析测定。分子量标记(kDa)显示在左侧。(图4C)使用如图4B中相同的细胞裂解物，通过测量豆荚蛋白底物肽Z-AAN-MCA (Peptide Institute，Louisville，KY)的水解，测定豆荚蛋白的蛋白酶活性(Y轴：″反应速率″)(X轴：未分化THP1单核细胞，″未分化的″；分化的THP1巨噬细胞，″分化的″)。

[0044]图5表明在M-CSF活化的原代人巨噬细胞中豆荚蛋白蛋白水平和活性增加。细胞裂解物从无血清培养基(图5A和5B)或添加0.25％FBS(图5C)的含有或不含M-CSF的RPMI培养基培养的原代人巨噬细胞制备。(图5A)：通过Western分析，检测MCSF刺激的人巨噬细胞中的豆荚蛋白蛋白(“成熟豆荚蛋白”和“豆荚蛋白前体”)。电泳泳道1：未刺激的；电泳泳道2：M-CSF处理的。“肌动蛋白”：肌动蛋白加样对照。(图5B)：从M-CSF刺激的人巨噬细胞检测条件培养基中的豆荚蛋白前体。电泳泳道1：未刺激的：电泳泳道2：M-CSF处理的。(图5C)：通过Z-AAN-MCA水解测量的M-CSF刺激的人巨噬细胞(X轴：“M-CSF”)或未刺激巨噬细胞(X轴：“未处理的”)中豆荚蛋白活性(Y轴：“反应速率”)的检测。

[0045]图6是原代人单核细胞向Boyden小室中纯化豆荚蛋白的剂量依赖性迁移，用发光法细胞活力检测(luminescent cellviability assay)测量和定量(Y轴：″发光″)。10ng/mL VEGF和5％FBS用作阳性对照；统计学显著性达到p＜0.05(ANOVA)。星号(*)表示与0ng/ml相比有显著性。

[0046]图7为细胞表面豆荚蛋白活性的检测。293细胞用表达小鼠豆荚蛋白的腺病毒侵染。细胞表面豆荚蛋白活性(Y轴：″反应速率″)通过有或没有蛋白酶抑制剂胱抑蛋白C或E64存在下，在含有豆荚蛋白底物肽Z-AAN-MCA(Peptide Institute)的反应缓冲液中培养表达豆荚蛋白的细胞而测定。对照：“无抑制剂”。

[0047]图8是体外伤口愈合分析中豆荚蛋白对HEK293细胞迁移的作用。VEGF(10ng/mL)和5％FBS用作阳性对照。结果表明相对于对照，用10ng/mL和25ng/mL豆荚蛋白刺激，细胞迁移显著增加，用星号(*)表示。统计学显著性达到p＜0.05(ANOVA)。

[0048]图9是体外伤口愈合分析中豆荚蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的作用。VEGF(10ng/mL)和5％FBS用作阳性对照。结果表明相对于对照，用25ng/mL豆荚蛋白刺激，细胞迁移显著增加，用星号(*)表示。VEGF为10ng/mL时，25ng/mL豆荚蛋白促进迁移增加到同样的程度。统计学显著性达到p＜0.05(ANOVA)。

[0049]图10是改良Boyden小室中接触纯化的豆荚蛋白的HUVEC的剂量依赖性Matrigel侵袭，用发光法细胞活力检测测量和定量(Y轴：“发光”)。10ng/mL VEGF用作阳性对照。加样到上层和下层小室的25ng/mL豆荚蛋白用作阳性对照。结果表明与对照相比，用25ng/mL豆荚蛋白刺激，细胞侵袭显著增加，用星号(*)表示。当VEGF为10ng/mL时，25ng/mL豆荚蛋白促进侵袭增加到同样的程度。统计学显著性达到p＜0.05(ANOVA)。

[0050]图11是与人豆荚蛋白序列(顶端序列(1-434))比对的人ZB-1(底部序列(1-377))的氨基酸序列。“Asp²⁵断裂”：N端前肽断裂位点；“Asn³²³断裂”：C端前肽断裂位点。

发明详述

[0051]本文公开的研究结果证明豆荚蛋白为参与血管疾病，例如心血管疾病如动脉粥样硬化，和炎性疾病，例如慢性炎性疾病如关节炎的基因。

[0052]此外本文公开的是豆荚蛋白的新型剪接变体，称为ZB-1，其缺少全长人豆荚蛋白的氨基酸341-397，并且和豆荚蛋白一样，是细胞培养中超量表达而分泌的。因此，ZB-1还可以在血管和炎性疾病中起作用。

[0053]本文公开的研究结果为：(1)在小鼠动脉粥样硬化模型中，病变形成过程中豆荚蛋白mRNA和蛋白表达显著增加；(2)与无疾病的组织相比，人动脉粥样硬化患者样本中豆荚蛋白mRNA增加；(3)在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的泡沫细胞中检测到豆荚蛋白蛋白；(4)豆荚蛋白是由ApoE-/-小鼠主动脉窦的动脉内皮细胞表达的；(5)豆荚蛋白在活化的人巨噬细胞和分化的巨噬细胞中高表达，并释放到活化的人巨噬细胞的培养基中；(6)巨噬细胞分化和巨噬细胞活化过程中豆荚蛋白活性在细胞培养物中显著增加；(7)重组体豆荚蛋白超量表达细胞的细胞表面检测到酶活性的豆荚蛋白；(8)豆荚蛋白在肾脏，例如在肾动脉的内皮细胞和近端小管细胞中表达；(9)豆荚蛋白在动脉粥样硬化患者的冠状动脉中表达；(10)豆荚蛋白刺激诱导人单核细胞迁移；以及(11)豆荚蛋白刺激诱导HEK293和HUVEC培养物伤口愈合模型中内皮细胞迁移和增殖，以及HUVEC培养物中内皮细胞侵袭。综合考虑，这些研究结果意味着豆荚蛋白(和ZB-1)与血管和/或炎性疾病，如(即包括但不限于)动脉粥样硬化之间的功能联系。

[0054]本文还公开的研究结果是小鼠关节炎模型中胶原诱导关节炎(CIA)爪中豆荚蛋白表达增加。由于发生在如动脉粥样硬化(血管炎症的形式)过程中的单核细胞募集和巨噬细胞分化也是以慢性炎症(如关节炎和结核病)为特征的疾病的典型特征，因此这些研究结果表明豆荚蛋白和ZB-1在炎性疾病中具有普遍作用。

[0055]根据这些研究结果，分析和/或调节豆荚蛋白和豆荚蛋白变体，如新型ZB-1的分泌、表达和/或活性，提供了极好的诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防血管疾病和炎性疾病以及随其有关疾病的工具。

[0056]因此，本发明提供了豆荚蛋白和ZB-1调节剂(例如豆荚蛋白和ZB-1拮抗剂，以及豆荚蛋白和ZB激动剂)。因此，本发明提供豆荚蛋白和ZB-1拮抗剂，如哺乳类动物(如小鼠和人)豆荚蛋白和ZB抑制性多核苷酸(即或直接或间接降低豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的多核苷酸，例如反义分子、siRNA、适体)；豆荚蛋白和ZB-1抑制性多肽(即或直接或间接降低豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的多肽，例如豆荚蛋白或ZB-1的片段，如含有异常蛋白酶酶域的片段及其融合蛋白)；拮抗性抗豆荚蛋白和ZB-1抗体或抗体片段(即或直接或间接降低豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的抗体或抗体片段(即抗原结合片段)，包括例如结合全长豆荚蛋白和/或ZB-1和/或豆荚蛋白和/或ZB-1片段的拮抗性抗体和抗体片段)；以及拮抗性小分子(如siRNA分子、适体以及有机小分子或化合物)，其可用于抑制豆荚蛋白和/或ZB-1介导的天冬酰胺酰基键水解，并因此可用于诊断、预测、监测和/或治疗与增加的豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的疾病，和/或通过降低豆荚蛋白和/或ZB-1活性或表达可治疗的疾病，即豆荚蛋白和/或ZB-1有关的疾病。本文所用的术语“拮抗剂”指直接拮抗剂(如直接与豆荚蛋白和/或ZB-1多肽或多核苷酸相互作用的分子)和间接拮抗剂(如间接降低ZB-1和/或豆荚蛋白活性、分泌和/或表达的分子(例如含有阻断豆荚蛋白与整合素相互作用的肽的RGD))。

[0057]本发明还提供豆荚蛋白和ZB-1激动剂，例如哺乳动物(如小鼠和人)豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸(即或直接或间接增加豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的多核苷酸，例如mRNAs、cDNAs)；豆荚蛋白和ZB-1多肽(即或直接或间接增加豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的多肽，例如豆荚蛋白或ZB-1的片段，如含有蛋白酶酶域的片段及其融合蛋白)；激动性抗豆荚蛋白和ZB-1抗体或抗体片段(即或直接或间接增加豆荚蛋白和/或ZB-1水平、细胞分泌和/或活性的抗体或抗体片段，包括例如结合全长豆荚蛋白和/或ZB-1和/或豆荚蛋白和/或ZB-1片段的激动抗体和抗体片段)；以及激动性小分子(如有机小分子或化合物)，其可用于增强豆荚蛋白和/或ZB-1介导的天冬酰胺酰基键水解，并因此可用于诊断、预测、监测和/或治疗与降低的豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的疾病，和/或通过增加豆荚蛋白和/或ZB-1活性或表达可治疗的疾病，例如通过增加的细胞(如内皮细胞)迁移可治疗的或将从中受益的疾病，如伤口愈合(例如手术引起或意外发生或其它方式造成的伤口)，或其它通过这样增加的细胞迁移可治疗或将从中受益的疾病，如移植手术恢复。本文所用的术语“激动剂”指直接激动剂(如直接与豆荚蛋白和/或ZB-1多肽或多核苷酸相互作用的分子)和间接拮抗剂(如间接增加ZB-1和/或豆荚蛋白活性、分泌和/或表达的分子(例如豆荚蛋白与ZB-1表达的转录增强子))。

[0058]由于豆荚蛋白是被认为与基质分子和/或细胞表面相互作用的分泌蛋白，因此降低细胞外出现的豆荚蛋白和/或ZB-1量的化合物用于调节分泌豆荚蛋白和/或ZB-1的细胞或细胞群，如巨噬细胞，泡沫细胞，血管和内皮细胞(例如动脉内皮细胞)，炎性细胞浸润到血管壁中的部位(例如到动脉内膜)，新内膜病变区域，肾近端小管细胞，单核细胞等中豆荚蛋白和/或ZB-1的活性。

[0059]与增加的豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的疾病本文描述为“豆荚蛋白-和/或ZB-1-相关疾病”等等，包括但不限于动脉粥样硬化(包括但不限于动脉粥化形成与动脉粥样硬化的所有阶段，如内皮细胞激活、脂纹形成、血管壁的炎性细胞浸润、内皮细胞迁移、泡沫细胞形成、斑块剥蚀、粥样斑块形成、粥样斑块破裂、动脉粥样硬化血栓形成、动脉瘤、狭窄等)，充血性心力衰竭，心肌梗死，心律失常(如心房和心室心律不齐)，狭窄，动脉瘤，周围性血管疾病，慢性周围动脉闭塞性疾病(CPAOD)，周围动脉闭塞性疾病(PAOD)，血栓形成(包括如急性动脉血栓形成、动脉粥样硬化血栓形成和深静脉血栓形成)，栓塞，炎症血管疾病，雷诺氏现象，血管炎和/或动脉炎(包括例如Bechet’s病、Buerger’s病、中枢神经系统血管炎、Churg-Strauss症候群冷凝球蛋白血症、巨细胞性动脉炎、川崎病、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、类风湿性血管炎、大动脉炎和韦格纳肉芽肿)，静脉病，高血压血管疾病，跛行，绞痛(例如稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛)，中风，冠心病(CAD)，周围动脉疾病(PAD)，急性冠脉综合征(ACS)，代谢综合征，缺血，再灌注，以及受循环系统影响的各种疾病的恶化(如糖尿病肾病、慢性肾脏病、终末期肾病(ESRD)、高脂血症、高血压和糖尿病)。使用本文公开的方法诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防的另外的疾病包括炎性疾病(如慢性炎性疾病，包括但不限于关节炎、肺结核和多发性硬化症，以及炎性肠病，如Crohn’s病和溃疡性结肠炎)。

[0060]本发明进一步提供筛选：(1)豆荚蛋白和/或ZB型1拮抗剂，例如小鼠和人豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多核苷酸(例如反义多核苷酸、siRNA、适体)；豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多肽(例如豆荚蛋白和/或ZB-1的酶非活性片段)；拮抗剂抗豆荚蛋白和/或-ZB-1抗体和抗体片段(包括结合豆荚蛋白和/或ZB-1片段的抗体和抗体片段)；和拮抗性小分子(例如siRNAs、适体和有机小分子或化合物)；以及(2)用于治疗、减轻和/或预防豆荚蛋白-和/或ZB-1相关疾病，如血管疾病和/或炎性疾病的化合物的方法。这样的筛选方法可通过例如测量豆荚蛋白和/或ZB-1表达水平的变化(例如豆荚蛋白和/或ZB-1mRNA、cDNA、蛋白和/或蛋白片段的水平)，或通过测量豆荚蛋白和/或ZB-1活性水平的变化(例如底物天冬酰胺酰基键水解水平的变化)，或通过测量豆荚蛋白和/或ZB-1分泌水平的变化(例如通过使用免疫组织化学或其他众所周知的技术)进行。

[0061]本文所用的术语“豆荚蛋白”和“ZB-1”在适当情况下是指哺乳动物豆荚蛋白和ZB-1，例如灵长类动物(包括人)和/或啮齿动物(包括小鼠)豆荚蛋白和ZB-1，并包括豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽。

[0062]因此，本申请提供豆荚蛋白和ZB-1相关的多核苷酸和多肽。本发明还提供抗体及其抗体片段，例如完整的抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗体片段结合豆荚蛋白和/或ZB-1，例如哺乳动物豆荚蛋白和/或ZB-1，尤其是人、猪和/或鼠豆荚蛋白和/或ZB-1。在一个实施方案中，抗豆荚蛋白或ZB-1抗体抑制或拮抗至少一种豆荚蛋白和/或ZB-1相关的活性。例如，抗豆荚蛋白抗体可结合豆荚蛋白并抑制(例如降低、限制、中和、阻断、干扰，或以其他方式减少)豆荚蛋白和蛋白/肽底物间的相互作用。抗豆荚蛋白抗体还可以结合豆荚蛋白和/或ZB-1，并通过诱导豆荚蛋白或ZB-1氨基酸三级和/或二级结构构象变化，或通过防止豆荚蛋白和/或ZB-1加工成成熟肽(例如通过防止所述前肽的N端或C端加工)，干扰豆荚蛋白和/或ZB-1酶活性(例如蛋白酶活性、蛋白/肽裂解、蛋白/肽激活)。因此，本发明的所述抗体可以用来检测，并任选地抑制豆荚蛋白和/或ZB-1活性(例如豆荚蛋白和/或ZB-1与蛋白/肽底物的相互作用，或豆荚蛋白和/或ZB-1天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶活性)。因此本发明的抗豆荚蛋白抗体和抗ZB-1抗体可用于诊断、预测、监测、治疗、减轻或预防豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病，如血管和炎性疾病，如动脉粥样硬化和关节炎。

豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽

[0063]本发明提供了豆荚蛋白和ZB-1的表征，例如在主动脉、肾和动脉粥样硬化斑块中的表达概况图，亚细胞定位以及酶活性。因此，本发明涉及豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽(例如豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽的全长和片段)以及抑制性豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽(例如豆荚蛋白和ZB-1抑制性多核苷酸和多肽的全长和片段)。与GenBank检索号NM_001008530和NM 005606对应的人豆荚蛋白核酸序列为SEQ ID NOs：1和3。相应的人豆荚蛋白氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：2和4。与GenBank检索号NM_011175对应的小鼠豆荚蛋白核酸序列为SEQID NO：5。相应的小鼠豆荚蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：6。黑猩猩(Pan troglodytes)核酸序列预测为豆荚蛋白，对应GenBank检索号XM_510133，是SEQ ID NO：7。相应的黑猩猩(Pantroglodytes)氨基酸序列是SEQ ID NO：8。猕猴(Macaca mulatta)核酸序列预测是豆荚蛋白，对应GenBank检索号XM_001092047，是SEQ ID NO：9。相应的猕猴(Macaca)氨基酸序列是SEQ IDNO：10。另外的豆荚蛋白核苷酸和预测是豆荚蛋白蛋白的核苷酸包括来自牛(Bos taurus)(GenBank检索号NM_174101)、绵羊(Ovisaries)(GenBank检索号DQ₁52974)、家犬(Canis familiaris)(GenBank检索号XM_851487 and XM_537355)以及大鼠(Rattusnorvegicus)(GenBank检索号NM_022226)的。“豆荚蛋白多肽”指哺乳动物(如人和小鼠)豆荚蛋白蛋白(包括但不限于等位基因变体)及其片段，例如SEQ ID NOs：2、4、6、8和10中的氨基酸序列。“豆荚蛋白多核苷酸”指哺乳动物(如人和小鼠)豆荚蛋白核酸(包括但不限于RNA、DNA及其等位基因变体)及其片段，例如SEQ ID NOs：1、3、5、7和9中的核酸序列。

[0064]本发明人还确立了豆荚蛋白和ZB-1间存在高度同源性，ZB-1和豆荚蛋白一样是分泌蛋白。因此，本发明涉及ZB-1多核苷酸和多肽(例如ZB-1多核苷酸和多肽的全长和活性片段)以及抑制性ZB-1多核苷酸和多肽(例如ZB-1抑制性多核苷酸和多肽的全长和片段)。编码此新型蛋白的cDNA的核酸序列被称作人ZB-1，是SEQ ID NO：11。本发明的多核苷酸还包括严格条件下与SEQ ID NO：11杂交的多核苷酸，或其互补序列，和/或编码保留全长人ZB-1大量生物活性的多肽。本发明的多核苷酸还包括包含至少21个连续核苷酸的SEQ ID NO：11中序列的连续部分。

[0065]人ZB-1的推断氨基酸序列为SEQ ID NO：12。本发明的多肽还包括包含至少七个连续氨基酸的SEQ ID NO：12中序列的连续部分。本发明优选的多肽包括保留人ZB-1大量生物活性的SEQ ID NO：12中序列的任何连续部分(即活性片段)。除了上述人源的那些多核苷酸外，本发明的多核苷酸还包括编码SEQ IDNO：12中所述氨基酸序列或其连续部分，并且仅因为众所周知的遗传密码简并而与上述人源多核苷酸不同的多核苷酸。

[0066]“ZB-1多肽”指哺乳动物(如人和小鼠)ZB-1蛋白(包括等位基因变体)及其片段，如SEQ ID NO：12中氨基酸序列。“ZB-1多核苷酸”指哺乳动物(例如人和小鼠)ZB-1核酸(包括RNA和DNA，及其等位基因变体)及其片段，如SEQ ID NO：11中所述核酸序列。“活性片段”指豆荚蛋白或ZB-1多核苷酸或多肽的一部分，其相当大程度上保留了豆荚蛋白或ZB-1多核苷酸或多肽的生物活性，如天冬酰胺酰基蛋白酶/肽酶活性或编码保留了天冬酰胺酰基蛋白酶/肽酶活性的多肽/肽。本领域普通技术人员会了解几种评估这样的片段的生物活性的检测。

[0067]本发明的或有关的分离的多核苷酸可用作识别并分离具有与编码所述公开的多核苷酸的相同或相似序列的核酸的杂交探针以及引物。鉴别和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，并且对本领域技术人员是熟知的。

[0068]杂交反应可在不同的严格性条件下进行。杂交反应的严格性包括任意两个核酸分子彼此杂交的难度。优选地，每个杂交多核苷酸在降低的严格性条件下，更优选严格条件，最优选高严格条件下与其相应多核苷酸杂交。严格性条件的例子如下表1所示：高严格条件至少和例如条件A-F一样严格；严格条件至少和例如条件G-L一样严格；以及降低的严格性条件至少和例如条件M-R一样严格。

表1严格性条件

严格性条件	多核苷酸杂交体	杂交体长度(bp)1	杂交温度和缓冲液2	清洗温度和缓冲液2
					A	DNA:DNA	＞50	65℃；1xSSC-或-42℃；1xSSC，50％甲酰胺	65℃；0.3xSSC
B	DNA:DNA	＜50	TB*；1xSSC	TB*；1xSSC
					C	DNA:RNA	＞50	67℃；1xSSC-或-	67℃；0.3xSSC

严格性条件	多核苷酸杂交体	杂交体长度(bp)1	杂交温度和缓冲液2	清洗温度和缓冲液2
								45℃；1xSSC，50％甲酰胺
D	DNA:RNA	＜50	TD*；1xSSC	TD*；1xSSC
					E	RNA:RNA	＞50	70℃；1xSSC-或-50℃；1xSSC，50％甲酰胺	70℃；0.3xSSC
F	RNA:RNA	＜50	TF*；1xSSC	TF*；1xSSC
					G	DNA:DNA	＞50	65℃；4xSSC-或-42℃；4xSSC，50％甲酰胺	65℃；1xSSC
H	DNA:DNA	＜50	TH*；4xSSC	TH*；4xSSC
					I	DNA:RNA	＞50	67℃；4xSSC-或-45℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
J	DNA:RNA	＜50	TJ*；4xSSC	TJ*；4xSSC
					K	RNA:RNA	＞50	70℃；4xSSC-或-50℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
L	RNA:RNA	＜50	TL*；2xSSC	TL*；2xSSC
					M	DNA:DNA	＞50	50℃；4xSSC-或-40℃；6xSSC，50％甲酰胺	50℃；2xSSC
N	DNA:DNA	＜50	TN*；6xSSC	TN*；6xSSC
					O	DNA:RNA	＞50	55℃；4xSSC-或-42℃；6xSSC，50％甲酰胺	55℃；2xSSC
P	DNA:RNA	＜50	TP*；6xSSC	TP*；6xSSC
					Q	RNA:RNA	＞50	60℃；4xSSC-或-45℃；6xSSC，50％甲酰胺	60℃；2xSSC
R	RNA:RNA	＜50	TR*；4xSSC	TR*；4xSSC

1：杂交体长度是杂交多核苷酸杂交区域的预期长度。当将多核苷酸与具有未知序列的目标多核苷酸杂交时，所述杂交体长度假设为所述杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸被杂交时，所述杂交体长度可通过比对所述多核苷酸的序列，并确定具有最优序列互补性的所述区域确定。

2：杂交和清洗缓冲液中的SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA，pH 7.4)可用SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)代替；杂交完成后清洗15分钟。

T_B*-T_R*：预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应为低于所述杂交体熔点(T_m)5-10℃，T_m根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体而言，T_m(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对于长度在18至49个碱基对的杂交体而言，T_m(℃)＝81.5+16.6(log₁₀Na⁺)+0.41(％G+C)-(600/N)，N是杂交体中碱基的数量，Na⁺是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的Na⁺＝0.165M)。

多核苷酸杂交严格性条件的另外的例子在Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9和11章，以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节中提供，在此引作参考。

[0069]本发明的或相关的分离多核苷酸可用作鉴别和分离具有编码所述公开的多核苷酸等位基因变体的序列的DNA的杂交探针以及引物。等位基因变体是所述公开的多核苷酸的自然产生的可能的形式，其编码与所述公开的多核苷酸编码的多肽相同或具有重要相似性的多肽。优选地，等位基因变体与所述公开的多核苷酸具有至少90％的序列一致性(更优选地，至少95％一致性；最优选地，至少99％一致性)。或者当所述核酸部分在选择性杂化条件下(如高严格杂化条件)与所述公开的多核苷酸杂交时，存在大量相似性。这种变体涵盖在本发明的范围内。

[0070]本发明的或相关的分离多核苷酸可用作鉴别和分离具有编码与所述公开多核苷酸同源多肽的序列的DNA的杂交探针以及引物。这些同源物是从与所述公开多肽或多核苷酸不同种，或是相同种，分离得到的多核苷酸和多肽，但与所述公开多核苷酸和多肽具有大量序列相似性。优选地，多核苷酸同源物与所述公开的多核苷酸具有高序列一致性，例如至少50％序列一致性(更优选地，至少75％一致性，如80％或85％一致性；最优选地，至少90％一致性，如92％、94％、96％、98％或99％一致性)，而多肽同源物与所述公开的多肽具有高序列一致性，例如至少30％序列一致性(更优选地，至少45％一致性，如50％或55％一致性；最优选地，至少60％一致性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致性)。优选地，所述公开的多核苷酸和多肽的同源物是从哺乳动物中分离的。这样的同源物涵盖在本发明的范围内。

[0071]两个序列间“同源性”或“序列一致性”的计算可通过本领域熟知的比较方法进行。例如关于一致性，为最优比较目的比对序列(例如为最优比对，空位可引入第一和第二氨基酸之一或两者中，或引入核酸序列中，为比较目的可不考虑非同源序列)。在一个实施方案中，为比较目的比对的参考序列的长度是所述参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置是相同的。考虑到为所述两个序列最优比对需要引入的空位的数量和每个空位的长度，两个序列的一致性百分比是所述序列共有的相同位置数量的函数。

[0072]序列比较和两个序列间序列一致性百分比的确定可使用数学算法完成。在一个实施方式中，两个氨基酸序列间的一致性百分比用已纳入GCG软件包(从www.gcg.com获得)GAP程序的Needleman and Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-53)算法，使用或Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及间隙权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定。在另一实施方案中，两个核苷酸序列间的一致性百分比用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵，以及间隙权重40，50，60，70，or80和长度权重1、2、3、4、5或6确定。优选的一组参数(如果专业人员不确定什么参数应该用于确定分子是否在本发明的序列一致性或同源性限制范围内，则应使用此组参数)是空位罚分为12的Blossum 62得分矩阵，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。两种氨基酸或核苷酸间的一致性百分比还可以用已纳入ALIGN程序(版本2.0)的Meyers and Miller((1989)CABIOS 4：11-17)算法，使用PAM120加权残量表(PAM120weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4确定。

[0073]本发明的或相关的分离多核苷酸还可以用作杂交探针和引物，以鉴别表达本发明的或相关多肽的细胞和组织，及其表达的条件。

[0074]此外，本发明的或相关多肽的功能可通过使用编码多肽的多核苷酸，以改变(即增强、降低或修饰)与细胞或生物体中本发明的或相关多核苷酸相应的基因表达而直接测定。这些“相应的基因”为本发明的或相关的被转录生成mRNA的染色体组DNA序列，本发明的或相关多核苷酸来源于所述mRNA。

[0075]本发明的或相关基因表达的改变可通过使用各种抑制性多核苷酸如反义多核苷酸、siRNAs，以及结合和/或裂解从本发明的或相关基因转录的mRNA的核酶，在细胞或生物体内实现(参见如Galderisi et al.(1999)J.Cell Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88)。对豆荚蛋白和/或ZB-1而言的抑制性多核苷酸可能是有用的天冬酰胺酰基肽酶拮抗剂，因此也可用于治疗、减轻和/或预防豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病，如血管和炎性疾病(如动脉粥样硬化和关节炎)。抑制性多核苷酸还可由适体，即结合并调节蛋白活性，如人豆荚蛋白和/或ZB-1活性的多核苷酸组成。适体的描述遍及文献(参见如Nimjee et al.(2005)Annu.Rev.Med.56：555-83；Patel(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：32-46；Pendergrast et al.(2005)J.Biomol.Tech.16：224-34；Proske et al.(2005)Appl.Microbiol.Biotechnol.69：367-74；Blank and Blind(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9：336-42；Tombelli et al.(2005)Biosens.Bioelectron.20(12)：2424-34；和Di Gusto et al.(2006)Chembiochem.7(3)：535-44)。

[0076]与本发明相关的反义多核苷酸或核酶可以与本发明的或相关基因的整个编码链互补，或与仅其部分互补。或者，反义多核苷酸或核酶可以与本发明的或相关基因编码链的非编码区互补。所述反义多核苷酸或核酶可以用化学合成或酶连接反应，使用本领域众所周知的方法构建。化学合成的多核苷酸的核苷连键可经修饰以增强其抗核酸酶介导的降解的能力，并增加其序列特异性。这样的连接修饰包括但不限于磷硫酰、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、吗啉代和肽核酸(PNA)连键(Galderisi etal.，supra；Heasman(2002)Dev.Biol.243：209-14；Micklefield(2001)Curr.Med.Chem.8：1157-79)。或者，这些分子可使用本发明的或相关多核苷酸以反义方向(即反向)亚克隆到其中的表达载体进行生物学制备。

[0077]本发明的抑制性多核苷酸还包括结合具有高特异性和亲和力的双螺旋DNA大沟的三链形成寡核苷酸(TFOs)(Knauert andGlazer(2001)Hum.Mol.Genet.10：2243-51)。本发明的或相关基因的表达可以通过靶向与所述基因调控区(即启动子或增强子序列)互补的TFOs，形成防止所述基因转录的三螺旋结构而被抑制。

[0078]在本发明的一个实施方案中，本发明的所述抑制性多核苷酸是小分子干扰RNA(siRNA)分子。这些siRNA分子是使靶标mRNA序列特异性降解的短的(优选19-25个核苷酸；最优选19或21个核苷酸)，双链RNA分子。此降解已知为RNA干扰(RNAi)(如Bass(2001)Nature 411：428-29)。鉴定起源于低等生物体的RNAi已有效地用于哺乳动物细胞，最近已证实预防用靶向FasmRNA的siRNA分子处理的小鼠患爆发性肝炎(Song et al.(2003)Nature Med.9：347-51)。此外，最近报道鞘内传递的siRNA阻断大鼠两种模型(激动剂诱导的疼痛模型和神经性疼痛模型)中的疼痛应答(Dorn et al.(2004)Nucleic Acids Res.32(5)：e49).。

[0079]本发明的siRNA分子可通过使两种互补的单链RNA分子一起退火(其中一种与所述靶标mRNA的一部分配对)(Fire etal.，美国专利号6,506,559)，或通过使用自身折回以产生所需双链部分的的单个发夹RNA分子而得到(Yu et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-52)。所述siRNA分子可化学合成(Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-98)或通过使用单链DNA模板体外转录制备(Yu et al.，supra)。或者所述siRNA分子可使用含有所述正义或反义siRNA序列的表达载体，或者短暂地(Yu et al.，supra；Sui et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20)或稳定地Paddison et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-48；Cullen(2006)GeneTherapy 13：503-08)进行生物学制备。近来证实，使用表达进一步加工成siRNA的发夹RNA的腺病毒载体以有效和序列特异性的方式降低原代人细胞中的靶标mRNA的水平(Arts et al.(2003)GenomeRes.13：2325-32)。

[0080]靶向本发明的或相关多核苷酸的siRNA可基于本领域众所周知的标准设计(e.g.，Elbashir et al.(2001)EMBO J.20：6877-88；Aronin (2006)Gene Therapy 13：509-16)。例如，所述靶mRNA的靶部分应该以AA(最优选)、TA、GA或CA开始；所述siRNA分子的GC比优选应为45-55％；所述siRNA分子优选应不含有排成一列的三个相同核苷酸；所述siRNA分子优选不应含有排成一列的七个混合的G/C；所述靶部分优选应在靶mRNA的ORF区，并优选起始ATG后应该至少75bp，终止密码子前至少75bp。基于这些标准或其它已知标准(如Reynolds et al.(2004)Nature Biotechnol.22：326-30)，与本发明相关的靶向本发明的或相关mRNA多核苷酸的siRNA分子可由本领域技术人员设计。

[0081]生物体中本发明的或相关基因表达的改变还可通过创造本发明的或相关多核苷酸已导入其基因组的非人转基因动物实现。这样的转基因动物包括具有本发明基因(即转基因)多拷贝的动物。组织特异性的调控序列可操作地连接到转基因上，引导本发明的或相关多肽在特定细胞或特定发育阶段表达。通过胚胎处理和微注射产生转基因动物，尤其是如小鼠的动物的方法已经是常规的，并且为本领域所熟知(如Bockamp et al.(2002)Physiol.Genomics11：115-32)。

[0082]生物体中本发明的或相关基因表达的改变还可通过创造动物而实现，所述动物的与本发明的或相关多核苷酸相应的内源性基因已经通过插入体外多核苷酸序列而被破坏(即(基因)敲除动物)。所述内源性基因的编码区可被破坏，因而产生非功能蛋白。或者所述内源性基因的上游调控区可被破坏，或被不同调控元件取代，导致仍有功能蛋白(still-functional protein)表达改变。产生基因敲除动物的方法包括同源重组，为本领域所熟知(如Wolfer et al.(2002)Trends Neurosci.25：336-40)。

[0083]本发明的或相关分离的多核苷酸还可以可操作地连接到表达控制序列和/或连接到表达载体，以重组制备本发明的或相关多肽(包括其活性部分和/或融合多肽)。表达重组蛋白的一般方法在本领域是众所周知的。

[0084]本文所用的表达载体是核酸，该核酸能够转运其已与之连接的另一核酸。载体的一种类型是质粒，质粒指另外的DNA片段可连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其已被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有复制细菌起点的细菌载体或附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加体哺乳动物载体)可以通过导入宿主细胞，整合到宿主细胞基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外某些载体能引导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体本文被称为重组表达载体(或简单地说是表达载体)。一般来说在重组DNA技术中有用的表达载体通常都是质粒的形式。在本说明书中，质粒和载体可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是该发明旨在于包括其他形式的表达载体，如起相当作用的病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

[0085]在一个实施方案中，本发明的或相关多核苷酸用于创建重组豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂。豆荚蛋白拮抗剂的一个例子包括酶非活性的豆荚蛋白(多肽或多核苷酸)及其酶非活性片段。ZB-1拮抗剂的例子包括酶非活性的ZB-1(多肽或多核苷酸)及其酶非活性片段。酶非活性的豆荚蛋白和/或ZB-1包括含有全部或部分N-端和/或C-端前肽(例如序列N端到氨基酸位置21或25和/或序列C-端到氨基酸位置323)的分子。这样的拮抗剂可用于调节天冬酰胺酰基蛋白酶活性，因此可用于治疗动脉粥样硬化或其他血管和炎性疾病，其中可取的是减少天冬酰胺酰基键水解。在另一实施方案中，本发明的或相关的多核苷酸用于创建其他豆荚蛋白和ZB-1拮抗剂，如豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多核苷酸，豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多肽(包括其片段和融合蛋白)，拮抗性抗豆荚蛋白抗体及其片段，拮抗性抗ZB-1抗体及其片段，以及拮抗性小分子。

[0086]创建融合多肽即与第二多肽部分连接的第一多肽部分的方法，在本领域是众所周知的。例如豆荚蛋白和/或ZB-1多肽可融合到第二多肽部分，例如免疫球蛋白或其片段(如Fc片段)。在一些实施方案中，所述第一多肽部分包括例如全长人豆荚蛋白或ZB-1多肽。或者，第一多肽可包含小于全长的豆荚蛋白或ZB-1多肽(例如豆荚蛋白或ZB-1的底物结合域)。另外，可溶形式的豆荚蛋白或ZB-1可通过“接头”序列融合到免疫球蛋白的Fc部分。也可使用其它融合蛋白，例如带有谷胱甘肽-S转移酶(GST)、Lex-A、硫氧还蛋白(TRX)或麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白。

[0087]第二多肽部分优选可溶的。在一些实施方案中，第二多肽部分增加连接多肽的半衰期(如血清半衰期)。在一些实施方案中第二多肽部分包括促进融合多肽与豆荚蛋白或ZB-1多肽结合的序列。在一个实施方案中，第二多肽包括至少免疫球蛋白多肽的域。免疫球蛋白融合多肽在本领域是已知的，并在例如美国专利号5,516,964、5,225,538、5,428,130、5,514,582、5,714,147和5,455,165中有描述，因此其全部都在此引作参考。融合蛋白还可包括将第一多肽部分，如人豆荚蛋白或ZB-1，包括其片段，连接到第二部分的接头序列。这样的接头序列的使用在本领域是众所周知的。例如所述融合蛋白可包括肽接头，例如氨基酸长度约2至20个的肽接头，更优选氨基酸长度少于10个。在一个实施方案中，所述肽接头可以是2个氨基酸长度。在其它实施方案中，本发明的或相关融合蛋白包括超过两个多肽部分，例如三联融合蛋白可包含两个豆荚蛋白多肽(或其片段)，两个ZB-1多肽(或其片段)，或被有助于所述两个豆荚蛋白多肽(或其片段)结合的第三部分连接的其组合，两个ZB-1多肽(或其片段)，或其组合。

[0088]在另一实施方案中，所述重组蛋白包括其N端异源信号序列(即由豆荚蛋白或ZB-1多核苷酸编码的多肽中未出现的多肽序列)。例如来自另一蛋白的信号序列可与豆荚蛋白或ZB-1多肽，包括其片段和/或融合蛋白融合。在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，重组蛋白的表达和/或分泌可通过使用异源信号序列而增加。可包括在融合蛋白中的信号肽是带有序列MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO：13)的蜂毒肽信号肽。

[0089]本发明的融合蛋白可以通过标准重组DNA技术制备。例如，编码不同多肽序列的DNA片段依据常规技术，通过采用例如平末端或粘性末端进行连接，限制性内切酶消化提供合适的末端，视情况而定补平粘性末端，避免不需要的连接的碱性磷酸酶处理以及酶连接，而符合读框地连接在一起。在另一实施方案中，所述融合基因可通过常规技术包括DNA自动合成仪合成。或者基因片段的PCR扩增可使用锚定引物进行，该锚定引物产生两个能随后退火并再扩增产生嵌合基因序列的连续基因片段间的互补突出段(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.(eds.)，John Wiley & Sons，1992)。此外，许多编码融合部分的表达载体(例如免疫球蛋白重链的Fc区)可从商业获得。豆荚蛋白编码或ZB-1编码核酸可克隆到这样的表达载体中，从而所述融合部分符合读框地与所述免疫球蛋白蛋白连接。

[0090]本发明的所述重组表达载体可携带另外的序列，如调控宿主细胞中载体复制的序列(如复制起点)和选择性标记基因。所述选择性标记基因有助于筛选所述载体已导入其中的宿主细胞。例如典型地所述选择性标记基因赋予所述载体已导入其中的宿主细胞对例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗药性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨喋呤筛选/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(G418筛选)。

[0091]可以选择或构建合适的载体，含有合适的调控序列，视情况而定包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它序列，如调控宿主细胞中载体复制的序列(如复制起点)。视情况而定载体可以是质粒或病毒，例如噬菌体、噬菌粒。进一步的详情参见例如Molecular Cloning：aLaboratory Manual：2nd ed.，Sambrook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989。许多已知的核酸操作技术和方案，例如核酸构建物的制备，突变，测序，DNA导入细胞和基因表达，以及蛋白分析在Current Protocols in Molecular Biology，2nd ed.，Ausubelet al.(eds.)John Wiley & Sons，1992中详细描述。

[0092]本发明的另一方面提供了包含如本文公开的核酸的宿主细胞。另一方面提供了包含将这样的核酸导入宿主细胞的方法。导入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染、以及使用逆转录病毒或其它病毒如牛痘，或对于昆虫细胞使用杆状病毒转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用细菌噬菌体转染。导入后可以引起或允许核酸的表达，例如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。

[0093]对于本发明的或相关多肽的重组表达，一些细胞系可作为合适的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括例如COS细胞、CHO细胞、3T3-L1、293细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞以及来自原代组织和原代外植块体外培养物的细胞株。

[0094]或者，在低等真核生物如酵母或原核细胞中，重组地制备本发明的或相关多肽是可能的。可能适合的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)菌株和假丝酵母(Candida)菌株。可能适合的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。如果本发明的或相关多肽在酵母或细菌中制备，则为了获得功能，通过例如合适位点的磷酸化或糖基化对它们进行修饰可能是必要的。这样的共价结合可使用众所周知的化学或酶方法完成。

[0095]细菌中的表达可能会导致形成包涵体掺入所述重组蛋白。因此为了制备活性或活性更高的细菌，重组蛋白的重折叠是需要的。从细菌包涵体获得正确折叠的异源蛋白的几种方法是本领域已知的。这些方法一般涉及溶解来自包涵体的蛋白，然后使用离液剂使蛋白完全变性。当半胱氨酸残基出现在所述蛋白的一级氨基酸序列中时，通常需要在允许二硫键正确形成的环境(氧化还原体系)中完成重折叠。重折叠的一般方法在例如Kohno(1990)Meth.Enzymol.185：187-95中公开。其它合适的方法在例如EP 0433225和U.S.专利号5,399,677中公开。

[0096]本发明的或相关多肽还可以通过将本发明分离的多核苷酸可操作地连接到一个或多个昆虫表达载体如杆状病毒中合适的控制序列，并采用昆虫细胞表达体系重组制备。杆状病毒/Sf9表达体系的材料和方法可以试剂盒的形式从商业获得(如BAC-TO-

and

kits，Invitrogen，Carlsbad，CA)。

[0097]在合适的宿主细胞中重组表达后，本发明的重组多肽可随后使用已知纯化方法如免疫沉淀法、凝胶过滤和离子交换层析，从细胞提取物纯化。例如，膜结合形式的豆荚蛋白和/或ZB-1多肽可通过从表达细胞制备总的膜组分，并用非离子型洗涤剂如TritonX-100提取膜而纯化。本发明的或相关多肽可用商业上可获得的蛋白浓缩过滤仪，例如

or Millipore

超滤装置(Millipore，Billerica，MA)浓缩。浓缩步骤后，浓缩物可加到纯化基质如凝胶过滤介质。或者可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙氨基乙基臂(DEAE)或聚亚乙基亚胺基团的基质。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其他蛋白纯化中普遍采用的类型。或者可采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基的各种不溶性基质。优选磺丙基(例如Scolumns，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。从培养物上清纯化重组蛋白还可包括一个或多个使用如伴刀豆蛋白A-琼脂糖、肝素-

(Toyo Soda Manufacturing Co.，Ltd.，Japan)或Cibacrom blue 3GA

(Tosoh Biosciences，SanFrancisco，CA)的亲和树脂的柱步骤；或通过如苯基醚、丁基醚或丙基醚这样树脂的疏水相互作用色谱；或免疫亲和层析。最后，可采用使用疏水RP HPLC基质，如有甲基臂或其它脂族基的硅胶的一个或多个反向高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，进一步纯化重组蛋白。包括所述重组蛋白的抗体(例如使用本文方法描述的)的亲和柱还可用于根据已知方法的纯化。还可采用一些或全部上述纯化步骤的各种组合，或与其它已知方法一起，提供基本纯化的分离重组蛋白。优选地，所述分离的重组蛋白是被纯化的，因此其基本上没有其它哺乳类动物蛋白。此外这些纯化过程也可用于从其它来源，包括天然来源纯化本发明的多肽。例如本发明的或相关多肽，例如小鼠和人豆荚蛋白和ZB-1(例如全长豆荚蛋白或ZB-1或片段，及其融合)，其作为转基因动物的产物被表达，例如作为如转基因奶牛、山羊、猪或绵羊的转基因动物的奶的组分，可如上所述纯化。

[0098]或者所述多肽也可以以有助于纯化的形式重组表达。例如，所述多肽可与例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的蛋白融合表达。表达和纯化这样的融合蛋白的试剂盒从商业获得，分别来自New England BioLabs(Beverly，MA)、Pharmacia(Piscataway，NJ)和Invitrogen。重组蛋白也可用小的表位标记，之后用表位的特异性抗体鉴别或纯化。优选的表位是从Eastman Kodak(New Haven，CT)商业获得的FLAG表位。

[0099]本发明的或有关多肽，包括豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，也可通过已知的常规化学合成制备。化学合成这样的多肽的方法对本领域技术人员而言是众所周知的。这样的化学合成多肽可具有与天然、纯化的多肽相同的生物性质，因此可用作所述天然多肽的生物活性或免疫学替代物。

[0100]本发明的或相关多肽，包括豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，还包括与公开的多肽结构不同(如其具有稍有改变的序列)，但与所述公开的多肽具有基本相同生物化学活性(例如仅功能上非必需氨基酸残基改变)的分子。这样的分子包括天然产生的等位基因变体，以及含有改变、取代、替换、插入或缺失的人工特意改造的变体。这样的改变、取代、替换、插入或缺失的技术对本领域技术人员而言是熟知的。在一些实施方案中，所述多肽部分作为有天然产生序列(野生型)中突变，产生更耐蛋白水解序列(相对于未突变序列)的变体多肽提供。

[0101]豆荚蛋白和ZB-1的一些氨基酸序列可以被改变，而不显著修饰豆荚蛋白或ZB-1结构或功能。为了保持特定结构或功能，取代形成豆荚蛋白或ZB-1蛋白三级结构的残基是可能的，只要取代的残基执行类似功能。在其他例子中，如果改变发生在非关键区域，则残基的类型可完全无关。因此本发明进一步包括豆荚蛋白或ZB-1变体。这样的变体包括缺失、插入、倒位、重复和同类型替换(例如用一个亲水残基取代另一个，但不是强亲水残基取代强疏水残基)。小的改变或“中性”氨基酸替换通常对蛋白功能的影响不大(Taylor(1986)J.Theor.Biol.119：205-18)。保守替换可以包括但不限于脂肪族氨基酸中的取代、酸性残基的交换、酰胺残基间的替换，碱性残基的交换，以及芳香族残基中的取代。有关什么氨基酸变化可能是表型沉默(phenotypically silent)或噪音(noisy)的进一步指导可在Bowie et al.((1990)Science 247：1306-10)andZvelebil et al.((1987)J.Mol.Biol.195：957-61)中找到。因此，豆荚蛋白和/或ZB-1多核苷酸和多肽可以是自然产生的，或可以通过改变各种残基而不改变底物特异性和酶活性制备。或者本领域技术人员能使用所公开的多核苷酸和多肽序列，制备底物特异性和酶活性改变的豆荚蛋白和/或ZB-1多核苷酸和多肽。

[0102]哺乳动物豆荚蛋白是高度保守的，并含有pfam01650.12“Peptidase_C13”保守域，可用作设计和构建表现不同底物特异性、底物亲和力和酶活性的重组豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽的指导。例如Chen et al.((2000)报道非活性豆荚蛋白可通过突变活性位点半胱氨酸，即残基Cys(189)制备。此外，哺乳动物豆荚蛋白经历C-和N-端的前肽加工，诱导激活(id.；Li et al.，supra)。已经证实非活性豆荚蛋白可以通过简单地以各种残基如天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸或谷氨酸替换C端裂解位点，即Asn(323)制备(Chen et al.(2000)supra)。此外豆荚蛋白活性可通过突变N端裂解位点，即Asp(21)或Asp(25)，例如通过丙氨酸取代(Li et al.，supra)而降低。因此，本文所用的“豆荚蛋白”和“ZB-1”另外还指这些和其他衍生的和变体多肽及多核苷酸序列。这样的衍生物和变体被视为在所述范围和本领域技术人员的知识范围内。

[0103]正如本文进一步描述的，豆荚蛋白和/或ZB-1多肽、其片段和/或融合多肽，其重组体和/或天然形式，其变体和/或天然产生的形式，可用于筛选能结合豆荚蛋白和/或ZB-1和/或调节豆荚蛋白和/或ZB-1活性的物质(例如其他豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，如抗豆荚蛋白抗体)。利用理想的固定或非固定的结合蛋白进行的结合分析在本领域是众所周知的，可与本发明的或相关多肽用做此目的，包括本发明的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，例如豆荚蛋白多核苷酸和多肽。基于纯化的细胞或基于蛋白(无细胞)的筛选分析可用于鉴别这样的物质。例如，豆荚蛋白和/或ZB-1多肽可以纯化的形式固定在载体上，可测量可能的底物/配体/拮抗剂与纯化的豆荚蛋白和/或ZB-1的结合。

抗体

[0104]在其它实施方案中，本发明提供作为抗体的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂及其抗体片段，即完整的抗体及其抗原结合片段，其特异性结合豆荚蛋白和/或ZB-1及其片段，优选哺乳动物(例如人或小鼠)豆荚蛋白和/或ZB-1。在一个实施方案中，所述抗体为抑制性抗体，即其抑制或减少至少一种豆荚蛋白和/或ZB-1活性(例如天冬酰胺酰基键的水解)，并可用于诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或防止豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病，如血管和/或炎性疾病。此外，本发明提供了与豆荚蛋白和/或ZB-1特异性结合(分别或同时，视整体情况而定)，但不抑制豆荚蛋白和/或ZB-1活性(即检测抗体)的抗豆荚蛋白抗体和抗ZB-1抗体；这样的抗体可用于检测例如豆荚蛋白或ZB-1蛋白的存在，例如作为诊断、预测和/或监测豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病，例如血管和/或炎性疾病的试剂盒的一部分。在一个实施方案中，所述抗体针对豆荚蛋白，优选哺乳动物豆荚蛋白，更优选人豆荚蛋白。在另一实施方案中，所述抗体针对ZB-1，优选哺乳动物ZB-1，更优选人ZB-1。在另一实施方案中，所述抗体是单克隆或单特异性抗体。所述抗体还可以是人的、人源化的、嵌合的，或针对例如人或小鼠豆荚蛋白和/或人或小鼠ZB-1的体外生成的抗体。

[0105]本领域技术人员将意识到，本文所用的术语“抗体”是指包含至少一个，优选两个重(H)链可变区(本文缩写为VH)，和至少一个并优选两个轻(L)链可变区(本文缩写为VL)的蛋白。所述抗体可进一步包括重链和轻链恒定区，从而分别形成重和轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，所述抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述重和轻免疫球蛋白链是相互连接的，例如通过二硫键。

[0106]本文所用的例如抗体(或仅“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合片段”指例如全长抗体的一个或多个片段，其保留了特异性结合抗原的能力。包括在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的例子包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1区组成的一价片段；(ii)F(ab’)₂片段，包含通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由所述VH和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH区组成的Fv片段；(v)由VH区组成的dAb片段；和(vi)单独的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域VL和VH是由单独的编码基因的，但它们可使用重组方法，通过使其制备成单个蛋白链的合成接头连接，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为单链Fv(scFv))。这样的单链抗体也打算包括在术语“抗原结合片段”范围内。这些抗体片段或抗原结合片段使用本领域技术人员已知的常规方法获得，以与完整抗体同样的方式对所述片段的效用进行筛选。

[0107]在一些实施方案中，本发明提供了单域抗体。单域抗体可以包括其CDRs是单域多肽的一部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体，轻链天然缺失的抗体，来自常规四链抗体的单域抗体，基因工程抗体以及除了来自抗体的单域支架。单域抗体可以是任意本领域已知的，或任意将来知道的单域抗体。单域抗体可来自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲鸵、山羊、兔、牛。根据本发明的一个方面，本文所用的单域抗体是已知为轻链缺失的重链抗体的自然产生的单域抗体。这样的单域抗体在例如WO 94/04678中公开。源于天然轻链缺失的重链抗体的此可变域此处被称为VHH或纳米体，以区别于常规的四链免疫球蛋白的VH。这样的VHH分子可来自驼科种中产生的抗体，例如骆驼、美洲鸵、单峰驼、羊驼和原驼。除了驼科的其他种可以产生天然轻链缺失的抗体；这样的VHH分子在本发明范围内。

[0108]本发明的或相关多肽的抗体分子，例如豆荚蛋白和/或ZB-1抗体，可通过本领域技术人员众所周知的方法制备。本发明的豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白还可用于免疫动物，获得与豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白反应，并抑制底物和豆荚蛋白和/或ZB-1相互作用的的多克隆和单克隆抗体。本发明的全长多肽可作为免疫原，或者可使用多肽的抗原肽片段。本发明多肽的抗原肽包括至少7个连续氨基酸残基，并涵盖了表位，因此产生的针对所述肽的多肽形成了特定的与多肽的免疫复合物。优选地，所述抗原肽包含至少10个氨基酸残基，更优选15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。

[0109]在制备抗体方法的进一步改进中，鉴别免疫原临床相关表位的方法，以及筛选高亲和力免疫特异性结合相关表位的抗体的相关方法，在例如美国公开专利申请号2002/0029391中公开，因此此专利申请在此全部引作参考。一般用于靶向脂类天冬酰胺酰基肽酶和其他半胱氨酸肽酶的典型表位在Coleman and Lee(2004)supra中讨论。

[0110]单克隆抗体可通过其它重组DNA技术领域技术人员已知的方法生成。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的另选，本发明多肽的单克隆抗体可通过用本发明的或相关多肽(例如小鼠和人豆荚蛋白和/或ZB-1及其片段)筛选重组的组合免疫球蛋白库(例如抗体噬菌体展示文库)鉴别和分离，从而分离与本发明的或相关多肽结合的免疫球蛋白库成员。“组合的抗体展示”方法是众所周知的，并被发展为鉴别并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，可用于制备单克隆抗体。

[0111]多克隆血清和抗体可通过用本发明的或相关多肽免疫合适的受试者制备。免疫的受试者中抗体效价可随时间进行监测，针对本发明的多肽的抗体分子可从受试者或培养基分离，并通过众所周知的技术进一步纯化。

[0112]本发明多肽的抗体片段可根据本领域众所周知的方法通过裂解抗体制备。例如免疫活性Fab和F(ab’)₂片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体产生。

[0113]此外，本发明的多肽的嵌合的、人源化的以及单链抗体，包含人和非人部分，可使用标准重组DNA技术和/或重组组合免疫球蛋白文库制备。例如针对如人豆荚蛋白和/或ZB-1的人单克隆抗体(mAbs)可使用携带所述人免疫球蛋白基因，而非鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠生成。

[0114]已通过例如缺失、加成或取代所述抗体的其它部分如恒定区而修饰的单克隆、嵌合、人和人源化抗体也在本发明的范围内。作为非限制性的例子，抗体可通过缺失所述恒定区，通过用另一恒定区，例如意味着增加所述抗体半衰期、稳定性或亲和力的恒定区，或来自另一种或抗体类的恒定区替代所述恒定区，或通过修饰所述恒定区的一个或多个氨基酸，改变例如糖基化位点的数量、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等等，得以修饰。

[0115]功能改变的抗体，例如对效应物配体如细胞上的FcR，或补体的C1组分的亲和力改变，可通过用不同残基取代所述抗体恒定部分中至少一个氨基酸残基制备(参见例如EP388,151、U.S.专利号5,624,821和5,648,260，所有上述内容因此在此全部引作参考)。

[0116]除了用于本发明的抗体，其他分子也可用来调节豆荚蛋白和/或ZB-1的活性。这样的分子包括小分子免疫药物(SMIP^TM)药物(Trubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)。SMIP是由例如抗原、反受体或诸如此类的相应结构的结合域、具有一个或没有半胱氨酸残基的铰链区多肽，以及免疫球蛋白CH2和CH3区组成的单链多肽(还见于www.trubion.com)。SMIP及其用途和应用在例如U.S.公开专利申请号2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646，及其相关同族专利成员中公开，因此其所有在此全部引作参考。

[0117]本发明的抗豆荚蛋白抗体和/或抗ZB-1抗体可用于分离、纯化和/或检测上清、细胞裂解液，或细胞表面，或细胞外基质中的豆荚蛋白和/或ZB-1多肽，以及豆荚蛋白和/或ZB-1多肽片段(或其融合体)。此发明中公开的抗体也可作为临床检测方法的一部分，诊断上用于监测如豆荚蛋白和/或ZB多肽水平，或临床上用于将治疗用调节剂靶向包含所述抗体的抗原的细胞或组织。例如为了将治疗物靶向表达豆荚蛋白和/或ZB-1的细胞或组织，治疗物如本发明的小分子或其它治疗物可连接到抗豆荚蛋白和/或抗ZB-1抗体。结合豆荚蛋白和/或ZB-1多肽的拮抗抗体(包括但不限于单克隆抗体)还可用于治疗与豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的疾病，或豆荚蛋白-和/或ZB-1相关疾病。因此，本发明进一步提供包含特异性结合豆荚蛋白和/或ZB-1，并降低、限制、阻断或以其它方式减少豆荚蛋白和/或ZB-1活性的抑制性(拮抗)抗体的组合物。类似地，抗豆荚蛋白和/或抗ZB-1抗体可用于分离、纯化、检测和诊断上监测豆荚蛋白和/或ZB-1，和/或临床上将治疗调节物靶向包含豆荚蛋白和/或ZB-1的细胞或组织。

筛选分析

[0118]所述豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽可用于筛选分析，以鉴别能调节细胞或生物体中豆荚蛋白和/或ZB-1活性的药物或药物的先导化合物，并因此是与例如天冬酰胺酰基肽酶活性失调相关的血管或炎性疾病的可能调节剂。例如，含有豆荚蛋白和/或ZB-1的样本可与许多测试化合物(或者生物制剂或者有机小分子)中的一种接触，每个经处理的样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性可与未处理的样本，或与不同测试化合物接触的样本中的豆荚蛋白和/或ZB-1活性比较。这样的比较将决定任何所述测试化合物是否会导致：(1)豆荚蛋白和/或ZB-1表达和/或活性(和/或分泌，如果所述样本由完整细胞组成)水平大幅降低，则表明是豆荚蛋白和/或ZB-1的拮抗剂；或(2)豆荚蛋白和/或ZB-1表达和/或活性(和/或分泌，如果所述样本由完整细胞组成)水平大幅增加，则表明是豆荚蛋白和/或ZB-1的激动剂。在一个实施方案中，能够调节豆荚蛋白和/或ZB-1活性的测试化合物的鉴别是使用高通量筛选试验，如

(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)、BRET(生物发光共振能量转移)和FRET(荧光共振能量转移)分析，以及ELISA和基于细胞的分析进行的。

[0119]由于豆荚蛋白水解天冬酰胺酰基键(预计ZB-1类似地水解这样的键)，因此筛选豆荚蛋白和/或ZB-1活性的拮抗剂可采用既定的方法分析半胱氨酸蛋白酶活性，或遵循实施例中描述的方案。因此，可以将含有豆荚蛋白和/或ZB-1的细胞或样本与待测化合物接触，并通过例如Western或Northern分析、PCR、免疫组织化学、原位杂交、差异显示等确定所述待测化合物是否调节豆荚蛋白和/或ZB-1表达。或者，可将含有豆荚蛋白和/或ZB-1的细胞或样本与待测化合物接触，并确定所述待测化合物是否调节豆荚蛋白和/或ZB-1活性(和/或分泌，如果样本由完整细胞组成)。豆荚蛋白和/或ZB-1活性可通过各种方法，包括Chen et al.((2006)supra)，Li et al.(supra)和Kato et al.(supra)中公开的测量。正如实施例中所示，使用例如所述肽底物Z-AAN-MCA(PeptideInstitute)，可确定某一待测化合物存在下，豆荚蛋白或ZB-1是否已增加或减少蛋白酶活性。各种直接和间接的豆荚蛋白调节物在本领域是众所周知的，可用于比较测量(参见例如Vigreswaran et al.，supra and Yamane et al.，supra)。此外，豆荚蛋白基于活性的探针在Kato et al.，supra中公开。

小分子

[0120]受与豆荚蛋白和/或ZB-1表达和/或活性增强有关的疾病(或患病风险)，或与例如增加的天冬酰胺酰基蛋白酶活性增加相关的疾病(或患病风险)，如动脉粥样硬化、关节炎等折磨的生物体(或受试者)中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌降低，或来自这样生物体参与这样疾病的细胞中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌降低，也可通过使用拮抗即降低或抑制豆荚蛋白和/或ZB-1活性的小分子(通常是有机小分子)实现。新型拮抗小分子可通过本文所述的筛选方法确定，并可用于本文所述的本发明的方法。豆荚蛋白的其它小分子调节物在本领域是众所周知的，可用于比较测量或本文所公开的方法中(参见例如Vigreswaran et al.，supra；Niestro，et al.，supra和supra)。

[0121]术语小分子指非大分子的化合物(参见例如Karp(2000)Bioinformatics Ontology 16：269-85；Verkman(2004)AJP-Cell Physiol.286：465-74)。因此，小分子往往被认为是例如小于1,000道尔顿的那些化合物(例如Voet and Voet，Biochemistry，2^nd ed.，ed.N.Rose，Wiley and Sons，New York，14(1995))。例如Davis et al.((2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5981-86)使用短语小分子表示叶酸、甲氨蝶呤和神经肽，而Halpin and Harbury((2004)PLos Biology 2：1022-30)使用所述短语表示小分子基因产物，例如DNAs、RNAs和多肽。天然小分子的例子包括但不限于胆固醇、神经递质、适体和siRNAs(见Dykxhoorn et al.(2006)Gene Therapy 13：541-52)；合成的小分子包括但不限于许多商业上可获得小分子数据库中列出的各种化合制品，例如FCD(Fine Chemicals Database)、SMID(SmallMolecule Interaction Database)、ChEBI(Chemical Entities ofBiological Interest)以及CSD(Cambridge Structural Database)(参见例如Alfarano et al.(2005)Nuc.Acids Res.Database Issue 33：D416-24)。

诊断、预测和监测与豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关疾病的过程的方法

[0122]本发明提供通过监测例如豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的上调，诊断、预测以及监测受试者中与豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关疾病的过程的方法(例如如血管和炎性疾病的疾病，其直接或间接涉及豆荚蛋白和/或ZB-1活性的增加)，包括但不限于在人受试者中使用此种方法。这些方法可通过利用预先装好的诊断试剂盒进行，该试剂盒包含豆荚蛋白和/或ZB-1多核苷酸或其片段，豆荚蛋白和/或ZB-1多肽或其片段(包括其融合蛋白)，豆荚蛋白和/或ZB-1多肽的抗体或抗体片段，或豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的小分子调节物的至少一种，正如本文所述的，可以方便地用于临床环境。熟练技术人员将认识到，其他间接的方法可用来确认例如如人豆荚蛋白和/或ZB-1的上调，包括但不限于测量动脉粥样硬化斑块的质量或大小的变化。

[0123]“诊断的”或“诊断”指确定病理疾病存在或是不存在。诊断方法包括检测测试量的：1)豆荚蛋白和/或ZB-1的表达水平；2)豆荚蛋白和/或ZB-1的活性水平；和/或3)豆荚蛋白和/或ZB-1的分泌水平，通过测定受试者(如人或非人哺乳动物)生物样本中测试量的豆荚蛋白和/或ZB-1的表达水平(如mRNA、cDNA和/或多肽，包括其片段的水平)，豆荚蛋白和/或ZB-1的活性水平(如天冬酰胺酰基蛋白酶/肽酶活性)，和/或豆荚蛋白和/或ZB-1的分泌水平(如细胞外发现的豆荚蛋白和/或ZB-1水平)，并将豆荚蛋白和/或ZB-1的测试水平/活性/分泌与豆荚蛋白和/或ZB-1的正常水平/活性/分泌或其变动范围(例如参考量，如已知没有患与豆荚蛋白和/或ZB-1活性等相关的疾病的个体的量或变化范围)进行比较。虽然某一诊断方法可能无法提供与豆荚蛋白和/或ZB-1活性等相关的疾病的确切诊断，但是如果该方法提供了有助于诊断的积极指示那就足够了。

[0124]本发明还提供通过检测豆荚蛋白和/或ZB-1的表达、分泌和/或活性的变化，预后这样的疾病的方法。预后方法包括检测受试者的生物样本中测试量的：1)豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物的水平；2)豆荚蛋白和/或ZB-1的活性水平；和/或3)豆荚蛋白和/或ZB-1的分泌水平，并将豆荚蛋白和/或ZB-1的测试水平/活性/分泌与豆荚蛋白和/或ZB-1的预测水平/活性/分泌或其变动范围(例如有不同严重程度的与豆荚蛋白和/或ZB-1活性等相关的疾病，和/或与天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶调节异常相关的疾病的个体的量或变化范围)进行比较。在一个实施方案中，豆荚蛋白和/或ZB-1或其变化范围的所述预后水平/活性/分泌可以是比豆荚蛋白和/或ZB-1的测试水平/活性/分泌更早时间点的个体的测量值。测试样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达的各种量，与对豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的疾病和/或与天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶调节异常有关的疾病的某些预后一致。某一预后水平的豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达的量的检测提供了对受试者的预后。

[0125]本发明还提供了通过监测例如豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达的上调和下调，监测与豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关疾病(和/或与天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶调节异常有关的疾病，例如血管疾病和炎性疾病)的进程或过程，或治疗所述疾病的进展或过程的方法。监测方法包括第一次和第二次测定受试者的生物样本中测试量的：1)豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物的水平；2)豆荚蛋白和/或ZB-1的活性水平；和/或3)豆荚蛋白和/或ZB-1的分泌水平，并比较所述量。第一和第二次豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达的量的变化显示了豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病过程中的变化。这种监测分析还用于评价正在治疗豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病，和/或导致天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶调节失常的疾病的患者中特定干预治疗的功效。

[0126]以上概述的方法中增加的豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达可以在各种生物样本中检测，包括体液(如全血、血浆和尿液)，细胞(例如整个细胞、细胞组分和细胞提取物)，以及其它组织。生物样本还包括组织的切片，如为组织学目的所做的活组织切片和冰冻切片。优选的生物样本包括动脉、肾脏、血管、内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞。应理解生物样品分析不一定需要从受试者去除细胞或组织。举例来说，结合豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物的适当标记的物质(如抗体、核酸)可施用于受试者，并使用标准的成像技术(如CAT、NMR(MRI)和PET)可视化(当结合所述靶标时)。

[0127]在本发明的诊断及预测分析中，豆荚蛋白和/或ZB-1的活性、分泌和/或表达的水平被检测和量化，以得到测试量。所述测试量随后与正常量或变化范围比较。检测和定量豆荚蛋白和ZB-1活性、分泌和/或表达水平的详细方法如下所述。

[0128]对于任何特定样本类型和群体，可测定豆荚蛋白或ZB-1活性、分泌(即基因产物的定位，例如分泌的或细胞外对细胞内)，和/或表达的正常量或基线水平。一般来说，豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白或mRNA的基线(正常)水平或基线位置通过测量正常(即健康)受试者生物样本中豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白或mRNA的各自量和位置确定。或者，豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物的正常值或位置可通过测量来自与患病(或可能患病)测试细胞或组织相同的受试者的健康细胞或组织中的水平或位置而确定。豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物(或正常量或测试量)或这样的基因产物的位置(即细胞外或细胞内)可以以每个细胞、每个总蛋白或每个单位容积基数确定或表示。为了建立样本中豆荚蛋白或ZB-1的标准/对照细胞水平或位置，可测量组成型表达基因产物，或在所述生物样本来源类型的细胞中已知水平或位置表达的其它基因产物的水平或位置。

[0129]应该理解，本发明的测定方法不一定需要测量豆荚蛋白和/或ZB-1活性、分泌和/或表达的绝对值，因为对这些方法的许多应用而言，相对值是足够的。还应理解，除了豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物的量或丰度，变体或异常豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物(例如突变的转录物、截断多肽)或其表达模式可通过与正常基因产物和表达模式比较而确定。

[0130]两个样本中某一基因产物的表达或位置是否显著相似或显著不同，如显著高于或显著低于特定水平，取决于基因本身，其中尤其是其不同个体或不同样本之间表达或定位的变异性。确定表达水平或定位是否显著类似或不同，这在本领域技术人员的技能范围内。当确定两个样本之间例如人豆荚蛋白和/或ZB-1的表达、活性和/或分泌的水平是否显著类似或显著不同，例如显著高于或低于特定水平时，可考虑(如果需要)个体、种、器官、组织或细胞之间，例如在豆荚蛋白和/或ZB-1表达水平或定位中如遗传变异的因素。作为个体、种、器官、组织或细胞之间基因表达天然异质性的结果，短语例如“显著类似”、“显著大于”、“显著低于”、“显著高于”等等不能作为精确的百分比或值定义，而可以通过本领域技术人员实践本发明确定。

[0131]本发明的诊断、预测和监测分析包括例如检测和量化生物样本中豆荚蛋白和/或ZB-1基因产物。豆荚蛋白和ZB-1基因产物包括但不限于mRNAs和多肽；两者都可使用本领域技术人员熟知的方法测量。例如mRNA可使用基于杂交的分析如Northern杂交、原位杂交、点和狭缝印迹以及寡核苷酸分析直接检测和定量。基于杂交的分析指其中探针核酸与靶核酸杂交的分析。在一些形式中，所述靶标、探针或靶标和探针二者都是固定化的。所述固定化核酸可以是DNA、RNA，或另一种寡核苷酸或多核苷酸，并可以包含天然或非天然产生的核苷酸、核苷酸类似物或主链。选择用于本发明的核酸探针序列的方法是基于豆荚蛋白和ZB-1核酸序列，所述方法是众所周知的。

[0132]或者mRNA在检测和定量前可扩增。这种基于扩增的分析在本领域是众所周知的，包括聚合酶链反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、定量或实时PCR(Q-PCR)、PCR-酶联免疫吸附分析(PCR-ELISA)以及连接酶链反应(LCR)。基于本文提供的并在本领域已知的豆荚蛋白和ZB-1的核酸序列，本领域技术人员容易设计，并无需过多实验即可制备用于制备和检测扩增的豆荚蛋白和/或ZB-1基因产品(例如mRNA或cDNA)的引物和探针。作为非限制性的例子，扩增的豆荚蛋白或ZB-1基因产物可直接分析，例如通过凝胶电泳；通过与探针核酸杂交；通过测序；通过检测荧光、磷光或放射性信号；或通过任何各种众所周知的方法。此外，增加通过扩增靶标核酸序列制备的信号的方法对本领域技术人员是众所周知的。本领域技术人员将认识到，无论使用哪种扩增方法，如果需要定量基因产物，则可用本领域已知的各种定量方法(如定量PCR)。

[0133]可使用各种众所周知的免疫学分析，采用如本文所述生成的抗豆荚蛋白抗体和/或抗ZB-1抗体，检测豆荚蛋白和/或ZB-1多肽(或其片段)。抗豆荚蛋白抗体也已在文献中描述(Choi et al.(1999)supra)。免疫分析法指利用特异性结合例如人豆荚蛋白和/或ZB-1多肽(或其片段)的抗体(例如多克隆、单克隆、嵌合、人源化抗体、scFv和/或其片段)的分析。适合实行本发明的这样众所周知的免疫分析法包括ELISA、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀法、免疫荧光法、荧光激活细胞分选(FACS)和Western印迹法。也可使用蛋白酶的标记底物如实施例中所示的Z-AAN-MCA，或Kato et al.，supra中公开的基于活性的探针，检测豆荚蛋白和/或ZB-1多肽。本领域技术人员应理解，上述方法可用于与豆荚蛋白和/或ZB-1活性有关的疾病，例如血管和炎性疾病。

治疗中与豆荚蛋白和/或ZB-1活性有关的分子的用途

[0134]本发明人已证明了以下：(1)相对于健康动脉样本，豆荚蛋白在人动脉粥样硬化患者样本中高表达；(2)动脉粥样硬化病发展过程中，ApoE KO小鼠主动脉窦和主动脉弓中豆荚蛋白表达增加；(3)ApoE-/-小鼠主动脉弓和主动脉窦动脉粥样硬化病变中豆荚蛋白是强阳性的；(4)ApoE-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变中豆荚蛋白的表达发生在炎性细胞浸润的区域；(5)动脉粥样硬化斑块中ApoE-/-小鼠冠状动脉中豆荚蛋白表达增加；(6)动脉粥样硬化病变加速的ApoE-/-小鼠模型中颈动脉新内膜病变区域内发现豆荚蛋白表达；(7)豆荚蛋白在ApoE-/-小鼠主动脉窦的动脉内皮细胞中表达；(8)豆荚蛋白在肾脏，例如肾动脉的内皮细胞和近端小管细胞中表达；(9)分化的THP-1巨噬细胞和M-CSF激活的原代人巨噬细胞中豆荚蛋白蛋白水平、mRNA水平和活性增加；(10)豆荚蛋白在M-CSF-激活的原代人巨噬细胞的条件培养基中发现；(11)豆荚蛋白蛋白通过在CHO或HEK293细胞中重组超表达出现在细胞表面，HEK293细胞表达的细胞表面豆荚蛋白是酶活性的；(12)豆荚蛋白在动脉粥样硬化患者的冠状动脉中表达；(13)豆荚蛋白刺激诱导人单核细胞迁移；(14)豆荚蛋白刺激诱导HEK293和HUVEC培养物伤口愈合模型中内皮细胞迁移和增殖，以及HUVEC培养物中内皮细胞侵袭；(15)关节炎的胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型的患病爪中豆荚蛋白表达增加；以及(16)豆荚蛋白新剪接变体ZB-1分泌到重组ZB-1超表达的HEK293细胞的培养基中。

[0135]上述结果表明，可采用使用与豆荚蛋白和/或ZB-1活性相关的分子，例如豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的所述公开的方法，治疗豆荚蛋白-和/或ZB-1-相关疾病，例如血管和炎性疾病，如动脉粥样硬化和关节炎。这些方法将尤其用于治疗人的这样的疾病。

[0136]本文公开的豆荚蛋白和ZB-1相关分子，包括可用本发明公开的方法鉴别的小鼠和/或人豆荚蛋白和/或ZB-1多核苷酸和/或多肽活性、表达和/或分泌的调节物，可体外、先体外后体内使用，或掺入药物组合物并施用于个体(如人受试者)，以治疗、减轻或预防与豆荚蛋白和/或ZB-1活性有关的疾病，以及与天冬酰胺酰肽酶/蛋白酶活性有关的疾病(如血管疾病和炎性疾病)，通过施用豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂(例如，豆荚蛋白抑制性多核苷酸(即直接或间接降低豆荚蛋白水平、活性和/或分泌的多核苷酸)，如反义分子、siRNA分子和适体；豆荚蛋白抑制性多肽(即或直接或间接降低豆荚蛋白和/或ZB-1水平、活性和/或分泌的多肽，例如豆荚蛋白片段，如含有非活性酶区的片段及其融合蛋白)；拮抗剂抗豆荚蛋白和/或抗ZB-1抗体或抗体片段(即或直接或间接降低豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的抗体或抗体片段，包括结合豆荚蛋白和/或ZB-1片段的抗体或抗体片段)；以及拮抗小分子(如siRNAs、适体和小有机分子或化合物)。在确定是否施用豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂中考虑的几种药物基因组学方法对本领域技术人员是众所周知的，包括全基因组关联、候选基因法和基因表达谱。本发明的药物组合物经配制以符合其预期的给药途径(如口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体)。其他给药途径的非限制性例子包括非肠道(例如静脉内)、皮内、皮下、口腔(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药。与每种预期途径相容的药物组合物在本领域是众所周知的。

[0137]当与药学上可接受的载体组合时，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂可用作药物组合物。除了豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂(例如人豆荚蛋白拮抗剂)，这样的组合物可含有载体、各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他本领域众所周知的物质。术语“药学上可接受的”指不干扰所述活性成分生物活性有效性的无毒物质。所述载体的特点将取决于给药途径。

[0138]本发明的药物组合物可以是脂质体的形式，其中除了其它药学上可接受的载体，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂与两亲物质例如以聚集形式如水溶液中胶束、不溶性单层、液晶、片晶层存在的脂类组合。脂质体组合物的合适脂类包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫脑苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂甙、胆汁酸等。

[0139]本文所用的术语“治疗有效量”指足以表现出有意义的患者受益，例如这样的疾病症状减轻、治愈或治愈率增加的药物组合物或方法的每种活性组分的总量。当适用于单个活性成分，单独给药时，所述术语仅指该成分。当适用于组合物时，所述术语指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是联合、连续或同时给药。

[0140]在实践本发明的治疗方法或用途中，治疗有效量的豆荚蛋白和/或ZB拮抗剂施用于受试者，如哺乳动物(如人)。豆荚蛋白和/或ZB-1受体可根据本发明的方法，或单独或与其它疗法结合，例如与关节炎和动脉粥样硬化的其它疗法相结合施用。当与一种或多种药物合用时，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂可或者与第二个药物同时施用，或者连续施用。如果连续施用，主治医生将决定将豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂与其它药物联合施用时合适的顺序。

[0141]当治疗有效量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂口服给药时，所述黏合剂会是片剂、胶囊、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂形式施用时，本发明的所述药物组合物可另外含有固体载体如明胶或佐剂。片剂、胶囊和/或粉剂含有约5至95％的黏合剂，优选约25至90％的黏合剂。当以液体形式施用时，可添加液体载体如水，石油，动物或植物来源的油如花生油(花生过敏谨慎运用)，矿物油，大豆油或麻油，或合成油。液体形式的药物组合物可进一步含有生理盐水溶液，葡萄糖或其他糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，以黏合剂重量计所述药物组合物含有约0.5至90％，以黏合剂重量计优选1至50％。

[0142]当治疗有效量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂通过静脉内、皮肤或皮下注射给药时，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂是无热原，胃肠外可接受的水溶液。这样的胃肠外可接受的，充分考虑到pH、等渗性、稳定性等等的蛋白溶液的制剂在本领域技术人员的技能范围内。静脉内、皮肤或皮下注射的优选药物组合物应含有除豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂外的等渗溶剂，如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、乳酸盐林格注射液或其他本领域已知的溶剂。本发明的所述药物组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧剂或其它本领域技术人员已知的添加剂。

[0143]本发明药物组合物中豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的量取决于正在治疗的疾病的性质和严重程度，以及患者已接受的之前治疗的性质。最终主治医生将决定治疗每个患者的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的量。开始时主治医生将施用低剂量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，并观察病人的反应。可施用更大剂量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，直至患者获得最佳治疗效果，在那点上剂量一般不进一步增加。设想用于实行本发明方法的各种药物组合物应含有每千克体重约0.1ug至约100mg豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，例如人豆荚蛋白多肽(包括其融合蛋白)。

[0144]使用本发明的药物组合物的静脉内(i.v.)治疗持续时间会变化，取决于正在治疗的疾病的严重程度，和每个个体病人的可能特殊反应。设想豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂每次应用持续可能在例如1-12、6-18，或12-24小时连续或间歇静脉注射给药的范围内。还设想的是使用本发明药物组合物皮下(S.C.)治疗。这些治疗可以每天、每周，或者更优选，每两周或每月实施。还设想的是，如果豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂是小分子(如口服给药)，则该疗法可每日，一天两次，一天三次等等实施。最后主治医师将决定使用本发明的药物组合物，静脉注射或皮下治疗或用小分子治疗的合适持续时间，以及实施所述治疗的时间安排。

[0145]本发明的多核苷酸和蛋白预期显示出本文确定的一种或多种用途或生物活性(包括与本文引用的分析有关的)。所描述的本发明蛋白的用途或活性可通过施用或使用这样的蛋白，或通过施用或使用编码这样的蛋白的多核苷酸提供(例如在基因疗法或适于导入DNA的载体中)。

豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的用途

[0146]一方面，本发明的特征是调节有兴趣的细胞或样本中(例如单核细胞、泡沫细胞、巨噬细胞、肾近端小管细胞、炎性细胞侵袭血管的部位、动脉粥样硬化斑块内膜、肾脏或动脉)天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶活性的方法。一种这样的方法包含将细胞或细胞群与足以调节感兴趣的细胞或样本中天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶活性水平的量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂(例如人豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多核苷酸或多肽(如siRNA、适体、反义或拮抗豆荚蛋白和/或ZB-1可溶性蛋白，包括融合蛋白)；或抗豆荚蛋白或ZB-1抗体(即拮抗抗体))接触。在本发明的另一实施方案中，使用豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，以致感兴趣的细胞或样本中豆荚蛋白和/或ZB-1的分泌或表达水平降低。天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶活性、表达和/或分泌的调节预期有益于患有豆荚蛋白相关疾病、ZB-1相关疾病，和/或伴随天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶调节异常的疾病，如血管和炎性疾病，例如动脉粥样硬化和关节炎的个体。

[0147]因此豆荚蛋白和/或ZB-1的拮抗剂被认为用于治疗受疾病困扰的受试者，例如动脉粥样硬化(包括但不限于动脉粥样硬化形成和动脉粥样硬化的所有阶段，内皮细胞激活、脂纹形成，炎性细胞侵袭血管壁、内皮细胞迁移、泡沫细胞形成、斑块剥落、粥样斑块形成、粥样斑块破裂、动脉粥样硬化血栓形成、动脉瘤，狭窄等)，充血性心力衰竭，心肌梗死，心房和心室心律不齐，狭窄，动脉瘤，周围性血管疾病，慢性周围动脉闭塞性疾病(CPAOD)，周围动脉闭塞性疾病(PAOD)，血栓形成(包括如急性动脉血栓形成、动脉粥样硬化血栓形成和深静脉血栓形成)，栓塞，炎症血管疾病，雷诺氏现象，血管炎和/或动脉炎(包括例如Bechet’s病、Buerger’s病、中枢神经系统血管炎、Churg-Strauss症候群冷凝球蛋白血症、巨细胞动脉炎、川崎病、显微镜下多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、类风湿血管炎、Takayasu’s炎和韦格纳肉芽肿)，静脉病，高血压血管疾病，跛行，稳定型心绞痛，不稳定型心绞痛，中风，冠心病(CAD)，急性冠脉综合征(ACS)，代谢综合征，缺血，再灌注，以及受循环系统影响的各种疾病的恶化(如慢性肾病、终末期肾病(ESRD)、高脂血症、高血压和糖尿病)。使用本文公开的方法诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防的其它疾病包括炎性疾病(如慢性炎性疾病，例如关节炎和肺结核)。

[0148]本发明的方法是基于，至少部分基于以下研究结果，来自主动脉弓、主动脉窦、颈动脉泡沫细胞和炎性细胞浸润血管部位的动脉粥样硬化样本中豆荚蛋白表达增加，在激活的巨噬细胞中豆荚蛋白水平和活性增加，以及ZB-1是豆荚蛋白的剪切变异体，从ZB-1超表达细胞分泌。因此豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，即抑制豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的分子(例如拮抗剂抗豆荚蛋白抗体)，可用于减少与血管和炎性疾病相关的天冬酰胺酰基肽酶/蛋白酶活性，例如治疗、减轻或预防如动脉粥样硬化和关节炎的疾病。

[0149]通过使用豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，在许多方面调节天冬酰胺酰基蛋白酶/肽酶是可能的。例如，降低活性、表达和/或分泌可通过抑制或阻断已形成的豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病进行，或可包括预防豆荚蛋白和/或ZB-1相关疾病的诱导。

[0150]含有豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的本发明的药物组合物还可含有另外的治疗剂，治疗所述特定定向疾病。例如治疗动脉粥样硬化的药物组合物还可以包括抗高血压药物、降胆固醇药物、他汀类和/或炎性细胞因子调节剂，如

或

所述药物组合物可含有溶栓或抗凝因子，如纤溶酶原激活剂和因子VIII。所述药物组合物可进一步含有另外的抗炎药物。这些另外的因子和/或药物可包括在所述药物组合物中，产生与豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的协同效应，或最小化豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂导致的副作用。

[0151]在一个实施方案中，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，包括其药物组合物以联合治疗方式给药，即与其它物质如用于治疗病理疾病如心血管系统疾病的治疗剂合用。此上下文中术语“联合”指所述药物基本上同时，或同时或连续给药。如果连续给药，则第二个化合物开始给药时，两个化合物中的第一个优选在治疗部位仍能检测到有效浓度。

[0152]与豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂联合使用的优选治疗剂是调节血管和炎性疾病不同方面的那些物质，例如干扰促炎细胞因子活性的物质。

[0153]因此，与豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂合用的物质包括但不限于刺激胆固醇从含有胆固醇的细胞，如巨噬细胞和泡沫细胞流出的物质，如PPARs调节剂(即PPARα、PPARβ和PPARγ)，LXR调节剂(肝X受体，如氧甾酮)，以及ABC调节剂(ATP结合盒转运子(ATP-binding cassette transporters)，例如ABCA、ABCG和ABC8)。这样的物质包括噻唑烷二酮(例如格列酮，如罗格列酮和曲格列酮)，脂肪酸(包括多不饱和脂肪酸)，fibrate类(例如非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯、Wy-14,643)、GW1516、GW764、GW7845、GW0742、GW7647、二十碳五烯酸、黄腐酚、roselipins、异戊二烯基类黄酮(prenylflavonoids)、聚乙炔、丹参酮及其衍生物(参见例如Coleman and Lee(2004)Prog.Lipid Res.43：134-76；Chen and Farse(2005)Atheroscler.Thromb.Vasc.Biol.25：482-86；Rustan et al.(1988)J.Lipid Res.29：1417-26；Tabata etal.(1997)Phytochemistry 46：683-87；Tomoda(1999)J.Antibiotics52：689-94；Chung et al.(2004)Planta Med.70：258-60；Lee et al.(2004)Planta Med.70：197-200；Ko et al.(2002)Arch.Pharm.Res.25：446-48；Li et al.(2004)J.Clin.Invest.1564-76；Castrillo and Tontonz(2004)J.Clin.Invest.114：1538-40；Marx et al.(2004)Circ.Res.94：1168-78；Chawla et al.(2001)Mol.Cell.7：161-71；Lie et al.(2000)J.Clin.Invest.106：523-31；Collins et al.(2001)Artheroscler.Thromb.Vasc.Biol.21：365-71；Lee et al.(2003)Science 302：453-57；Duez et al.(2002)J.Biol.Chem.277：48051-57；Rubins et al.(1999)N.Eng.J.Med.341：410-18；Oliver et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5306-11；Chinetti et al.(2001)Nat.Med.7：53-58；Ricotte et al.(1998)Nature391：79-82；Joseph et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：7604-09；Tangirala et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：11896-901；Venkateswaran et al.(2000)J.Biol.Chem.275：14700-07；和Wang et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9774-79).

[0154]此外，使用豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂的联合治疗可用他汀类(例如美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀和瑞舒伐他汀)，胱抑素(例如ovocystatin、胱抑素C和胱抑素M)和/或增加他汀类活性和/或生物利用度的物质，例如细胞色素P450(CYP450)、CYP 3A4和CYP 2C8/9(如大环内酯类抗生素、氮杂戊、蛋白酶抑制剂、维拉帕米、地尔硫卓、胺碘酮、华法令，葡萄柚汁、吉非贝齐、苯妥英、氯沙坦、双氯芬酸、布洛芬和dolbutamide)，以及肝他汀类转运蛋白抑制剂OATP-C(如环孢菌素A和吉非贝齐)(参见Rutishauser(2006)Swiss Med.Wkly.136：41-49)。与豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂联合使用的另外的物质包括降低血糖(例如瑞格列奈，参见Schmoelzer and Wascher(2006)Cardiovasc.Diabetol.5：9)；白三烯拮抗剂(如参与白三烯生物合成的蛋白拮抗剂，如5-脂氧化酶(5-LO)、5-LO-活化蛋白(FLAP)以及白三烯水解酶(例如LTA4水解酶))；降低胆固醇、LDL和甘油三酯水平的物质(例如fibrinates、HMG-CoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物)；抗高血压药；抗血小板药；抗促凝剂；胆固醇酰基转移酶抑制剂(见Krause et al.(1995)Inflammation Mediators and Pathways，pp.173-98CRC Press，Boca Raton，FL)；糖尿病治疗药(如胰岛素；胰岛素增敏剂，如二甲双胍；Glp-1模拟物，如艾塞那肽

胰岛素促分泌剂，如磺酰脲类(例如妥拉磺脲、优降糖和其它)和metiglinide(例如那格列奈)；固醇调节元件结合蛋白(SREBP)调节剂，如阿托伐他汀和辛伐他汀(例如

和)；法尼酯X受体(FXR)调节剂(例如胆汁酸)；和其他组织脂质及胆固醇水平调节剂。

[0155]本发明另一方面因此涉及将豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂与其它治疗化合物合用的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含与药物载体中一种或多种粘合剂一起配制的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂，以及至少一种其它物质，例如另一治疗剂，视情况而定在一种或多种单独的药物制剂中配制。

豆荚蛋白参与血管和炎性疾病

[0156]本发明提供了治疗、减轻或预防血管疾病，如动脉粥样硬化的方法，其包含将细胞或细胞群与溶酶体半胱氨酸蛋白酶豆荚蛋白和/或ZB-1调节剂接触，和/或包含将这样的调节剂施用于受试者。溶酶体半胱氨酸蛋白酶介导的蛋白酶解与动脉粥样硬化形成的多个病理方面有关。本发明人已证实，半胱氨酸蛋白酶豆荚蛋白在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块，以及结扎的小鼠颈动脉病变中高表达。在易动脉硬化的ApoE-/-小鼠中，病变区域豆荚蛋白表达的递增与疾病进展有关。在正常血管组织中未观察到豆荚蛋白蛋白，在2月龄ApoE-/-小鼠发展的病变中检测首次检测到。明显的豆荚蛋白表达在6月龄和1年龄ApoE-/-小鼠晚期动脉粥样硬化病变中发现。与ApoE-/-小鼠的结果一致，使用数据库的数据开采显示，与或来自相同病人的无症状血管或无症状病人的血管相比，人动脉粥样硬化斑块中豆荚蛋白mRNA表达增加2.4倍(图1)。因此豆荚蛋白表达模式表明其参与血管炎性疾病，例如动脉粥样硬化。

[0157]本文还公开了研究结果：巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块中表达疾病相关豆荚蛋白的主要细胞类型。巨噬细胞是涉及细胞外基质重塑和斑块不稳定的细胞外溶酶体蛋白酶的丰富来源。Reddy et al.已证实，单核细胞来源的巨噬细胞分泌活性组织蛋白酶S和L到能参与血管重塑的细胞外环境中(Reddy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.92：3849-53)。其他人已证实，组织蛋白酶S和L可以在功能上促进动脉粥样硬化(Liu et al.(2006)Atherosclerosis 184：302-11；Sukhova et al.，supra)。本文公开的研究结果是分化的巨噬细胞表达高水平的豆荚蛋白，并能分泌豆荚蛋白到细胞外空间。虽然分泌的豆荚蛋白以前体形式被发现，但它可以在细胞外酸性微环境中活化，在细胞外酸性微环境中其活化其它来自巨噬细胞的溶酶体蛋白酶，包括组织蛋白酶B、L和S(如Reddyet al.，supra)。或者豆荚蛋白可在细胞功能区隔内被活化，然后与细胞表面结合。实际上，本文公开的研究结果是，293细胞超表达的豆荚蛋白表现出细胞表面豆荚蛋白活性(例如图7；还参见Liu etal.(2003)Cancer Res.63：2957-64)。此活性可来自由于核内体/溶酶体膜与质膜融合，出现在细胞表面的核内体/溶酶体中的活性豆荚蛋白(Andrews(2000)Trends Cell Biol.10：316-21)。细胞膜结合可通过经成熟豆荚蛋白酶中RGD序列结合整合蛋白的豆荚蛋白介导。

[0158]内源性细胞表面豆荚蛋白活性可能难以检测，并可能仅存在于病变微环境中。例如，肿瘤细胞表面结合的豆荚蛋白只在肿瘤微环境中发现，但在培养物中的肿瘤细胞上没有发现(Liu et al.，supra；Wu et al.(2006)Cancer Res.66：970-80)。此外，豆荚蛋白在肿瘤相关巨噬细胞表面检测到，但在循环单核细胞(circulatingmonocyte)上未检测到(Wu et al.，supra)。

[0159]动脉粥样硬化中其它细胞外溶酶体半胱氨酸蛋白酶建议的作用是细胞外基质(ECM)降解和组织重建。组织蛋白酶L和S具有直接参与ECM降解的溶胶原和促弹性组织解离活性(Liuet al.(2006)supra；Reddy et al.，supra)。此外，一些组织蛋白酶包括组织蛋白酶B和L，可加工胱冬酶并诱导细胞凋亡，导致动脉粥样硬化性患者病变进展(Guicciardi et al.(2000)J.Clin.Invest.106：1127-37；Ishisaka et al.(1999)Cell Struct.Funct.24：465-70；Vancompernolleet al.(1998)FEBS Lett.438：150-58)。ECM组成部分和胱冬酶目前已知不是豆荚蛋白底物。然而通过加工和活化其它溶胶原/促弹性组织离解酶，例如MMP-2和组织蛋白酶B、H和L，豆荚蛋白可间接促进ECM降解。动脉粥样硬化斑块中存在豆荚蛋白及其蛋白水解功能表明，豆荚蛋白表达和活性的调节剂在治疗、预防或减轻动脉粥样硬化的方法中是有用的。

[0160]通过造成周围组织退化，假设巨噬细胞破坏处于慢性炎性疾病状态的宿主组织(Reddy et al.，supra)。本文提供的结果表明豆荚蛋白在小鼠CIA模型患关节炎的爪子中表达。由于类风湿关节炎是慢性炎性疾病，因而豆荚蛋白在CIA模型患关节炎爪子中表达的发现显示，豆荚蛋白可能通过巨噬细胞活性介导关节降解作用。此外，重要的是要注意一些血管疾病也是炎性疾病，即例如血管内膜的炎症是造成脉管系统损伤的至少部分原因。因此，豆荚蛋白的调节剂可用于治疗、预防和减轻炎性疾病，例如类风湿性关节炎的方法。

[0161]细胞迁移是炎性疾病的主要特征，包括但不限于血管炎性疾病，如动脉粥样硬化。举例来说，单核细胞迁移到动脉壁是导致泡沫细胞形成，并最终导致晚期动脉粥样硬化病变发展的动脉粥样硬化过程的早期事件。正如本文所公开的，豆荚蛋白能诱导纳摩尔浓度的单核细胞迁移，豆荚蛋白的趋化物活性可与VEGF一样有效。这表明豆荚蛋白具有趋化物性质。

[0162]单核细胞侵袭内皮细胞层被认为是通过已知为外渗作用的过程(例如白细胞外渗)产生，其中单核细胞首先粘附在血管的内皮细胞层，然后在朝向基底膜的内皮细胞和血管新内膜间挤压(Janeway et al.(1999)Immunobiology，4^th Edition，p.607，ElsevierScience Ltd./Garland Publishing)。因为本发明公开豆荚蛋白诱导单核细胞向动脉粥样硬化病灶募集，所以豆荚蛋白和/或ZB-1的拮抗剂将用于防止单核细胞募集和单核细胞外渗。已成功地外渗进入新内膜的单核细胞通常分化成巨噬细胞；因此豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂也会防止动脉粥样硬化斑块部位的单核细胞分化。

[0163]此外，这些相同的数据表明豆荚蛋白和/或ZB-1激动剂和拮抗剂将用于分别促进和抑制其他形式的外渗，如肿瘤转移(见下文)，其他形式的白细胞外渗等。除了实施例中(下文)中出现的这样相关的检测外，本领域普通技术人员会知道几种已建立的检测，评价例如豆荚蛋白激动剂或拮抗剂对细胞过程/活动，如细胞迁移、外渗等的生物学效应。

[0164]豆荚蛋白的趋化物功能似乎是独立于其蛋白酶活性的，因为纯化形式的豆荚蛋白和热变性的形式都保留了趋化物功能(数据未显示)，这表明线性肽序列介导豆荚蛋白的趋化物功能。有趣的是，豆荚蛋白已被描述为有蛋白酶非依赖性的生物活性。豆荚蛋白非活性前体形式含有在豆荚蛋白自催化激活过程中裂解的17kDa C端肽OIP-2(破骨细胞抑制肽2)。豆荚蛋白/OIP-2已证明抑制单核细胞分化成破骨细胞，并抑制骨吸收(Choi et al.(2001)supra；Choi et al.(1999)supra)。因此，豆荚蛋白受体可出现在单核细胞表面，豆荚蛋白的C端肽可足以介导化学趋化。因此，豆荚蛋白可能在动脉粥样硬化形成中表现出双重功能，例如作为蛋白酶和作为趋化物。豆荚蛋白蛋白酶功能可能会导致细胞外基质降解，而趋化作用可能有助于单核细胞募集进入动脉粥样硬化病灶，以及巨噬细胞保留在斑块内。由于豆荚蛋白的双重功能，豆荚蛋白的拮抗剂会抑制豆荚蛋白的蛋白水解和趋化功能，因而在治疗如动脉粥样硬化的方法中是有用的。此外，OIP-2及相关激动剂和/或拮抗剂可用于治疗、减轻或预防例如哺乳动物中的各种血管疾病或炎性疾病。

[0165]此外，本发明教导豆荚蛋白是ApoE-/-小鼠的内皮细胞表达的，此结果与肿瘤血管内皮细胞表面中检测的豆荚蛋白相符(Wu et al.，supra)。正如本文所公开的，内皮细胞例如HEK293细胞和HUVEC，已增加了向豆荚蛋白的迁移特性。此结果与人冠状动脉斑块新血管形成区域中检测到高浓度的表达豆荚蛋白的炎性细胞相结合，表明豆荚蛋白在血管形成中的作用。斑块内血管新生被认为是动脉粥样硬化重要的病理特征，增强斑块生长和易损性(Moulton et al(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：4736-41；Moulton et al.(1999)Circulation 99：1726-32)。巨噬细胞分泌的豆荚蛋白通过促进内皮细胞迁移、侵袭和增殖，可能有助于新血管的形成，因此豆荚蛋白的调节剂可用于治疗、减轻或预防血管生成，如与动脉粥样硬化和肿瘤生长有关的血管生成的方法，以及抑制或促进内皮细胞增殖的方法(例如在组织血管的再形成中促进扩散和血管生成)。

[0166]有趣的是，豆荚蛋白最近已被发现在肿瘤细胞微环境中出现并有活性，与细胞外基质和细胞表面有关。有人认为，细胞外豆荚蛋白活性功能上促进肿瘤细胞的转移行为。事实上，研究人员已证明豆荚蛋白在肿瘤细胞树突状伪足(invadopodia)膜结合泡囊的膜中，以及与整联蛋白定位相同的肿瘤细胞表面上被发现(Liu etal.(2005)Cancer Res.63：2957-64；Wu et al.(2006)Cancer Res.66：970-80)。另据报道豆荚蛋白在肿瘤病理中发挥作用(Murthy et al.(2005)Clin.Cancer Res.11：2293-99)。正如本文所公开的，通过促进内皮细胞迁移，豆荚蛋白在血管生成中起关键作用。因此豆荚蛋白活性在促进与转移性癌症有关的血管生成中将是重要的；豆荚蛋白和/或ZB-1的拮抗剂可用于治疗、减轻和预防肿瘤转移的方法中。

[0167]相反地，豆荚蛋白和/或ZB-1的激动剂可用于治疗、减轻或预防需要增加血管形成的疾病的方法。例如豆荚蛋白的激动剂可用于促进例如血管再形成、伤口愈合、移植手术恢复等的方法中。

[0168]总之，本文提供的数据建立了溶酶体蛋白酶豆荚蛋白和血管以及炎性疾病间的新联系。这些结果还表明单核细胞/巨噬细胞是动脉粥样硬化相关豆荚蛋白的主要来源，细胞表面/细胞外豆荚蛋白功能上可能促进疾病形成，例如通过刺激细胞迁移。

[0169]贯穿此申请的所有出版物、专利、专利申请以及引用的其它参考文献的所有内容，据此其全部在此引作参考。

实施例

[0170]下面的实施例提供本发明的说明性实施方案，不以任何方式限制本发明。本领域的普通技术人员会认识到许多其他实施方案涵盖在本发明的范围内。

[0171]实施例不包括常规方法的详细说明，例如载体构建中采用的方法，编码多肽的基因插入这样的载体和质粒，这样的载体和质粒导入宿主细胞，以及来自宿主细胞中这样的载体和质粒的多肽的表达。这样的方法对本领域普通技术人员是众所周知的。

实施例1：豆荚蛋白在人动脉粥样硬化样本以及在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化疾病进展过程中高表达

[0172]为确定半胱氨酸蛋白酶是否可能参与动脉粥样硬化病变，在人动脉粥样硬化动脉样本中分析了豆荚蛋白的表达模式。

实施例1.1：豆荚蛋白在人动脉粥样硬化中的表达概况图

[0173]人动脉粥样硬化斑块和人无斑块动脉样本的表达数据从GENELOGIC^TM数据库下载。该数据从RNA与

(Santa Clara，CA)Hg 133A GENECHIP^TM寡核苷酸微阵列杂交产生。数据分析是用GENESPRING^TM进行的。对于相对于对照的平均已经或增加或降低表达水平的基因转录物，筛选归一化数据。表达水平提高的基因转录物必须有“Present”的呼叫，频率＞5，在至少70％样本中表达变化至少2倍。减少的基因转录物必须有“Present”的呼叫，频率＞5，在至少70％的样本中表达变化至少2倍。统计分析用GENESPRING^TM v6.1进行。

实施例1.2：结果

[0174]相对于无斑块的片段或无疾病的动脉样本，豆荚蛋白表达在含有斑块的人动脉粥样硬化动脉样本中增加(图1)。

实施例2：豆荚蛋白在ApoE-/-小鼠主动脉弓、冠状动脉和主动脉窦的动脉粥样硬化病灶中高表达

[0175]易患动脉粥样硬化的载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠中与疾病过程有关的基因表达通过微阵列分析确定。所述ApoE/-小鼠发展为严重高胆固醇血症，诱导动脉粥样硬化病变在脉管中的特定位置，包括主动脉窦、主动脉弓和冠状动脉的近端部分形成(Nakashima et al.(1994)Arterioschler.Thromb.14：133-40；Reddick etal.(1994)Arterioscler.Thromb.14：141-47)。

实施例2.1：动物和组织制备

[0176]所有动物研究通过机构动物照顾与使用委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee)核准。来自TaconicFarms(Germantown，NY)的雄性ApoE KO(ApoE-/-)和C57BL/6小鼠保持饲以正常饲料，选定时间点安乐死。所有小鼠吸入100％CO₂，左心室注射灌注生理盐水处死。心脏和主动脉弓进一步灌注

(Ambion Inc.，Austin，TX)，收集并冰冻，以备基因表达研究。对于组织学研究，左心室灌注生理盐水后，灌注4％多聚甲醛。心脏、主动脉弓和肾脏(见下文)在4％多聚甲醛中存放过夜，换到70％乙醇中，脱水并石蜡块包埋，以备原位杂交或免疫组织化学操作。石蜡包埋的心脏样本如前所述切片，以收集位于主动脉窦内的切片(Paigen et al.(1987)Atherosclerosis 68：231-40)。

实施例2.2：Affymetrix杂交和分析

实施例2.2.1：RNA分析

[0177]在选定时间点收集并合并ApoE KO(ApoE-/-)和C57BL/6小鼠中主动脉弓(n＝3-5)，从中分离并纯化(n＝3-5)总RNA。总RNA使用RNAEASY^TM minikit样本裂解缓冲液(RLT)分离，RNA按照制造商的建议(Qiagen，Valencia，CA)纯化。对于每个样本，总RNA于260nm测紫外吸收定量，并用

2100BIOANALYZER^TM(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)对等份进行分析，以确定RNA的完整性。

实施例2.2.2：寡核苷酸阵列分析杂交溶液的制备

[0178]双链cDNA使用SUPERSCRIPT^TM Choice试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)和含有T7RNA聚合酶启动子(Proligo，LLC，Boulder，CO)的33pmol寡脱氧胸腺核苷酸引物，从3-5μg总RNA制备。第一链cDNA的合成加入下列试剂盒组分引发：1X第一链缓冲液、10mM DTT、500mM dNTP、400U的SUPERSCRIPT^TM RT II和40U的RNase抑制剂。反应47℃进行1小时。第二链合成加入下列试剂盒组分进行：1X第二链缓冲液、200mM附加dNTP、40U的大肠杆菌DNA聚合酶I、2U的大肠杆菌RnaseH、10U的大肠杆菌DNA连接酶。反应15.8℃进行2小时。第二链反应的最后5分钟加入T4DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)，终浓度6U(每毫升原液2μl，3000U)。双链cDNA用如制造商(Affymetrix，Santa Clara，CA)描述的

Sample Cleanup Module纯化。纯化的cDNA(10μl)依据制造商的流程(Enzo，Farmingdale，NY)，用Bioarray High YieldRNA TRANSCRIPT LABELING KIT(T7)^TM转录。生物素标记的反义cRNA用如制造商(Affymetrix，Santa Clara，CA)描述的

Sample Cleanup Module纯化。260nm测量紫外吸收确定cRNA得率。

实施例2.2.3：寡核苷酸微阵列杂交步骤

[0179]碎片cRNA(15μg)如前所述制备(Byrne et al.(2000)Preparation of mRNA for expression monitoring，In：Ausubel et al.(eds.).Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，New York)，并如制造商(Affymetrix，Santa Clara，CA)建议的用于创建寡核苷酸微阵列杂交溶液。杂交溶液含有11种原核RNA混合液(Hill et al.，supra)，每种有不同的已知浓度，用来创建每个微阵列的内标曲线并内插以确定检测基因的频率。杂交溶液95℃加热1-2分钟，微型离心机最大速度离心2分钟，以沉淀粒状不溶性碎片。标记的cRNA溶液与

(Santa Clara，CA)Mouse Genome 4302.0GENECHIP^TM寡核苷酸微阵列杂交。杂交后回收cRNA洗涤并制备微阵列，根据Affymetrix流程扫描。采集原始荧光数据并用GENECHIP^TM MAS 5.0软件应用程序(Affymetrix，Santa Clara，CA)归约。频率使用细菌RNA标准曲线(Hill et al.(2001)Genome Biol.2(12)：research0055.1-0055.13)确定。

实施例2.2.4：表达概况图数据分析

[0180]通过筛选相对于对照的平均，已经或增加或降低表达水平的基因转录物，归约数据。表达水平提高的基因转录物必须有“Present”的呼叫，频率＞5，在至少70％样本中表达变化至少2倍。减少的基因转录物必须有“Present”的呼叫，在至少70％的对照中频率＞5，在至少70％的样本中表达变化至少2倍。统计分析使用Welch ANOVA和一些多测试修正(multiple testing correction)(Benjamini and Hochberg False Discovery Rate以及BonferroniMultiple Testing Correction-族误差率(Family-wise error rate)(FWER)p＜0.05)，用GENESPRING^TM v6.1(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)分析。选择豆荚蛋白合格物(qualifier)进行另外的分析。

实施例2.3：实时定量PCR

[0181]RNA用

试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商说明从小鼠组织(或THP-1细胞；见下文)分离纯化。使用

7000序列检测系统(PE Applied Biosystems，FosterCity，CA)，如前所述(Lake et al.(2005)J.Lipid Res.46：2477-87)，用Assay-on-Demand

试剂(PE Applied Biosystems，FosterCity，CA or Eurogentec，San Diego，CA)，通过

实时定量PCR测定豆荚蛋白mRNA水平。使用下面的引物：CCAGGAGGCTGTAACCCACTT(正向引物；SEQ ID NO：14)和GCAAGGCATGCTCGTACGT(反向引物；SEQ ID NO：15)。根据制造商的说明分析数据。

实施例2.4：原位杂交

[0182]鼠豆荚蛋白正义和反义核糖核酸探针通过产生两种具有T7RNA聚合酶结合位点的单独的PCR产物制备，所述结合位点对正义核糖核酸探针而言在PCR产物的5’末端，对反义核糖核酸探针而言在PCR产物的3’末端。地高辛标记的探针如制造商描述的，使用DIG RNA标记混合液和T7RNA聚合酶(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)制备。引物和探针序列中在表2(下文)中描述。

[0183]石蜡包埋组织的切片用二甲苯脱石蜡(换液两次，每次3分钟)，并在水中再水合。用无RNA酶的水和磷酸缓冲液(PBS)清洗后，用0.2％Triton-X 100/PBS培养15分钟进行透化。用PBS洗2次，每次3分钟，切片预备好进行蛋白酶K(PK)(Sigma，St.Louis，MO)处理。切片浸泡在37℃预热，含有5mg/ml PK的0.1M Tris和50mM EDTA(Sigma)(pH 8.0)中15分钟。PK活性用0.1M甘氨酸/PBS终止5分钟，然后用4％多聚甲醛后固定3分钟，PBS冲洗。为防止探针的非特异性静电结合，切片浸泡在0.25％醋酐和0.1M三乙醇胺溶液(pH 8.0)中10分钟，随后4℃下在20％醋酸浸泡15秒。PBS中换液3次，每次5分钟后，切片用70％、90％和100％乙醇脱水，每次3分钟。切片完全风干后，使用40ml预杂交缓冲液，用封口膜覆盖52℃培养30分钟，以减少非特异性结合。去除封口膜，含5ng/ml地高辛标记探针的40ml杂交缓冲液加到每个切片，用封口膜覆盖，潮湿小室内52℃孵育过夜。

[0184]小心去除封口膜，切片置于GENOMX^TM i6000(Biogenex，San Ramon，CA)自动染色系统中。切片于室温用2×柠檬酸钠盐水(SSC)/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)(都来自Sigma)清洗4次，每次5分钟。为确保只有特异性杂交信号存在，切片52℃下用含有0.1x SSC/0.1％SDS的高严格性溶液洗涤，洗涤2次，每次5分钟。为减少内源性过氧化物酶染色，切片在3％H₂O₂孵育15分钟之后，缓冲液洗3次。标记的探针用2％正常绵羊血清/0.1％Triton X-100中1∶500稀释的，与辣根过氧化物酶复合物(Roche，Nutley，NJ)结合的抗地高辛抗体结合检测1小时。生物素化复合物用Tyramide Amplification System(TSA^TM)(Biogenex，San Ramon，CA)扩增。切片与TSA孵育5分钟，然后缓冲液洗5次。TSA复合物然后与辣根过氧化物酶孵育15分钟进一步扩增，然后缓冲液中洗5次。扩增产物用3，3`-二氨基联苯胺(Vector Laboratory，Burlingame，CA)显影10分钟，水洗，用Mayers’hematoxylin(Sigma)简单染色，分级乙醇置于二甲苯中脱水，镜检前用DPX封固剂封固。

表2

实施例2.5：免疫组织化学和组织学

[0185]4μm厚石蜡包埋组织切片脱石蜡并再水合。Masson三色染色根据制造商的说明(American MasterTech Scientific，Lodi，CA)进行。对于免疫组织化学，根据制造商的说明，组织切片进行热介导的抗原恢复处理(Target Retrieval Solution，DAKO，Carpinteria，CA；DECLOAKING CHAMBER^TM，Biocare Medical，Concord，CA)，随后阻断非特异性背景染色(Serum-Free Protein Block，DAKO，Carpinteria，CA)。豆荚蛋白的免疫荧光检测使用羊抗小鼠豆荚蛋白第一抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)和驴抗羊Alexa594第二抗体或驴抗羊Alexa488第二抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)完成。豆荚蛋白的显色检测是用与碱性磷酸酶第二抗体结合的羊抗小鼠豆荚蛋白第一抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)和兔抗羊IgG抗体进行。信号检测使用加入左旋咪唑溶液(Vector Laboratories)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑底物(BCIP/NBT，VectorLaboratories，Burlingame，CA)和核固红复染得到。CD68的免疫检测使用大鼠抗小鼠CD68第一抗体(Serotec，Raleigh，NC)和兔抗大鼠Alexa488第二抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)获得。对于CD68和豆荚蛋白的双重免疫荧光染色，如上所述使用合适的第二抗体前，使用CD68和豆荚蛋白第一抗体的混合物。

[0186]P-选择素的免疫检测使用与生物素(R&D Systems，Minneapolis，MN)结合的山羊抗小鼠P-选择素第一抗体获得，所述生物素施用于组织切片，其中内源性生物素和抗生物素蛋白已用商业试剂盒(#X0590，DAKO，Carpinteria，CA)阻断。然后免疫荧光信号用与载玻片中Alexafluor488(S32354，Molecular Probes，Eugene，OR)结合的链霉亲和素检测，载玻片用有DAPI(Vector Laboratories，Burlingame，CA)的

Hardset Mounting Medium封固。对于P-选择素和豆荚蛋白的双重免疫荧光染色，使用如上所述的P-选择素第一抗体和大鼠抗小鼠豆荚蛋白(R&D Systems，Cat#MAB2058，Clone 301417，Minneapolis，MN)第一抗体的混合物。P-选择素的检测如本文所述获得，在这种情况下用于检测豆荚蛋白的第二抗体是与Alexafluor594结合的兔抗大鼠抗体。

实施例2.6：结果

[0187]豆荚蛋白mRNA被鉴定为从25周龄开始的ApoE-/-小鼠主动脉弓中被上调基因之一(统计学显著性用星号表示)，但一段时间内在C57BL/6(野生型(WT))对照动物中保持不变的低水平表达(图2)。

实时PCR分析证实，与或者12周龄ApoE-/-小鼠或对照40周龄C57BL/6(WT)对照小鼠比较，成年ApoE/-小鼠(40和54周)中豆荚蛋白mRNA增加(图3)。原位杂交检测豆荚蛋白mRNA在55周龄ApoE/-主动脉弓，但不是在45周龄C57BL/6对照切片或用对照探针染色的切片中表达(数据未显示)。

[0188]免疫组织化学染色表明，豆荚蛋白蛋白在ApoE/-小鼠主动脉窦病变中表达(数据未显示)。在主动脉窦，豆荚蛋白表达首次在2月龄ApoE-/-小鼠中检测到(数据未显示)。在老年小鼠的发展的动脉粥样硬化斑块中检测到表达增加。在1年龄ApoE-/-小鼠中，被浸润的炎性细胞区域中动脉粥样硬化病变内发现豆荚蛋白(数据未显示)。豆荚蛋白在成年C57BL/6对照小鼠的主动脉窦中没有检测到(数据未显示)。

实施例3：豆荚蛋白在加速动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型中表达

[0189]为确定豆荚蛋白表达是否限于ApoE-/-小鼠中自然形成的动脉粥样硬化病变中，在血管损伤后加速动脉粥样硬化模型中分析了豆荚蛋白的表达模式。

实施例3.1：加速动脉粥样硬化小鼠模型的制备

[0190]如前所述，一小组动物进行左侧颈动脉结扎(A.Kumarand V.Lindner(1997)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17：2238-44)。简单地说，8-10周龄的老年ApoE KO小鼠腹腔内注射氯胺酮(100mg/kg体重)和甲苯噻嗪(20mg/kg)溶液麻醉。通过颈部小的正中切口使左侧颈总动脉暴露。动脉于紧邻颈动脉分叉近端处完全结扎破坏血液流动。这些动物被允许恢复4周。恢复期结束时，动物安乐死，如本文所述灌注生理盐水和4％多聚甲醛，收集左右颈动脉5mm长的切片，石蜡块包埋进行免疫组织化学分析。

实施例3.2：结果

[0191]免疫组织化学染色表明，结扎后4周受伤的颈动脉中新内膜病变中检测到豆荚蛋白表达(数据未显示)。使用正常IgG的对照染色没有检测到任何信号(数据未显示)。用抗豆荚蛋白抗体染色未受伤颈动脉没有显示任何信号(数据未显示)。

实施例4：豆荚蛋白在动脉粥样硬化病变的泡沫细胞中表达

[0192]为鉴别与动脉粥样硬化病变中豆荚蛋白有关的细胞类型，细胞免疫染色，检测豆荚蛋白和巨噬细胞标记CD68。

实施例4.1：动脉粥样硬化免疫染色，检测豆荚蛋白和巨噬细胞标记

[0193]CD68的免疫检测使用大鼠抗小鼠CD68第一抗体(Serotec，Raleigh，NC)和兔抗大鼠Alexa488第二抗体(MolecularProbes，Eugene，OR)得到。对于双重免疫荧光染色，如上所述在使用合适的第二抗体前，使用CD68和豆荚蛋白第一抗体的混合物。豆荚蛋白的显色检测如本文所述进行。

实施例4.2：结果

[0194]显色和免疫荧光染色显示，豆荚蛋白蛋白集中在冠状动脉内动脉粥样硬化斑块中(数据未显示)。此外，豆荚蛋白与巨噬细胞标记CD68共同定位在主动脉窦发展的病变中，表明在动脉粥样硬化斑块中表达豆荚蛋白的主要细胞类型是巨噬细胞和泡沫细胞(数据未显示)。

实施例5：豆荚蛋白由主动脉窦动脉内皮细胞表达

[0195]为确定豆荚蛋白是否是动脉内皮细胞表达的，细胞被免疫染色，以检测豆荚蛋白和内皮标记物P-选择素。

实施例5.1：豆荚蛋白和内皮细胞标记的动脉粥样硬化病变免疫染色

[0196]P-选择素的免疫检测使用与生物素(R&D Systems)结合的山羊抗小鼠P选择素第一抗体，而后是与Alexafluor488(Molecular Probes，Eugene，OR)结合的链霉亲和素进行。对于双重免疫荧光染色，在使用第二抗体和链霉亲和素前，使用豆荚蛋白和P-选择素第一抗体的混合物。

实施例5.2：结果

[0197]免疫荧光染色显示，豆荚蛋白是2月到1年龄的ApoE-/-小鼠主动脉窦的动脉内皮细胞表达的，包括覆盖早期炎性病变的内皮细胞(数据未显示)。

实施例6：豆荚蛋白在ApoE-/-小鼠肾动脉的肾近端小管细胞和内皮细胞内表达

[0198]由于血管功能异常和炎性过程参与肾脏病理，所以测量豆荚蛋白在ApoEKO和C57BL/6小鼠肾脏中的表达。

实施例6.1：材料

[0199]如上所述收集雄性ApoEKO和C57BL/6小鼠的肾，制备并进行免疫组织化学操作，以评估豆荚蛋白在肾和肾动脉中的表达。P-选择素用作内皮细胞的标记。

实施例6.2：结果

[0200]从ApoE KO(ApoE-/-)小鼠分离的肾中豆荚蛋白蛋白的免疫检测显示，豆荚蛋白主要在肾近端小管细胞中表达(数据未显示)。C57BL/6小鼠中豆荚蛋白和P-选择素的双重染色显示两种蛋白质定位相同，并且豆荚蛋白一贯由小鼠肾动脉内皮细胞表达(数据未显示)。

实施例7：豆荚蛋白在人动脉粥样硬化病变中的表达

[0201]为确定豆荚蛋白是否也在人动脉粥样硬化病变中表达，对人冠状动脉切片进行免疫染色以确定豆荚蛋白表达。

实施例7.1：人冠状动脉免疫染色

[0202]重度动脉粥样硬化斑块的57岁老年女性的人冠状动脉，使用羊抗人豆荚蛋白第一抗体(R&D Systems)和生物素化的兔抗羊IgG第二抗体染色以检测豆荚蛋白。

实施例7.2：结果

[0203]免疫组织化学实验表明，豆荚蛋白蛋白不在正常人冠状动脉中表达。与此相反，豆荚蛋白蛋白主要由炎性细胞表达于重度冠状动脉粥样硬化斑块中，泡沫细胞覆盖斑块纤维化和钙化部分的区域，以及新血管形成的部位(数据未显示)。

实施例8：豆荚蛋白的表达和活性在分化的THP1单核细胞和激活的原代人巨噬细胞中增加

[0204]在THP-1巨噬细胞和CSF-刺激的人巨噬细胞中测量豆荚蛋白的表达和豆荚蛋白的酶活性。

实施例8.1：细胞培养

[0205]人单核细胞THP-1细胞取自ATCC，并保持在含有10％胎牛血清和β-巯基乙醇的PRMI 1640培养基(ATCC)中。THP-1单核细胞在含有100μg/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma)的生长培养基中经三天分化为巨噬细胞。

实施例8.2：人原代细胞培养条件

[0206]人单核细胞使用Rosettesep人单细胞富集混合物(Human Monocyte Enrichment cocktail)(StemCell Technologies，Vancouver，BC)，遵照制造商的流程，从志愿献血者的暗黄覆盖层副产品分离。单核细胞纯度由Celldyne临床细胞计数器(Abbott，Alameda，CA)确定为88％。单核细胞混悬在添加有青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、2.5mM Hepes(Sigma)和10％热灭活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI中，2×10⁶细胞/ml，并于37℃通过附着在10cm组织培养皿(Falcon，BD Biosciences，Rockville，MD)的塑料上2小时，进一步富集。

[0207]用力洗贴壁细胞，在有或没有20ng/ml重组人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(R&D Systems，Minneapolis，MN)存在的含0.25％FBS的RPMI中培养72小时。收集上清，离心使澄清，-80℃保存。细胞加入含Complete Mini蛋白酶抑制剂(Roche，Nutley，NJ)的0.5ml改良RIPA(50mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP40、0.25％脱氧胆酸)中裂解，冰上孵育15分钟。不溶性物质离心除去，上清-80℃保存。

实施例8.3：蛋白质印迹分析

[0208]用添加蛋白酶抑制剂片(Roche Diagnostics，Nutley，NJ)的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、pH 7.5、150mM NaCl、5mMEDTA、1％Triton-X、5mM DTT)裂解细胞，从THP-1细胞或人巨噬细胞制备蛋白提取物。细胞裂解物随后离心使澄清。收集上清，SDS-PAGE分离。蛋白转移到PVDF膜(Bio-Rad，Hercules，CA)，与一抗和二抗孵育后ECL检测(Roche Diagnostics，Nutley，NJ)。使用的抗体包括抗肌动蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)，和抗豆荚蛋白多克隆抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)。

实施例8.4：豆荚蛋白活性分析

[0209]荧光分析法测量豆荚蛋白蛋白酶活性操作如前所述但有些修改(Johansen et al.(1999)Anal.Biochem.273：278-83)。细胞提取物(20-50μl)加入96孔板的每个孔中，加入含有10nM底物Z-AAN-MCA(Peptide Institute)的150μl分析缓冲液。板在室温下孵育5分钟，在VICTOR 3^TM荧光板阅读仪(fluorescence platereader)(PerkinElmer，Wellesley，MA)，使用360nm激发滤光片和460nm发射滤光片测量荧光。室温下重复测量每隔5分钟一次，测20分钟。荧光随时间而增加，作图。

实施例8.5：TAQMAN^TM实时定量PCR

[0210]RNA使用RNEASY^TM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)根据制造商的说明，从小鼠组织或THP-1细胞分离纯化。使用ABIPRISM^TM 7000Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)，豆荚蛋白mRNA水平通过TAQMAN^TM实时定量PCR如前所述(Lake et al.(2005)J.Lipid Res.46：2477-87)，用定制TAQMAN^TM试剂(PE Applied Biosystems，Foster City，CA orEurogentec，San Diego，CA)测量。使用下面的引物：正向引物(SEQID NO：14)和反向引物(SEQ ID NO：15)。数据根据制造商的说明进行分析。

实施例8.6：结果

[0211]与未分化株THP-1单核细胞相比，分化的THP-1巨噬细胞中豆荚蛋白mRNA(图4A)、蛋白(图4B)和蛋白酶活性(图4C)明显增加。此外，用M-CSF分化的人巨噬细胞也显示豆荚蛋白(图5A)和活性增加(图5C)。通过Western分析，在M-CSF处理的人巨噬细胞条件培养基中检测到分泌的豆荚蛋白(如豆荚蛋白前体)(图5B)。这些结果表明，分化的巨噬细胞表达高水平的豆荚蛋白，并能将豆荚蛋白分泌到细胞外环境。

实施例9：体外豆荚蛋白向分化的人单核细胞的趋化性

[0212]为确定豆荚蛋白是否释放到细胞外环境作为促进单核细胞募集的趋化分子，在改良的Boyden小室中检测了原代人单核细胞向纯化的豆荚蛋白前体的迁移。

实施例9.1：人单核细胞迁移分析

[0213]人单核细胞使用阴性选择法，用Monocyte Isolation Kit(Miltenyi Biotech)，根据制造商的说明，从健康供体的血液中分离。分离的单核细胞的纯度通过流式细胞仪用CD14染色细胞证实。在改良Boyden小室检测中使用Multi Screen 96孔滤板(Millipore，5.0um孔径)检测。血清饥饿单核细胞加到上层小室(20,000细胞/孔)，无血清培养基加入有或没有纯化的豆荚蛋白(R&D Systems)的下层小室。VEGF(R&D Systems)用作阳性对照。迁移到下层小室的细胞使用发光法细胞活力检测(CellTiter-

Assay，Promega，Madison，WI)在2小时时定量。

实施例9.2：结果

[0214]观察到人单核细胞向豆荚蛋白迁移剂量依赖性增加(图6)。发现剂量25ng/mL是豆荚蛋白的最小有效浓度，与对照相比诱导单核细胞迁移增加2.3倍。对25ng/mL豆荚蛋白和10ng/mLVEGF响应的迁移细胞数量近似。

实施例10：活性豆荚蛋白在重组超表达细胞的细胞表面表达

[0215]为确定豆荚蛋白是否在细胞表面表达，生成超表达小鼠豆荚蛋白的CHO细胞，并对细胞表面豆荚蛋白进行分析。为确定这样的细胞表面豆荚蛋白是否是酶活性的，分析HEK293细胞超表达豆荚蛋白的豆荚蛋白蛋白酶活性。

实施例10.1：CHO细胞的免疫荧光染色

[0216]CHO细胞用表达小鼠豆荚蛋白的腺病毒感染，MOI为500。感染后48小时，细胞用含2％多聚甲醛的PBS于4℃固定20分钟。用封闭缓冲液(含10％FBS、3％BSA的PBS)室温下封闭细胞30分钟后，细胞与羊抗小鼠豆荚蛋白抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)或对照正常羊IgG(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)室温孵育1小时。细胞用PBS洗涤三次，与Alexa488结合驴抗羊抗体(Molecular Probes，Eugene，OR)室温孵育1小时。PBS洗涤三次后，细胞用Hoechst染色液室温复染色5分钟。细胞随后在荧光显微镜下放大40×拍照。

实施例10.2：HEK293细胞表面豆荚蛋白活性分析

[0217]HEK293细胞置于96孔黑色组织培养板中(BDBiosciences)，用表达小鼠豆荚蛋白的腺病毒感染，MOI为10。感染24小时后，细胞用豆荚蛋白分析缓冲液[39.5mM柠檬酸、125mM Na₂HPO₄(pH 5.8)、1mM EDTA、0.8％NaCl]清洗一次，含有10nM底物Z-AAN-MCA(Peptide Institute，Louisville，KY)的50μl分析缓冲液加到每个孔里。分析缓冲液包括蛋白酶抑制剂胱抑蛋白C(R&D Systems，Minneapolis，MN)或E64(Sigma)，浓度为100nM。培养板37℃孵育10分钟，使用360nm激发滤光片和460nm发射滤光片，在VICTOR 3^TM荧光板阅读仪(PerkinElmer，Wellesley，MA)测量荧光。室温下重复测量每隔5分钟一次，测20分钟。荧光随时间增加作图。

实施例10.3：结果

[0218]通过免疫荧光染色，用表达小鼠豆荚蛋白的腺病毒感染的CHO细胞表面上检测到豆荚蛋白的表达(数据未显示)。用豆荚蛋白抗体染色的细胞是蛋白染色阳性，而对照正常羊IgG染色的细胞只显示背景染色(数据未显示)。

[0219]使用非渗透分析条件，在超表达小鼠豆荚蛋白的活HEK293细胞上直接测量用表达小鼠豆荚蛋白的腺病毒感染的HEK293细胞中细胞表面豆荚蛋白活性。如图7所示，测量的活性可用胱抑蛋白C而非E64抑制，说明所述活性是豆荚蛋白特异性的。模拟感染HEK293细胞在此分析中并没有表现出可测量的活性(数据未显示)。因此细胞能以酶活形式在其表面表达豆荚蛋白。

实施例11：豆荚蛋白介导的内皮细胞迁移和增殖

[0220]为确定豆荚蛋白是否参与细胞迁移和增殖，例如动脉粥样硬化形成过程中出现的内皮细胞迁移，在HEK293和HUVEC培养物中研究豆荚蛋白对伤口愈合的影响。

实施例11.1：体外伤口愈合分析

[0221]使用的传代10次的HEK293细胞(ATCC，Manassas，VA)和使用的传代3次HUVEC(Cambrex，Walkersville，MD)接种到单室载玻片(Lab-Tek cat#177410，Campbell，CA)上。HEK293细胞在添加10％FBS和1％青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(Cat#10378-016，Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM中，培养至＞80％铺满，HUVEC在ECM(Cat#CC-3124，Cambrex，East Rutherford，NJ)中生长至＞90％铺满。在无血清培养基中清洗细胞后，用细胞刮(Cat#3010，Costar[Corning]，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)机械损伤单细胞层，得到2.0×1.7cm²矩形裸露区域。受伤细胞随后在添加0.05％脱脂BSA(BD Biosciences，Bedford，MA)和VEGF(10ng/mL，R&DSystems，Minneapolis，MN)或豆荚蛋白(10ng/mL或25ng/mL，R&DSystems，Minneapolis，MN)的无血清培养基中培养24小时(HEK293细胞)或20小时(HUVEC)。伤口愈合通过使用发光法细胞活力检测(CellTiter-

Assay，Promega，Madison，WI)，通过测量出现在最初损伤区域中细胞数量进行定量。

实施例11.2：结果

[0222]图8和9的数据表明，相对于对照(5％FBS和VEGF)，响应10ng/mL和25ng/mL豆荚蛋白刺激，细胞迁移增加。因此，豆荚蛋白似乎参与内皮细胞迁移；这种迁移发生在动脉粥样硬化形成过程中，并可能参与血管生成。经设计用于诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防涉及血管生成的疾病(包括但不限于癌症和炎性疾病)的方法和疗法等等都设想在本发明中。

实施例12：豆荚蛋白介导的内皮细胞侵袭

[0223]为确定豆荚蛋白是否也参与内皮细胞侵袭，如涉及血管生成，在改良Boyden小室分析中检测HUVEC。

实施例12.1：改良Boyden小室分析

[0224]在改良Boyden小室分析中，响应加到下层小室的纯化豆荚蛋白，加到上层小室的25000个血清饥饿的HUVEC被允许侵袭涂Matrigel的PET膜(3.0μm孔径，Becton Dickinson，BioCoatAngiogenesis System：内皮细胞侵袭)。Matrigel基质侵袭的细胞用发光法细胞活力检测(CellTiter-

Assay，Promega，Madison，WI)定量。VEGF用作阳性对照。

实施例12.2：结果

[0225]在改良Boyden小室分析中检测HUVECs的侵袭性质时，检测到侵袭涂Matrigel膜的细胞响应豆荚蛋白，细胞数量剂量依赖性增加，22小时内25ng/mL豆荚蛋白诱导的应答与10ng/mLVEGF类似(图10)。

实施例13：豆荚蛋白在胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型的患病爪中高表达

[0226]为确定豆荚蛋白是否在其它以增加的巨噬细胞和单核细胞活性为标志的疾病如结核病和类风湿关节炎中起作用，检测豆荚蛋白在胶原诱导关节炎(CIA)模型中的表达。

实施例13.1：胶原诱导关节炎(CIA)模型

[0227]雄性DBA/1小鼠从Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine获得。关节炎用溶解于0.1M乙酸，并在含有1mg/ml结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(H37RA菌株)的同体积完全弗氏佐剂(Sigma)中乳化的II型牛胶原(Chondrex，Redmond，WA)诱导。小鼠尾根部皮下注射100μg胶原混合物。21天时小鼠尾根部另外皮下注射与同体积不完全弗氏佐剂(Sigma)混合的含100μg牛胶原的0.1M乙酸。未曾测试过的动物(

animal)没有注射胶原。小鼠至少一周三次监测病情。四肢被指定基于指数的临床分值：0＝正常；P＝以趾尖病灶红斑为特点的关节炎前；1＝伴有1-2个肿胀脚趾的可见红斑；2＝明显红斑，爪子肿胀和/或多脚趾肿胀；3＝大规模肿胀延伸到踝关节或腕关节；4＝肢体活动困难或关节僵硬；结果最高的总躯体分值为16。不同时间间隔于疾病发作后处死动物，收集组织，爪子在pH 7.47的4％多聚甲醛中固定，20％EDTA(pH 8.0)中脱钙，石蜡包埋进行原位杂交。

实施例13.2：结果

[0228]CIA小鼠中豆荚蛋白信号在患病爪(临床分值3)中为强阳性，但正常对照爪没有，表明豆荚蛋白表达在此关节炎模型中随疾病上调(数据未显示)。这些结果表明豆荚蛋白参与炎性疾病，其中巨噬细胞和单核细胞与之长期有关。

实施例14：豆荚蛋白剪接变体ZB-1的鉴别和表征

[0229]为确定额外的豆荚蛋白的蛋白或转录物是否可能促进血管疾病和炎性疾病，筛选人肾上腺cDNA，以确定蛋白与人豆荚蛋白有高同源性。

实施例14.1：从人肾上腺分离ZB-1

[0230]人肾上腺cDNA被亚克隆到Adori表达载体中。有了Adori载体，表达由巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子和增强子调控。Ad5 E1a缺失的重组腺病毒通过人胚肾细胞系293(HEK293，ATCC，Manassas，VA)中同源重组产生。重组腺病毒被分离，随后在293细胞上扩增。经过3个冻融循环，病毒从感染的293细胞释放。病毒经两次氯化铯梯度离心和4℃下对pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)透析进一步纯化。透析后，加入甘油至浓度10％，病毒-80℃存放至使用。病毒通过评估下列参数进行表征；转基因的表达，293细胞上噬斑形成单位，颗粒/毫升，内毒素测定，病毒的PCR分析和病毒中豆荚蛋白或ZB-1编码区的序列分析。通过放射标记病毒感染的HEK293细胞并监测蛋白表达，检测腺病毒重组蛋白的表达。

[0231]为监测蛋白合成，细胞用³⁵S-蛋氨酸和³⁵S-半胱氨酸标记6小时。HEK293细胞置于P60培养板中，4ml完全培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Media(DME)+10％热失活胎牛血清(FBS)+青霉素/链霉素(Penn/Strep)+2mM谷氨酰胺)中密度为7.5×10⁵细胞/板。24小时后，培养基用2ml含有MOI为20-100腺病毒的减少血清培养基(DME+2％FBS+Penn/Strep+谷氨酰胺)替代。板孵育2小时，然后补料3ml完全培养基再孵育24小时。第二天去除培养基，用2ml无血清、无蛋氨酸/半胱氨酸-DME替代。细胞培养1小时，然后去除培养基，用添加-³⁵S蛋氨酸和³⁵S-半胱氨酸的无血清-DME代替。细胞孵育15分钟，加入1ml含有蛋氨酸和半胱氨酸+2％FBS+抑肽酶(1∶100抑肽酶；Sigma-6279)的DME。细胞再培养4小时，之后收集2ml培养基，低速离心去除标记过程中可能已分离的细胞。澄清的培养基转移到含有大豆胰蛋白酶抑制剂(1mg/ml)和20μl苯甲磺酰氟(1mM)的干净管中。放射标记的条件培养基-2℃储存，为以后SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析之用。

实施例14.2：结果

[0232]如图11所示，ZB-1编码在人肾上腺表达的新型分泌蛋白。ZB-1似乎是人豆荚蛋白的剪接变体，与人豆荚蛋白有100％一致性，除了所述57个氨基酸残基缺失(相当于豆荚蛋白的氨基酸341-397)。ZB-1是在用超表达ZB-1的腺病毒感染的HEK293细胞培养物培养基中发现的分泌蛋白(数据未显示)。

序列表

<110>Wyeth

<120>EXPRESSION OF THE CYSTEINE PROTEASE LEGUMAIN IN VASCULAR AND

     INFLAMMATORY DISEASES

<130>01997.056000

<150>US 60/808,381

<151>2006-05-25

<150>US 60/837,604

<151>2006-08-15

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2166

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(327)..(1628)

<400>1

gcacagtggc ccttaagcga ggagcggcgg cgcccgcagc aatcacagca gtgccgacgt    60

cgtgggtgtt tggtgtgagg ctgcgagccg ccgcgagttc tcacggtccc gccggcgcca    120

ccaccgcggt cactcaccgc cgccgccgcc accactgcca ccacggtcgc ctgccacagg    180

gtcttactct gttgcccagg ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaacctct    240

gcctcccggg ttcaagcaat tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg attacaggtg    300

tctgcaattg aactccaagg tgcaga atg gtt tgg aaa gta gct gta ttc ctc     353

                             Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu

                             1               5

agt gtg gcc ctg ggc att ggt gcc gtt cct ata gat gat cct gaa gat      401

Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp

10                  15                  20                  25

gga ggc aag cac tgg gtg gtg atc gtg gca ggt tca aat ggc tgg tat      449

Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr

                30                  35                  40

aat tat agg cac cag gca gac gcg tgc cat gcc tac cag atc att cac      497

Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His

            45                  50                  55

cgc aat ggg att cct gac gaa cag atc gtt gtg atg atg tac gat gac      545

Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp

        60                  65                  70

att gct tac tct gaa gac aat ccc act cca gga att gtg atc aac agg    593

Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg

    75                  80                  85

ccc aat ggc aca gat gtc tat cag gga gtc ccg aag gac tac act gga    641

Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly

90                  95                  100                 105

gag gat gtt acc cca caa aat ttc ctt gct gtg ttg aga ggc gat gca    689

Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala

                110                 115                 120

gaa gca gtg aag ggc ata gga tcc ggc aaa gtc ctg aag agt ggc ccc    737

Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro

            125                 130                 135

cag gat cac gtg ttc att tac ttc act gac cat gga tct act gga ata    785

Gln Asp His Val Phe Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile

        140                 145                 150

ctg gtt ttt ccc aat gaa gat ctt cat gta aag gac ctg aat gag acc    833

Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr

    155                 160                 165

atc cat tac atg tac aaa cac aaa atg tac cga aag atg gtg ttc tac    881

Ile His Tyr Met Tyr Lys His Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr

170                 175                 180                 185

att gaa gcc tgt gag tct ggg tcc atg atg aac cac ctg ccg gat aac    929

Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn

                190                 195                 200

atc aat gtt tat gca act act gct gcc aac ccc aga gag tcg tcc tac    977

Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr

            205                 210                 215

gcc tgt tac tat gat gag aag agg tcc acg tac ctg ggg gac tgg tac    1025

Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr

        220                 225                 230

agc gtc aac tgg atg gaa gat tcg gac gtg gaa gat ctg act aaa gag    1073

Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu

    235                 240                 245

acc ctg cac aag cag tac cac ctg gta aaa tcg cac acc aac acc agc    1121

Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser

250                 255                 260                 265

cac gtc atg cag tat gga aac aaa aca atc tcc acc atg aaa gtg atg    1169

His Val Met Gln Tyr Gly Asn Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met

                270                 275                 280

cag ttt cag ggt atg aaa cgc aaa gcc agt tct ccc gtc ccc cta cct    1217

Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro

            285                 290                 295

cca gtc aca cac ctt gac ctc acc ccc agc cct gat gtg cct ctc acc    1265

Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr

        300                 305                 310

atc atg aaa agg aaa ctg atg aac acc aat gat ctg gag gag tcc agg      1313

Ile Met Lys Arg Lys Leu Met Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg

    315                 320                 325

cag ctc acg gag gag atc cag cgg cat ctg gat gcc agg cac ctc att      1361

Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu Ile

330                 335                 340                 345

gag aag tca gtg cgt aag atc gtc tcc ttg ctg gca gcg tcc gag gct      1409

Glu Lys Ser Val Arg Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala

                350                 355                 360

gag gtg gag cag ctc ctg tcc gag aga gcc ccg ctc acg ggg cac agc      1457

Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser

            365                 370                 375

tgc tac cca gag gcc ctg ctg cac ttc cgg acc cac tgc ttc aac tgg      1505

Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp

        380                 385                 390

cac tcc ccc acg tac gag tat gcg ttg aga cat ttg tac gtg ctg gtc      1553

His Ser Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val

    395                 400                 405

aac ctt tgt gag aag ccg tat ccg ctt cac agg ata aaa ttg tcc atg      1601

Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met

410                 415                 420                 425

gac cac gtg tgc ctt ggt cac tac tga agagctgcct cctggaagct            1648

Asp His Val Cys Leu Gly His Tyr

                430

tttccaagtg tgagcgcccc accgactgtg tgctgatcag agactggaga ggtggagtga    1708

gaagtctccg ctgctcgggc cctcctgggg agcccccgct ccagggctcg ctccaggacc    1768

ttcttcacaa gatgacttgc tcgctgttac ctgcttcccc agtcttttct gaaaaactac    1828

aaattagggt gggaaaagct ctgtattgag aagggtcata tttgctttct aggaggtttg    1888

ttgttttgcc tgttagtttt gaggagcagg aagctcatgg gggcttctgt agcccctctc    1948

aaaaggagtc tttattctga gaatttgaag ctgaaacctc tttaaatctt cagaatgatt    2008

ttattgaaga gggccgcaag ccccaaatgg aaaactgttt ttagaaaata tgatgatttt    2068

tgattgcttt tgtatttaat tctgcaggtg ttcaagtctt aaaaaataaa gatttataac    2128

agaacccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                            2166

<210>2

<211>433

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr

    130                 135                 140

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg

        275                 280                 285

Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met

305                 310                 315                 320

Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln

                325                 330                 335

Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu Ile Glu Lys Ser Val Arg Lys Ile

            340                 345                 350

Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser

        355                 360                 365

Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu

    370                 375                 380

His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Pro Thr Tyr Glu Tyr

385                 390                 395                 400

Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr

                405                 410                 415

Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met Asp His Val Cys Leu Gly His

            420                 425                 430

Tyr

<210>3

<211>2048

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(209)..(1510)

<400>3

gcacagtggc ccttaagcga ggagcggcgg cgcccgcagc aatcacagca gtgccgacgt  60

cgtgggtgtt tggtgtgagg ctgcgagccg ccgcgagttc tcacggtccc gccggcgcca  120

ccaccgcggt cactcaccgc cgccgccgcc accactgcca ccacggtcgc ctgccacagg  180

tgtctgcaat tgaactccaa ggtgcaga atg gtt tgg aaa gta gct gta ttc     232

                               Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe

                               1               5

ctc agt gtg gcc ctg ggc att ggt gcc gtt cct ata gat gat cct gaa    280

Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu

    10                  15                  20

gat gga ggc aag cac tgg gtg gtg atc gtg gca ggt tca aat ggc tgg    328

Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp

25                  30                  35                  40

tat aat tat agg cac cag gca gac gcg tgc cat gcc tac cag atc att    376

Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile

                45                  50                  55

cac cgc aat ggg att cct gac gaa cag atc gtt gtg atg atg tac gat    424

His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp

            60                  65                  70

gac att gct tac tct gaa gac aat ccc act cca gga att gtg atc aac    472

Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn

        75                  80                  85

agg ccc aat ggc aca gat gtc tat cag gga gtc ccg aag gac tac act    520

Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr

    90                  95                  100

gga gag gat gtt acc cca caa aat ttc ctt gct gtg ttg aga ggc gat    568

Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp

105                 110                 115                 120

gca gaa gca gtg aag ggc ata gga tcc ggc aaa gtc ctg aag agt ggc    616

Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly

                125                 130                 135

ccc cag gat cac gtg ttc att tac ttc act gac cat gga tct act gga    664

Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly

            140                 145                 150

ata ctg gtt ttt ccc aat gaa gat ctt cat gta aag gac ctg aat gag    712

Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu

        155                 160                 165

acc atc cat tac atg tac aaa cac aaa atg tac cga aag atg gtg ttc    760

Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe

    170                 175                 180

tac att gaa gcc tgt gag tct ggg tcc atg atg aac cac ctg ccg gat    808

Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp

185                 190                 195                 200

aac atc aat gtt tat gca act act gct gcc aac ccc aga gag tcg tcc    856

Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser

                205                 210                 215

tac gcc tgt tac tat gat gag aag agg tcc acg tac ctg ggg gac tgg    904

Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp

            220                 225                 230

tac agc gtc aac tgg atg gaa gat tcg gac gtg gaa gat ctg act aaa    952

Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys

        235                 240                 245

gag acc ctg cac aag cag tac cac ctg gta aaa tcg cac acc aac acc    1000

Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr

    250                 255                 260

agc cac gtc atg cag tat gga aac aaa aca atc tcc acc atg aaa gtg    1048

Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val

265                 270                 275                 280

atg cag ttt cag ggt atg aaa cgc aaa gcc agt tct ccc gtc ccc cta    1096

Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu

                285                 290                 295

cct cca gtc aca cac ctt gac ctc acc ccc agc cct gat gtg cct ctc    1144

Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu

            300                 305                 310

acc atc atg aaa agg aaa ctg atg aac acc aat gat ctg gag gag tcc    1192

Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser

        315                 320                 325

agg cag ctc acg gag gag atc cag cgg cat ctg gat gcc agg cac ctc    1240

Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu

    330                 335                 340

att gag aag tca gtg cgt aag atc gtc tcc ttg ctg gca gcg tcc gag    1288

Ile Glu Lys Ser Val Arg Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu

345                 350                 355                 360

gct gag gtg gag cag ctc ctg tcc gag aga gcc ccg ctc acg ggg cac    1336

Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His

                365                 370                 375

agc tgc tac cca gag gcc ctg ctg cac ttc cgg acc cac tgc ttc aac    1384

Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn

            380                 385                 390

tgg cac tcc ccc acg tac gag tat gcg ttg aga cat ttg tac gtg ctg    1432

Trp His Ser Pro Thr Tyr Glu Tyr Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu

        395                 400                 405

gtc aac ctt tgt gag aag ccg tat ccg ctt cac agg ata aaa ttg tcc    1480

Val Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser

    410                 415                 420

atg gac cac gtg tgc ctt ggt cac tac tga agagctgcct cctggaagct        1530

Met Asp His Val Cys Leu Gly His Tyr

425                 430

tttccaagtg tgagcgcccc accgactgtg tgctgatcag agactggaga ggtggagtga    1590

gaagtctccg ctgctcgggc cctcctgggg agcccccgct ccagggctcg ctccaggacc    1650

ttcttcacaa gatgacttgc tcgctgttac ctgcttcccc agtcttttct gaaaaactac    1710

aaattagggt gggaaaagct ctgtattgag aagggtcata tttgctttct aggaggtttg    1770

ttgttttgcc tgttagtttt gaggagcagg aagctcatgg gggcttctgt agcccctctc    1830

aaaaggagtc tttattctga gaatttgaag ctgaaacctc tttaaatctt cagaatgatt    1890

ttattgaaga gggccgcaag ccccaaatgg aaaactgttt ttagaaaata tgatgatttt    1950

tgattgcttt tgtatttaat tctgcaggtg ttcaagtctt aaaaaataaa gatttataac    2010

agaacccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                            2048

<210>4

<211>433

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr

    130                 135                 140

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg

        275                 280                 285

Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met

305                 310                 315                 320

Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln

                325                 330                 335

Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu Ile Glu Lys Ser Val Arg Lys Ile

            340                 345                 350

Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser

        355                 360                 365

Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu

    370                 375                 380

His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Pro Thr Tyr Glu Tyr

385                 390                 395                 400

Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr

                405                 410                 415

Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met Asp His Val Cys Leu Gly His

            420                 425                 430

Tyr

<210>5

<211>1889

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220>

<221>CDS

<222>(95)..(1402)

<400>5

gctctgagtc tgcgcgacgc ccggaattcc cacggttctg cagtcaccgc ggcgatcacc    60

cgcccagtct tctgtagcgg acacggggtg caga atg acc tgg aga gtg gct gtg    115

                                      Met Thr Trp Arg Val Ala Val

                                      1               5

ctt ctc agc ctg gtg ctg ggt gct ggt gcc gtt ccc gtc ggt gtg gac      163

Leu Leu Ser Leu Val Leu Gly Ala Gly Ala Val Pro Val Gly Val Asp

        10                  15                  20

gat ccc gag gat gga ggc aag cac tgg gtg gtg att gtg gcg ggc tcc      211

Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile Val Ala Gly Ser

    25                  30                  35

aat ggc tgg tat aat tac cga cac cag gca gac gca tgc cac gcc tac      259

Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr

40                  45                  50                  55

cag atc atc cac cgg aac ggg att cct gac gag cag atc ata gtg atg      307

Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln Ile Ile Val Met

                60                  65                  70

atg tat gac gac att gcc aac tct gaa gaa aac cct acc cca ggt gtt    355

Met Tyr Asp Asp Ile Ala Asn Ser Glu Glu Asn Pro Thr Pro Gly Val

            75                  80                  85

gtg atc aac cga cct aac ggc aca gat gta tac aag gga gtc ctg aag    403

Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr Lys Gly Val Leu Lys

       90                  95                  100

gac tac acc gga gag gat gtg act cca gag aat ttc ctc gcc gtg ctg    451

Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Glu Asn Phe Leu Ala Val Leu

    105                 110                 115

aga ggt gac gca gaa gct gtg aag ggc aaa ggg tct gga aaa gtc ttg    499

Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Lys Gly Ser Gly Lys Val Leu

120                 125                 130                 135

aag agt ggc ccc cga gat cat gtc ttc att tac ttc acc gac cac gga    547

Lys Ser Gly Pro Arg Asp His Val Phe Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly

                140                 145                 150

gcc acc ggg atc ctg gtg ttt cct aat gat gat ctt cat gtc aag gac    595

Ala Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Asp Asp Leu His Val Lys Asp

            155                 160                 165

ctg aat aag act att cgc tac atg tat gaa cac aaa atg tac cag aag    643

Leu Asn Lys Thr Ile Arg Tyr Met Tyr Glu His Lys Met Tyr Gln Lys

        170                 175                 180

atg gtg ttc tac att gaa gct tgt gag tct ggc tcc atg atg aac cac    691

Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Met Met Asn His

    185                 190                 195

ctg ccc gac gac atc aac gtt tat gca act act gcg gcc aac ccc aag    739

Leu Pro Asp Asp Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala Ala Asn Pro Lys

200                 205                 210                 215

gag tca tct tat gcc tgc tac tac gac gag gag agg ggc act tac ctg    787

Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Glu Arg Gly Thr Tyr Leu

                220                 225                 230

ggt gac tgg tac agc gtc aac tgg atg gaa gac tcc gat gtg gag gac    835

Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp

            235                 240                 245

ctg acc aaa gag acc ctt cac aag cag tac cac ctg gtc aag tcc cac    883

Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu Val Lys Ser His

        250                 255                 260

acc aac acc agc cat gtc atg caa tat ggg aac aaa tct atc tct acc    931

Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn Lys Ser Ile Ser Thr

    265                 270                 275

atg aaa gtg atg cag ttt cag gga atg aag cac aga gcc agt tcc ccc    979

Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys His Arg Ala Ser Ser Pro

280                 285                 290                 295

atc tcc ctg cct ccg gtc aca cac ctt gac ctc acc ccc agc cct gac    1027

Ile Ser Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp

                300                 305                 310

gtg ccc ctg acc atc ttg aag agg aag ctg ctg aga acc aac gac gtg      1075

Val Pro Leu Thr Ile Leu Lys Arg Lys Leu Leu Arg Thr Asn Asp Val

            315                 320                 325

aag gaa tcc cag aat ctc att ggg cag atc cag caa ttt ctg gat gcc      1123

Lys Glu Ser Gln Asn Leu Ile Gly Gln Ile Gln Gln Phe Leu Asp Ala

        330                 335                 340

agg cac gtc att gag aag tct gtg cac aag atc gtt tcc ctg ctg gcg      1171

Arg His Val Ile Glu Lys Ser Val His Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala

    345                 350                 355

gga ttt ggg gaa act gct gag aga cat ctg tca gag agg acc atg ctc      1219

Gly Phe Gly Glu Thr Ala Glu Arg His Leu Ser Glu Arg Thr Met Leu

360                 365                 370                 375

aca gca cat gac tgc tac cag gag gct gta acc cac ttc cgc aca cac      1267

Thr Ala His Asp Cys Tyr Gln Glu Ala Val Thr His Phe Arg Thr His

                380                 385                 390

tgc ttt aac tgg cac tct gtc acg tac gag cat gcc ttg cgg tac ttg      1315

Cys Phe Asn Trp His Ser Val Thr Tyr Glu His Ala Leu Arg Tyr Leu

            395                 400                 405

tat gtg ctg gcc aat ctc tgt gag gca cca tat ccg att gac agg ata      1363

Tyr Val Leu Ala Asn Leu Cys Glu Ala Pro Tyr Pro Ile Asp Arg Ile

        410                 415                 420

gag atg gcc atg gac aaa gtg tgt ctt agt cac tac tga acagctcgct       1412

Glu Met Ala Met Asp Lys Val Cys Leu Ser His Tyr

    425                 430                 435

tcccaatgag tgagcacagt ccactggaat atgaaccaac cagagactga aagggcggac    1472

cagaggcagc acccgcgccc ctggccccca ggaatactgc ccgcccaccc cagggcttgc    1532

tttttgaaga tacctgctta ctaagaagcc agtttgggtg ggtaaagctc tctggaagaa    1592

ggaactttgc ttcttaggag tttttttgtt tgtttgtttt ggtttgtttt gttgtccatt    1652

agctttcaag agcaaattcc ccgcggcttc tctagccagg gaaggaatcg tctgagaaat    1712

tcaaagctga aacctcttgc cgtcttcaca gtgatttcac tgaagaagag ggtggaaagc    1772

aagcccctat gggagaatta tttttagaat tatataattt ttgattgctt ttatatttta    1832

ttctgtaata atggatgttt taaaacaaat aagtgaagtg aaaaaaaaaa aaaaaaa       1889

<210>6

<211>435

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

Met Thr Trp Arg Val Ala Val Leu Leu Ser Leu Val Leu Gly Ala Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Val Gly Val Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp

            20                  25                  30

Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln

        35                  40                  45

Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro

    50                  55                  60

Asp Glu Gln Ile Ile Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Asn Ser Glu

65                  70                  75                  80

Glu Asn Pro Thr Pro Gly Val Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp

                85                  90                  95

Val Tyr Lys Gly Val Leu Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro

            100                 105                 110

Glu Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Arg Asp His Val Phe

    130                 135                 140

Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly Ala Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn

145                 150                 155                 160

Asp Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Lys Thr Ile Arg Tyr Met Tyr

                165                 170                 175

Glu His Lys Met Tyr Gln Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu

            180                 185                 190

Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asp Ile Asn Val Tyr Ala

        195                 200                 205

Thr Thr Ala Ala Asn Pro Lys Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp

    210                 215                 220

Glu Glu Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met

225                 230                 235                 240

Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln

                245                 250                 255

Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr

            260                 265                 270

Gly Asn Lys Ser Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met

        275                 280                 285

Lys His Arg Ala Ser Ser Pro Ile Ser Leu Pro Pro Val Thr His Leu

    290                 295                 300

Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Leu Lys Arg Lys

305                 310                 315                 320

Leu Leu Arg Thr Asn Asp Val Lys Glu Ser Gln Asn Leu Ile Gly Gln

                325                 330                 335

Ile Gln Gln Phe Leu Asp Ala Arg His Val Ile Glu Lys Ser Val His

            340                 345                 350

Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ala Glu Arg His

        355                 360                 365

Leu Ser Glu Arg Thr Met Leu Thr Ala His Asp Cys Tyr Gln Glu Ala

    370                 375                 380

Val Thr His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Val Thr Tyr

385                 390                 395                 400

Glu His Ala Leu Arg Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Asn Leu Cys Glu Ala

                405                 410                 415

Pro Tyr Pro Ile Asp Arg Ile Glu Met Ala Met Asp Lys Val Cys Leu

            420                 425                 430

Ser His Tyr

        435

<210>7

<211>1034

<212>DNA

<213>黑猩猩(Pan troglodytes)

<220>

<221>CDS

<222>(192)..(1034)

<400>7

cgaggagcgg cggcgcccgc agcaatcaca gcagtgcggc cgtcgtgggt gtttggtgtg    60

aggctgcgcg ccgccgcgag ttctcacggt cccgccggcg ccaccaccgc ggtcactcac    120

tgccgccgcc gccaccactg ccaccacggt cgcctgccac aggtttctgc aattgaactc    180

caaggtgcag a atg gtt tgg aaa gta gct gta ttc ctc agt gtg gcc ctg     230

             Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu

             1               5                   10

ggc att ggt gcc gtt cct ata gat gat cct gaa gat gga ggc aag cac      278

Gly Ile Gly Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His

    15                  20                  25

tgg gtg gtg atc gtg gcg ggt tca aat ggc tgg tat aat tat agg cac      326

Trp Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His

30                  35                  40                  45

cag gca gac gcg tgc cat gcc tac cag atc att cac cgc aat ggg att      374

Gln Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile

                50                  55                  60

cct gac gaa cag atc gtt gtg atg atg tac gat gac atc gct tac tct      422

Pro Asp Glu Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser

            65                  70                  75

gaa gac aat ccc act cca gga att gtg atc aac agg ccc aat ggc aca      470

Glu Asp Asn Pro Thr Pro Gly ILe Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr

        80                  85                  90

gat gtc tat cag gga gtc ccg aag gac tac acc gga gag gat gtt acc      518

Asp Val Tyr Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr

    95                  100                 105

cca caa aat ttc ctt gct gtg ttg aga ggc gat gca gaa gca gtg aag      566

Pro Gln Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys

110                 115                 120                 125

ggc ata gga tcc ggc aaa gtc ctg aag agc ggc ccc cag gat cac gtg      614

Gly Ile Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val

                130                 135                 140

ttc att tac ttc act gac cat gga tct act gga ata ctg gtt ttt ccc      662

Phe Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro

            145                 150                 155

aat gaa gat ctt cat gta aag gac ctg aat gag acc atc cat tac atg      710

Asn Glu Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met

        160                 165                 170

tac aaa cac aaa atg tac cga aag atg gtg ttc tac att gaa gcc tgt      758

Tyr Lys His Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys

    175                 180                 185

gag tct ggg tcc atg atg aac cac ctg ccg gat aac atc aat gtt tat      806

Glu Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr

190                 195                 200                 205

gca act act gct gcc aac ccc aga gag tcg tcc tac gcc tgt tac tat    854

Ala Thr Thr Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr

                210                 215                 220

gat gag aag agg tcc acg tac ctg ggg gac tgg tac agc gtc aac tgg    902

Asp Glu Lys Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp

            225                 230                 235

atg gaa gac tcg gac gtg gaa gat ctg act aaa gag acc ctg cac aag    950

Met Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys

        240                 245                 250

cag tac cac ctg gta aaa tcg cac acc aac acc agc cac gtc atg cag    998

Gln Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln

    255                 260                 265

tat gga aac aaa aca atc tcc acc atg aaa ggg tag                    1034

Tyr Gly Asn Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Gly

270                 275                 280

<210>8

<211>280

<212>PRT

<213>黑猩猩(Pan troglodytes)

<400>8

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr

    130                 135                 140

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Gly

        275                 280

<210>9

<211>1610

<212>DNA

<213>猕猴(Macaca mulatta)

<220>

<221>CDS

<222>(330)..(1610)

<400>9

gcgcagtggc ccttaagcca ggagctgcgg cgcccgcagc aatcacagca gtggggccgt    60

cgtgggtggt tggtgtgagg ctgcgcgccg ccgcgagttc tcacggtccc gcaggcgcca    120

gcagcgcagt cactcaccgc cgccgccgcc gccaccactg ccaccacggt cgcctgccac    180

agggtctcac tgtgttaccc atgctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaacc    240

tctgcctcct gggttcaagc agttctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggattacag    300

gtttctgcag ttgaactcca aggtgcaga atg gtt tgg aaa gta gct gta ttt      353

                                Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe

                                1               5

ctc agt gtg acc ctg ggc att ggt gct gtt ccc ata gat gat cct gaa      401

Leu Ser Val Thr Leu Gly Ile Gly Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu

    10                  15                  20

gat gga ggc aag cac tgg gta gtg atc gtg gcg ggt tca aat ggc tgg      449

Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp

25                  30                  35                  40

tat aat tat agg cac cag gca gat gcg tgc cat gcc tac cag atc att      497

Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile

                45                  50                  55

cac cgg aat ggg att cct gac gag cag atc gtt gtg atg atg tat gac      545

His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp

            60                  65                  70

gac att gct tac tct gaa gat aat ccc act cca gga att gtg atc aac      593

Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn

        75                  80                  85

agg ccc aat ggc acg gat gtc tat cag gga gtc ccg aag gac tac act      641

Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr

    90                  95                  100

gga gag gat gtt acc cca caa aat ttc ctt gct gtg ttg aga ggc gat      689

Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp

105                 110                 115                 120

gca gaa gca gtg aag ggc atc gga tcc ggg aaa gtc ctg aag agc ggc      737

Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly

                125                 130                 135

ccc cag gat cac gtg ttc gtt tac ttc act gac cat gga tct act gga      785

Pro Gln Asp His Val Phe Val Tyr Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly

            140                 145                 150

ata ctg gtt ttt ccc aat gaa gat ctt cat gta aag gac ctg aat gag      833

Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu

        155                 160                 165

acc atc cat tac atg tac aaa cac aaa atg tac cga aag atg gtg ttc      881

Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe

    170                 175                 180

tac att gaa gcc tgt gag tct ggg tcc atg atg aac cac ctg ccg gat      929

Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp

185                 190                 195                 200

aac atc aat gtt tat gca act act gcc gcc aac ccc aga gag tcg tcc      977

Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser

                205                 210                 215

tac gcc tgt tac tat gat gag aag agg tcc aca tac ctg ggg gac tgg    1025

Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp

            220                 225                 230

tac agc gtc aac tgg atg gaa gac tcg gac gtg gaa gat ctg act aaa    1073

Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys

        235                 240                 245

gag acc ctg cac aag cag tac cac ctg gtg aaa tca cac acc aac acc    1121

Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr

    250                 255                 260

agc cac gtc atg cag tac gga aac aaa acg atc tcc acc atg aaa gtg    1169

Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val

265                 270                 275                 280

atg cag ttt cag ggt atg aag cac aaa gcc agt tct cct ctc tcc ctg    1217

Met Gln Phe Gln Gly Met Lys His Lys Ala Ser Ser Pro Leu Ser Leu

                285                 290                 295

cct cca gtc aca cac ctg gac ctc acc ccc agc cct gac gtg ccc ctc    1265

Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu

            300                 305                 310

acg atc atg aag agg aaa ctg atg aac acc aat gat ctg gag gag tcc    1313

Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser

        315                 320                 325

agg cag ctc acg gag gag atc cag cgg cat ctg gat gcc agg cac ctc    1361

Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu

    330                 335                 340

att gag aag tca gtg cac aag atc gtc tcc ttg ctg gca gcg tcc gag    1409

Ile Glu Lys Ser Val His Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu

345                 350                 355                 360

gct gag gtg gag cag ctc ctg tcc gag aga gcc ccg ctc aca ggg cac    1457

Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His

                365                 370                 375

agc tgc tac cca gag gcc ctg ctg cac ttc cgg acc cac tgc ttc aac    1505

Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn

            380                 385                 390

tgg cac tcc ccc acg gtg agc cgg cgg ggc tct ccc cac gtc tgg aat    1553

Trp His Ser Pro Thr Val Ser Arg Arg Gly Ser Pro His Val Trp Asn

        395                 400                 405

cca gaa gct gaa ttc ata ttg tcc ccc ggc agt cac act gga tgg aca    1601

Pro Glu Ala Glu Phe Ile Leu Ser Pro Gly Ser His Thr Gly Trp Thr

    410                 415                 420

act tta tag                                                        1610

Thr Leu

425

<210>10

<211>426

<212>PRT

<213>猕猴(Macaca mulatta)

<400>10

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Thr Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Val Tyr

    130                 135                 140

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys His

        275                 280                 285

Lys Ala Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met

305                 310                 315                 320

Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln

                325                 330                 335

Arg His Leu Asp Ala Arg His Leu Ile Glu Lys Ser Val His Lys Ile

            340                 345                 350

Val Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser

        355                 360                 365

Glu Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu

    370                 375                 380

His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Pro Thr Val Ser Arg

385                 390                 395                 400

Arg Gly Ser Pro His Val Trp Asn Pro Glu Ala Glu Phe Ile Leu Ser

                405                 410                 415

Pro Gly Ser His Thr Gly Trp Thr Thr Leu

            420                 425

<210>11

<211>1131

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1128)

<400>11

atg gtt tgg aaa gta gct gta ttc ctc agt gtg gcc ctg ggc att ggt    48

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

gcc gtt cct ata gat gat cct gaa gat gga ggc aag cac tgg gtg gtg    96

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

atc gtg gca ggt tca aat ggc tgg tat aat tat agg cac cag gca gac    144

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

gcg tgc cat gcc tac cag atc att cac cgc aat ggg att cct gac gaa    192

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

cag atc gtt gtg atg atg tac gat gac att gct tac tct gaa gac aat    240

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

ccc act cca gga att gtg atc aac agg ccc aat ggc aca gat gtc tat    288

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

cag gga gtc ccg aag gac tac act gga gag gat gtt acc cca caa aat    336

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

ttc ctt gct gtg ttg aga ggc gat gca gaa gca gtg aag ggc ata gga    384

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

tcc ggc asa gtc ctg aag agt ggc ccc cag gat cac gtg ttc att tac    432

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr

    130                 135                 140

ttc act gac cat gga tct act gga ata ctg gtt ttt ccc aat gaa gat    480

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

ctt cat gta aag gac ctg aat gag acc atc cat tac atg tac aaa cac    528

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

aaa atg tac cga aag atg gtg ttc tac att gaa gcc tgt gag tct ggg    576

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

tcc atg atg aac cac ctg ccg gat aac atc aat gtt tat gca act act    624

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

gct gcc aac ccc aga gag tcg tcc tac gcc tgt tac tat gat gag aag    672

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

agg tcc acg tac ctg ggg gac tgg tac agc gtc aac tgg atg gaa gac    720

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

tcg gac gtg gaa gat ctg act aaa gag acc ctg cac aag cag tac cac    768

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

ctg gta aaa tcg cac acc aac acc agc cac gtc atg cag tat gga aac    816

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

aaa aca atc tcc acc atg aaa gtg atg cag ttt cag ggt atg aaa cgc    864

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg

        275                 280                 285

aaa gcc agt tct ccc gtc ccc cta cct cca gtc aca cac ctt gac ctc    912

Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu

    290                 295                 300

acc ccc agc cct gat gtg cct ctc acc atc atg aaa agg aaa ctg atg    960

Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met

305                 310                 315                 320

aac acc aat gat ctg gag gag tcc agg cag ctc acg gag gag atc cag    1008

Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln

                325                 330                 335

cgg cat ctg gat tac gag tat gcg ttg aga cat ttg tac gtg ctg gtc    1056

Arg His Leu Asp Tyr Glu Tyr Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val

            340                 345                 350

aac ctt tgt gag aag ccg tat ccg ctt cac agg ata aaa ttg tcc atg    1104

Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met

        355                 360                 365

gac cac gtg tgc ctt ggt cac tac tga                               1131

Asp His Val Cys Leu Gly His Tyr

    370                 375

<210>12

<211>376

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>12

Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly

1               5                   10                  15

Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val

            20                  25                  30

Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp

        35                  40                  45

Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu

    50                  55                  60

Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn

65                  70                  75                  80

Pro Thr Pro Gly Ile Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr

                85                  90                  95

Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn

            100                 105                 110

Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr

    130                 135                 140

Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp

145                 150                 155                 160

Leu His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His

                165                 170                 175

Lys Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly

            180                 185                 190

Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp AsnIle Asn Val Tyr Ala Thr Thr

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys

    210                 215                 220

Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp

225                 230                 235                 240

Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His

                245                 250                 255

Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn

            260                 265                 270

Lys Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg

        275                 280                 285

Lys Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Met Lys Arg Lys Leu Met

305                 310                 315                 320

Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln

                325                 330                 335

Arg His Leu Asp Tyr Glu Tyr Ala Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val

            340                 345                 350

Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr Pro Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met

        355                 360                 365

Asp His Val Cys Leu Gly His Tyr

    370                 375

<210>13

<211>21

<212>PRT

<213>蜜蜂(Apis mellifera)

<400>13

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1               5                   10                  15

Ser Tyr Ile Tyr Ala

            20

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>定量实时PCR的正向引物

<400>14

ccaggaggct gtaacccact t                                          21

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>定量实时PCR的反向引物

<400>15

gcaaggcatg ctcgtacgt                                                 19

<210>16

<211>49

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>生成鼠豆荚蛋白正义核糖核酸探针的用于原位杂交的正向引物

<400>16

gactgataat acgactcact atagggcgaa caccaacacc agccatgtc                49

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>生成鼠豆荚蛋白正义核糖核酸探针的用于原位杂交的反向引物

<400>17

ctctcagcag tttccccaaa tc                                             22

<210>18

<211>313

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>18

acaccaacac cagccatgtc atgcaatatg ggaacaaatc tatctctacc atgaaagtga    60

tgcagtttca gggaatgaag cacagagcca gttcccccat ctccctgcct ccggtcacac    120

accttgacct cacccccagc cctgacgtgc ccctgaccat cttgaagagg aagctgctga    180

gaaccaacga cgtgaaggaa tcccagaatc tcattgggca gatccagcaa tttctggatg    240

ccaggcacgt cattgagaag tctgtgcaca agatcgtttc cctgctggcg ggatttgggg    300

aaactgctga gag                                                       313

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>生成鼠豆荚蛋白反义核糖核酸探针的用于原位杂交的正向引物

<400>19

acaccaacac cagccatgtc                                                20

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>生成鼠豆荚蛋白反义核糖核酸探针的用于原位杂交的反向引物

<400>20

gactgataat acgactcact atagggcgac tctcagcagt ttccccaaat c             51

<210>21

<211>313

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>21

ctctcagcag tttccccaaa tcccgccagc agggaaacga tcttgtgcac agacttctca    60

atgacgtgcc tggcatccag aaattgctgg atctgcccaa tgagattctg ggattccttc    120

acgtcgttgg ttctcagcag cttcctcttc aagatggtca ggggcacgtc agggctgggg    180

gtgaggtcaa ggtgtgtgac cggaggcagg gagatggggg aactggctct gtgcttcatt    240

ccctgaaact gcatcacttt catggtagag atagatttgt tcccatattg catgacatgg    300

ctggtgttgg tgt                                                       313

Claims (20)

1.多核苷酸，其包含SEQ ID NO：11的核酸序列。

2.多肽，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，SEQ ID NO：12的氨基酸21至323，或SEQ ID NO：12的氨基酸25至323。

3.特异性结合哺乳动物ZB-1多肽或哺乳动物ZB-1多肽片段的抗体或其抗原结合片段。

4.权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述哺乳动物ZB-1多肽或所述哺乳动物ZB-1多肽的片段来自人。

5.豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂在制备用于治疗、减轻或预防血管疾病或炎性疾病的方法的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

6.权利要求5所述的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂的用途，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗体及其抗原结合片段。

7.治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包含将治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于所述哺乳动物。

8.权利要求7所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗体及其抗原结合片段。

9.治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法，其包含将哺乳动物细胞或细胞群与治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂接触。

10.权利要求9所述的方法，其中所述细胞或细胞群包含巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞，或单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和/或泡沫细胞的混合物。

11.权利要求10所述的方法，其中所述细胞或细胞群分泌豆荚蛋白和/或ZB-1。

12.降低哺乳动物豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的方法，其包含将足以降低哺乳动物豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。

13.监测患者血管疾病或炎性疾病治疗过程的方法，其包含：

(a)测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平；

(b)将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于患者；以及

(c)施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂后，测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，

其中与施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂前患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂后患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平更低，表明患者血管疾病或炎症疾病的治疗有积极效果。

14.抑制哺乳动物细胞迁移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。

15.权利要求14所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗体及其抗原结合片段。

16.促进哺乳动物伤口愈合的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。

17.抑制哺乳动物血管生成的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。

18.权利要求17所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗体及其抗原结合片段。

19.抑制哺乳动物内皮细胞增殖的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。

20.抑制哺乳肿瘤转移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。

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