KR101395004B1

KR101395004B1 - 단마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부 노화의 예방과 개선을 위한 조성물

Info

Publication number: KR101395004B1
Application number: KR1020110104511A
Authority: KR
Inventors: 우원홍; 문연자; 이영은; 김대성; 전병국
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2011-10-13
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2014-05-15
Also published as: KR20130039871A

Abstract

본 발명은 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물에 관한 것으로서, DPPH 라디칼 소거능 활성, SOD 활성 촉진, 교원질 분해효소(Collagenase) 활성 억제, 피부 보습 촉진, 섬유아세포의 증식 촉진 기능을 보유하는 것을 특징으로 하는 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명인 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물은 단마 추출물(Dioscorea aimadoimo) 을 유효성분으로 포함함에 기술적 특징이 있다.

Description

단마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부 노화의 예방과 개선을 위한 조성물 {A pharmaceutical comprising the extract of Dioscorea aimadoimo for treating or preventing skin aging}

본 발명은 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물에 관한 것으로서, DPPH 라디칼 소거능 활성, SOD 활성 촉진, 교원질 분해효소(Collagenase) 활성 억제, 피부 보습 촉진, 섬유아세포의 증식 촉진 기능을 보유하는 것을 특징으로 하는 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명인 피부노화의 예방과 개선을 위한 조성물은 단마 추출물(Dioscorea aimadoimo) 을 유효성분으로 포함함에 기술적 특징이 있다.

일반적으로, 유해산소로 알려져 있는 활성산소종(reactive oxygen species)은 생체에 존재하는 항산화 효소(superoxide dismutase, catalase, clutathione peroxidase, glutthione reductase)와 비효소적 항산화제(tocopherol, ascorbic acid, carotenoid, flavonoid, glutathione)들로 구성된 항산화 방어체계에 의해 제거됨으로써 인체의 정상적인 세포 기능이 유지된다.

그러나 활성산소종의 과도한 생성이나 방버 시스템의 기능 저하에 기인하는 산화적 스트레스는 피부 항산화제 파괴, 지질 과산화반응의 개시, 단백질의 산화, DNA 산화, 결합조직 성분인 콜라겐, 히아루론산 등의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합에 의한 주름생성, 멜라닌 생성 등을 유발하여 피부노화를 가속시킨다.

한편 피부 노화는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인선 노화(extrinsic aging)로 구분된다.

내인성 노화는 나이가 들어감에 따른 자연스러운 변화로 유전적 요인이 가미된 피부 주름의 발생을 의미하고, 외인성 노화의 경우는 환경적 요인에 의한 피부주름의 발생을 의미한다.

내인성 노화와 외인성 노화는 모두 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데 그 구성 요소 중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen)의 감소가 피부 주름 형성에 중요한 역할을 한다.

한편 각질층은 정상인의 경우 10~20% 정도의 수분을 함유하고 있어 피부보습을 유지하지만 수분 함량이 감소하면 가려움, 주름생성 등 피부노화를 촉진시킨다. 따라서 건강하고 탄력 있는 피부를 위해서는 각질층의 충분한 수분함유가 요구되며 이를 위해 건조한 환경에서도 수분손실을 억제해주는 장벽이 필요하다.

한편 본 발명은 피부노화를 예방, 개선 및 치료하는 조성물로서, 단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물을 유효성분으로 하고 있는바, 이하 단마에 관련하여 살펴본다.

마는 백합목 마과(Dioscoreacea)의 다년생 덩굴 식물로 현재까지 10속 650여 종이 알려져 있으나 이들 중 약 10여 종이 식량자원으로 활용되고 있다.

한방에서는, 마(D. batatas Decne.), 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.), 참마(Dioscorea japonica Thunb.)의 주피를 제거한 근경(根莖)을 산약(山藥)이라고 한다.

그런데 본 출원인은 기존의 산약(山藥)으로 사용되는 마의 종류가 아니라 익산지역에서 주로 재배하는 단마(Dioscorea aimadoimo)를 이용하여 그 효능을 밝혀서 발명을 안출하고자 한다.

마과 식물 추출물을 피부 노화 예방 및 개선에 사용한 종래기술에 대해 살펴보면, 먼저, 한국공개특허공보 10-2004-0101588호에는 산삼, 산수유, 산약, 감초, 맥문동, 복령 및 지황 등을 이용한 화장료 조성물이 기재되어 있다.

두 번째로, 한국공개특허공보 10-2006-0119047호에는 인삼잎 추출액 및 12가지 한약재를 사용하는 피부질환 치료제의 성분으로서 산약이 기재되어 있다.

세 번째로, 한국공개특허공보 10-2006-0033072호에는 산약을 포함한 12가지 성분을 혼합하여 피부를 윤택하게 하는 식품 조성물이 기재되어 있다.

네 번째로, 한국공개특허공보 10-2003-0025716호에는 마 및 참마과에 속하는성분들(산약 추출물)을 함유하는 미백용 조성물이 기재되어 있다.

다섯 번째로, 한국공개특허공보 10-1997-0005271호에는 마과 식물의 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 기재되어 있는데, 산약, 둥근마, 부채마, 큰마, 각시마, 국화마, 단풍마를 활용하고 있다.

정리하여 보면, 종래기술들은 산약(山藥)을 주로 활용하여 피부 노화 관련 조성물에 이용하였으며, 또한 산약 이외의 다른 종류의 마를 사용하더라도 단마(Dioscorea aimadoimo)를 충분히 활용하지 않았음을 알 수 있다.

본 발명의 목적은, 부작용을 가져오지 않으면서, 산화적 스트레스, 내인성 노화 및 외인성 노화에 기인하는 피부 노화 증상을 예방, 개선 및 치료하는 효능이 현저한 조성물을 제공함에 있다.

본 발명은, 단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 및 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물를 포함하는 유효성분에, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화 된 피부노화의 예방 및 치료제를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한 상기 단마 추출물을 포함하는 유효성분을 제제화 할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.

상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물을 포함하는 유효성분에 식품 보조 첨가제를 추가하여 피부노화의 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한 피부노화의 예방 및 개선효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 20 중량% 이 될 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 상기 추출물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외에 향미제로써 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 유효성분은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 유효성분은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명인 단마 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, DPPH 라디칼 소거능 활성, SOD 활성 효과를 보유하고 있는바 산화적 스트레스에 의한 피부 노화를 개선, 방지할 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.

본 발명인 단마 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 교원질 분해효소(Collagenase)의 활성 억제, 피부 보습 효과를 보유하고 있는바 피부의 상태를 건강하게 유지함으로써 피부 노화를 개선, 방지할 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.

본 발명인 단마 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 섬유아세포의 증식 유도 효과를 보유하고 있는바 노화되거나 상처가 있는 피부의 상태를 개선, 향상시킬 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.

도 1은 단마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능에 관한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 단마 추출물의 SOD 활성에 관한 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 단마 추출물의 교원질 분해효소 억제 활성에 관한 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 단마 추출물의 피부 보습 효과에 관한 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 단마 추출물의 섬유아세포 증식 효과에 관한 실험 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 단마 추출물의 섬유아세포 이동 및 증식 효과에 관한 실험 결과를 나타내는 도면이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예 및 실험예에 기재된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예 및 실험예 등을 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1. 단마 추출물의 제조

본 실시예에 사용된 단마(Dioscorea aimadoimo)는 금마농협(익산시)에서 분말을 구입하여 사용하였다.

단마 분말 400 g에 에탄올 4,000 ml를 넣고 실온에서 7일간 추출한 후 여과지에 여과시킨 다음 감압농축 하고 동결건조 시켜 분말 형태의 시료 12 g(수득률 3%)을 얻었으며, 냉침추출물(low temperature extract of Dioscorea aimadoimo, LDA)로 사용하였다.

온침추출물(high temperature extract of Dioscorea aimadoimo, HDA)은 위와 동일한 양을 80℃에서 3시간 추출한 후 3,000 rpm/min으로 원심분리한 추출액을 여과지로 여과하여 감압농축 후 동결건조 하여 26.4 g(수득률 6.6%)을 얻었다.

참고예 1. 실험 준비

1-1. 실험시료

Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(NY, USA)사 제품을, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 Sigma(USA)사 제품을, CytoSelect^TM 24-well Wound Healing Assay은 Cell Biolabs(CA, USA)사 제품을, EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit invitrogen(CA, USA)사 제품을 사용하였다.

1-2. 통계처리

실험 결과는 student's t-test를 이용하여 p-value를 구하였고 0.05 이하일 경우 *를, 0.01 이하일 경우 **를 표시하여 유의성을 나타내었다.

실험예 1. 단마 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 효과

1-1. DPPH 라디칼 소거능 실험방법

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA) 라디칼 소거능은 Blois(Blois, M.S. “Antioxidant determination by the use of a stable free radical”, Nature 181:1199-1200, 1958)의 방법으로 측정하였다.

시료를 MeOH로 녹여 500 ㎕를 1.5 ㎖tube에 넣고 0.3 mM DPPH 500 ㎕를 넣어 총 양이 1 ㎖가 되도록 하였다.

실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Bio-Tek, USA)로 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능 = 100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도)×100}

1-2. DPPH 라디칼 소거능 실험결과

활성산소종의 과도한 생성이나 시스템의 기능 저하로 산화적 스트레스를 받게되면 노화나 암 등의 여러 가지 성인병이 유발되는데, 이들 활성산소종 중에서 ¹O₂ 및 ㆍOH은 피부 광손상에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

전자공여능에 이용되는 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazy) 라디칼(radical)은 화학적으로 유도되는 비교적 안정한 라디칼로서 어떠한 반응계에서 전자를 공여 받으면 고유의 자색이 엷어지므로, 천연 항산화제의 유리 라디칼 소거능을 평가하는데 일반적으로 사용된다.

실시예 1에 따른 단마 냉침추출물과 온침추출물을 각각 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 400 mg/ml 농도로 처리하고 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다.

도 1을 참조해보면, 냉침추출물은 각각의 농도에서 0 ± 0.9%, 4.5 ± 1.0%, 12.9 ± 1.7%, 21.8 ± 0.3%, 40.3 ± 0.4%의 소거능을 보였으며, 온침추출물은 39.7 ± 0.2%, 41.4 ± 0.4%, 53.2 ± 0.2%, 61.8 ± 0.1%, 70.6 ± 0.2%로 온침추출물이 냉침추출물보다 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.

즉 각 추출물에 대한 전자공여능을 측정한 결과 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 온침추출물이 냉침추출물 보다 더 좋은 라디칼 소거능을 나타냈다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 산화적 스트레스에 의한 피부 노화를 억제할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

실험예 2. 단마 추출물의 SOD 활성 효과

2-1. SOD 활성 실험방법

과산화물제거효소(SOD, Superoxide dismutase) 활성 측정은 Marklund(Marklund, S., Marklund, G. “Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and convenient assay for superoxide dismutase”, Eur J Biochem 47: 468-474, 1975.)등의 방법으로 측정하였다.

일정농도의 시료 0.2 ㎖, Tris-HCl buffer [50 mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane + 10 mM EDTA, pH 8.5] 3 ㎖, 7.2 mM pyrogallol 0.2 ㎖을 첨가하고 25℃에서 10 분간 반응시키고 1 N HCl 1 ㎖를 가하여 반응을 정지시켰다.

반응 액 중 산화된 pyrogallol의 양은 420 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (Bekman, Germany)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며 SOD 유사활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.

SOD 유사활성능 (%) = 100-{(시료첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도)×100}

2-2. SOD 활성 실험결과

과산화물제거효소(SOD)는 활성산소종에 대한 항산화 효소의 일종으로서, 세포와 조직에 강한 독성을 갖는 superoxide radical anion(O₂ ^-)을 hydrogen peroxide(H₂O₂)와 O₂로 전환시켜주어 세포를 보호하는 물질이다.

도2를 참조해보면, 농도에 따른 단마 냉침추출물과 온침추출물의 SOD 유사활성 측정 결과는, 단마 냉침추출물의 경우 25 mg/ml에서 29±1.5%로, 50 mg/ml에서 31±3.4%로, 100 mg/ml에서 28±0.5%로, 200 mg/ml에서 36±1.4%로, 400 mg/ml에서 32±0.3%로 측정되었다.

단마 온침추출물은 25 mg/ml에서 20±2.0%로, 50 mg/ml에서 28±1.4%로, 100 mg/ml에서 31±0.8%로, 200 mg/ml에서 36±1.1%로, 400 mg/ml에서 34±1.2%로 측정되었다.

즉 단마 냉침추출물과 온침추출물의 SOD 활성도는 비슷한 수준으로 나타났음을 알 수 있다.

실험예 3. 단마 추출물의 교원질 분해효소(Collagenase) 억제 활성 효과

3-1. 교원질 분해효소 억제 활성 실험방법

교원질 분해효소(Collagenase) 억제 활성 실험은 EnzCheck Gelatinase/Collagenase assay kit (Invitrogen, USA)를 사용하였으며, substrate로는 DQ^TM gelatins from pig skin, fluorescein conjugate을 이용하여 측정하였다.

즉 96-well plate에 reaction buffer를 150 ㎕, 시료 20 ㎕, collagenase (10 u/㎖) 20 ㎕, gelatin (100 ㎍/㎖) 10 ㎕을 가하여 잘 섞어준 후 37℃ 암실에서 1시간 동안 반응시켰다.

실험결과는 fluorescence micro plate reader (Bio-T다, USA)를 사용해 495/515 nm에서 측정하였다.

3-2. 교원질 분해효소 억제 활성 실험결과

노화된 피부의 대표적인 증상은 주름의 발생인데 피부가 위축되고 탄력이 감소되며 건조해지는 제반 현상에서 비롯된 결과이며, 특히 광노화는 자외선으로 인해 피부 기질을 형성하고 있는 콜라겐과 엘라스틴 등이 파괴되어 굵은 주름을 형성시킨다.

여기에서, 콜라겐은 일반적으로 진피층의 90%를 차지하고 있는 주요 단백질로서 피부의 강도와 장력을 부여하여 외부의 자극으로부터 피부를 보호하고 피부 구조의 탄력을 유지하는 역할을 한다.

그런데 교원질 분해효소(Collagenase)는 세포외기질 단백질을 분해하는 효소로서 피부의 주름 생성을 촉진시킨다.

도 3을 참조해보면, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml 농도에서, 단마 냉침추출물은 각각의 농도에서 7.9±1.4%, 18.3±1.4%, 25.4±1.4%, 30.2±1.4%, 32.5±1.4%의 collagenase 억제활성을 보였다.

또한 온침추출물은 각각 1.6±1.4%, 5.6±1.4%, 7.9±1.4%, 12.7±1.4%, 15.1±1.4%로 측정되었다.

즉 단마 냉침추출물이 온침추출물에 비해 대체적으로 높은 억제 활성을 보였으며, 또한 양자 모두 억제 활성을 보유하고 있음을 알 수 있다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 교원질 분해효소의 활성을 억제함으로써 피부 노화를 개선할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

실험예 4. 단마 추출물의 피부 보습 효과

4-1. 피부 보습 효과 실험방법

실험대상은 과거에 알레르기성 질환이나 아토피 피부염 등 질환의 병력이 없는 건강한 성인 남녀 5명을 대상으로 하였으며, 연령은 28~34세로서 평균 연령은 31세였다.

검사 전 최소 일주일 동안 경구 부신피질 호르몬제나 항히스타민제, 항염제를 복용하지 않았으며, 검사 부위에 국소 부신피질 호르몬제를 바르지 않았다.

수분 함량을 피부 정전부하용량 계측법(skin capacitance measurement)으로 측정하는 장비인 피부 수분량 측정기(Corneometer CM 825)를 이용하여 피부의 수분 함량을 측정하였다.

시험 시작 30분 전부터 항온항습 조건(20~22℃, 상대습도 40~55%)의 실내에서 대기한 지원자의 상박부에 각각의 시료를 균일하게 도포하고, 시료를 도포하지 않은 좌측상박부를 대조군으로 도포 직전 및 도포 직후에 피부 수분 함량을 측정하였다.

시료는 단마 냉침추출물과 온침추출물을 각각 3% 함유한 O/W 제형의 화장료와 단마 추출물을 함유하지 않은 화장료를 이용하였다.

4-2. 피부 보습 효과 실험결과

각질층은 정상인의 경우 10~20% 정도의 수분을 함유하고 있어 피부보습을 유지하지만 나이가 들거나 환경적 요인으로 수분 함량이 감소하여 피부 가려움, 주름생성 등 피부노화를 촉진시킨다. 또한 각질세포의 세포간 지질은 세라마이드 등의 라멜라 구조와 천연보습인자가 존재하지만 내, 외적인 요인에 의해 변형되거나 파괴되어 피부가 건조해지게 된다.

따라서 피부의 건조를 막아주는 막을 형성시켜 주거나 체내 천연보습인자를 증진시켜 줌으로써 피부 노화를 억제할 수 있다.

도 4를 참조해보면, 실험 결과 단마 냉침추출물과 온침추출물이 첨가된 화장료에서 기본 화장료 보다 각각 45.63%, 38.65% 더 좋은 보습력을 보였으며, 지속력 또한 우수한 것으로 나타났다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 보습력과 지속력을 갖고 있는바 피부 노화를 방지할 수 있는 화장료 소재로서의 효능을 보유하고 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 단마 추출물의 섬유아세포 증식 효과

5-1. 섬유아세포 증식 효과 실험방법

섬유아세포 증식률 측정은 Mosmann의 방법(Mosmann, T. Rapid, “colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J Immunol Methods 65: 55-63, 1983.)을 변형하여 실시하였다.

24-well 배양 용기에 HDFn(Human Dermal Fibroblast neonatal) 세포를 3×10⁴ 개씩 분주하고 24시간 배양 후 시료를 여러 농도로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 하에서 1일간 배양하였다.

배양 후 최종 농도 0.5 ㎎/㎖로 MTT 용액을 넣어 3시간 배양한 다음 상층액을 제거하고, 형성된 formazan을 DMSO(1 ml)로 녹여서 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

5-2. 섬유아세포 증식 효과 실험결과

피부에 상처가 생기면 손상된 조직의 구조와 기능적 항상성을 회복하기 위하여 다양한 신호전달 경로가 활성화되는데, 상처치유 과정은 크게 염증기, 재상피화기, 증식기 및 성숙기의 4단계로 구분된다.

염증기 동안에는 상처 자리에 면역 세포들이 혈관을 통해 이동하게 되고 과립조직 형성을 유도하는 성장인자와 신호전달 물질들이 분비된다.

증식기는 재상피화기와 비슷한 시기에 진행되는데, 과립 조직들이 형성된다. 과립조직은 섬유아세포, 염증성 세포, 미성숙 콜라겐, fibronectin, 히알루론산 등의 세포외기질 구성요소들로 이루어져 있다.

이 과립조직들이 상처부분을 빠르게 채우고 조직적인 구조를 갖추는 것이 상처치료에 중요하다.

재상피화가 완료되면 결합조직이 증식되고, 성숙기 조직의 엉긴 세포들과 모세혈관들이 조금씩 사리지게 되는데, 이 과정 동안 조직들이 과형성 되거나 정상적으로 분해되지 않을 경우 흉터가 남게 된다.

MTT 분석은 미토콘드리아의 탈수소 효소작용을 이용하여 세포의 증식과 성장을 측정하는 대표적인 실험방법 중 하나로 살아있는 세포 수에 비례해서 흡광도를 나타낸다.

도 5를 참조해보면, 단마 냉침추출물과 온침추출물을 처리하였을 때 모든 추출물에서 대조군과 비교하여 유의적으로 증식률이 증가하였고, 대조군과 비교하여 냉침추출물 200 mg/ml에서는 109.7%, 온침추출물 200 mg/ml에서는 114%로 온침추출물의 증식률이 더 높게 나타났다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 섬유아세포의 증식을 유도함으로써 피부 노화를 개선 및 치료할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

실험예 6. 단마 추출물의 섬유아세포 이동 및 증식 효과

6-1. 섬유아세포 이동 및 증식 효과 실험방법

0.9 ㎜로 세포가 자라지 않은 공간을 형성시키고 단마 냉침추출물과 온침추출물을 각각 50 mg/ml로 처리하여 24시간 배양한 후 현미경으로 관찰하였다.

양성 대조군으로 TGF-β(5 ng/ml)를 처리하였다.

6-2. 섬유아세포 이동 및 증식 효과 실험결과

도 6에는 A(대조군), B(24시간 경과후 대조군), C(TGF-β, 5 ng/ml 처리), D(50 mg/ml LDA 처리), E(50 mg/ml HAD 처리)의 현미경 관찰 결과가 나타나 있다.

실험 결과 냉침추출물과 온침추출물 처리군 모두 대조군 보다 우수한 이동성과 증식을 보였으며, 양성 대조군으로 사용한 TGF-β 보다 더 좋은 효과를 보였다.

또한 단마 온침추출물이 냉침추출물보다 세포의 이동성과 증식 효과가 더 좋은 것으로 나타났다.

즉 본 실험의 wound healing assay kit를 이용한 현미경적 관찰 결과는 실험예 5의 MTT 분석 결과와 유사함을 확인할 수 있었다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 섬유아세포의 증식을 유도함으로써 피부 노화를 개선함은 물론 상처 치유를 촉진할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

실험예 1 내지 실험예 6을 총괄하여 정리하여 보면, 실시예 1에 따른 단마 추출물은 DPPH 라디칼 소거능 활성, SOD 활성 효과를 보유하고 있는바 산화적 스트레스에 의한 피부 노화를 개선, 방지할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

또한 실시예 1에 따른 단마 추출물은 교원질 분해효소(Collagenase)의 활성 억제, 피부 보습 효과를 보유하고 있는바 피부의 상태를 건강하게 유지함으로써 피부 노화를 개선, 방지할 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

또한 실시예 1에 따른 단마 추출물은 섬유아세포의 증식 유도 효과를 보유하고 있는바 노화되거나 상처가 있는 피부의 상태를 개선, 향상시킬 수 있는 효과를 보유하고 있음을 알 수 있다.

따라서 실시예 1에 따른 단마 추출물은 산화적 스트레스, 내인성 노화 및 외인성 노화에 기인하는 피부 노화 증상을 예방, 개선 및 치료하는 효능이 현저하다고 할 수 있겠다.

Claims

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단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 단마 추출물은, DPPH 라디칼 소거능을 활성화하는 효능, SOD 활성을 촉진하는 효능, 교원질 분해효소(Collagenase) 활성을 억제하는 효능, 피부 보습을 촉진하는 효능, 섬유아세포의 이동 및 증식을 촉진하는 효능을 보유함으로써, 피부 내의 진피층(Dermis)에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 인하여 발생하는 내인성(intrinsic) 및 외인성(extrinsic) 피부 노화를 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물.
단마(Dioscorea aimadoimo) 추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 단마 추출물은, DPPH 라디칼 소거능을 활성화하는 효능, SOD 활성을 촉진하는 효능, 교원질 분해효소 활성을 억제하는 효능, 피부 보습을 촉진하는 효능 및 섬유아세포의 이동 및 증식을 촉진하는 효능을 보유함으로써, 피부 내의 진피층에 존재하는 세포외기질의 구조적인 변화로 인하여 발생하는 내인성 또는 외인성 피부 노화를 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품.