KR101480158B1 - 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법 및 이를 통해 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충추출물 - Google Patents
항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법 및 이를 통해 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충추출물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위한 전처리 방법, 및 상기 방법으로 전처리되어 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충추출물에 관한 것이다.
본 발명의 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 또는 이의 유충을 멸균한 사료를 먹이는 제1단계, 상기 멸균한 사료를 먹인 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 굶기는 제2단계 및, 상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 멸균시키는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위해, 세균을 제거하고 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 장수풍뎅이의 전처리 조건을 확립하였고, 장수풍뎅이가 세포독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였으며, 장수풍뎅이를 대식세포에 처리한 결과, 대식세포 내 염증 관련 다양한 사이토카인 및 염증 매개 물질의 생성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 식약용 장수풍뎅이의 제조 및 항염증용 약재 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 또는 이의 유충을 멸균한 사료를 먹이는 제1단계, 상기 멸균한 사료를 먹인 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 굶기는 제2단계 및, 상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 멸균시키는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위해, 세균을 제거하고 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 장수풍뎅이의 전처리 조건을 확립하였고, 장수풍뎅이가 세포독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였으며, 장수풍뎅이를 대식세포에 처리한 결과, 대식세포 내 염증 관련 다양한 사이토카인 및 염증 매개 물질의 생성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 식약용 장수풍뎅이의 제조 및 항염증용 약재 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위한 전처리 방법, 및 상기 방법으로 전처리되어 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충추출물에 관한 것이다.
최근 신약 개발과 관련하여 천연자원의 기능에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 지구상에 다수 종을 차지하고 있는 곤충에 대한 연구가 활성화되고 있다. 예로부터 곤충은 한약재로 자주 이용되어 왔으며 주로 굼벵이, 누에, 매미허물, 동충하초, 지네 등 약 30 여종이 유용한 곤충자원으로 이용되고 있다.
장수풍뎅이(학명: Allomyrina dichotoma) 딱정벌레목(Coleoptera), 장수풍뎅이과(Family Dynastidae)에 속하는 곤충이다. 장수풍뎅이의 애벌레인 굼벵이가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 또한 장수풍뎅이에서 분리한 단백질이 세균에 대해 강한 활성 억제를 보이며(비특허문헌 11), 장수풍뎅이에서 추출한 렉틴은 강력한 항암능력을 보여 항암효과를 기대할 수 있다고 보고되었다(비특허문헌 12). 또한 사염화탄소로 간독성을 유발한 쥐에 대해 간 보호 효과를 확인한 논문이 보고되었다(비특허문헌 13). 그러나 장수풍뎅이나 그 유충이 민간요법에서 널리 이용되는데 비해 이의 생리기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이다. 곤충을 식약용으로 이용하기 위해서는 혐오식품으로 분류되어 있기 때문에 효능에 대한 명확한 자료가 뒷받침되어야 한다. 현재 장수풍뎅이를 이용한 항염증에 관한 보고는 전무한 실정이며, 이와 유사한 곤충을 이용한 항염증 특허에는 호랑나비, 사마귀, 무당벌레에 대한 보고가 있지만, 이들은 현재 사육시스템이 갖춰 있지 않다.
염증반응이 일어나는 기작은 대식세포(macrophage)가 병원체에 반응하여 TNF-α(tumor necrotic factor-α), IL-6(interleukin-6), 및 IL-1β와 같은 염증유발인자(pro-inflammatory cytokine)을 생성하고, iNOS(inducible nitric oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)를 합성하여 일산화질소(NO) 및 PGE2(prostaglandin E2)를 생성한다(비특허문헌 1-4). 생리학적으로 NO는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 수행한다(비특허문헌 3). 그러나 염증 반응이 일어나면 관련 세포에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO 생성하고, 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진시킨다(비특허문헌 5).
PGE2는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다(비특허문헌 3-4). 그러므로, 염증 반응에서 생성되는 물질 중 NO 및 PGE2와 같은 물질의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인할 수 있다.
대식세포는 염증과 관련된 각종 사이토카인과 단백질을 분비하여 여러 염증질환에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 6). 과도하게 분비된 사이토카인은 각종 장기 및 기관에 착용하여 여러 가지 병을 일으키게 된다. LPS에 의한 대식세포의 활성화 과정은 TLR(toll-like receptor)에 의해 매개되며 전사 인자(transcription factor)인 NF-κB(nuclear factor-κB)을 활성화시키는 경로를 통해 이루어진다(비특허문헌 7). LPS는 그람 음성 (-)균의 세포 외벽에 존재하며 핵 부위(core region)과 O-다당류 부위(polysaccharide region)으로 이루어진 다당류 부위(polysaccharide region)과 지질(lipid) A로 알려진 지질 부위(lipid region)로 구성되어 있다. LPS의 지질 A가 그람 음성균의 병태생리학에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS의 지질 A에 의해 대식세포 표면에 있는 TLR-4가 자극되면 세포질 내의 Toll/IL-1R(TIR) 도메인으로 신호가 전달된다. 이렇게 대식세포 내로 전달된 신호는 MyD88(myeloid differentiation primary-response protein 88)와 연결을 유도하고 IRAK4(IL-1R-associated kinase 4)를 신호 전달 경로로 유도한다. 이 IRAK-4는 IRAK1을 인산화(phosphorylation)시키고 TRAF6(tumour-necrosis-factor-receptor-associated factor 6)도 신호 전달 체계로 합류된다. 인산화된 IRAK1과 TRAF6는 신호수용체(receptor complex)에서 분리되어 세포막에서 다른 기전을 거쳐 다시 세포질에서 TAK1(transforming-growth-factor-β-activated kinase)을 활성화시킨다. 활성화된 TAK1은 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제와 IKK(inhibitor of nuclear factor-κB (IκB)-kinasecomplex) 복합체를 인산화시켜 IκB와 NF-κB 분해를 유도한다. 분리된 NF-κB는 대식세포의 핵으로 이동하여 염증과 관련된 유전자의 발현을 유도하여 여러 사이토카인과 단백질을 생성한다(비특허문헌 8).
이에, 본 발명자들은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위해 세포독성을 확인하였고, 세균을 제거하는 조건 및 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 전처리 조건을 확립하였으며, 이를 이용하여 항염증 효능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
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본 발명의 목적은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위해, 세균을 제거하고 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 전처리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 전처리된 장수풍뎅이에서 항염증 효능을 확인하여, 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충추출물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 또는 이의 유충을 멸균한 사료를 먹이는 제1단계, 상기 멸균한 사료를 먹인 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 굶기는 제2단계 및, 상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 멸균시키는 제3단계를 포함하는 것이 특징이다.
상기 멸균은 65℃ ~ 100℃의 온도로 5분 ~ 30분 동안 증기 멸균(steam sterilization)시키는 것을 특징으로 한다.
상기 제1단계에서 사료는 무인 것을 특징으로 한다.
상기 제1단계에서 사료는 3일 ~ 5일간 먹이는 것을 특징으로 한다.
상기 제2단계에서 굶김은 1일 ~ 3일간 굶기는 것을 특징으로 한다.
상기 제3단계에서 멸균은 115℃ ~ 121℃의 온도로 고압 멸균(autoclaving)시키는 것을 특징으로 한다.
상기 3단계 이후 멸균된 상기 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 동결 및 건조시키는 단계 및, 상기 건조된 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 분쇄하여 분말화시키거나, 또는 알코올 또는 알코올 수용액에 현탁하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 추출물은 상기와 같은 전처리 방법을 통해 제조되는 것이 특징이다.
본 발명은 장수풍뎅이를 식재 또는 약재로 이용하기 위해, 세균을 제거하고 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 장수풍뎅이의 전처리 조건을 확립하였고, 장수풍뎅이가 세포독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였으며, 장수풍뎅이를 대식세포에 처리한 결과, 대식세포 내 염증 관련 다양한 사이토카인 및 염증 매개 물질의 생성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 식약용 장수풍뎅이의 제조 및 항염증용 약재 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 장수풍뎅이의 전처리과정을 나타내는 모식도이다. 구체적으로, 상기 도 1은 장수풍뎅이를 15 ~ 20분간 고온의 증기로 멸균한 사료(버섯폐목)를 3 ~ 5일간 먹인 후, 1일간 굶기며 배변 활동하여 115℃, 5분의 조건으로 멸균한 다음, 동결 건조한 후, 분쇄하는 과정을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 2는 장수풍뎅이의 RAW267 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과, 분말의 멸균(115℃, 5분) 및 비 멸균의 처리구에서 세포 독성이 없음을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 미생물 수를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이의 사료 멸균의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 3은 장수풍뎅이를 굶기기 전에 살균한 참나무톱밥을 먹여서 사육하는 것이 장수풍뎅이 체내 미생물 수를 감소시킬 수 있고, 스팀(steam)으로 5분간 쪄도 미생물이 확인되지는 않지만, 많은 양의 사료를 살균하기 위해서는 15 ~ 20분 동안 찌는 것이 바람직함을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 미생물 수를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이 유충 분말의 멸균의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 4는 장수풍뎅이 유충 배변 후 고압멸균기를 사용하여 유충 자체를 멸균한 결과 115℃, 0.9 kgf/㎤ 압력을 5분간 처리하면 세균 및 진균이 제거됨을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 악취를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이의 사료의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 5는 장수풍뎅이 유충을 5가지 채소 및 곡물(배추, 양파, 밀가루, 무, 쌀겨 발효품)을 5일간 먹인 후, 1차 관능평가에서는 각 군마다 악취가 나지 않는 일수를 정하였고, 2차 관능평가에서는 1차로 선별된 샘플 중에서 냄새와 색을 평가한 결과, 냄새 평가에서는 5일간 무를 먹이고, 색 평가에서는 1일 굶기며 배변 활동한 결과가 가장 좋은 평가가 나왔음을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 현탁액의 세포내 TNF-a, IL-6 및 iNOS의 발현 억제를 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 6은 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액을 농도별로 처리를 하여 Real-time PCR을 통해 사이토카인의 유전자 발현량을 조사한 결과, 염증에 관여하는 TNF-a, IL-6 및 iNOS의 유전자의 발현이 억제되는 것을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 현탁액의 세포내 TNF-a 발현 억제를 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 7은 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액을 농도별로 처리를 하여 ELSIA assay를 통해 사이토카인의 단백질 발현량을 조사한 결과, 염증에 관여하는 TNF-a의 단백질 발현이 억제되는 것을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 2는 장수풍뎅이의 RAW267 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과, 분말의 멸균(115℃, 5분) 및 비 멸균의 처리구에서 세포 독성이 없음을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 미생물 수를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이의 사료 멸균의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 3은 장수풍뎅이를 굶기기 전에 살균한 참나무톱밥을 먹여서 사육하는 것이 장수풍뎅이 체내 미생물 수를 감소시킬 수 있고, 스팀(steam)으로 5분간 쪄도 미생물이 확인되지는 않지만, 많은 양의 사료를 살균하기 위해서는 15 ~ 20분 동안 찌는 것이 바람직함을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 미생물 수를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이 유충 분말의 멸균의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 4는 장수풍뎅이 유충 배변 후 고압멸균기를 사용하여 유충 자체를 멸균한 결과 115℃, 0.9 kgf/㎤ 압력을 5분간 처리하면 세균 및 진균이 제거됨을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 유충 분말의 악취를 감소시킬 수 있는 장수풍뎅이의 사료의 최적 조건을 나타내는 그림이다. 구체적으로, 상기 도 5는 장수풍뎅이 유충을 5가지 채소 및 곡물(배추, 양파, 밀가루, 무, 쌀겨 발효품)을 5일간 먹인 후, 1차 관능평가에서는 각 군마다 악취가 나지 않는 일수를 정하였고, 2차 관능평가에서는 1차로 선별된 샘플 중에서 냄새와 색을 평가한 결과, 냄새 평가에서는 5일간 무를 먹이고, 색 평가에서는 1일 굶기며 배변 활동한 결과가 가장 좋은 평가가 나왔음을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 현탁액의 세포내 TNF-a, IL-6 및 iNOS의 발현 억제를 유전자 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 6은 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액을 농도별로 처리를 하여 Real-time PCR을 통해 사이토카인의 유전자 발현량을 조사한 결과, 염증에 관여하는 TNF-a, IL-6 및 iNOS의 유전자의 발현이 억제되는 것을 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따라 전처리된 장수풍뎅이 현탁액의 세포내 TNF-a 발현 억제를 단백질 수준에서 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 구체적으로, 상기 도 7은 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액을 농도별로 처리를 하여 ELSIA assay를 통해 사이토카인의 단백질 발현량을 조사한 결과, 염증에 관여하는 TNF-a의 단백질 발현이 억제되는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
본 발명은 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 식재 또는 약재로 이용하기 위해, 세균을 제거하고 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위한 전처리 방법을 제공한다.
이에, 본 발명의 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법을 구체적으로 설명한다.
1. 제1단계 : 멸균 사료 급이
장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 또는 이의 유충을 멸균한 사료를 먹인다.
상기 사료의 멸균(sterilization)은 65℃ 이상의 온도로 5분 이상 동안 증기 멸균(steam sterilization)시키는 것이 바람직하고, 65℃ ~ 100℃의 온도로 5분 ~ 30분 동안 증기 멸균시키는 것이 더욱 바람직하나 상기 온도 및 시간에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 사료는 채소 또는 곡물인 것이 바람직하고, 무, 배추, 양파, 밀가루 및 발효된 쌀겨로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하고, 무(radish)인 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 사료는 3일 이상 동안 먹이는 것이 바람직하고, 3일 ~ 5일 동안 먹이는 것이 더욱 바람직하다.
2. 제2단계: 굶김
상기 멸균한 사료를 먹인 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 굶긴다.
상기 굶김(fasting)은 1일 이상 굶기는 것이 바람직하고 1일만 굶기는 것이 더욱 바람직하며, 이때 배변활동을 유도하는 것이 바람직하다.
3. 제3단계: 멸균
상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 멸균시킨다.
상기 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 멸균은 115℃ 이상의 온도로 5분 이상 고압 멸균(autoclaving)시키는 것이 바람직하고, 115℃ ~ 121℃의 온도로 0.9 kgf/㎤ ~ 1.2 kgf/㎤의 압력에서 5분 ~ 10분 동안 멸균시키는 것이 더욱 바람직하나, 상기 온도, 압력 및 시간에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 장수풍뎅이의 식용화를 위해, 장수풍뎅이의 유충을 스팀 멸균한 사료를 3일 ~ 5일 동안 먹여서 키우거나, 장수풍뎅이의 유충 자체를 고압 멸균시킨 후, 미생물 조사를 하여 미생물이 없음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 장수풍뎅이의 식용화를 위해, 장수풍뎅이 특유의 이취를 제거하기 위해 채소 또는 곡물(무, 배추, 양파, 밀가루, 쌀겨발효품)을 3 ~ 5일 동안 공급하거나, 또는 사료 섭취 후 1일 ~ 5일 동안 굶기면서 배변 활동을 유도한 후, 관능평가를 하여 이취가 없음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 장수풍뎅이가 상기와 같이 전처리된 경우, 세포독성이 거의 없음을 확인함으로써 식재 또는 약재로 사용할 수 있음을 확인하였다.
추가적으로 상기 3단계 이후 멸균된 상기 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 동결 및 건조시키는 단계 및, 상기 건조된 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 분쇄하여 분말화시키거나, 또는 알코올 또는 알코올 수용액에 현탁하는 단계를 더 포함하여 식재 또는 약재로 이용가능한 항염증 효능을 갖는 식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 추출물을 제공하기도 한다.
이때, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 장수풍뎅이를 초저온 냉동고에서 24시간 동안 동결시킨 후 고압 멸균하여 멸균시킨 후 동결건조기를 이용하여 건조시킨 후 초고속믹서를 이용하여 분말을 제조하였고, 제조한 분말을 70% 에탄올에 넣고 초음파 분쇄기로 230 줄(jule)의 세기로 10초간 2회 분쇄하고 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 동결건조기를 이용하여 건조시킨 다음, 건조 중량을 측정하여 희석 농도를 결정한 후 현탁액으로 제조하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명에 따른 전처리된 장수풍뎅이를 대식세포에 처리하였을 때, 염증관련 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6, 및 염증매개물인 iNOS의 생성을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 대식세포에서 분비되는 각종 사이토카인의 양에 대한 조절은 멸균에 영향을 받지 않음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 장수풍뎅이는 우수한 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다.
이하에서는 본 발명의 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예로만 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 장수풍뎅이 현탁액의 제조
장수풍뎅이는 국내산 가나안 농원(경상남도 거제)에서 키운 장수풍뎅이를 분양 받아서 이를 이용하여 제조하였다. 분말을 만드는 조건은 고압멸균기로 멸균한 버섯폐목(참나무톱밥/ 가나안 농원, 경남 거제)을 3일 동안 먹인 후 액체질소를 부은 후 급속 동결하여 영하 70℃의 초저온 냉동고에 24시간 동안 동결시킨 후 115℃, 5분 동안 멸균한 후 동결 건조기를 이용하여 건조시켜 수분을 제거하였다. 수분을 제거한 장수풍뎅이를 믹서로 세절하여 가루를 얻은 후 70% 에탄올에 분말을 넣은 후 초음파 분쇄기로 230 jule의 세기로 10초 동안 2번 나눠서 분쇄하였다. 분쇄된 분말을 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 후 상층액을 얻었다. 상층액을 동결건조기에 넣어 24시간동안 건조시킨 후 건조 중량(실험에 들어가기 전보다 분말 무게가 1/5로 줄어듦)을 구한 다음 실험에 이용하였다. 비 멸균된 현탁액은 위 과정 중 사료 멸균과 동결 건조된 장수풍뎅이를 멸균시키는 조건을 생략하였다. 이런 전처리 과정에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
<실시예 2> 세포의 배양
쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포(한국세포주은행에서 구입)는 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin) 100 unit/ml과 10% FBS이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다. 상기 Raw 264.7 세포를 1×106/ml 농도로 24 웰 플레이트(well plate)에 각각 분주하고 LPS 100 ng/ml을 처리하고 갈색 현탁액을 0, 10, 100, 500, 1000 μg/ml 농도에 처리한 실험군과 LPS를 처리하지 않은 대조군을 24시간 배양하였다.
<실험예 1> 장수풍뎅이의 세포독성 평가
장수풍뎅이의 Raw 264.7 세포에 대한 독성 여부를 측정하기 위해, 장수풍뎅이를 고압 멸균한 참나무 톱밥을 먹인 후 3일 동안 굶겨 배변을 시킨 후 멸균한 그룹과 배변을 시키지 않고 멸균을 하지 않고 분말을 낸 두 그룹으로 나누어서 70% 에탄올에 각각 녹이고 이를 건조하여 현탁액의 농도를 확인한 후, 이를 농도별(10, 100, 500 및 1000 ug/ml)로 RAW 264.7 세포에 처리한 다음, 24시간 후에 다음, CellTiter 96®AQueousONE Solution Cell proliferation Assay kit(MTS assay kit, Promega)를 이용해서 세포 생장률을 측정하였다.
그 결과, 멸균한 그룹과 비멸균한 그룹 양쪽 모두 대조군에 비해 세포 생장률이 저해되지 않아 뚜렷한 독성이 검출되지 않은 것을 확인하였다(도 2). 따라서, 장수풍뎅이 유충이 식용으로 사용하기에 적합한 것을 알 수 있었다.
<실험예 2> 장수풍뎅이의 미생물 검사
장수풍뎅이 현탁액을 식약용 소재로 사용하기 위해서는 세균 및 곰팡이와 같은 미생물이 없어야 하므로 바람직한 조건을 확립하기 위해, 멸균시간 및 온도를 조절하여 사료 및 유충분말의 최적조건을 확립하였다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 참나무 톱밥은 온도의 변화 없이 5, 10, 20, 30분 동안 고압 멸균하였고, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 장수풍뎅이 현탁액을 115℃와 121℃의 2가지 온도와 5분과 10분의 시간을 주는 조건으로 멸균하였으며, 이들 각 조건의 분말을 내어 10-3 농도로 희석한 후 고체 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에 배양하여 세균군집(colony)이 생성되는지 확인하였다.
| 샘플-LB 배지(세균) No. | 찌는 시간(분) | 미생물(cfu/g) |
| 1 | × | 4.7×104 |
| 2 | 5 | - |
| 3 | 10 | - |
| 4 | 20 | - |
| 5 | 30 | - |
| 샘플-LB 배지(세균) No. | 찌는 시간(분) | 미생물(cfu/g) |
| 1 | × | 7.3×105 |
| 2 | 115℃, 0.9 kgf/㎤, 5min | - |
| 3 | 115℃, 0.9 kgf/㎤, 10min | - |
| 4 | 121℃, 1.2 kgf/㎤, 5min | - |
| 5 | 121℃, 1.2 kgf/㎤, 10min | - |
그 결과, 장수풍뎅이 유충을 굶기기 전에 살균한 참나무톱밥을 먹여서 사육하는 것이 장수풍뎅이 체내 미생물 수를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 스팀(steam)으로 5분간 쪄도 미생물이 확인되지는 않는 것을 확인하였다(표 1 및 도 3).
또한, 장수풍뎅이 유충 배변 후 고압멸균기를 사용하여 유충 자체를 멸균한 결과 115℃, 0.9 kgf/㎤ 압력을 5분간 처리하면 세균 및 진균이 제거됨을 확인할 수 있었다(표 2 및 도 4).
<실험예 3> 장수풍뎅이의 관능평가
장수풍뎅이 특유의 이취 감소조건을 확립하기 위해 관능평가를 실시하였다. 악취감소에 도움이 되며, 경제적이라 사료되는 5가지 채소 및 곡물(배추, 양파, 밀가루, 무, 쌀겨 발효품)을 5일간 먹인 후, 제조된 장수풍뎅이 현탁액을 패널 20명을 통해 관능평가를 실시하였다. 1차 관능평가에서는 각 군마다 악취가 나지 않는 일수를 정하였고, 2차 관능평가에서는 1차로 선별된 샘플 중에서 냄새와 색을 평가하였다.
그 결과, 냄새 평가에서는 5일간 무를 먹이고, 색 평가에서는 1일 굶기며 배변 활동한 결과가 가장 좋은 평가가 나왔다(도 5). 따라서 경제성과 효율성을 고려하였을 때 1일 굶기면서 배변활동한 샘플이 식품으로 사용되기 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 4> 장수풍뎅이의 항염증 효능 검정
1) 사이토카인의 유전자 수준에서 측정
장수풍뎅이의 항염증 효능을 분석하기 위해, LPS를 통해 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액을 처리하여 사이토카인(cytokine)의 유전자 발현량과 세포 외로 분비되는 사이토카인 양을 실시간(Real-time) PCR을 통해 유전자 수준에서 조사하였다. 구체적으로, 장수풍뎅이 현탁액과 LPS 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군 이용하였다. 세포의 배지를 제거 한 후 트리졸 시약(Trizol reagent)을 처리하고 세포 스크랩퍼(cell scraper)를 통해 긁어낸 후, 클로로포름(chloroform)을 넣은 다음, 12000 G에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 얻은 다음, 이소프로판올(isopropanol)을 통해 RNA를 추출하고, 추출된 RNA량을 측정한 후, 2 ug/ml로 농도를 통일시킨 후 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용해 Power SYBR Green Mixture와 프라이머(primer)를 혼합한 후, 실시간 PCR 기기(AB, UK)를 통해 사이토카인의 유전자 발현 수준을 조사하였다. 이때, 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
| 명칭 | 서열 | |
| GAPDH | forward | 5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3' (서열번호: 1) |
| reverse | 5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3' (서열번호: 2) | |
| IL-6 | forward | 5'-TTGGGAGYGGTATCCTCTGT-3' (서열번호: 3) |
| reverse | 5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3' (서열번호: 4) | |
| iNOS | forward | 5'-TGAAGCGTTTCGGGATCTG-3' (서열번호: 5) |
| reverse | 5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3' (서열번호: 6) | |
| TNF-α | forward | 5'-ACAGCACCGCAGTACCTGAG-3' (서열번호: 7) |
| reverse | 5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3' (서열번호: 8) | |
그 결과, 장수풍뎅이 현탁액은 염증에 관여하는 TNF-a, IL-6 및 iNOS의 유전자의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다(도 6).
2) 사이토카인의 단백질 수준에서 측정
장수풍뎅이의 항염증 효능을 분석하기 위해, LPS를 통해 염증반응을 유도한 RAW 264.7 세포에 장수풍뎅이 현탁액이 처리된 배양액의 사이토카인의 양을 TNF-α Elisa kit를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 표준(standard)과 배양액을 반응액과 반응시키고 각각의 항체가 코팅된 플레이트를 이용하여 항체와 반응시킨 후 발색을 통해 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Beckman, USA)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 장수풍뎅이 현탁액은 염증에 관여하는 염증에 관여하는 TNF-a의 단백질 발현을 억제시키는 것을 확인하였다(도 7).
본 발명의 장수풍뎅이 현탁액은 다양한 염증관련 질환을 위한 약제 또는 식품으로 사용함으로써 곤충농가 및 산업체 소득 증대를 기대할 수 있고, 본 발명의 장수풍뎅이 현탁액 제조방법을 통해 간편하고 경제적으로 상기 약제 또는 식품을 대량 생산할 수 있다.
Claims (8)
- 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma) 또는 이의 유충을 65℃ ~ 100℃의 온도로 5분 ~ 30분 동안 증기 멸균(steam sterilization)한 무인 사료를 3일 ~ 5일간 먹이는 제1단계;
상기 멸균한 사료를 먹인 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 1일 ~ 3일간 굶기는 제2단계 및,
상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 115℃ ~ 121℃의 온도로 고온고압 멸균(autoclaving)시키는 제3단계를 포함하되,
상기 3단계 이후 멸균된 상기 굶긴 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 동결 및 건조시키는 단계 및, 상기 건조된 장수풍뎅이 또는 이의 유충을 분쇄하여 분말화시키거나, 또는 알코올 또는 알코올 수용액에 현탁하는 단계를 추가적으로 더 포함하여, 세균이 제거되고 장수풍뎅이 특유의 이취가 제거됨과 동시에 항염증 효능을 갖는 것을 특징으로 하는,
식약용 장수풍뎅이 또는 이의 유충의 전처리 방법. - 삭제
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