WO2019022476A2 - 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물 - Google Patents

장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물 Download PDF

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임아랑
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한국 한의학 연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling longevity ( Allomyrina dichotoma
  • the present invention relates to a composition for improving skin wrinkles or moisturizing skin.
  • Skin is an organ that is always in contact with the outside environment. It protects the body from external physical damage and chemical substances, prevents bacteria, fungi, viruses from invading the skin, and acts as a protection barrier against moisture loss.
  • Skin structure consists of three layers: epidermis, dermis, and subcutaneous fat.
  • the epidermis is the thinnest of the three layers, which plays an important role in moisturizing and protecting the skin.
  • the skin is elastic and softened by the water present in the stratum corneum of the epidermis, and it is known that the water content of 10% or more is essential for the elasticity of the stratum corneum to be maintained (OK Jacobi, Proc. , 22).
  • long-lived beetle larvae long beetle ( Allomyrina dichotoma ) is an insect belonging to Coleoptera and Family Dynastidae.
  • Korean Patent No. 1702046 a composition for liver protection and anticancer comprising Longevity beetle larvae or a fraction thereof as an active ingredient
  • Korean Patent No. 1533600 Discloses a method for producing a long-beetle larvae extract having an anti-obesity effect and an anti-obesity composition containing the same, but the composition for improving skin wrinkles or skin moisturizing composition containing the extract of the present invention as an active ingredient has been disclosed none.
  • the present invention provides a composition for improving skin wrinkles or skin moisturizing, which comprises an extract of Ganoderma lucidum as an active ingredient, wherein the effective ingredient is a collagen It was confirmed that the expression of MMP-1 (MMP-1) was decreased and the content of hyaluronic acid was increased to prevent skin moisturizing function and skin barrier damage. An animal model was used to reduce the transdermal water loss , An increase in skin moisturizing amount, an expression amount of MMP-1 and MMP-9, and an expression amount of a protein related to wrinkle improvement, thereby completing the present invention.
  • MMP-1 MMP-1
  • MMP-9 an expression amount of a protein related to wrinkle improvement
  • the present invention provides a health functional food composition for improving skin wrinkles or skin moisturizing, comprising an extract of Ganoderma lucidum as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin wrinkles containing an extract of Ganoderma lucidum as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for improving skin wrinkles or skin moisturizing composition containing an extract of Ganoderma lucidum or a compound isolated therefrom as an active ingredient.
  • the active ingredient of the present invention has little cytotoxicity, and is effective for improving skin wrinkles and skin moisturizing It is. Therefore, the composition of the present invention can be used as a health functional food for skin wrinkle improvement or skin moisturizing; And a medicament for preventing or treating skin wrinkles.
  • FIG. 1 shows the MTS assay results of confirming the cell viability (%) of HaCaT cells according to the treatment (10, 50, 100, 200 and 250 ⁇ g / ml)
  • FIG. 2 shows the cytoprotective effect of HaCaT cells of the present invention on the cell damage caused by UVB irradiation.
  • Each sample was incubated in HaCaT cells (human keratinocyte line) for 24 hours at concentrations of 10, 50 , 100 and 200 ⁇ ⁇ / ml), irradiated with ultraviolet light (UV Crosslinker, UltR5 Lum) for 30 minutes, and subjected to MTS assay.
  • HaCaT cells human keratinocyte line
  • UV Crosslinker UltR5 Lum
  • FIG. 3 shows the results of confirming the change in the expression level of MMP-1 according to the treatment with the longevity extract of the present invention.
  • # Indicates that the amount of MMP-1 expression in the UVB irradiated group was statistically significantly increased compared with that in the control group, which means that p ⁇ 0.05, * indicates that the amount of MMP-1 expressed in the UVB- Of the total MMP-1 expression level, which means that p ⁇ 0.05.
  • FIG. 4 shows the results of analysis of changes in the content of hyaluronic acid (HA) according to the UV irradiation and the treatment according to the concentration of the extract of the present invention.
  • Control is a normal group that does not treat anything
  • UVB is a control group in which only the ultraviolet rays are irradiated without treating the gangrene extract of the present invention.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the transdermal water loss (TEWL) of the group treated with the gangrene extract of the present invention.
  • TEWL transdermal water loss
  • Veh is a group irradiated with ultraviolet rays to induce transdermal water loss
  • JSA is a group administered with ultraviolet irradiation (UVB) and the longevity extract of the present invention.
  • #### indicates a statistically significant increase in transdermal water loss in the ultraviolet irradiated group compared to the normal group, p ⁇ 0.0001, and **** indicates that the transdermal water loss Was significantly lowered, p ⁇ 0.0001.
  • Fig. 6 shows the result of confirming the skin moisture content of the group administered with the extract of the present invention.
  • a normal group not irradiated with ultraviolet rays Veh is a group irradiated with ultraviolet rays
  • JSA is a group administered with ultraviolet irradiation and the present invention.
  • ### indicates a statistically significant decrease in the skin moisture content of the ultraviolet irradiated group compared to the normal group, p ⁇ 0.001, and * indicates that the skin moisture content of the group administered with the lengthening extract of the present invention was statistically significantly increased , P ⁇ 0.05.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the effect of improving the wrinkles by H & E staining of the tissues collected from the group of hairless mice to which the present invention was administered.
  • Normal is a normal group not irradiated with ultraviolet rays
  • Vehicle is a group irradiated with ultraviolet rays
  • JSA is a group administered with ultraviolet irradiation and the longevity extract of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the wrinkle-improving effect of Masson's trichrome staining of the tissues collected from the group of hairless mice to which the present invention was administered.
  • Normal is a normal group not irradiated with ultraviolet rays
  • Vehicle is a group irradiated with ultraviolet rays
  • JSA is a group administered with ultraviolet irradiation and the longevity extract of the present invention.
  • FIG. 9 shows the results of confirming changes in the expression levels of MMP-1 and MMP-9 proteins according to the administration of the present invention.
  • Veh is a group irradiated with ultraviolet rays
  • JSA is a group administered ultraviolet light (UVB) and the longevity extract of the present invention.
  • #### indicates that the expression levels of MMP-1 and MMP-9 proteins in the ultraviolet irradiation group were statistically significantly increased compared to the normal group, p ⁇ 0.0001, The expression level of MMP-1 and MMP-9 protein in the group treated with the extract of L. japonica was statistically significantly decreased, p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 10 shows the results of confirming changes in the expression levels of pERK, pMEK, pJNK and pp38 protein according to the present invention.
  • the present invention relates to a health functional food composition for improving skin wrinkles or skin moisturizing, comprising an extract of Ganoderma lucidum as an active ingredient.
  • the longevity extract can be prepared by a method including, but not limited to, the following steps:
  • step (3) The step of extracting the filtered extract of step (2) by concentration under reduced pressure and drying.
  • the extraction solvent is preferably selected from water, a C 1 -C 4 lower alcohol or a mixture thereof, more preferably ethanol, even more preferably 70% (v / v) ethanol But is not limited thereto.
  • any conventional method known in the art such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction may be used.
  • the extraction solvent is preferably added in an amount of 1 to 20 times the dry weight, more preferably 5 to 15 times.
  • the extraction temperature is preferably 4 to 50 DEG C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 0.5 to 10 hours, more preferably 0.5 to 5 hours, most preferably 1 hour, but not always limited thereto.
  • the drying is preferably performed under reduced pressure, vacuum drying, boiling, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.
  • wrinkle formation is caused by reduction of collagen, and reduction of the collagen may be caused by excessive oxidative stress or ultraviolet irradiation.
  • the longevity extract reduces the expression levels of MMP-1 and MMP-9 proteins and can increase the content of hyaluronic acid.
  • the health functional food composition of the present invention When used as a food additive, the health functional food composition may be added as it is, or may be used together with other food or food ingredients, and suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably used depending on the purpose of use (prevention or improvement).
  • the health functional food composition of the present invention is added in an amount of not more than 15 parts by weight, preferably not more than 10 parts by weight based on the raw material, when the food or beverage is produced.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount of more than the above range.
  • the kind of the health functional food There is no particular limitation on the kind of the health functional food.
  • foods to which the health functional food composition can be added include meat products, sausages, breads, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen noodles, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health foods in a conventional sense.
  • the health functional food composition of the present invention can be produced as a food, particularly a functional food.
  • the functional food of the present invention includes components that are ordinarily added in food production, and includes, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, and seasonings.
  • the active ingredient when it is made of a drink, it may contain, in addition to the active ingredient, a natural carbohydrate or a flavoring agent as an additional ingredient.
  • the natural carbohydrate may be selected from the group consisting of monosaccharides (e.g., glucose, fructose, etc.), disaccharides (e.g., maltose, sucrose, etc.), oligosaccharides, polysaccharides (e.g., dextrin, cyclodextrin, For example, xylitol, sorbitol, erythritol, etc.).
  • the flavoring agent may be a natural flavoring agent (e.g., tau Martin, stevia extract, etc.) and a synthetic flavoring agent (e.g., saccharin, aspartame, etc.).
  • the above health functional food composition it is also possible to use various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acids and salts thereof, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, A carbonating agent used in beverages, and the like.
  • the ratio of the above-mentioned ingredients is not critical, it is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 part by weight based on 100 parts by weight of the health functional food composition of the present invention.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating skin wrinkles containing an extract of Ganoderma lucidum as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the pharmacologically acceptable carrier to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is one which is usually used at the time of formulation and includes saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, But are not limited to, sucrose, sucrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, Hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • an antioxidant in addition to the above components, an antioxidant, a buffer, a bacteriostatic agent, a diluent, a surfactant, a binder, a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent or a preservative may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and parenteral administration can be carried out by injection or application to skin.
  • a suitable dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prescribed by factors such as the formulation method, the administration method, the age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and responsiveness of the patient .
  • the longevity dried powder was refluxed for 3 hours using 70% ethanol.
  • a 70% ethanol extract was obtained and distilled under reduced pressure to prepare a long-lived ethanol extract.
  • Each sample was diluted by concentration for 24 hours in the cultured HaCaT cells (human keratinocyte line), and the cells were treated with MTS assay (CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) Cell viability was measured at 490 nm using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) At 490 nm by the method of MTS, Promega Co., Madison, Wis., USA) , CA, USA).
  • MTS assay CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) Cell viability was measured at 490 nm using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) At 490 nm by the method of MTS, Promega Co., Madison, Wis., USA) , CA, USA).
  • UV Crosslinker Ultra Lum
  • HaCaT cells were treated with dilution of each sample for 24 hours.
  • Cells were stained with CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3- (4,5- The cell viability was measured at 490 nm using a microplate reader (MTS, Promega Co., Madison, Wis., USA) Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).
  • HaCaT cells were plated on a 96-well plate and treated with the concentrations of (10, 50, 100, and 200 ⁇ g / ml) of the present invention. Then, ultraviolet (UV) irradiation was performed, and the supernatant of the culture was collected and centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was then subjected to fluorescent assay using an ELISA kit to quantitatively analyze the expression level of MMP-1.
  • UV ultraviolet
  • Hyaluronic acid ( Hyaluronic Acid; HA)
  • the HaCaT cells were treated with each sample for 24 hours and irradiated with ultraviolet light (UV Crosslinker, Ultra Lum) at 20 mJ / cm 2 for 30 minutes. Then, the supernatant of the culture was collected and placed in a hyaluronic acid ELISA kit (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). The reactants were subjected to an absorbance assay.
  • UV Crosslinker Ultra Lum
  • mice were purchased from 6-week-old male rats (male HR-1, hairless mice, Japan SLC, Inc.) from a central laboratory animal and adapted for 1 week before use. Animals in healthy state were used for the test by observing the general condition during the adaptation period. The breeding environment was maintained at a temperature of 23 ⁇ 3 ° C, a humidity of 50 ⁇ 5%, and a light period of 12 hours (07: 00-19: 00 / lighting time). During the test period, the experimental animals were fed 6 rats per group. Feeds were fed 5L79 (Charles river, USA) for mouse feed and free water for drinking water.
  • the samples were divided into the normal group (Nor), UV treatment group (UVB + Veh), ultraviolet irradiation group and UVB + JSA group. Samples were administered orally using a mouse mouse. The administration period was 12 weeks for a total of 5 days.
  • UVB lamp Mineralight UV Display lamp, UVP, USA
  • 1 to 4 weeks are 60 mJ / cm 2
  • 5 to 8 weeks are 90 mJ / cm 2
  • 9 to 12 weeks were irradiated with ultraviolet light for 12 weeks at a size of 120 mJ / cm 2 .
  • Ultraviolet radiation was measured by measuring the amount of ultraviolet light using a photometer (Delta OHM, Italy) and then adjusting the irradiation time.
  • the amount of transdermal water loss is the amount of water emanating from the skin. The higher the value, the lower the moisturizing function of the skin, indicating that the inherent barrier function of the skin is impaired.
  • Percutaneous water loss was calculated by area and time according to the amount of water evaporating from the skin using a tweeter (Tewameter, Courage & Khazaka, Germany) at constant temperature and humidity conditions (23 ° C, 50% relative humidity)
  • the amount of moisture evaporated (g / m 2 / hr) was read by a moisturizing electronic sensor, and the moisture content of the skin was measured by quantifying it.
  • Moisture content of the skin was measured using a Corneometer (Courage & Khazaka, Germany) at constant temperature and humidity conditions (23 ° C, 50% relative humidity).
  • the amount of water present in the epidermis of the skin was measured by measuring the degree of ion of water using a sensor, numerically calculating the amount of moisture, and then measuring the moisture content.
  • the skin tissues of each experimental group were extracted, fixed in 10% neutral formalin solution, washed, dehydrated, transparent, permeated, embedded with paraffin, Eosin) and Masson's trichome staining.
  • the thickness from the keratin layer to the epidermal basement membrane of H & E stained tissue was measured using a microscope.
  • the horny layer was alleviated compared to the ultraviolet irradiation group, and collagen was reduced by ultraviolet rays from the result of Masson's trichome staining, and the amount of collagen (Fig. 8).
  • MMP-1 or MMP-9 is known to increase by oxidative stress such as ultraviolet light, it is known to be associated with skin aging. Therefore, in order to measure the inhibitory effect of MMP-1 or MMP-9 induced from oxidative damage, MMP-1 or MMP-9 was measured using Quantikine ELISA pro MMP-1 or MMP-9 kit (R & D systems, Minneapolis, MN, USA).
  • both the expression amounts of MMP-1 and MMP-9 were increased by ultraviolet irradiation, compared with the cells not irradiated with ultraviolet light, and the expression level was decreased when the extract was administered (FIG. 9).
  • Proteins were extracted from 20 ⁇ 30 mg of skin tissue and pulverized to obtain proteins. The same amount of proteins were electrophoretically transferred to PVDF membrane, and reacted with antibodies to measure protein expression.
  • the expression levels of pERK, pMEK, pJNK and pp38 proteins which are known as proteins that play important roles in the wrinkle formation in the skin, were increased in the ultraviolet irradiation group compared to the unirradiated group, .
  • the expression levels of pERK, pMEK, pJNK and pp38 protein were decreased.

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Abstract

본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 장수애 추출물이 세포 독성이 거의 없으며, 피부 보습을 증진시킬 수 있는 히알루론산의 함량을 증진시킬 뿐만 아니라, 자외선에 의해 증가된 경피수분손실량을 감소시키고, 피부 보습량을 증가시키며, MMP-1 및 MMP-9의 발현량을 감소시키고, 주름개선 관련 단백질의 발현량을 조절하는 것이다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물 또는 피부 주름의 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

Description

장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물
본 발명은 장수애(Allomyrina dichotoma larva) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 주로 외부의 물리적 손상 및 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하며, 수분 손실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 피부의 구조를 보면 표피, 진피, 피하지방의 3개 층으로 구성되고 표피는 3개 층 중 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 한다. 특히 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의하여 피부가 탄력 있고 부드럽게 되는데, 각질층의 탄력이 유지되려면 10% 이상의 수분함유가 필수적인 것으로 알려져 있다(O. K. Jacobi, Proc. Sci. Sec. Toilet Goods Assoc. 1959, 31, 22).
최근 들어, 환경오염 등의 이유로 강한 자외선에 노출되는 경우가 많아졌고, 이에 의한 피부의 수분 손실이 증가하면서 피부 노화가 가속화되고, 피부의 손상에 의한 관련 질병의 발병률이 증가함에 따라, 자외선에 노출된 피부의 보습 유지 및 주름개선 효과를 오랫동안 지속시켜주는 조성물에 대한 요구는 점점 증가하는 추세이다.
한편, 장수애는 장수풍뎅이 유충으로, 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목(Coleoptera), 장수풍뎅이과(Family Dynastidae)에 속하는 곤충이다.
장수풍뎅이의 애벌레인 굼벵이가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 장수풍뎅이에서 분리한 단백질이 세균에 대해 강한 활성 억제를 보이며, 장수풍뎅이에서 추출한 렉틴은 강력한 항암능력을 보여 항암효과를 기대할 수 있다고 보고되었다. 또한 사염화탄소로 간독성을 유발한 쥐에 대해 간 보호 효과가 보고된 바 있으나, 장수풍뎅이나 그 유충이 민간요법에서 널리 이용되는데 비해 이의 생리기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이다.
지금까지 알려진 장수애(장수풍뎅이 유충) 관련 기술의 일례로는 한국등록특허 제1702046호에 장수풍뎅이 유충 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 항암용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1533600호에 항비만 효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물에 대해서는 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물을 제공하고, 상기 유효성분이 세포 외 기질과 기저막의 분해에 관여하는 콜라겐 분해 효소(MMPs; matrix metalloproteinases)인 MMP-1의 발현량을 감소시키는 것과, 피부 보습 기능과 피부 장벽 손상을 방지하는 히알루론산의 함량을 증진시키는 것을 확인하였고, 동물모델을 이용하여 경피수분손실량 감소, 피부보습량 증가, MMP-1 및 MMP-9의 발현량 및 주름개선 관련 단백질의 발현량을 조절하는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 장수애 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분은 세포 독성이 거의 없으며, 피부 주름 개선과 피부 보습에 효과가 있는 것이다. 따라서 본 발명의 조성물을 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품; 피부주름의 예방 또는 치료용 의약품;에 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 장수애 추출물의 농도별(10, 50, 100, 200 및 250㎍/㎖) 처리에 따른 HaCaT 세포의 세포생존률(%)을 확인한 MTS 어세이 결과이다.
도 2는 UVB 조사에 따른 세포 손상에 대하여, 본 발명의 장수애 추출물의 HaCaT 세포의 세포 보호 효과를 확인한 것으로, HaCaT 세포(사람 각질형성 세포주)에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별(10, 50, 100 및 200㎍/㎖)로 처리하고, 자외선(UV Crosslinker, UltR5 Lum)을 30분간 조사한 후, MTS 어세이를 수행한 결과이다. #은 UVB 조사군의 세포 생존률이 Control 군에 비해 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.05임을 의미하고, *은 장수애 추출물을 처리하고 UVB를 조사한 실험군의 세포 생존률이 UVB 조사군의 세포 생존률에 비교하여 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05임을 의미한다.
도 3은 본 발명의 장수애 추출물 처리에 따른 MMP-1의 발현량 변화를 확인한 결과이다. #은 UVB 조사군의 MMP-1 발현량이 Control 군에 비해 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.05임을 의미하고, *은 장수애 추출물을 처리하고 UVB를 조사한 실험군의 MMP-1 발현량이 UVB 조사군의 MMP-1 발현량에 비교하여 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.05임을 의미한다.
도 4는 UV 조사 및 본 발명의 장수애 추출물의 농도별 처리에 따른 히알루론산(HA) 함량 변화를 분석한 결과이다. Control은 아무것도 처리하지 않는 정상군이고, UVB는 본 발명의 장수애 추출물을 처리하지 않고, 자외선만을 조사한 대조군이다. #은 UVB 조사군의 히알루론산 함량이 Control 군에 비해 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.05임을 의미하고, *은 장수애 추출물을 처리하고 UVB를 조사한 실험군의 히알루론산 함량이 UVB 조사군에 비해 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05임을 의미한다.
도 5는 본 발명의 장수애 추출물 투여군의 경피수분손실량(TEWL)을 확인한 결과이다. Nor은 자외선을 조사하지 않은 정상군이고, Veh는 자외선을 조사하여 경피수분손실을 유도한 군이고, JSA는 자외선 조사(UVB) 및 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 군이다. ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 경피수분손실량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.0001이고, ****은 자외선 조사군에 비해 본 발명의 장수애 추출물 투여군의 경피수분손실량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 6은 본 발명의 장수애 추출물 투여군의 피부 수분량을 확인한 결과이다. Nor은 자외선을 조사하지 않은 정상군이고, Veh는 자외선 조사군이며, JSA는 자외선 조사 및 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 군이다. ###은 정상군에 비해 자외선 조사군의 피부 수분량이 통계적으로 유의미하게 감소했다는 것으로, p<0.001이고, *은 자외선 조사군에 비해 본 발명의 장수애 추출물 투여군의 피부 수분량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 7은 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 무모 생쥐군으로부터 채취한 조직의 H&E 염색을 통한 주름개선 효과를 확인한 결과이다. Normal은 자외선을 조사하지 않은 정상군이고, Vehicle은 자외선을 조사한 군이고, JSA는 자외선 조사 및 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 군이다.
도 8은 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 무모 생쥐군으로부터 채취한 조직의 Masson's trichrome 염색을 통한 주름개선 효과를 확인한 결과이다. Normal은 자외선을 조사하지 않은 정상군이고, Vehicle은 자외선을 조사한 군이고, JSA는 자외선 조사 및 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 군이다.
도 9는 본 발명의 장수애 추출물 투여에 따른 MMP-1 및 MMP-9 단백질의 발현량 변화를 확인한 결과이다. Nor은 자외선을 조사하지 않은 정상군이고, Veh는 자외선을 조사한 군이고, JSA는 자외선 조사(UVB) 및 본 발명의 장수애 추출물을 투여한 군이다. ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 MMP-1 및 MMP-9 단백질의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가했다는 것으로, p<0.0001이고, ****은 자외선 조사군에 비해 본 발명의 장수애 추출물 투여군의 MMP-1 및 MMP-9 단백질의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.0001이다.
도 10은 본 발명의 장수애 추출물 투여에 따른 pERK, pMEK, pJNK 및 pp38 단백질의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 장수애 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 장수애 건조 분말에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이고, 더욱더 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 장수애 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 4 내지 50℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 주름 생성은 콜라겐의 감소로 인해 발생하는 것이며, 상기 콜라겐의 감소는 과도한 산화 스트레스나 자외선 조사가 원인일 수 있다.
상기 장수애 추출물은 MMP-1 및 MMP-9 단백질의 발현량을 감소시키며, 히알루론산의 함량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 주사 또는 피부에 도포하는 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 장수애 추출물의 제조
장수애 건조 분말에 70% 에탄올을 사용하여 3시간 동안 환류추출하였다. 70% 에탄올 추출액을 수득하고 감압증류하여 장수애 에탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 장수애 추출물의 처리에 따른 세포 생존율 분석
HaCaT 세포는 37℃, 5%의 CO2 조건으로, 10%의 FBS(Fetal bovine serum)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(PS, Gibco)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다.
상기 배양한 HaCaT 세포(사람 각질형성 세포주)에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존능을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하여 시험하였다.
그 결과 도 1에 개시한 바와 같이, 본 발명의 장수애 추출물을 처리하여도 아무것도 처리하지 않은 대조군을 기준으로 세포 생존율(%)의 변화가 거의 없어, 본 발명의 장수애 추출물은 세포독성이 나타나지 않았다는 것을 확인하였다.
실시예 3. 자외선 조사에 따른 세포 보호 효과 확인
HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 자외선(UV Crosslinker, Ultra Lum)을 30분간 조사한 후, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존능을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 측정하여 시험하였다.
그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 UVB 조사에 의해 세포생존률(%)이 약 50% 정도 감소한 것을 확인할 수 있었고, UV 조사 후, 본 발명의 장수애 추출물을 처리한 경우 세포생존률(%)이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하여 본 발명의 장수애 추출물이 세포보호 효과가 있다고 판단하였다.
실시예 4. MMP -1 단백질의 발현량 변화 분석
HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 처리하고 자외선(UV Crosslinker, Ultra Lum)을 20mJ/cm2로 조사한 후, MMP-1 ELISA kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 MMP-1의 발현량을 측정하였다.
상세하게는 96웰 플레이트에 HaCaT 세포를 도말한 후, 본 발명의 장수애 추출물을 각각 농도별(10, 50, 100 및 200㎍/㎖)로 처리하였다. 이후, 자외선(UV) 조사하고, 배양물의 상등액을 수집하고 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액을 취해 ELISA 키트를 이용한 형광 어세이를 수행하여 MMP-1의 발현량을 정량분석하였다.
그 결과, 도 3 에 개시한 바와 같이 자외선을 조사하지 않은 정상군에 비해, 자외선을 조사한 군에서 현저하게 MMP-1의 발현량이 현저하게 증가한 것을 확인하였고, 본 발명의 장수애 추출물의 처리군에서 MMP-1의 발현량이 자외선 조사군에 비해 현저하게 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 히알루론산( Hyaluronic Acid; HA)의 함량 변화 분석
상기 HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 처리하고 자외선(UV Crosslinker, Ultra Lum)을 20 mJ/cm2로 30분간 조사한 후, 배양물의 상등액을 수집하여 히알루론산 ELISA 키트(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 HA의 함량을 측정하였다. 반응물은 흡광 어세이를 수행하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이, 자외선 조사에 의해, 히알루론산의 함량은 감소하였으나, 본 발명의 100 및 200㎍/㎖의 장수애 추출물을 처리한 각각의 실험군에서는 히알루론산의 함량이 증가한 것을 확인하였다(도 4).
실시예 6. 동물모델을 이용한 피부보습 및 주름 개선 효과 확인
(1) 실험동물 및 시료투여
무모생쥐는 6주령의 수컷 무모쥐(male HR-1, hairless mice, Japan SLC, Inc.)를 중앙실험동물로부터 구입하여 1주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 상태의 동물을 시험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간 (07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다. 시험기간 중 실험동물은 군당 6마리로 사육하였고 사료는 마우스 전용사료 5L79 (Charles river, USA)를 자유급이 하였으며, 음수는 자외선으로 소독한 상수도수를 자유 급이하였다.
시료투여는 자외선을 조사하지 않은 정상군(Nor), 자외선 처리군(UVB+Veh), 자외선 조사 및 장수애 추출물(UVB+JSA) 투여군으로 나누어 실험을 하였다. 시료투여는 마우스 존대를 이용하여 경구투여를 실시하였다. 투여기간은 총 12주로 주 5일 동안 투여하였다.
(2) 자외선조사
자외선조사는 대조군을 제외한 실험군에 12주 동안 주 3회 실시하였고, 자외선은 UVB 램프(Mineralight UV Display lamp, UVP, USA)를 사용하였다. 1~4주는 60mJ/cm2, 5~8주는 90mJ/cm2, 9~12주는 120mJ/cm2의 크기로, 12주 동안 자외선 조사하였다. 자외선 조사량은 광측정기(Delta OHM, Italy)를 이용하여 광량을 측정한 후 조사시간으로 조절하였다.
(3) 경피수분손실량(TEWL: transepidermal water loss) 평가
경피수분손실량 수치는 피부로부터 발산되는 수분량으로서, 수치가 높을수록 피부의 보습 기능이 떨어져 있음을 의미하며, 피부 고유의 장벽 기능이 손상되었음을 나타낸다.
경피수분손실량은 항온, 항습 조건(23℃, 상대습도 50%)에서 투와미터(Tewameter, Courage & Khazaka, Germany) 장비를 이용하여 피부에서 증발하는 수분의 양을 면적과 시간에 따라 계산하여, 증발하는 수분의 양(g/m2/hr)을 보습 전자센서로 읽고, 이를 수치화하여 피부의 보습력을 측정하였다.
그 결과 도 5에 개시한 바와 같이, 자외선 조사에 의해 피부 장벽이 손상되어 피부 보습 기능이 떨어진 것을 확인할 수 있었으며, 장수애 추출물 투여군의 경우, 자외선에 의해 유발된 피부 수분 손실을 통계적으로 유의미하게 방지하는 것을 확인하였다.
(4) 피부수분량 측정
피부수분량은 항온, 항습 조건(23℃, 상대습도 50%)에서 코니오미터(Corneometer, Courage & Khazaka, Germany) 장비를 이용하여 피부에 함유된 수분을 측정하였다. 피부의 표피 내에 존재하는 수분의 양을 센서를 이용하여 수분의 이온 정도를 측정하고, 이를 수치화하여 수분의 양을 계산함으로써 보습력을 측정하였다.
그 결과 도 6에 개시한 바와 같이, 자외선 조사군(Veh)은 자외선을 조사하지 않은 정상군(Nor)에 비해 피부 수분량이 감소하였으며, 장수애 추출물 투여군(JSA)은 자외선 조사군에 비해 피부 수분량이 높게 나타났다. 이와 같은 결과를 토대로 장수애 추출물은 피부 보습효과가 있다고 판단하였다.
(5) 피부의 조직학적 관찰
주름억제 효능을 확인하기 위하여, 각 실험군의 피부조직을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정한 후 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4μm 두께로 절편을 만든 후 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색 및 Masson's trichome 염색을 실시하였다. H&E 염색을 실시한 조직의 케라틴층에서 표피세포 기저막(epidermal basement membrane)까지의 두께를 현미경에 장착된 자를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 7 에 개시한 바와 같이, 장수애 추출물(JSA) 투여군은 자외선 조사군에 비해서 각질층이 완화되었고, Masson's trichome 염색 결과로부터 자외선에 의해서 콜라겐이 감소한 것을 확인하였고, 장수애 투여군에서는 콜라겐의 양이 회복된 것을 확인하였다(도 8).
(7) MMP-1 또는 MMP-9 발현량 변화 확인
MMP-1 또는 MMP-9은 피부노화와 연관있는 단백질로 자외선과 같은 산화적 스트레스에 의해 증가하는 것으로 알려졌으므로 산화적 손상으로부터 유도된 MMP-1 또는 MMP-9의 억제 효능을 측정하기 위해 장수애 추출물(JSA)을 경구투여한 후 피부조직을 적출하여, Quantikine ELISA pro MMP-1 또는 MMP-9 kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 MMP-1 또는 MMP-9을 측정하였다.
그 결과, 자외선 조사에 의해 MMP-1과 MMP-9의 발현량 모두 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 증가하였으며 장수애 추출물을 투여한 경우 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 9).
(6) 전기영동 및 Western blotting
피부조직 20~30mg에 단백질을 추출하는 용액을 첨가하여 분쇄하여 단백질을 얻어내어 정량하고 같은 양의 단백질을 전기영동하여 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후 항체와 반응시켜 단백질의 발현량을 측정하였다.
도 10에 개시한 바와 같이, 피부에서 주름생성에 중요한 역할을 하는 단백질로 알려진 pERK, pMEK, pJNK 및 pp38 단백질의 발현량이 자외선 조사군에서는 조사하지 않은 군에 비하여 증가하였고, 장수애 추출물(JSA) 투여군에서는 pERK, pMEK, pJNK 및 pp38 단백질의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
[통계학적 방법]
본 발명에서 얻은 결과치는 one-way ANOVA와 Tukey's 다중비교분석를 이용하여 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성을 검정하였다.

Claims (5)

  1. 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 장수애 추출물의 추출용매는 C1~C4의 저급알코올, 물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 장수애 추출물은 MMP-1 및 MMP-9 단백질의 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 장수애 추출물은 히알루론산의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 건강기능식품 조성물.
  5. 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2018/008359 2017-07-28 2018-07-24 장수애 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 또는 피부 보습용 조성물 WO2019022476A2 (ko)

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