WO2019022222A1 - 培地添加用組成物及び培地添加用化合物並びにそれらを用いた細胞又は組織の培養方法 - Google Patents

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WO2019022222A1
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mmol
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carbon atoms
medium
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泰斗 西野
彩子 相原
敬一朗 大塚
康一郎 猿橋
巧 三ヶ島
政宏 竃浦
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日産化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/72—Hydrazones
    • C07C251/86—Hydrazones having doubly-bound carbon atoms of hydrazone groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Definitions

  • the present invention relates to a composition or the like for adding a culture medium, and more particularly, to a composition or the like for adding a culture medium for promoting cell growth, and a method of culturing cells or tissues characterized by using the composition or the like for adding the culture medium. .
  • Three-dimensional culture is a cell culture technology that plays an intermediate role between in vitro and in vivo.
  • cells can form a three-dimensional structure such as spheres (also referred to as spheroids), and thus can allow a more biological assay as compared to normal two-dimensional culture. Therefore, three-dimensional culture may be able to identify a compound for treating a disease that could not be identified by drug discovery screening using two-dimensional culture (Non-patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a novel compound capable of promoting cell growth in cell culture (particularly three-dimensional cell culture).
  • the present inventors have found that the compound newly synthesized this time can extremely well promote the growth of various cells in three-dimensional culture, and further studies based on such findings. To complete the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a composition for adding a medium which comprises a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or -YWZ-Ar, wherein Y and Z each have a single bond or a carbon number of 1 to 6 which may have a substituent Is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2). It is. ⁇ [2] The composition according to [1], wherein X is -NHCO-. [3] The composition according to [1] or [2], wherein R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and n is 0.
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is a methylene group which may have an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • W is N (R 4 )
  • Z is a single bond
  • Ar is an aryl group which may have a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • [1] The composition according to any one of to [3].
  • [5] The composition according to [4], wherein the aryl group is a phenyl group.
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is a single bond
  • W is N (R 4 )
  • R 4 is a hydrogen atom
  • Z is a single atom
  • Ar has a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • [7] The composition according to [6], wherein the aryl group is a phenyl group.
  • composition according to any one of [1] to [3], [6], and [7], wherein the compound is a compound selected from the group consisting of: or a salt thereof.
  • composition according to any one of [1] to [3], [9] and [10], wherein the compound is a compound shown below or a salt thereof.
  • composition according to any one of [1] to [13], which is for promoting cell growth [15] The composition according to [14], wherein the cells are selected from the group consisting of normal cell lines, cancer cell lines and stem cells.
  • the normal cell line is African green monkey kidney epithelium-derived cells (Vero cells), canine kidney tubular epithelial cells (MDCK cells), Chinese hamster ovary-derived cells (CHO-K1), human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) or The composition according to [15], which is a mouse embryonic fibroblast (C3H10T1 / 2).
  • the cancer cell line is human ovarian cancer cell line SKOV3, human cervical cancer cell line HeLa, human malignant melanoma cell line A375, human epithelial cell carcinoma cell line A431, human gastric gland Cancer cell line AGS, human prostate cancer cell line LN Cap clone FGC, human colon adenocarcinoma cell line HCT116, human alveolar basal epithelial cell carcinoma cell line A549, and human prostate cancer cell DU145
  • the composition according to [15] which is one or more selected from the group consisting of [18]
  • the composition of [15] wherein the stem cells are human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human mesenchymal stem cells (MSC).
  • composition according to any one of [1] to [13], which is used to promote sphere formation, organoid formation, or Cyst formation [20] The composition according to [19], wherein the sphere is a cancer cell line, human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human mesenchymal stem cells (MSC). [21] The composition according to [19], wherein the organoid is a small intestine-derived cell. [22] The composition of [19], wherein Cyst is a kidney-derived cell. [23] A medium comprising the composition for adding a medium according to any one of [1] to [13]. [24] The medium according to [23], which is for promoting cell growth.
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • MSC human mesenchymal stem cells
  • a method for promoting cell growth which comprises adding the medium addition composition according to any one of [1] to [13] to a medium.
  • the method according to [27], wherein the cells are selected from the group consisting of normal cell lines, cancer cell lines and stem cells.
  • Normal cell lines are African green monkey kidney epithelium-derived cells (Vero cells), canine kidney tubular epithelial cells (MDCK cells), Chinese hamster ovary-derived cells (CHO-K1), human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) or The method according to [28], which is a mouse embryonic fibroblast (C3H10T1 / 2).
  • the cancer cell line is human ovarian cancer cell line SKOV3, human cervical cancer cell line HeLa, human malignant melanoma cell line A375, human epithelial cell cell line A431, human gastric gland Cancer cell line AGS, human prostate cancer cell line LN Cap clone FGC, human colon adenocarcinoma cell line HCT116, human alveolar basal epithelial cell carcinoma cell line A549, and human prostate cancer cell DU145 [28] the method according to [28], which is one or more selected from the group consisting of [31] The method according to [28], wherein the stem cells are human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human mesenchymal stem cells (MSC).
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • MSC human mesenchymal stem cells
  • a method for promoting sphere formation, organoid formation or cyst formation which comprises adding to the culture medium a composition for adding a culture medium according to any one of [1] to [13].
  • the sphere is a cancer cell line, human induced pluripotent stem cells (iPS cells) or human mesenchymal stem cells (MSC).
  • iPS cells human induced pluripotent stem cells
  • MSC human mesenchymal stem cells
  • the method of [33] wherein the organoid is a small intestine-derived cell.
  • Cyst is a kidney-derived cell.
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or -YWZ-Ar, wherein Y and Z each have a single bond or a carbon number of 1 to 6 which may have a substituent Is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2).
  • R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2).
  • X is -NHCO-
  • R 2 is an ethyl group, when n is 0, R 1 is, -CH Not -NH-C 6 H 5.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms and n is 0.
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is a methylene group
  • W is N (R 4 )
  • Z is a single bond
  • Ar is a halogen atom
  • the compound or a salt thereof according to [40] wherein the aryl group is a phenyl group.
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is a single bond
  • W is N (R 4 )
  • R 4 is a hydrogen atom
  • Z is a single atom
  • Ar has a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • the compound or the salt thereof according to any one of [37] to [39], which is an optionally substituted aryl group.
  • the present invention is as follows.
  • a composition for adding a medium which comprises a compound represented by the following general formula (Ia), or a salt thereof.
  • a medium comprising the composition for adding a medium according to [50].
  • a method for promoting cell growth comprising adding the composition for adding a medium described in [50] to a medium.
  • a method for promoting sphere formation, organoid formation or Cyst formation comprising adding the composition for media addition described in [50] to a culture medium.
  • R 1a is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent
  • Ar is an aryl group which may have a substituent
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent
  • R 3a Is a hydrogen atom or a hydroxyl group (wherein, when X is -NHCO-, R 2 is an ethyl group, and R 3a is a hydrogen atom, R 1a is -CH 2 -NH-C 6 H Not 5 ).
  • the compound represented by the formula (I) or a salt thereof has cell growth promoting activity in three-dimensional culture, and thus significantly promotes cell growth, sphere formation, organoid formation, and / or Cyst formation. Can.
  • FIG. 1 is a diagram showing Cyst formation of MDCK cells cultured in a medium to which the composition of the present invention was added, using a confocal fluorescence microscope.
  • n- is normal, i- is iso, sec- is secondary and tert- is tertiary.
  • o- is ortho, m- is meta and p- is para.
  • halogen atom is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • halogeno group is fluoro, chloro, bromo or iodo.
  • alkyl group and the “alkyl group having 1 to 10 carbon atoms” mean a linear or branched alkyl group, and specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl , Sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, n-hexyl, 2-hexyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n -Groups such as decyl and the like.
  • C1-C6 alkyl group means a linear or branched alkyl group, and specifically, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, Groups such as tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, n-hexyl, 2-hexyl and the like can be mentioned.
  • Aryl includes monocyclic, bicyclic, tricyclic and tetracyclic carbocyclic groups in which at least one ring is aromatic and each ring has 5 to 8 ring atoms.
  • examples include phenyl, indenyl, naphthyl, fluorenyl and the like.
  • the aryl group may be phenyl, indenyl or naphthyl which is a ring having 6 to 10 carbon atoms.
  • alkylene group and "alkylene group having 1 to 6 carbon atoms” mean a linear or branched alkylene group, and more specifically, groups such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene and the like It can be mentioned.
  • alkyl group the "aryl group” and the “alkylene group” may have a substituent, and examples of such a substituent include the following.
  • alkyl group the following (1) to (40) may be mentioned, and in the case of "aryl group” and “alkylene group”, the following (1) to (41) may be mentioned.
  • halogeno group (2) hydroxyl group, (3) cyano group, (4) nitro group, (5) Carboxyl group, (6) Alkenyl group (C 2-10 alkenyl group; for example, vinyl, allyl, propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, butadienyl, hexatrienyl, and each isomer thereof), (7) alkynyl group (C 2-10 alkynyl group; for example, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl and each isomer thereof), (8) a halogenoalkyl group (eg, monofluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, monofluoroethyl, difluoroethyl, trifluoroethyl, chloromethyl, chloroethyl, dichloroethyl and their respective
  • carbamoyl group (27) carbamoyl group, (28) a carbamoyl group mono- or di-substituted with an alkyl group (as defined for the “alkyl group” in the above (26)) (eg, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl) (29) sulfamoyl group, (30) A sulfamoyl group mono- or di-substituted with an alkyl group (as defined for the "alkyl group” in the above (26)) (eg, methylsulfamoyl, ethylsulfamoyl, dimethylsulfamoyl, diethylsulfamoyl, Ethyl methyl sulfamoyl), (31) an alkanoyl group (eg, a
  • C 1-6 alkyl group is one having 1 to 6 carbon atoms among the above “alkyl groups”
  • C 6-10 aryl group is one of the above “aryl groups”. Among them, those having 6 to 10 carbon atoms.
  • acyl group examples include acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyroyl group, valeroyl group, isovaleroyl group, pivaloyl group, hexanoyl group, acryloyl group, methacryloyl group, crotonoyl group, isocrotonoyl group, benzoyl group, naphthoyl group Groups, etc., (37) an alkoxycarbonylamino group (eg, a carbonylamino group substituted with an alkoxy group (as defined in the above (12)), (38) an alkylsulfonyl group (eg, a sulfonyl group substituted with an alkyl group (as defined as the “alkyl group” in the above (26)), (39) an alkylsulfinyl group (eg, a sulfinyl group substituted with an alkyl group (as defined as the “alkyl
  • substituents When two or more substituents are present, they may be the same or different.
  • the compounds of formula (I) may be in the form of salts.
  • the salt of the compound represented by the formula (I) include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid and hydrobromic acid, as well as acetic acid, propionic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, And salts with organic acids such as succinic acid, citric acid and benzoic acid.
  • the compound represented by the formula (I) may have geometric isomers of E form having E configuration and Z form having Z configuration depending on the type of substituent.
  • the present invention includes the E form, the Z form or a mixture containing the E form and the Z form in any ratio.
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or -YWZ-Ar, wherein Y and Z each have a single bond or a carbon number of 1 to 6 which may have a substituent Is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2). It is. ⁇
  • the compounds represented by the above formula (I) have ketone compounds (k) and H 2 N—X—R 1 (wherein X and R 1 have the above-mentioned meanings, as represented by the following reaction formula, For example, it can synthesize
  • a salt thereof [eg, glycine ethyl hydrochloride (A-1) and the like] can be used to synthesize a compound consisting of a combination of a ketone compound and an amine compound among the compounds represented by formula (I) . It is preferable to carry out the reaction in a solvent such as toluene, 1,4-dioxane, N, N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide or the like at a temperature range of 100 ° C. or more for 1 hour to 24 hours, using one equivalent of each of the above-mentioned raw materials. .
  • a salt of amine hydrochloride, p-toluenesulfonate, trifluoroacetate and the like can be used.
  • the reaction mixture is precipitated by adding distilled water, or when not precipitated, it is subjected to a usual post treatment such as extraction after extraction with an organic solvent, and used for the intended present invention Compounds can be obtained.
  • a purification method such as recrystallization, column chromatograph, thin layer chromatograph, liquid chromatograph or the like.
  • three-dimensional cell culture means culturing cells in a three-dimensional environment using, for example, an embedded culture method, a microcarrier culture method, a sphere culture method or the like.
  • a solid or semisolid gel substrate such as Matrigel (registered trademark), Geltrex (registered trademark), agar, methylcellulose, collagen, gelatin, fibrin, agarose, and alginate. Culture method.
  • microcarriers In the microcarrier culture method, cells are grown in a monolayer on the surface of microparticles (hereinafter, also referred to as microcarriers) slightly heavier than water, and the microparticles are agitated in a culture vessel such as a flask, and suspended in a suspended state. It is a culture.
  • a culture vessel such as a flask
  • spheres or spheroids In the sphere culture, cells of interest form aggregates of several tens to several hundreds (hereinafter also referred to as spheres or spheroids), and then the aggregates are cultured by standing or shaking in a medium. It is a method.
  • an irregular three-dimensional network can be obtained by dispersing polysaccharides such as hyaluronic acid, deacylated gellan gum, xanthan gum or derivatives thereof in a medium.
  • polysaccharides such as hyaluronic acid, deacylated gellan gum, xanthan gum or derivatives thereof in a medium.
  • a method of culturing the cells in a three-dimensional state closer to the living body can also be used.
  • the cells in the three-dimensional cell culture are trapped in the three-dimensional network and do not precipitate. Therefore, the cells can be cultured without requiring shaking, rotation operation and the like.
  • Three-dimensional cell culture can be performed by a method known per se (see, for example, WO 2014/017513).
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or -YWZ-Ar, wherein Y and Z each have a single bond or a carbon number of 1 to 6 which may have a substituent Is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent
  • R 3 is a hydroxyl group
  • n is 0, 1 or 2). It is.
  • the compounds, media, and compounds of the present invention or salts thereof used in the methods may be collectively referred to as “compounds used in the present invention”).
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent (more preferably, it has a substituent)
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, particularly preferably an octyl group
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent (preferably, the number of carbons which may have a substituent)
  • R 2 is an alkyl group of 1 to 6, particularly preferably an ethyl group
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably has no substituent)
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably an ethyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, or R 1 is a C 1 to 10 carbon atom which may have a substituent.
  • R 1 is an aryl group which may have a substituent (more preferably, an aryl group having no substituent, particularly preferably a phenyl group)
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which does not have a substituent, particularly preferably an ethyl group)
  • n 0.
  • R 1 is -YWZ-Ar, where, when Y is a single bond, W is N (R 4 ) (more Preferably, it is N (R 4 ), and R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and particularly preferably N (R 4 ), and R 4 is a hydrogen atom) Or an oxygen atom, and Z is a single bond or an alkylene group which may have a substituent (more preferably a single bond or an alkylene group having no substituent, particularly preferably a single bond or An aryl group (more preferably a hydroxyl group), and an aryl group (more preferably a hydroxyl group) which may have a substituent (more preferably a halogen atom, a hydroxyl group, a methyl group or a methoxy group) Aryl groups which do not have, particularly preferably A phenyl group) having no phenyl group or a substitu
  • X is -NHCO-
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably, carbon
  • W is N (R 4 ) (more preferably N (R 4 ), wherein R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably N (R 4 ) (Wherein R 4 is a hydrogen atom), Z is a single bond
  • Ar is an aryl group which may have a substituent (more preferably, an aryl group having a substituent) , Particularly preferably, phenyl having a halogeno group, a hydroxyl group, a methyl group or an
  • the present invention provides the following novel compound or a salt thereof (hereinafter sometimes referred to as “the compound of the present invention”).
  • the compounds of the present invention have the formula (I)
  • R 1 is an optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, substituted An aryl group which may have a group, or -YWZ-Ar, wherein Y and Z each have a single bond or a carbon number of 1 to 6 which may have a substituent Is an oxygen atom, a sulfur atom or N (R 4 ), R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and Ar has a substituent.
  • R 2 each represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent, R 3 is a hydroxyl group, and n is 0, 1 or 2). is (provided that X is -NHCO-, R 2 is an ethyl group, when n is 0, R 1 is, -CH Not -NH-C 6 H 5.) . Or a salt thereof.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent (more preferably And an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which has no substituent, particularly preferably an octyl group
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent
  • it is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which has no substituent, particularly preferably an ethyl group
  • n 0.
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a substituent (preferably, the number of carbons which may have a substituent)
  • R 2 is an alkyl group of 1 to 6, particularly preferably an ethyl group
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably has no substituent)
  • R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably an ethyl group
  • R 3 is a hydrogen atom, or R 1 is a C 1 to 10 carbon atom which may have a substituent.
  • R 1 is an aryl group which may have a substituent (more preferably, an aryl group having no substituent, particularly preferably a phenyl group)
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which does not have a substituent, particularly preferably an ethyl group)
  • n 0.
  • R 1 is -YWZ-Ar, where, when Y is a single bond, W is N (R 4 ) (more Preferably, it is N (R 4 ), and R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and particularly preferably N (R 4 ), and R 4 is a hydrogen atom) Or an oxygen atom, and Z is a single bond or an alkylene group which may have a substituent (more preferably a single bond or an alkylene group having no substituent, particularly preferably a single bond or An aryl group (more preferably a hydroxyl group), and an aryl group (more preferably a hydroxyl group) which may have a substituent (more preferably a halogen atom, a hydroxyl group, a methyl group or a methoxy group) Aryl groups which do not have, particularly preferably A phenyl group) having no phenyl group or a substitu
  • X is -NHCO-
  • R 1 is -YWZ-Ar
  • Y is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent (more preferably substituted When it is a C1-C6 alkylene group having no group, particularly preferably a methylene group
  • W is N (R 4 ) (more preferably N (R 4 )
  • R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, particularly preferably N (R 4 ), wherein R 4 is a hydrogen atom)
  • Z is a single bond
  • Ar is an aryl group which may have a substituent (more preferably, an aryl group having a substituent, particularly preferably a phenyl group having a halogeno group, a hydroxyl group, a methyl group or an ethoxy group, or
  • R 2 is a naphthyl group), which may have a substituent And an alkyl group of ⁇
  • the compounds used in the present invention are as follows.
  • composition for Media Addition provides a composition for media addition (hereinafter sometimes referred to as "the composition of the present invention") containing the compound used in the present invention as an active ingredient.
  • the composition of the present invention is capable of promoting cell growth, sphere formation, organoid formation, and Cyst formation by adding to a cell culture medium, particularly to a three-dimensional cell culture medium, or any of these. Combinations can be achieved.
  • composition of the present invention is specifically exemplified below: (1) cell growth promotion; (2) sphere formation promotion; (3) promotion of organoid formation; (4) promotion of cyst formation; (5) cell growth promotion and sphere formation promotion; (6) cell growth promotion and organoid formation promotion; (7) Cell growth promotion and Cyst formation promotion; (8) sphere formation promotion and organoid formation promotion; (9) sphere formation promotion and Cyst formation promotion; (10) Organoid formation promotion and Cyst formation promotion; (11) cell growth promotion, sphere formation promotion and organoid formation promotion; (12) cell growth promotion, sphere formation promotion and Cyst formation promotion; (13) cell growth promotion, organoid formation promotion and Cyst formation promotion; (14) sphere formation promotion, organoid formation promotion and Cyst formation promotion; or (15) Cell growth promotion, sphere formation promotion, organoid formation promotion and Cyst formation promotion.
  • composition of the present invention may contain one or more of the compounds used in the present invention as an active ingredient.
  • composition of the present invention may also contain other components other than the compounds used in the present invention.
  • Such components are not particularly limited as long as the desired effects of the present invention can be obtained, and such components include, for example, water, physiological saline, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerin, propylene glycol, butylene glycol, and methanol, ethanol, butanol, propanol And various alcohols, etc. may be included.
  • the composition of the present invention may be sterilized if necessary.
  • the sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, filter sterilization and the like.
  • the material of the filter part when performing filter sterilization is not particularly limited, for example, glass fiber, nylon, PES (polyether sulfone), hydrophilic PVDF (polyvinylidene fluoride), cellulose Mixed esters, cellulose acetate, polytetrafluoroethylene and the like can be mentioned.
  • the size of the pores of the filter is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, more preferably 0.1 ⁇ m to 1 ⁇ m, and most preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the composition may be solid or in solution.
  • the compounding amount of the compound used in the present invention as an active ingredient in the composition of the present invention is that when the composition of the present invention is added to a culture medium (particularly, a three-dimensional cell culture medium), the culture medium is
  • the concentration is not particularly limited as long as it can achieve the desired effect of
  • the lower limit of the concentration of the compound used in the present invention is usually 0.001 ⁇ M or more, preferably as a concentration at which the desired effect of the present invention can be exerted. It may be 0.01 ⁇ M or more, more preferably 0.1 ⁇ M or more, further preferably 1 ⁇ M or more, and particularly preferably 10 ⁇ M or more.
  • the upper limit value of the concentration may be usually 100 ⁇ M or less, preferably 50 ⁇ M or less, particularly preferably 10 ⁇ M or less.
  • compositions of the present invention may be in any form as provided or stored.
  • the composition may be bound to a formulated solid such as a tablet, pill, capsule or granule, a suitable solvent and a liquid such as a solution or suspension dissolved with a solubilizer, or a substrate or carrier.
  • Can be Additives at the time of formulation include preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters; excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol; lubricants such as magnesium stearate and talc; polyvinyl Binders such as alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; and plasticizers such as glycerin.
  • Cell types that achieve cell growth promotion and the like are not particularly limited as long as desired effects can be obtained by adding the composition of the present invention to a culture medium (in particular, a three-dimensional cell culture medium).
  • a culture medium in particular, a three-dimensional cell culture medium.
  • Germ cells, somatic cells that constitute a living body normal cell lines, cancer cell lines, progenitor cells, stem cells, artificially genetically modified cells isolated from living bodies, artificially nuclear exchange after isolated from living bodies Cell types such as cultured cells.
  • the origin of these cells is also not particularly limited, but rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, common Preferred are cells derived from mammals such as marmosets, squirrel monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees and humans.
  • the tissue or organ from which the cells are derived is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained, but the tissue may be skin, kidney, spleen, adrenal, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach Tissues such as colon, small intestine, large intestine, spleen, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessel tissue, blood, heart, eye, brain or nerve tissue
  • the organs include, but are not limited to, organs such as liver, lung, kidney, heart, pancreas, stomach, spleen, small intestine, large intestine, genitals and the like.
  • the organoid may be preferably small intestine-derived cells.
  • Cyst may be preferably a kidney-derived cell.
  • C3H10T1 / 2 human embryonic fibroblasts
  • HEK293 human fetal kidney cells
  • MDBK bovine kidney-derived cells
  • MDCK dog renal tubular epithelial cells
  • CHO-K1 Choinese
  • Vero cells African green monkey kidney epithelial-derived cells
  • NIH 3T3 mouse fetal fibroblasts
  • HepaRG hepatocytes, registered trademark
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • human primary culture hepatocytes etc.
  • MDCK, HUVEC, CHO-K1 and Vero cells are particularly preferred.
  • cancer cell lines include, but are not limited to, human breast cancer cell lines such as HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7 / ADR RES, HS578T. , MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, HeLa as a human cervical cancer cell line, A549 as a human lung cancer cell line, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, human colon cancer cell lines Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116 , HT-29, KM-12, SW-620, WiDr, DU-14 as a human prostate cancer cell line , PC-3, LNCaP, U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75,
  • a stem cell is a cell having both the ability to replicate itself and the ability to differentiate into cells of multiple other lineages, examples of which include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES Cells), embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, Stem cells, hair follicle stem cells and the like.
  • Pluripotent stem cells include ES cells, embryonic germ stem cells, and iPS cells among the stem cells.
  • the precursor cells are cells in the process of differentiating from the stem cells to specific somatic cells or germ cells.
  • iPS cells and mesenchymal stem cells are particularly preferred.
  • stem cells such as MSCs are cultured using a three-dimensional cell culture medium to which the composition of the present invention is added
  • cell proliferation is maintained while maintaining the cell trait (eg, undifferentiated).
  • Maintenance of the undifferentiated nature of MSCs can be confirmed by analyzing the expression of cell surface markers by flow cytometry (FCM) (see, for example, WO 2016/136986), and as cell surface markers of MSCs, CD29, CD73, It is mentioned that CD90 and CD105 etc. are positive. Therefore, the present invention can also be suitably used for mass production of stem cells such as MSCs.
  • FCM flow cytometry
  • composition of the present invention can be replaced with the term “agent of the present invention” or “agent for media addition of the present invention”.
  • the present invention provides a culture medium (hereinafter sometimes referred to as “the culture medium of the present invention”) containing the compound used in the present invention or the composition of the present invention.
  • the medium of the present invention any one or any combination of the promotion of cell growth, the promotion of sphere formation, the promotion of organoid formation, and the promotion of Cyst formation can be achieved.
  • the medium of the present invention is particularly preferably a three-dimensional cell culture medium.
  • the concentration of the compound used in the present invention contained as an active ingredient in the culture medium of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
  • it may be 0.01 ⁇ M or more, more preferably 0.1 ⁇ M or more, still more preferably 1 ⁇ M or more, and particularly preferably 10 ⁇ M or more.
  • the upper limit value of the concentration may be usually 100 ⁇ M or less, preferably 50 ⁇ M or less, particularly preferably 10 ⁇ M or less.
  • the medium of the present invention can be the same as the composition of a known medium except that the compound used in the present invention or the composition of the present invention is blended.
  • the culture medium of the present invention can be prepared by adding the compound or composition used in the present invention to a commercially available culture medium (in particular, a three-dimensional cell culture medium).
  • the commercial medium which can be used as the medium of the present invention by adding the compound used in the present invention or the composition of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, for example, Dulbecco's modified Eagle's medium (Dulbecco ' s Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM / F12 Medium, McCoy's 5A Medium (McCoy's 5A medium), Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM (alpha) Modified Eagle's Minimum Essential Medium; ⁇ MEM, MEM (Minimum Essential Medium) ), RPMI 1640 medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB 131 medium, William medium E, IPL 41 medium, Fischer's medium, Ste
  • polysaccharides such as deacylated gellan gum
  • the culture medium made into the three-dimensional cell culture culture medium can be used.
  • FCeM registered trademark
  • Wako Pure Chemical Industries, Ltd. may be mentioned, but it is not limited thereto.
  • sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, cell growth factors, differentiation inducers, cell adhesion factors, antibodies, enzymes, Cytokines, hormones, lectins, extracellular matrices, physiologically active substances and the like may be added according to the purpose.
  • the culture of cells in the medium of the present invention may be carried out in a petri dish generally used for cell culture, flasks, plastic bags, Teflon® bags, dishes, petri dishes, dishes for tissue culture, mulch It can be carried out using culture vessels such as dishes, microplates, microwell plates, multiplates, multiwell plates, chamber slides, tubes, trays, culture bags, roller bottles and the like. It is desirable that these culture vessels have low cell adhesion so that cells to be cultured (adherent) do not adhere to the culture vessel.
  • the surface of the culture vessel is not artificially treated (for example, coated with an extracellular matrix etc.) for the purpose of improving the adhesion to cells, or a culture vessel
  • the surface may be artificially treated to reduce its adhesion to cells.
  • Sumilon cell tight plate made by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • PrimeSurface (registered trademark) plate made by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • super low adhesion surface plate made by Corning
  • Nunclons ferra plate Manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • the present invention promotes cell proliferation, which comprises adding the compound used in the present invention or the composition of the present invention to a culture medium
  • a method, a method of promoting sphere formation, a method of promoting organoid formation, or a method of promoting Cyst formation may be collectively referred to as "the method of the present invention”.
  • the culture medium used in the method of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained.
  • it is a three-dimensional cell culture medium.
  • cell culture conditions for example, temperature, carbon dioxide concentration, culture period, etc.
  • the temperature at which the cells are cultured is usually 25 ° C. to 39 ° C., preferably 33 ° C. to 39 ° C. (eg, 37 ° C.) for animal cells.
  • the carbon dioxide concentration is usually 4% by volume to 10% by volume, preferably 4% by volume to 6% by volume, in the culture atmosphere.
  • the culture period is usually 1 to 35 days, but may be appropriately set according to the purpose of culture.
  • the method for forming cell aggregates (spheres) is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art. Examples thereof include a method using a container having a cell non-adherent surface, a hanging drop method, a swirl culture method, a three-dimensional scaffold method, centrifugation, a method using aggregation by an electric field or a magnetic field, and the like.
  • a method using a container having a cell non-adherent surface cells of interest can be cultured in a surface-treated culture container that inhibits cell adhesion to form spheres. When this cell non-adherent culture vessel is used, first, the target cell is collected, and then the cell suspension is prepared, and the cell suspension is seeded and cultured.
  • a surface of a culture vessel such as a petri dish generally used may be coated with a substance that inhibits cell adhesion.
  • a substance that inhibits cell adhesion include agarose, agar, copolymers of poly-HEMA (poly- (2-hydroxy-ethyl methacrylate) 2-methacryloyloxyethyl phosphoryl choline) with other monomers (such as butyl methacrylate), Examples include 2-methoxymethyl acrylate), poly-N-isopropyl acrylamide, Meviol gel (registered trademark) and the like, but there is no limitation to these without cytotoxicity.
  • NATURE BIOTECHNOLOGY VOL. 28, NO. 4, APRIL 2010, 361-366, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO.
  • the methods described in US Patent No. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259 can also be used.
  • the medium used in the culture to form the spheres can also contain components that accelerate the formation of the spheres or promote their maintenance.
  • components having such an effect include dimethyl sulfoxide, superoxide dismutase, ceruloplasmin, catalase, peroxidase, L-ascorbic acid, L-ascorbic acid phosphate, tocopherol, flavonoid, uric acid, bilirubin, selenium-containing compound And transferrin, unsaturated fatty acid, albumin, theophylline, forskolin, glucagon, dibutylyl cAMP and the like.
  • the selenium-containing compounds include sodium selenite, sodium selenate, dimethyl selenide, hydrogen selenide, selenomethionine, Se-methylselenocysteine, selenocystathionine, selenocysteine, selenohomocysteine, adenosine-5'-phosphoselenic acid, Examples include ROCK inhibitors such as Se-adenosylselenomethionine, Y-27632, Fasudil (HA1077), H-1152, Wf-536 and the like.
  • the seeded cells do not form cell aggregates between the recess and the recess when the cells are seeded. It is possible to reliably form cell aggregates of a size corresponding to the volume in the recess and obtain a cell aggregate population of uniform size.
  • the shape of the recess in this case is preferably a hemisphere or a cone.
  • spheres can be formed on a support having cell adhesion.
  • a support having cell adhesion.
  • examples of such a support include collagen, polyrotaxane, polylactic acid (PLA), polylactic acid glycolic acid copolymer (PLGA), hydrogel and the like.
  • Spheres can also be formed by co-culture with feeder cells.
  • feeder cells for promoting sphere formation, any adherent cells can be used, but preferably feeder cells corresponding to various cells are desirable.
  • the feeder cells include COS-1 cells and vascular endothelial cells as a suitable cell type.
  • a hanging drop method can also be selected as a method of forming a sphere.
  • the hanging drop method for example, droplets of a cell suspension (about 10 to 50 ⁇ L as a volume) are spotted on the ceiling side of the lid of the culture vessel and the like, and cultured in an inverted state so that the deposited droplets hang The method is mentioned. By culturing in this way, the cells are minimally affected by contact with the flat surface and form spheres at the bottom of the droplet.
  • Such droplets can also be prepared using a special culture vessel such as GravityPLUS Plate (manufactured by Perkin Elmer).
  • spheres can be prepared using droplets containing 100 to 100,000, preferably 200 to 10,000, more preferably 500 to 10,000 cells. In order to form spheres, culture is preferably performed for 6 to 48 hours.
  • the size of the spheres varies depending on the cell type and the culture period, but is not particularly limited, but when it is spherical or spheroidal, it is 20 to 1000 ⁇ m, preferably 40 to 500 ⁇ m, more preferably 50 to 300 ⁇ m, most preferably Have a diameter of 80 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • Such spheres can retain their proliferation ability for a period of 10 days or more, preferably 13 days or more, more preferably 30 days or more, by continuing the static culture as they are, but furthermore, periodically during static culture.
  • proliferative ability can be maintained substantially indefinitely.
  • the culture vessel used for the culture of the spheres is not particularly limited as long as it can generally culture animal cells, and, for example, a flask, a dish, petri dishes, a dish for tissue culture, a multidish, a microplate, a micro Well plate, multi plate, multi well plate, chamber slide, cell culture flask, spinner flask, petri dish, tube, tray, culture bag, roller bottle, EZSPHERE (manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.), Sumilon cell tight plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) Etc.).
  • EZSPHERE manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.
  • Sumilon cell tight plate manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • a microplate, a microwell plate, a multiplate, and a multiwell plate are suitably used when carrying out the evaluation of a large number of anticancer agents and the evaluation of drug candidate compounds or drugs.
  • the shape of the well bottom of these plates is not particularly limited, but flat bottom, U-shaped or V-shaped can be used, and preferably U-shaped is used.
  • the material of the culture equipment is not particularly limited, and examples thereof include glass, polyvinyl chloride, cellulose polymers, polystyrene, polymethyl methacrylate, polycarbonate, polysulfone, polyurethane, polyester, polyamide, polystyrene, polypropylene, and other plastics. .
  • the culture medium used when performing the embedding culture can contain a cell adhesion factor, and examples thereof include Matrigel (registered trademark), Geltrex (registered trademark), collagen, gelatin, poly-L-lysine, Poly-D-lysine, laminin, fibronectin, vitronectin, tenascin, selectin, hyaluronic acid, fibrin and the like can be mentioned.
  • cell adhesion factors can also be added in combination of 2 or more types.
  • agar, guar gum, tamarind gum, alginic acid propylene glycol ester, locust bean gum, gum arabic, tara gum, tamarind gum, methylcellulose, carboxymethylcellulose, agarose, tamarind seed gum, pullulan, etc. can be further mixed.
  • These thickeners can also be added in combination of 2 or more types.
  • organoid mini-organ formed by culturing stem cells or progenitor cells in vitro in a three-dimensional environment
  • Cyst a luminal structure formed by epithelial cells
  • a method using the above-mentioned embedded culture can be mentioned.
  • a cell or tissue of interest can be cultured in the embedded culture medium containing the cell adhesion factor described above to form an organoid or cyst.
  • the suspension is prepared and seeded in a culture medium for embedding culture and culture is performed. When culture is continued for 3 to 14 days, cells spontaneously form organoid or cyst.
  • the medium used in the method of the present invention may be the medium of the present invention.
  • concentration, cell type and the like of the compound used in the present invention or the composition of the present invention in the medium in the method of the present invention are the same as those described in “2. Composition for Medium Addition”.
  • k-1, k-2 and k-5 can be synthesized by known methods (Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1; 71 (26-27): 4557 -4564.
  • H-1, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-9, D-2 and D-4 are synthesized by known methods (Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun; 81 (6): 715-29. Et al.). Therefore, the synthesis methods of k-3 and H-7 will be detailed below.
  • composition of k-3 Dissolve 2,4,6-trihydroxybenzaldehyde (2.22 g, 14.4 mmol) in THF (40 mL), add NaBH 3 CN (2.7 g, 43 mmol), acetic acid (8 mL) under ice-cooling, and at room temperature Stir for 2 hours.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate (50 mL) and washed sequentially with water (50 mL ⁇ 2), saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 mL), brine (50 mL).
  • the intermediate compound (1.04 g, 7.42 mmol) obtained as described above is suspended in propionic acid (7 mL), propionic anhydride (1.15 mL, 8.90 mmol), BF 3 -Et 2 O (1.12 mL, 8.90 mmol) was added and heated to reflux at 130 ° C. for 1 h. After cooling, the reaction solution was diluted with ethyl acetate (100 mL) and washed successively with water (100 mL ⁇ 3), saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (100 mL ⁇ 2), and brine (100 mL).
  • the intermediate compound (5.11 g, 26.4 mmol) obtained as described above is dissolved in methanol (26 mL), hydrazine monohydrate (12.8 mL, 264 mmol) is added, and the reaction is continued for 4.5 hours at room temperature. It stirred. Water (150 mL) was added and extracted with methylene chloride (30 mL ⁇ 5).
  • compound numbers k-1: D-2 and k-1: D-4 can also be synthesized by a method according to the above synthesis method.
  • k-1 100 mg, 0.55 mmol
  • glycine benzyl p-toluenesulfonate (A-2) 243 mg, 0.721 mmol
  • sodium acetate 64 mg, 0.78 mmol
  • DMSO 1.1 mL
  • k-1 (100 mg, 0.55 mmol) is dissolved in DMSO (1.1 mL), n-octylamine (A-3) (120 mL, 0.72 mmol) is added, and 2 hours at room temperature, 17 hours at 100 ° C. It stirred. After allowing to cool, water (20 mL) and ethyl acetate (20 mL) were added for liquid separation, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL).
  • the 104 (187 mg, 0.937 mmol) and k-1 (130 mg, 0.72 mmol) obtained as described above were dissolved in DMSO (1.4 mL) and stirred at 100 ° C. for 22 hours.
  • the solid was collected by filtration and dried under reduced pressure to give k-1: I-3 (155 mg, 0.428 mmol, 59% yield) as a white solid.
  • the 106 (168 mg, 0.937 mmol) and k-1 (130 mg, 0.72 mmol) obtained as described above were suspended in DMSO (2.8 mL) and stirred at 100 ° C. for 22 hours.
  • Table 1 shows the results of 1 H-NMR measurement of the compounds listed in Table 3.
  • Dissolve 110 (340 mg, 1.9 mmol) obtained as above in methanol (3.8 mL), add hydrazine monohydrate (0.18 mL, 3.8 mmol) and stir at 60 ° C. for 24 hours did. Hydrazine monohydrate (0.36 mL, 7.4 mmol) was added and stirred at 60 ° C. for additional 17 hours.
  • Ethyl 2-bromoisovalerate (112) (700 mg, 3.3 mmol) is dissolved in DMSO (7 mL) and aniline (0.40 mL, 4.4 mmol), potassium carbonate (0.60 g, 4.4 mmol) are added The mixture was stirred at room temperature for 21 hours, at 80 ° C. for 6 hours, and at 120 ° C. for 20 hours. Ethyl acetate (30 mL) and water (50 mL) were added for separation, and the organic layer was washed with saturated brine (30 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Dissolve 116 (585 mg, 2.47 mmol) obtained as described above in DMSO (5 mL) and add aniline (0.29 mL, 3.2 mmol), potassium carbonate (0.44 g, 3.2 mmol) The mixture was stirred at room temperature for 21 hours and at 60 ° C. for 16 hours. Ethyl acetate (30 mL) and water (50 mL) were added for separation, and the organic layer was washed with saturated brine (30 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Phenyl puruvic acid (119) (1.0 g, 6.1 mmol) is dissolved in DMF (5 mL), and under ice cooling, DBU (1.0 mL, 6.7 mmol), methyl iodide (0.42 mL, 6.7 mmol) ) was added and stirred at room temperature for 3 hours. Ethyl acetate (30 mL) and 1 M hydrochloric acid (50 mL) were added for separation, and the organic layer was washed with saturated brine (50 mL) and dried over anhydrous sodium sulfate.
  • Dissolve 120a (295 mg, 1.66 mmol) obtained as described above in methanol (6.6 mL), acetic acid (0.66 mL), 2 M ethylamine in THF (0.87 mL, 1.7 mmol), and cool on ice Lower picoline borane (0.35 g, 3.3 mmol) was added and stirred at room temperature for 2.5 hours. 4 M hydrochloric acid (3 mL) was added, and the mixture was heated at 50 ° C. for 30 minutes, allowed to cool, and then ethyl acetate (20 mL) and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 mL) were added to separate the layers.
  • the 120b (45 mg, 0.22 mmol) obtained as described above is dissolved in methanol (0.9 mL), hydrazine monohydrate (0.021 mL, 0.43 mmol) is added, and 3 hours at 50 ° C. Add methanol (0.9 mL), hydrazine monohydrate (0.021 mL, 0.43 mmol) and add methanol (0.9 mL), hydrazine monohydrate (0.021 mL, 0.43 mmol) for 12 hours The mixture was additionally stirred for 3 hours.
  • Boc-Gly-OH (121) (0.70 g, 4.0 mmol) in methylene chloride (13 mL) and add WSC (0.84 g, 4.4 mmol), phenylhydrazine (122) (0.47 mL, 4. 8 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. Water (20 mL) was added for separation, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL).
  • Boc-Gly-OH (121) (0.70 g, 4.0 mmol) in methylene chloride (13 mL), WSC (0.84 g, 4.4 mmol), benzylamine (125) (0.52 mL, 4. 8 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 hours. Water (20 mL) and methylene chloride (20 mL) were added for separation, and the organic layer was washed with saturated brine (20 mL).
  • the 138 (0.94 g, 4.1 mmol) obtained as described above was dissolved in acetonitrile (4 mL), hydrazine monohydrate (1.0 mL, 21 mmol) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 23 hours.
  • the 141 (100 mg, 0.43 mmol) and k-1 (233 mg, 1.29 mmol) obtained as described above were suspended in DMSO (1.4 mL) and stirred at 100 ° C. for 20 hours. After allowing to cool, methylene chloride was added, insolubles were filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained solid was washed with methylene chloride and water and then dried under reduced pressure to give k-1: F-1 (88. 6 mg, 0.159 mmol, yield 37%) as a pale yellow solid.
  • N-Methyl-aniline (142) (0.50 g, 4.7 mmol) is dissolved in ethanol (9 mL), potassium carbonate (0.97 g, 7.0 mmol), ethyl bromoacetate (128) (0.57 mL, 5 1 mmol) was added and stirred at 60 ° C. for 21 hours.
  • the insoluble matter was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate (30 mL) and water (30 mL) were added to the residue obtained to separate it.
  • the organic layer is washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • Dissolve 143 (0.49 g, 2.6 mmol) obtained as above in methanol (5 mL), add hydrazine monohydrate (0.25 mL, 5.1 mmol) and stir at 55 ° C. for 15 hours did. Additional hydrazine monohydrate (0.50 mL, 10 mmol) was added and stirred at 60 ° C. for a further 18 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the obtained solid was washed with IPE and then dried under reduced pressure to give 144 (389 mg, 2.17 mmol, yield 83%) as a white solid.
  • k-1 L-1 (65 mg, white solid) was synthesized by the method according to Synthesis Example 21 described above.
  • k-1 M-1 (119 mg, white solid) was synthesized by the method according to the above-mentioned Synthesis Example 21.
  • N-ethyl-aniline (145) (0.50 g, 4.1 mmol) is dissolved in ethanol (8 mL) and potassium carbonate (0.86 g, 6.2 mmol), ethyl bromoacetate (128) (0.50 mL, 4 1 mmol) was added and stirred at 60 ° C. for 21 hours.
  • the insoluble matter was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate (30 mL) and water (30 mL) were added to the residue obtained to separate it.
  • the organic layer is washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • Dissolve 146 (0.47 g, 2.3 mmol) obtained as above in methanol (4.5 mL) and add hydrazine monohydrate (0.22 mL, 4.5 mmol) to 55 ° C. 15 Stir for hours. Additional hydrazine monohydrate (0.44 mL, 9.1 mmol) was added and stirred at 60 ° C. for a further 18 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the obtained solid was washed with IPE and then dried under reduced pressure to give 147 (309 mg, 1.60 mmol, 70% yield) as a white solid.
  • Dissolve 149 (200 mg, 1.6 mmol) obtained as described above in methylene chloride (2 mL) and water (2 mL), add sodium hydrogen carbonate (0.27 g, 3.2 mmol), and cool under ice cooling. Acid phenyl (136) (0.22 mL, 1.7 mmol) was slowly added dropwise. It stirred at room temperature for 20 hours, ethyl acetate (20 mL) and water (20 mL) were added, and it liquid-separated. The organic layer is washed with saturated brine (20 mL), dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • 2-Hydroxybenzyl alcohol (1.0 g, 8.1 mmol) is suspended in methylene chloride (10 mL) and water (10 mL), sodium hydrogen carbonate (2.0 g, 24 mmol) is added, and phenyl chloroformate (ice-cooled) 2.0 mL, 16 mmol) was slowly added dropwise. The temperature was gradually raised to room temperature and stirred for 5.5 hours, and methylene chloride (20 mL) and water (20 mL) were added to separate the layers. The organic layer is washed with saturated brine (30 mL), dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the residue was collected by filtration to give k-1: N-1 (85.5 mg, 0.248 mmol, 45% yield) as a white solid.
  • Test Example 1 Examination of Cell Proliferation Activity of Each Compound The growth promotion effect of cells when the compound used in the present invention was added to a three-dimensional medium was examined. Specifically, SKOV3 cells (human ovarian cancer-derived cell line) precultured (adherent culture) are recovered and suspended in a three-dimensional cell culture medium ("FCeM (registered trademark)" (Nissan Chemical Co., Ltd.)). , Cell suspension was prepared. The cell suspension was seeded in wells of a 384-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (Corning # 3827) at a density of 1000 cells / 40 ⁇ L / well. The cell suspension seeded on the plate was allowed to stand overnight at 37 ° C.
  • FCeM registered trademark
  • the results are shown in Tables 5 and 6.
  • the growth rate was calculated based on the control (100%) as a control (cells to which DMSO not containing the compound used in the present invention was added). Also, the values shown in the table are the average values of the results of two tests.
  • the human ovarian cancer cell line SKOV3 (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) is suspended in the medium composition to which the above-mentioned deacylated gellan gum is added, and then a 384-well flat bottom ultra low adhesion surface microplate (manufactured by Corning) # 3827) wells were dispensed at 1000 cells / 40 ⁇ L / well per well (three-dimensional culture (3D)).
  • Monolayer culture (2D) was carried out by suspending human ovarian cancer cell line SKOV3 in the above-mentioned medium composition without deacylated gellan gum, and then using the wells of a 384-well flat bottom microplate (Corning # 3712).
  • each plate was cultured in a static state in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). On the first day of the culture, 4.4 ⁇ L each of the compound used in the present invention dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to a final concentration of 0, 0.5, 1, 5, 10, 20 ⁇ M, and then The culture was continued for 4 days.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • k-1: H-7 and k-1: H-10 show a cell growth promoting effect in a wide range of concentrations under the conditions in which SKOV3 cells are three-dimensionally cultured (3D), and further SKOV3 cells are in the medium Form a sphere.
  • 3D three-dimensionally cultured
  • 2D monolayer culture
  • the non-supplemented culture medium composition which does not contain deacylated gellan gum was prepared as monolayer culture.
  • the human ovarian cancer cell line SKOV3 (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) is suspended in the medium composition to which the above-mentioned deacylated gellan gum is added, and then a 384-well flat bottom ultra low adhesion surface microplate (manufactured by Corning) # 3827) wells were distributed at 1000 cells / 36 ⁇ L / well per well (three-dimensional culture (3D)).
  • Monolayer culture (2D) was carried out by suspending human ovarian cancer cell line SKOV3 in the above-mentioned medium composition without deacylated gellan gum, and then using the wells of a 384-well flat bottom microplate (Corning # 3712). It dispensed so that it might become 400 cells / 36 microliters per well. After dispensing, 4 ⁇ L each of the compound used in the present invention dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to a final concentration of 0, 1, 5, 10, and 20 ⁇ M. Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 4 days in a stationary state.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • k-1 I-1
  • k-1: J-1 under the conditions in which SKOV3 cells were three-dimensionally cultured (3D)
  • the k-1: D-2, k-1: I-10, and k-1: N-1 exhibited cell growth promoting effects at a wide range of concentrations, and further, SKOV3 cells formed spheres in the culture medium.
  • DMEM / F12 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 1 mL is aliquoted and observed under a microscope, and the small intestine fragment (crypt, Crypt) is sufficiently filtered.
  • the solution was selected and the Crypt number was counted on a hemocytometer.
  • Test Example 5 Effects of Compounds Used in the Present Invention on Various Human Cancer Cells 1
  • Various human-derived cancer cells were precultured (monolayer culture) in each culture medium as described below.
  • FBS fetal bovine serum
  • HeLa American Type Culture Collection
  • DMEM Abbreviated as DMEM
  • human malignant melanoma-derived cell line A375 manufactured by ATCC, DMEM containing 10% FBS
  • human epithelial-like cell carcinoma-derived cell line A431 Manufactured by ATCC
  • 10% FBS and 1% MEM non-essential amino acid solution
  • MEM Non-Essential Amino Acids solution hereinafter abbreviated as NEAA
  • MEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • MEM abbreviated as MEM
  • human gastric adenocarcinoma cancer-derived cell line AGS manufactured by DS Pharma Biomedical, Ham's F-12 containing 10% FBS
  • adherent cells After washing the above cells in logarithmic growth phase with PBS, adherent cells are added with 0.25 w / v% trypsin-1 mmol / L EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1 at 37 ° C. The cells were incubated for ⁇ 5 minutes, peeled off, added with each medium, centrifuged, resuspended in the same medium, and then recovered as single cells.
  • trypsin-1 mmol / L EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • deacylated gellan gum concentration is 0.015 w / v%, but only RPMI 1640 only 0.020 w / v%), 1000 to 12000 cells.
  • 96 well low adhesion U bottom plate (Corning, Deacylated gellan gum-free medium) or low adhesion flat bottom plate (Corning, deacylated gellan gum containing medium) at a cell concentration of / 135 ⁇ L / well Seeded (both in 3D culture). After standing culture overnight at 37 ° C.
  • a DMSO solution of the compound used in the present invention was added to each medium to a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M.
  • the amount of each compound solution added was 15 ⁇ L / well.
  • a DMSO solution dissolved in the medium was added (DMSO final concentration 0.1%).
  • WST-8 solution made by Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.
  • the absorbance at 450 nm was measured by SPECTRA MAX 190 (manufactured by Molecular Devices), and the number of living cells was determined by subtracting the absorbance of the medium alone. Furthermore, the relative value at the time of each compound addition was calculated when the absorbance of no compound addition (control) was 100%. Those showing values of 119% or less are shown as-, those showing values of 120% or more as ⁇ , and those showing values of 150% or more as ⁇ as compared with no compound addition (control). .
  • k-1: H-7 and k-1: H-10 enhance proliferation activity under three-dimensional conditions in a plurality of cancer cell lines.
  • the cancer cell lines formed spheres using either the low adhesion U bottom plate or the low adhesion flat bottom plate.
  • Test Example 6 Effects of Compounds Used in the Present Invention on Various Human Cancer Cells 2
  • Human ovarian cancer cell line SKOV3 DS Pharma Biomedical, 15% fetal bovine serum (FBS, Corning) containing McCoy's 5a medium (Sigma Aldrich)
  • human alveolar basal epithelial adenocarcinoma derived cells Strain A549 DS Pharma Biomedical, 10% FBS-containing DMEM (Wako Pure Chemical Industries)
  • human cervical cancer-derived cell line HeLa ATCC, 10% FBS-containing DMEM
  • human malignant melanoma -Derived cell line A375 manufactured by ATCC, DMEM containing 10% FBS
  • cell line A431 derived from human epithelial-like cell carcinoma (manufactured by ATCC, 10% FBS and 1% MEM non-essential amino acid solution (MEM NEAA
  • the various cells described above are suspended in each medium containing or not containing deacylated gellan gum (deacylated gellan gum concentration is 0.015 w / v%), and at a cell concentration of 700 to 2000 cells / 90 ⁇ L / well,
  • the cells were seeded on 96-well low adhesion U bottom plates (Corning # 4520, deacylated gellan gum-free medium) or low adhesion flat bottom plates (Corning # 3474, deacylated gellan gum-containing medium) 3D culture).
  • the compounds used in the present invention dissolved in DMSO were added to each culture medium to a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M.
  • the addition amount of each compound solution was 10 ⁇ L / well.
  • a DMSO solution dissolved in the medium was added (DMSO final concentration 0.1%).
  • DMSO final concentration 0.1%) After 4 days of culture in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, add 40 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Promega) to the culture fluid on day 4 for 15 minutes.
  • ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Promega
  • k-1 I-1
  • k-1 B-1
  • k-1 D-1
  • k-1 J-1 in three-dimensional conditions in multiple cancer cell lines It was found to enhance the proliferative activity. At this time, the cancer cell lines formed spheres using either the low adhesion U bottom plate or the low adhesion flat bottom plate.
  • the compounds used in the present invention dissolved in the culture medium to a final concentration of 10 ⁇ M were added, and the cells were cultured in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 for 7 days.
  • DMSO was added to a final concentration of 0.1%.
  • PBS 1 mL / well
  • Paraformaldehyde / PBS manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the supernatant was removed, washed three times every 5 minutes with IF buffer, and 0.5 mL / well of blocking buffer (1% BSA (Sigma Aldrich) / IF buffer) was added and incubated for 30 minutes.
  • the supernatant was removed, and anti- ⁇ -catenin antibody (manufactured by BD Bioscience) was diluted 100-fold in blocking buffer and added at 250 ⁇ L / well, and incubated overnight at 4 ° C. in the dark.
  • VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI manufactured by Vector Laboratories
  • ArrayScan manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • the compounds used in the present invention dissolved in the medium to a final concentration of 5 ⁇ M and 10 ⁇ M were added, and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 in an incubator for 6 days.
  • DMSO was added to a final concentration of 0.1%.
  • the size and number of Cysts formed with Cell 3 iMager were measured. The proportion of Cysts of 70 ⁇ m or more in the whole Cyst is shown in Table 14.
  • a permeabilization buffer (0.5% Triton X-100 (Sigma Aldrich) / PBS) was added and incubated for 30 minutes at room temperature. The supernatant was removed, washed three times every 5 minutes with IF buffer, and 0.5 mL / well of blocking buffer (1% BSA (Sigma Aldrich) / IF buffer) was added and incubated for 30 minutes. The supernatant was removed, and anti- ⁇ -catenin antibody (manufactured by BD Bioscience) was diluted 100-fold in blocking buffer, added at 250 ⁇ L / well, and incubated at room temperature for 60 minutes.
  • hMSCs were suspended in a deacylated gellan gum-free medium composition, and then seeded at 4.0 ⁇ 10 4 cells / 2 mL / well in a 6-well flat bottom plate (Corning # 3516) . Subsequently, a solution of the compound used in the present invention dissolved in the medium was added to a final concentration of 10 ⁇ M, and the mixture was cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 7 days. As a control, DMSO was added to a final concentration of 0.1%.
  • the cells are washed with PBS, added with 0.25 w / v% trypsin-1 mmol / L EDTA solution, incubated at 37 ° C. for 2 to 5 minutes, detached, added with culture medium, centrifuged, and supernatant Was removed. Thereafter, after resuspension in the same medium, a part was suspended in trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the number of living cells was counted by TC-20 (manufactured by BIO-RAD).
  • CD34 antibody APC, manufactured by BD Bioscience
  • CD73 BV421, manufactured by BD Bioscience
  • CD29 BB515, manufactured by BD Bioscience
  • SM buffer 2% FBS / PBS
  • PI Propidium Iodide
  • Table 15 The relative value at the time of each compound addition when the cell number of a compound non-addition (control) is set to 1 to Table 15 was computed.
  • Table 16 shows the positive or negative rates of CD34, CD73, and CD29 in cells subjected to three-dimensional culture (3D) with no addition and compound addition conditions.
  • k-1: H-7 and k-1: H-10 were found to have the effect of increasing the number of hMSCs in two- and three-dimensional cell culture conditions. In three-dimensional cell culture conditions, hMSCs formed spheres. At that time, the negative rate of the cell surface markers CD34, the positive rate of CD73 and CD29 did not change with the addition of the compound (Table 16). From the above results, it was revealed that k-1: H-7 and k-1: H-10 enhance cell proliferation while maintaining the undifferentiated nature of hMSCs.
  • BM-hMSC Bone marrow-derived human mesenchymal stem cells
  • 2D bone marrow-derived human mesenchymal stem cells
  • 3D three-dimensional culture method
  • hMSCs are suspended in a medium composition to which deacylated gellan gum is added, and then 6000 cells / 90 ⁇ L / well in 96-well flat bottom ultra low adhesion surface plate (Corning # 3474) It sowed so that it might become.
  • hMSCs are suspended in a deacylated gellan gum-free medium composition, and then 2000 cells are formed in a 96-well EZSPHERE plate (Asahi Techno Glass Co., Ltd., # 4860-900). The cells were seeded at 90 ⁇ L / well.
  • hMSCs were suspended in a deacylated gellan gum-free medium composition, and then seeded on a 96-well flat bottom plate (Corning # 3585) at 2000 cells / 90 ⁇ L / well.
  • k-1: I-1, k-1: B-1, k-1: D-1 and k-1: J-1 are proliferations of BM-hMSC in three-dimensional cell culture conditions It was found to enhance the activity. Under three-dimensional cell culture conditions, BM-hMSCs formed spheres. In addition, k-1: B-1 and k-1: J-1 were found to enhance the proliferation activity of hMSC even in two-dimensional cell culture conditions.
  • the above cells in logarithmic growth phase are washed with PBS, added with 0.25 w / v% trypsin-1 mmol / L EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and kept at 37 ° C. for 3 minutes. Incubate and detach, add media, centrifuge and remove supernatant.
  • trypsin-1 mmol / L EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the various cells described above are suspended in each medium containing or not containing deacylated gellan gum (deacylated gellan gum concentration is 0.015 w / v%, cell concentration of 700 to 2000 cells / 90 ⁇ L / well, 96
  • the cells were seeded (3D culture) on well low adhesion U-bottom plates (Corning # 4520, deacylated gellan gum-free medium)
  • the compounds used in the present invention dissolved in DMSO had a final concentration of 1 ⁇ M or The amount of each compound solution added was 10 ⁇ L / well, and the DMSO solution dissolved in the medium was added (final concentration of DMSO 0.1%).
  • fibroblasts As a result of this test, in fibroblasts, k-1: I-1, k-1: B-1, k-1: D-1, and k-1: J-1 have proliferative activity under three-dimensional conditions. It has been found to enhance. At this time, fibroblasts formed spheres when using a low adhesion U bottom plate.
  • the cell suspension was seeded on the back of a lid of a 3.5 cm dish (Falcon, # 351 008) in 15 ⁇ l aliquots to make droplets. At this time, 15 drops of 10 ⁇ L of medium (DMSO final concentration 0.05%) to which DMSO was added was inoculated as a control. The lid was returned to a 3.5 cm dish to which 2 mL of PBS was added, and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 2 days. The cultured droplet was collected into a 1.5 mL tube, and the medium was added to a final volume of 150 ⁇ L.
  • medium DMSO final concentration 0.05%
  • ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • RLU luminescence intensity
  • k-1: H-1, k-1: H-7, and k-1: B-1 were found to be A431 cell line and bone marrow-derived human even under the condition of three-dimensional cell culture by hanging drop method. The effect of increasing the number of mesenchymal stem cells was observed. At this time, the A431 cell line and bone marrow-derived human mesenchymal stem cells formed spheres in the droplets by the hunting drop method.
  • the above cells are suspended in a medium containing 10 ⁇ M Y-27632 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 96-well EZSPHERE plate (AGC Technoglass Co., Ltd.) at a cell concentration of 10000 cells / 200 ⁇ L / well. Sowing to # 4860-900).
  • the compound used in the present invention dissolved in diluted DMSO was added to each culture medium to a final concentration of 5 ⁇ M. The amount of each compound solution added was 2 ⁇ L / well.
  • a DMSO solution dissolved in the medium was added (DMSO final concentration 0.05%). The medium was changed by half every day, and each compound solution was also added so that the compound concentration became constant.
  • k-1 H-1, k-1: H-7, k-1: B-1, k-1: D-1, k-1: J-1 And k-1: I-10 were found to enhance proliferative activity under three-dimensional conditions.
  • Test Example 14 Action of the Compound of the Present Invention on Vascular Endothelial Cells Preincubation (monolayer culture) of human umbilical vein endothelial cells (PromoCell) was performed in Endothelial Cell Growth Medium (PromoCell) medium. After washing the cells in logarithmic growth phase with PBS, adherent cells were detached by adding Detach Kit (PromoCell), incubating for 3 minutes at 37 ° C., adding medium, centrifuging and resuspending in the same medium .
  • the above cells are suspended in each medium containing or not containing deacylated gellan gum (deacylated gellan gum concentration is 0.015 w / v%), and at a cell concentration of 700 to 2000 cells / 90 ⁇ L / well, 96 Seeds were applied to hole low adhesion U bottom plate (Corning # 4520, deacylated gellan gum-free medium) or low adhesion flat bottom plate (Corning # 3474, deacylated gellan gum-containing medium) (all in 3D) culture). Subsequently, the compounds used in the present invention dissolved in DMSO were added to each culture medium to a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M. The addition amount of each compound solution was 10 ⁇ L / well.
  • a DMSO solution dissolved in the medium was added (DMSO final concentration 0.1%).
  • DMSO final concentration 0.1%) 100 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Promega) to the culture fluid on day 4 for 15 minutes.
  • ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Promega
  • RLU value luminescence intensity
  • EnSpire manufactured by Perkin Elmer
  • the number of viable cells was measured.
  • the relative values upon addition of each compound are shown in [Table 22], where the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) with no compound added is 100%.
  • k-1: H-1, k-1: H-7, k-1: I-1, k-1: B-1, k-1: D-1 And k-1: J-1 were found to enhance proliferative activity under three-dimensional conditions.
  • human umbilical vein endothelial cells formed spheres using either the low adhesion U-bottom plate or the low adhesion flat-bottom plate.
  • Test Example 15 Effects of the Compound of the Present Invention on Animal Cell Lines
  • Various animal cell lines were precultured (monolayer culture) in each medium as described below.
  • Chinese hamster ovary-derived cell line CHO-K1 manufactured by DS Pharma Biomedical, 10% fetal bovine serum (FBS, manufactured by Corning) Ham's F-12 medium (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries)), African green monkey Renal epithelium-derived cell line Vero (distributed from JCRB cell bank, Medium 199 medium containing 5% FBS (manufactured by Life Technologies)).
  • adherent cells After washing the above cells in logarithmic growth phase with PBS, adherent cells are added with 0.25 w / v% trypsin-1 mmol / L EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. Incubate for 3 minutes to detach, add each medium, centrifuge and resuspend in the same medium.
  • trypsin-1 mmol / L EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the various animal cells described above are suspended in each medium containing or not containing deacylated gellan gum (the deacylated gellan gum concentration is 0.02 w / v% for Ham's F-12 medium and 0.015 w for Medium 199 medium) 96-well low-adhesion U-bottom plate (Corning # 4520, deacylated gellan gum-free medium) or low-adhesion flat-bottom plate at a cell concentration of 700-2000 cells / 90 ⁇ L / well The cells were seeded on Corning (# 3474, deacylated gellan gum-containing medium) (all in 3D culture).
  • the compounds used in the present invention dissolved in DMSO were added to each culture medium to a final concentration of 5 ⁇ M or 10 ⁇ M.
  • the addition amount of each compound solution was 10 ⁇ L / well.
  • a DMSO solution dissolved in the medium was added (DMSO final concentration 0.1%).
  • ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, Promega
  • the luminescence intensity (RLU value) is measured by EnSpire (manufactured by Perkin Elmer), and the luminescence value of the medium alone is subtracted. The number of viable cells was measured. The relative value at the time of each compound addition was calculated when the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) with no compound added was 100%. When compared with no compound added (control), those showing values of 119% or less are shown as-, those showing values of 120% or more as ⁇ , those showing 150% or more as ⁇ Tables and 23 as Table It is shown in Table 24.
  • k-1: H-1, k-1: H-7, k-1: I-1, k-1: B-1, k-1: D-1 in a plurality of animal cell lines And k-1: J-1 were found to enhance proliferative activity under three-dimensional conditions.
  • animal cell lines formed spheres using either the low adhesion U bottom plate or the low adhesion flat bottom plate.
  • any one or any combination of these can be achieved in promoting cell growth, promoting sphere formation, promoting organoid formation, and promoting Cyst formation.
  • the cells etc. prepared according to the present invention are very useful, for example, in the field of drug discovery.

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Abstract

本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩を含む、培地添加用組成物を提供する。｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝

Description

培地添加用組成物及び培地添加用化合物並びにそれらを用いた細胞又は組織の培養方法
　本発明は、培地添加用組成物等に関し、詳細には、細胞増殖促進用の培地添加用組成物等、並びに当該培地添加用組成物等を用いることを特徴とする細胞又は組織の培養方法に関する。
　近年、細胞を用いた実験は、生命現象の作用機序の解明や疾患の治療法の確立等を目的として、生命科学分野をはじめとする多くの分野において極めて頻繁に行われている。例えば、創薬の分野における一例として、治療標的となるがん細胞に対して候補化合物を作用させ、がん細胞の増殖を抑制し得る化合物をスクリーニングする方法がある。かかるスクリーニングにおいては、数万種の候補化合物をスクリーニングすることもあり、このような態様では均質な細胞を大量に準備する必要がある。しかし、ヒト等の高等生物の細胞は、比較的分裂が早い細胞であっても１日程度の期間を要し、また、がん細胞や幹細胞には１回の細胞分裂に要する期間が数か月以上にも及ぶものも存在し、迅速な細胞調達を妨げる要因となっている。かかる背景から、分裂の遅い細胞の増殖を促進し得る手段の構築が求められており、例えば、特定の構造を有するチオール化合物が造血前駆細胞の増殖を促進することや、ポリプレニル系化合物が肝細胞の増殖を促進すること等が報告されている（特許文献１、２）。
　一方で、創薬スクリーニングの分野において、近年、細胞の３次元培養が注目されている。３次元培養は、in vitroとin vivoの中間を担う細胞培養技術である。３次元培養では、細胞はスフェア（スフェロイドともいう）等の立体構造を形成し得、従って、通常の２次元培養と比較して、より生体に近いアッセイが可能となり得る。従って、３次元培養は、２次元培養を用いた創薬スクリーニングでは特定できなかった疾患治療用化合物を特定できる可能性がある（非特許文献１）。
特表平１１－５０４０００号公報 国際公開第２００８／１５５９２０号
スーザン・ブレスリン（Susan Breslin）、「ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ（Drug Discovery Today）」、２０１３年、第１８巻、第５号、ｐ．２４０－２４９
　本発明は、細胞培養（特に３次元細胞培養）において、細胞増殖を促進させ得る新規化合物の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、今回新規に合成した化合物が３次元培養下の各種細胞の増殖を極めて良好に促進し得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]下記式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩を含む、培地添加用組成物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
[２]Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、[１]記載の組成物。
[３]Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、[１]または[２]に記載の組成物。
[４]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[１]～[３]のいずれかに記載の組成物。
[５]アリール基が、フェニル基である、[４]に記載の組成物。
[６]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、単結合または炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[１]～[３]のいずれかに記載の組成物。
[７]アリール基が、フェニル基である、[６]に記載の組成物。
[８]Ｚが、メチレン基である、[６]または[７]に記載の組成物。
[９]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、酸素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[１]～[３]のいずれかに記載の組成物。
[１０]アリール基が、フェニル基であり、Ｚが、メチレン基である、[９]に記載の組成物。
[１１]化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、[１]～[５]のいずれかに記載の組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 [１２]化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、[１]～[３]、[６]、及び[７]のいずれかに記載の組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
[１３]化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、[１]～[３]、[９]及び[１０]のいずれかに記載の組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
[１４]細胞増殖促進用である、[１]～[１３]のいずれかに記載の組成物。
[１５]細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、[１４]記載の組成物。
[１６]正常細胞株が、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはマウス胚線維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）である、[１５]記載の組成物。
[１７]がん細胞株が、ヒト卵巣がん由来細胞株ＳＫＯＶ３、ヒト子宮頚がん由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａｐ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９、およびヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５からなる群から選択される１以上である、[１５]記載の組成物。
[１８]幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、[１５]記載の組成物。
[１９]スフェア形成、オルガノイド形成、またはＣｙｓｔ形成の促進に用いられる、[１]～[１３]のいずれかに記載の組成物。
[２０]スフェアが、がん細胞株、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、[１９]記載の組成物。
[２１]オルガノイドが、小腸由来細胞である、[１９]記載の組成物。
[２２]Ｃｙｓｔが、腎臓由来細胞である、[１９]記載の組成物。
[２３][１]～[１３]のいずれかに記載の培地添加用組成物を含む、培地。
[２４]細胞増殖促進用である、[２３]記載の培地。
[２５]三次元細胞培養培地である、[２３]または[２４]に記載の培地。
[２６]スフェア形成、オルガノイド形成、またはＣｙｓｔ形成の促進に用いられる、[２３]記載の培地。
[２７][１]～[１３]のいずれかに記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
[２８]細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、[２７]記載の方法。
[２９]正常細胞株が、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞（Ｖｅｒｏ細胞）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ－Ｋ１）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）またはマウス胚線維芽細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）である、[２８]記載の方法。
[３０]がん細胞株が、ヒト卵巣がん由来細胞株ＳＫＯＶ３、ヒト子宮頚がん由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａｐ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９、およびヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５からなる群から選択される１以上である、[２８]記載の方法。
[３１]幹細胞が、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、[２８]記載の方法。
[３２]培地が、三次元細胞培養培地である、[２７]～[３１]のいずれかに記載の方法。
[３３][１]～[１３]のいずれか記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、スフェア形成、オルガノイド形成またはＣｙｓｔ形成を促進させる方法。
[３４]スフェアが、がん細胞株、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、[３３]記載の方法。
[３５]オルガノイドが、小腸由来細胞である、[３３]記載の方法。
[３６]Ｃｙｓｔが、腎臓由来細胞である、[３３]記載の方法。
[３７]下記式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝
[３８]Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、[３７]記載の化合物またはその塩。
[３９]Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、[３７]または[３８]に記載の化合物またはその塩。
[４０]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、メチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[３７]～[３９]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[４１]アリール基が、フェニル基である、[４０]に記載の化合物またはその塩。
[４２]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、単結合または炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[３７]～[３９]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[４３]アリール基が、フェニル基である、[４２]に記載の化合物またはその塩。
[４４]Ｚが、メチレン基である、[４２]または[４３]に記載の化合物またはその塩。
[４５]Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、酸素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、[３７]～[３９]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
[４６]アリール基が、フェニル基であり、Ｚが、メチレン基である、[４５]に記載の化合物またはその塩。
[４７]以下からなる群より選択される、[３７]～[４１]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
[４８]以下からなる群から選択される、[３７]～[３９]、[４２]及び[４３]のいずれかに記載の化合物またはその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
および、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
[４９]以下で示される化合物またはその塩である、[３７]～[３９]、[４５]及び[４６]のいずれかに記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　別態様において、本発明は以下の通りである。
［５０］下記一般式（Ｉ－ａ）で示される化合物、またはその塩を含む、培地添加用組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１ａは、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３ａは、水素原子またはヒドロキシル基である。｝
［５１］［５０］に記載の培地添加用組成物を含む、培地。
［５２］［５０］に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
［５３］［５０］に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、スフェア形成、オルガノイド形成またはＣｙｓｔ形成を促進させる方法。
［５４］下記一般式（Ｉ－ａ）で示される化合物、またはその塩：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１ａは、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－ＮＨ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３ａは、水素原子またはヒドロキシル基である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、Ｒ３ａが水素原子であるとき、Ｒ１ａは、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない）。｝
　式（I）で示される化合物またはその塩は、３次元培養下における細胞の増殖促進活性を有し、従って、細胞の増殖、スフェア形成、オルガノイド形成、および／またはＣｙｓｔ形成を顕著に促進することができる。
図１は、本発明組成物を添加した培地において培養されたＭＤＣＫ細胞のＣｙｓｔ形成を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察した図である。
　本明細書において使用する用語を以下に定義する。
　本明細書において、ｎ－はノルマル、ｉ－はイソ、ｓｅｃ－はセカンダリーおよびｔｅｒｔ－はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ－はオルト、ｍ－はメタおよびｐ－はパラを各々意味する。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
　「アルキル基」および「炭素数１～１０のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等の基が挙げられる。「炭素数１～６のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等の基が挙げられる。
　「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５～８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、炭素数６～１０の環であるフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。
　「アルキレン基」および「炭素数１～６のアルキレン基」とは、直鎖または分岐状のアルキレン基を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。
　「アルキル基」、「アリール基」および「アルキレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。尚、「アルキル基」の場合には下記（１）～（４０）が挙げられ、「アリール基」および「アルキレン基」の場合には下記（１）～（４１）が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２－１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２－１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、３－ペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ－ブチルチオ、ｔｅｒｔ－ブチルチオ、ｎ－ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ－ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２－ペンチルチオ、３－ペンチルチオ、ｎ－ヘキシルチオ、２－ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
　ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１－６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
　ここで、「アシル基」とは、Ｃ１－６アルキル基、またはＣ６－１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１－６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１～６のものであり、「Ｃ6－１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６～１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1－１０アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、２－ヘキシル等）等が挙げられる。
　置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
　式（Ｉ）に示される化合物は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。
　式（Ｉ）に示される化合物は、置換基の種類によってはＥの立体配置を有するＥ体およびＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明はこれらＥ体、Ｚ体またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
［合成方法１］式（Ｉ）に示される化合物の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
　上記式（Ｉ）に示される化合物は、下記反応式で表されるように、ケトン化合物（ｋ）とＨ２Ｎ－Ｘ－Ｒ１（式中、ＸおよびＲ１は前記の意味を表し、例えば、ヒドラジド化合物等）とを反応させることにより合成することができる。前記原料それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４－ジオキサン、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
［反応式１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘおよびｎは、前記の意味を表す。）
　上記、ｋおよび１００のうちのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
［合成方法２］ケトン化合物およびヒドラジド化合物の組合せからなる化合物の合成
　前記、合成方法１に準じた方法で、Ｈ２Ｎ－Ｘ－Ｒ１のうち、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１が－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、ＷがＮ（Ｒ４）であり、Ｙが置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｚ、Ａｒおよびｎが前記の意味を表すヒドラジド化合物を用いることにより、式（Ｉ）に示される化合物うち、ケトン化合物およびヒドラジド化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。
　上記、ヒドラジド化合物のあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
［合成方法３］ケトン化合物およびアミン化合物の組合せからなる化合物の合成
　前記のケトン化合物（ｋ）［例えば、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン(ｋ－１)等］と、Ｈ２Ｎ－Ｘ－Ｒ１のうち、Ｘが単結合または－ＣＨ２ＣＯＯ－であり、Ｒ１が前記の意味を表す所望の一級アミン［例えば、ｎ－オクチルアミン(Ａ－３)等］またはその塩［例えば、グリシンエチル塩酸塩(Ａ－１)等］を用いることにより、式（Ｉ）に示される化合物のうち、ケトン化合物およびアミン化合物の組合せからなる化合物を合成することができる。前記原料それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４－ジオキサン、Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から２４時間反応を行なうのが好ましい。アミンの塩としては、塩酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を用いることができる。
　上記、一級アミンのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
［合成方法４］ウレア化合物の合成
　前記のケトン化合物（ｋ）［例えば、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン(ｋ－１)等］を、公知の合成方法に準じて、アンモニアのメタノール溶液に溶解させ、アンモニアガスを注入しながら撹拌することで、イミン化合物（ｋ－１’）を合成し、その後、対応するイソシアネート［例えば、フェニルイソシアネート（Ａ－５）］と反応させることで、式（Ｉ）に示される化合物のうち、Ｘが－ＣＯＮＨ－であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびｎが前記の意味を表す、ウレア化合物を合成することができる。
　上記、イソシアネートのあるものは、市販品として購入が可能であり、それ以外のものも公知の合成方法に準じて合成することができる。
　合成方法１～合成方法４において、反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、または析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の本発明に用いられる化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
　本明細書における３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）とは、例えば、包埋培養法、マイクロキャリア培養法、スフェア培養法などを用いて細胞を３次元的な環境にて培養することを意味する。包埋培養は、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、寒天、メチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形または半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。マイクロキャリア培養法は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。スフェア培養は、目的の細胞が、数十～数百個から成る凝集塊（以下、スフェアまたはスフェロイドともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置または振とうして培養する方法である。また、本発明における３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）として、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムなどの多糖類又はこれらの派生物を培地中で分散させることにより、不定型な３次元ネットワークを形成させ、これをスキャフォールドとして接着細胞を培地中に浮遊した状態に維持することにより、より生体内に近い３次元的な状態において細胞を培養する手法も用いることができる。この際、３次元細胞培養中の細胞は、該３次元ネットワークにトラップされており沈殿しないため、振とう、回転操作等を要することなく培養することが可能となる。３次元細胞培養は、自体公知の方法により実施することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０１７５１３を参照）。
1．化合物
　本発明の組成物、培地、方法に用いる化合物は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝（以下、本発明の組成物、培地、方法に用いる化合物またはその塩を総称して、「本発明に用いられる化合物」とも称する場合がある）。
　一態様において、前記式（Ｉ）中のＸが単結合である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～１０のアルキル基、特に好ましくは、オクチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＣＨ２ＣＯＯ－である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子であるか、あるいは、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有している炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、ベンジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＣＯＮＨ－である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、フェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＮＨＣＯ－である場合は、Ｒ１は、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、ここで、Ｙが、単結合である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であるか、酸素原子であり、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、単結合または置換基を有していないアルキレン基、特に好ましくは、単結合またはメチレン基）であり、Ａｒは置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基もしくは置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、水酸基を有するフェニル基もしくは置換基を有していないフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＮＨＣＯ－、かつ、Ｒ１が－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒ、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基（より好ましくは、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基、特に好ましくはメチレン基、メチル基、またはエチル基で置換されたメチレン基）である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子）であり、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、水酸基、メチル基もしくはエトキシ基を有するフェニル基、またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
　また、本発明は、以下の新規化合物またはその塩（以下、「本発明の化合物」と称することがある）を提供する。
　本発明の化合物は、以下式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝で表される化合物またはその塩である。
　本発明の化合物の一態様において、前記式（Ｉ）中のＸが単結合である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～１０のアルキル基、特に好ましくは、オクチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＣＨ２ＣＯＯ－である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子であるか、あるいは、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有している炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、ベンジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＣＯＮＨ－である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、フェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＮＨＣＯ－である場合は、Ｒ１は、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、ここで、Ｙが、単結合である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であるか、酸素原子であり、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、単結合または置換基を有していないアルキレン基、特に好ましくは、単結合またはメチレン基）であり、Ａｒは置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基もしくは置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、水酸基を有するフェニル基もしくは置換基を有していないフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎ＝０である。
　また、Ｘが－ＮＨＣＯ－、かつ、Ｒ１が－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒ、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキレン基、特に好ましくはメチレン基）である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子）であり、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、水酸基、メチル基もしくはエトキシ基を有するフェニル基、またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１～６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
　好ましい一態様において、本発明に用いられる化合物は、以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
２．培地添加用組成物
　本発明は、本発明に用いられる化合物を有効成分として含む、培地添加用組成物（以下、「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。本発明の組成物は、細胞培地、特に３次元細胞培養培地に添加することにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。
　すなわち、本発明の組成物の用途は、具体的には、以下に例示される：
（１）細胞増殖促進；
（２）スフェア形成促進；
（３）オルガノイド形成促進；
（４）Ｃｙｓｔ形成促進；
（５）細胞増殖促進およびスフェア形成促進；
（６）細胞増殖促進およびオルガノイド形成促進；
（７）細胞増殖促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（８）スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進；
（９）スフェア形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１０）オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１１）細胞増殖促進、スフェア形成促進およびオルガノイド形成促進；
（１２）細胞増殖促進、スフェア形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１３）細胞増殖促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；
（１４）スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進；または、
（１５）細胞増殖促進、スフェア形成促進、オルガノイド形成促進およびＣｙｓｔ形成促進。
　本発明の組成物は、有効成分として本発明に用いられる化合物を１種、または２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
　また、本発明の組成物は、本発明に用いられる化合物以外のその他の成分を含有していてもよい。本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、かかる成分には、例えば、水、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール、およびメタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール等の各種アルコール、等が含まれ得る。また、本発明の組成物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ乃至１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ乃至１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ乃至０．５μｍである。これらの滅菌処理は、当該組成物が固形でも溶液の状態でもよい。
　本発明の組成物中の有効成分としての本発明に用いられる化合物の配合量は、本発明の組成物を培地（特に、３次元細胞培養培地）に添加した際に、当該培地が、本発明の所望の効果を発揮できる濃度となるものであれば特に限定されない。なお、本発明の所望の効果を発揮できる濃度としては、例えば、本発明に用いられる化合物の培地（特に、３次元細胞培養培地）中の濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下であり得る。
　本発明の組成物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や担体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
　本発明の組成物の培地（特に、３次元細胞培養培地）への添加により、細胞増殖促進等が達成される細胞種としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞種が挙げられる。なお、これらの細胞の由来も特に限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が好ましい。また、細胞が由来する組織または臓器も、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、前記組織としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられるが、これらに限定されず、また、前記臓器としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられるが、これらに限定されない。なお、オルガノイド形成の促進を目的とする場合、オルガノイドは小腸由来細胞が好ましい場合がある。また、Ｃｙｓｔ形成の促進を目的とする場合、Ｃｙｓｔは腎臓由来細胞が好ましい場合がある。
　なお、正常細胞株としては、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（マウス胚線維芽細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＢＫ（ウシ腎臓由来細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓尿細管上皮細胞）、ＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞）、ＨｅｐａＲＧ（肝細胞、登録商標）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ヒト初代培養肝細胞等が挙げられる。これらの中では、特にＭＤＣＫ、ＨＵＶＥＣ、ＣＨＯ－Ｋ１およびＶｅｒｏ細胞が好ましい。また、がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ－４、ＢＳＹ－１、ＢＳＹ－２、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７／ＡＤＲ　ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＡ－Ｎ、ＢＴ－５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ－６２、ＨＯＰ－９２、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＮＣＩ－Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ－２、ＣＯＬＯ－２０５、ＨＣＣ－２９９８、ＨＣＴ－１５、ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＫＭ－１２、ＳＷ－６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ－１４５、ＰＣ－３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ－２９５、ＳＦ－５３９、ＳＦ－２６８、ＳＮＢ－７５、ＳＮＢ－７８、ＳＮＢ－１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、ＯＶＣＡＲ－５、ＯＶＣＡＲ－８、ＳＫＯＶ３、ＩＧＲＯＶ－１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ－６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ－３１、ＳＮ－１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ－１、ＲＸＦ－３９３Ｌ、７８６－０、ＴＫ－１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ－４、ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－７、ＭＫＮ－７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ－ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２、ＳＫ－ＭＥＬ－５、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＵＡＣＣ－６２、ＵＡＣＣ－２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ－ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ－４、ＨＬ－６０ＴBRＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。これらの中では、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３、ヒト子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａｐ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９、およびヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５が特に好ましい。さらに、幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。幹細胞としては、ｉＰＳ細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が特に好ましい。
　一態様において、本発明の組成物を添加した３次元細胞培養培地を用いてＭＳＣ等の幹細胞の培養を行う場合、該細胞の形質（例、未分化性）を維持したまま、その細胞増殖を促進することができる。ＭＳＣの未分化性の維持は、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）にて細胞表面マーカーの発現を解析することにより確認でき（例えば、ＷＯ２０１６／１３６９８６を参照）、ＭＳＣの細胞表面マーカーとしてはＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５などが陽性であることが挙げられる。従って、本発明は、ＭＳＣ等の幹細胞の大量生産に好適に用いることもできる。
　本明細書において「本発明の組成物」との語は、「本発明の剤」または「本発明の培地添加用剤」との語に置き換えることができる。
３．培地
　本発明は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物を含む、培地（以下、「本発明の培地」と称することがある）を提供する。本発明の培地を用いることにより、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。なお、本発明の培地は、特に３次元細胞培養培地であることが好ましい。
　本発明の培地に有効成分として含まれる本発明に用いられる化合物の濃度は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、その濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは１０μＭ以下であり得る。
　本発明の培地は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物が配合されている以外は、公知の培地の組成と同様とすることができる。
　一態様において、本発明の培地は、市販される培地（特に３次元細胞培養培地）に、本発明に用いられる化合物または組成物を添加することにより調製することができる。本発明に用いられる化合物または本発明の組成物を添加することにより本発明の培地とし得る市販の培地としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１培地（ステムセルテクノロジー社製）、ｍＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ（リプロセル社製）、リプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０３Ｎ（味の素社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等の培地が挙げられる。また、これらの培地に、脱アシル化ジェランガム等の多糖類を添加して３次元細胞培養培地化した培地を用いることができる。このような３次元細胞培養培地としては、例えば、ＦＣｅＭ（登録商標）（和光純薬工業株式会社製）が挙げられるが、これに限定されない。
　また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等を目的に応じて添加してもよい。
　本発明の培地における細胞の培養（特に３次元細胞培養）は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。培養する（接着性の）細胞が、培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。このような容器の例としては、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト株式会社製）、超低接着表面プレート（コーニング社製）、ヌンクロンスフェラプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられるが、これに限定されない。
４．細胞増殖促進方法、スフェア形成促進方法、オルガノイド形成促進方法、およびＣｙｓｔ形成促進方法
　本発明は、本発明に用いられる化合物または本発明の組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進する方法、スフェア形成を促進する方法、オルガノイド形成を促進する方法、またはＣｙｓｔ形成を促進する方法（以下、これらをまとめて、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の方法において用いられる培地は、所望の効果を得られる限り特に限定されない。好ましくは、３次元細胞培養培地である。また、本発明の方法における細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の方法を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５℃～３９℃、好ましくは３３℃～３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４体積％～１０体積％であり、４体積％～６体積％が好ましい。培養期間は、通常１乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
　細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ－ＨＥＭＡ（ポリ－（２－ハイドロキシ－エチルメタクリレート）２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）と他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体、ポリ（２－メトキシメチルアクリレート）、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル（登録商標）などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
　また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ　２０１０，３６１－３６６、ＮＡＴＵＲＥ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９－７００、ＮＡＴＵＲＥ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２－５７９、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７－１１１、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｖ　ａｎｄ　Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８－２５９等に記載された方法を用いることもできる。
　また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、またはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジスムターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ジブチルリルｃＡＭＰなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ－ メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン－５’－ホスホセレン酸、Ｓｅ－アデノシルセレノメチオニン、Ｙ－２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２、Ｗｆ－５３６等のＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
　あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
　また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ－１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
　また、スフェアを形成させる方法としてハンギングドロップ法を選択することもできる。ハンギングドロップ法としては、例えば細胞懸濁液の液滴（容量として１０～５０μＬ程度）を培養容器の蓋等の天井側に点着し、載せた液滴がぶら下がるように逆さの状態で培養する方法が挙げられる。このように培養することで、細胞は平面との接触により受ける影響が最小限となり、液滴の下部においてスフェアを形成する。このような液滴は、ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ Ｐｌａｔｅ（パーキンエルマー社製）の様な特殊な培養容器を用いて調製することもできる。具体的には、１００～１０００００個、好ましくは２００～１００００個、より好ましくは５００～１００００個の細胞を含む液滴を用いてスフェアを調製することができる。スフェアを形成させるためには、６～４８時間培養することが好ましい。
　スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状または楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍ、最も好ましくは８０μｍ乃至２００μｍの直径を有する。
　このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
　スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス社製）、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。
　これらの培養容器のうち、多数の抗がん剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、Ｕ字型、Ｖ字型のものを用いることが可能であり、好ましくはＵ字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。
　包埋培養を行う際に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等が挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、包埋培養に用いられる培地に対して寒天、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を更に混合することができる。これらの増粘剤は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。
　オルガノイド（幹細胞または前駆細胞を３次元的な環境下で生体外にて培養し、形成されたミニ臓器）またはＣｙｓｔ（上皮細胞により形成される管腔構造）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、上記の包埋培養を用いた方法が挙げられる。具体的には、目的の細胞または組織を、上記の細胞接着因子を含む包埋培養用培地中にて培養し、オルガノイドまたはＣｙｓｔを形成させることができる。例えば、目的の細胞または組織を採取した後にその浮遊液を調製し、包埋培養用の培地中に播種して培養を行なう。３乃至１４日間培養を続けると、細胞は自発的にオルガノイドまたはＣｙｓｔを形成する。
　本発明の方法において用いられる培地（特に３次元細胞培養培地）は、本発明の培地を用いればよい。
　本発明の方法における、培地中の本発明に用いられる化合物または本発明の組成物の濃度および細胞種等は、「２．培地添加用組成物」において説明したものと同様である。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。特に示されない場合、用いる試薬等は商業的に入手可能である。
　以下に、本発明に用いられる化合物の合成方法および構造式を示す。尚、１Ｈ－ＮＭＲはプロトン核磁気共鳴スペクトラムを表し、２７０ＭＨｚまたは４００ＭＨｚにて、重ジメチルスルホキシド中で測定した。ケミカルシフト値は、重ジメチルスルホキシドの値を２．４９ｐｐｍとして記載した。また、ｓとの記載はシングレットを表し、以下同様にbrsはブロードシングレットを、ｄはダブレットを、ｄｄはダブルダブレットを、ｔはトリプレットを、ｑはカルテットを、ｍはマルチプレットをそれぞれ表す。
［合成例１］ケトンおよびヒドラジドを原料とした本発明化合物の合成
（材料と方法）
　以下に図示されるケトン４種［１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）プロパン－１－オン（以下、ｋ－１と略称する。）、１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）エタン－１－オン（以下、ｋ－２と略称する。）、１－（２，４，６－トリヒドロキシ－３－メチルフェニル）プロパン－１－オン（以下、ｋ－３と略称する。）、１－（２，４－ジヒドロキシ－３－メチルフェニル）－３－メチルブタン－１－オン（以下、ｋ－５と略称する。）］及びヒドラジド１０種［２－（フェニルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－１と略称する。）、２－（ｏ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－２と略称する。）、２－（ｍ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－３と略称する。）、２－（ｐ－トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－４と略称する。）、２－［（４－フルオロフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ－５と略称する。）、２－（ナフタレン－１－イルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ－６と略称する。）、２－（フェニルアミノ）ブタンヒドラジド（以下、Ｈ－７と略称する。）、２－［（４－エトキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ－９と略称する。）、２－［（４－ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ－２と略称する。）、２－［（２－ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ－４と略称する。）］より化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　合成した３４化合物を第１表に記載する。表中、Ｍｅとの記載はメチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載はエチルを、ｎ－Ｐｒはノルマルプロピルを、ｉ－Ｂｕはイソブチルを、Ｐｈはフェニルを、Ｎａｐｈはナフチルをそれぞれ表す。（Ｒ３）ｎにおける「－」との記載は無置換を表し、構造式に記載された番号は、（Ｒ３）ｎの置換位置を表す。
［第１表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
　第１表に記載した化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を第２表に記す。
［第２表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
　以下に本発明に用いられる化合物及び合成中間体の化合物の合成法を記載する。
　４種のケトンのうち、ｋ－１、ｋ－２およびｋ－５については公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、１０種のヒドラジドのうち、Ｈ－１、Ｈ－２、Ｈ－３、Ｈ－４、Ｈ－５、Ｈ－６、Ｈ－９、Ｄ－２及びＤ－４は公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.等）。従って、以下、ｋ－３およびＨ－７の合成法につき詳述する。
［ｋ－３の合成］
　２，４，６－トリヒドロキシベンズアルデヒド(２．２２ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＮａＢＨ３ＣＮ（２．７ｇ、４３ｍｍｏｌ）、酢酸（８ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬｘ２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～５０／５０）で精製し、中間化合物（１．２０ｇ、８．５６ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた中間化合物（１．０４ｇ，７．４２ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（７ｍＬ）に懸濁させ、プロピオン酸無水物（１．１５ｍＬ，８．９０ｍｍｏｌ）、ＢＦ３－Ｅｔ２Ｏ（１．１２ｍＬ、８．９０ｍｍｏｌ）を加えて１３０℃で１時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水(１００ｍＬｘ３）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００ｍＬｘ２）、ブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～４５／５５）で精製し、得られた固体をヘキサンで洗浄してｋ－３（０．４１ｇ）を薄橙色固体として得た。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を再度中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製し、ｋ－３（０．７０ｇ）を薄橙色固体として得た。以上まとめて、ｋ－３（１．１１ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、収率７６％）を薄橙色固体として得た。
［Ｈ－７の合成］
　２－ブロモ酪酸メチル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）、アニリン(８．０ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）をトルエン(１０ｍＬ）に溶解させ、５時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(３０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～１０／９０）で精製し、中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）をメタノール(２６ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン・１水和物（１２．８ｍＬ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４．５時間撹拌した。水（１５０ｍＬ）を加えて、塩化メチレン（３０ｍＬｘ５）で抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄し、Ｈ－７（４．６０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－１の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ－１：Ｈ－１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－２の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（６９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残った固体を塩化メチレン、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた残渣をＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）に溶解させ、水を加えて析出した固体をメタノールで洗浄し、ｋ－１：Ｈ－２（１９．６ｍｇ、０．０５７４ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄橙色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－３の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１１９ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ－１：Ｈ－３（９８．９ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ、収率５２％）を白色固体として
得た。
［ｋ－１：Ｈ－４の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（６５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、酢酸エチルで洗浄してｋ－１：Ｈ－４（２８．６ｍｇ、０．０８３８ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－５の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１２２ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ－１：Ｈ－５（５５．６ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、収率２９％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－６の合成］
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１４３ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ－１：Ｈ－６（８６．５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、収率４１％）を茶色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－７の合成］
　ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶解させた。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ－１：Ｈ－７（５６．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率５７％）を白色固体として得た。
［ｋ－１：Ｈ－９の合成］
　ｋ－１（１５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（２２６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－１：Ｈ－９（４０．２ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ、収率１３％）を白色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－１の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（９５．４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－１（８０．４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、収率５３％）を黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－２の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－２（３４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－３の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１０４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（３ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－３（４６．９ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－４の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－４（５８．７ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－５の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１０６ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０～８０／２０）で精製してｋ－２：Ｈ－５（３６．６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、収率２３％）を白色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－６の合成］
　ｋ－２（１００ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１５５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－６（５９．３ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、収率２７％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－７の合成］
　ｋ－２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～５０／５０）で精製してｋ－２：Ｈ－７（１０９ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率６６％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－２：Ｈ－９の合成］
　ｋ－２（１００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（１６４ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）で精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－２：Ｈ－９（６３．１ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－１の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（２５３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－１（２５．０ｍｇ，０．０７２８ｍｍｏｌ、収率７．１％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－２の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、メタノールで洗浄した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－２（１０．３ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－３の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（２１９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－３（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－４の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－４（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－５の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（２２４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で６日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－５（１３．７ｍｇ、０．０３７９ｍｍｏｌ、収率３．７％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－６の合成］
　ｋ－３（１００ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１２１ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－６（１７．０ｍｇ、０．０４３２ｍｍｏｌ、収率８．５％）を橙色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－７の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（２５６ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄しｋ－３：Ｈ－７（２８．３ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ、収率７．５％）を白色固体として得た。
［ｋ－３：Ｈ－９の合成］
　ｋ－３（２００ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（２７７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ別し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０～７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ－３：Ｈ－９（１１．２ｍｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－１の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－１（９５．２ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ－５：Ｈ－１（３８．１ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、収率２２％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－２の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ－２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶解させ、芒硝乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣に塩化メチレン（１ｍＬ）を加え、超音波に晒して析出した固体をろ取してｋ－５：Ｈ－２（１８．６ｍｇ、０．０５０３ｍｍｏｌ、収率１０％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－３の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－３（１０３ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ－５：Ｈ－３（４４．６ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－４の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ，０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－４（１１２ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ－５：Ｈ－４（４４．４ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－５の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－５（１０６ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ－５：Ｈ－５（３７．４ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－６の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－６（１２４ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～５０／５０）で精製した。得られた固体をメタノールで洗浄してｋ－５：Ｈ－６（２８．１ｍｇ、０．０６９３ｍｍｏｌ、収率１４％）を薄黄色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－７の合成］
　ｋ－５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ－７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、酢酸エチル、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ－５：Ｈ－７（４３．６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
［ｋ－５：Ｈ－９の合成］
　ｋ－５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、Ｈ－９（１９６ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製しｋ－５：Ｈ－９（７２．０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、収率２５％）を薄黄色固体として得た。
　また、化合物番号ｋ－１：Ｄ－２及びｋ－１：Ｄ－４ついても、上記の合成法に準じた方法により合成することができる。
［合成例２］ｋ－１：Ａ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンエチル塩酸塩(Ａ－１）（１００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－１（２１．９ｍｇ、０．０８２５ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.30(d, J=10.8Hz, 1H), 5.76(s, 1H), 4.48(s, 2H), 4.19(q, J=8.1Hz, 2H), 2.67(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例３］ｋ－１：Ａ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンベンジルｐ－トルエンスルホナート(Ａ－２）（２４３ｍｇ、０．７２１ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－２（２５．０ｍｇ、０．０７６４ｍｍｏｌ、収率１４％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.45-7.35 (m, 6H), 7.32(d, J=10.8Hz, 1H), 6.31(d, J=10.8Hz, 1H), 5.23(s, 2H), 4.56(s, 2H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例４］ｋ－１：Ａ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、ｎ－オクチルアミン(Ａ－３）（１２０ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間、１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～２０／８０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－３（６０．１ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ、収率３７％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ9.52(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20(d, J=8.1Hz, 1H), 5.31 (t, J=8.1Hz, 2H), 2.73(q, J=8.1Hz, 2H), 1.90(s, 3H), 1.64(m, 2H), 1.30-1.05(m, 10H), 1.11(t, J=8.1Hz, 3H), 0.86(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例５］ｋ－１：Ａ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　ｋ－１（３００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア／メタノール溶液（１７ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１週間撹拌した。その間、毎日アンモニアガスを１５分バブリングした。反応溶液を減圧下濃縮し、４－（１－イミノプロピル）－２－メチルベンゼン－１，３－ジオール（ｋ－１’）とｋ－１の混合物（２９２ｍｇ、ｋ－１’:ｋ－１＝１:０．２）を黄土色固体として得た。上記のようにして得られたｋ－１’とｋ－１の混合物（２９２ｍｇ）をＴＨＦ（６．５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、フェニルイソシアネート（Ａ－５）（１５８ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。同温で３０分撹拌後、水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～４５／５５）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ａ－５（１６０ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ、２工程収率３２％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.74(s, 1H), 10.22(s, 1H), 10.11(s, 1H), 7.63(d, J=8.1Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.32 (t, J=8.1Hz, 2H), 7.06 (t, J=8.1Hz, 1H), 6.49 (d, J=8.1Hz, 1H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 2.00(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例６］ｋ－１：Ｈ－１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　ｋ－１（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、４－フェニルセミカルバジド(Ｈ－１０）（１０９ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ｈ－１０（１９．１ｍｇ、０．０６１０ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz):δ13.50(s, 1H), 9.75(s, 1H), 9.59(s, 1H), 8.82(s, 1H), 7.49(d, J=8.1Hz, 2H), 7.30(t, J=8.1Hz, 2H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 6.99(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.14(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例７］ｋ－１：Ｉ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　ヒドラジン一水和物（０．２６ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ベンジルイソシアネート（１０１）（０．３２４　ｍＬ、２．６３　ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３時間撹拌し、析出した固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１０２（３５２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ、収率８２％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０２（１５５ｍｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５５／４５）にて精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－１（５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.59(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.40-7.25(m, 5H), 7.17(d, J=12.0Hz, 1H), 6.84(t, J=8.0Hz, NH), 6.37(d, J=12.0Hz, 1H), 4.34(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例８］ｋ－１：Ｉ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　ヒドラジン一水和物（０．２０ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．２ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－クロロベンジルイソシアネート（１０３）（０．２７８ｍＬ、２．０９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１．５時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０４（３１５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、収率７５％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０４（１８７ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６５／３５）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチルに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－３（１５５ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.63(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.41(d, J=8.0Hz, 2H), 7.34(d, J=8.0Hz, 2H), 7.17(d, J=8.0Hz, 1H), 6.89(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.31(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例９］ｋ－１：Ｉ－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
　ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－メチルベンジルイソシアネート（１０５）（３５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０６（２９７ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、収率６９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０６（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ―１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解させ、水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－６（１１８ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ、収率４８％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.56(s, 1H), 9.55(s, 1H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 7.15(d, J=8.0Hz, 1H), 6.78(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.29(d, J=8.0Hz, 2H), 2.64(q, J=8.0Hz, 2H), 2.28(s, 3H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
［合成例１０］ｋ－１：Ｉ－７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　ヒドラジン一水和物（０．２１ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４－メトキシベンジルイソシアネート（１０７）（３５０ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０８（３８１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率９３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１０８（１８３ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～６５／３５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｉ－７（５５．０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率２１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ9.55(s, 2H), 7.25(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 1H), 6.91(d, J=8.0Hz, 2H), 6.75(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.26(d, J=8.0Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 2.63(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）
　上記の合成法に準じた方法により合成した化合物を第３表に記載する。
［第３表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
　また、第３表に記載した化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定結果を第４表に記す。
［第４表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
［合成例１１］ｋ－１：Ｂ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　２－ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１５／８５）で精製し、１１０（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～２０／８０）で精製し、１１１（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.71(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.07(t, J=8.0Hz, 2H), 6.63(d, J=8.0Hz, 2H), 6.56(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.93(d, J=12Hz, NH), 4.28(m, 1H), 2.80(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.40(d, J=8.0Hz, 3H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１２］ｋ－１：Ｂ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
　２－ブロモイソ吉草酸エチル（１１２）（７００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．４０ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．６０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、８０℃で６時間、１２０℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１３（１１０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１３（９６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０４２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．２ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１４（８０．７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１４（７５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ｋ－１（５０ｍｇ、０．２８　ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～７５／２５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－２（３７．６ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ10.83(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.26(d, J=8.0Hz, 1H), 7.05(t, J=8.0Hz, 2H), 6.71(d, J=8.0Hz, 2H), 6.53(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.78(d, J=12Hz, NH), 3.97(m, 1H), 2.82(q, J=8.0Hz, 2H), 2.03(m, 1H), 1.95(s, 3H), 1.06(t, J=8.0Hz, 3H), 0.97(d, J=8.0Hz, 6H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１３］ｋ－１：Ｂ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
　２－ブロモ－ｎ－オクタン酸（１１５）（６００ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に溶解させ、濃塩酸（３滴）を加えて５０℃で１８時間撹拌した。放冷後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して１１６（５８８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ、収率９２％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１６（５８５ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．２９ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、６０℃で１６時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９～５／９５）で精製し、１１７（２７７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、収率４５％）を黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１１７（２５６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１０ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～５／９５）で精製し、１１８（２６８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、収率９９％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１１８（１４４ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、ｋ－１（８０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．９ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～７５／２５）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）、にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１:Ｂ－３（８８．７ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
　1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 2H), 6.65(d, J=8.0Hz, 2H), 6.54(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.87(d, J=8.0Hz, NH), 4.19(m, 1H), 2.81(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.73(q, J=8.0Hz, 2H), 1.33(m, 4H), 1.27(m, 4H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H), 0.86(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１４］ｋ－１：Ｂ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
　フェニルプルビン酸（１１９）（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＤＢＵ（１．０ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（０．４２ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～１３／８７）で精製し、１２０ａ（２９８ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１２０ａ（２９５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（６．６ｍＬ）、酢酸（０．６６ｍＬ）、２ＭエチルアミンＴＨＦ溶液（０．８７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）に溶解させ、氷冷下ピコリンボラン（０．３５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間撹拌した。４Ｍ塩酸（３ｍＬ）を加えて５０℃で３０分加熱し、放冷後、酢酸エチル（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～３０／７０）で精製し、１２０ｂ（４８．９ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、収率１４％）を得た。
　上記のようにして得られた１２０ｂ（４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（０．９ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して１２時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して更に３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００～２０／８０）で精製し、１２０ｃ（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、収率６８％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２０ｃ（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ｋ－１（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～６０／４０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｂ－５（１８．４ｍｇ、０．０４９８ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.72(s, 1H), 7.30-7.10(m, 6H), 6.38(d, J=8.0Hz, 1H), 3.62(m, J=8.0Hz, 1H), 2.86(q, J=8.0Hz, 2H), 2.66(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.04(d, J=8.0Hz, 2H), 0.98(t, J=8.0Hz, 3H), 0.92(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの二つのシグナルとOHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１５］ｋ－１：Ｃ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、フェニルヒドラジン（１２２）（０．４７ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～６５／３５）にて精製し、１２３（８５３ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ、収率８１％）を無色アモルファスとして得た。
　上記のようにして得られた１２３（０．６４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩酸／ジオキサン（６ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～８／９２）にて精製し、１２４（２９０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、収率７３％）を、薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１２４（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０～９０／１０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｃ－１（２０．２ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ、収率１１％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.89 (s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.14(t, J=8.0Hz, 2H), 6.77(d, J=8.0Hz, 2H), 6.71(t, J=8.0Hz, 1H), 6.29(d, J=8.0Hz, 1H), 4.35(s, 2H), 2.74(q, J=8.0Hz, 2H), 1.92(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１６］ｋ－１：Ｃ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
　Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（１２５）（０．５２ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。水（２０ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６５／３５）にて精製し、１２６（９３７ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ、収率８９％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２６（０．９３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（７ｍＬ）を加えて室温で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～９５／５）にて精製し、１２７（４５７ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、収率７９％）を、薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１２７（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥ、塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｃ－２（２９．９ｍｇ、０．０９０８ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz):δ9.63 (s, 1H), 8.55(m, NH), 7.40-7.20(m, 6H), 6.25(d, J=8.0Hz, 1H), 4.32(d, J=8.0Hz, 2H), 4.29(s, 2H), 2.70(q, J=8.0Hz, 2H), 1.91(s, 3H), 1.09(t, J=8.0Hz, 3H).(OHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例１７］ｋ－１：Ｄ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
　３－ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１０／９０）にて精製し、１３０（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７～３５／６５）にて精製し、１３１（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３２（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５～５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｄ－１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.76(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.98(s, 1H), 7.25(d, J=10.8Hz, 1H), 6.86(t, J=10.8Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20-5.95(m, 3H), 5.87(t, J=5.4Hz, NH), 3.88(d, J=5.4Hz, 2H), 2.78(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例１８］ｋ－１：Ｄ－３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
　合成例１７の工程中で得られた１３０（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．１６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（１．３５ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で３時間、ヨードエタン（０．７ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を追加して１．５時間、室温で２０時間撹拌した。水（１００ｍＬ）、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～１０／９０）にて精製し、１３３（１．２１ｇ、３．８６ｍｍｏｌ、収率９２％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた化合物１３３（１．２ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１９ｍＬ）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で１５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～２５／７５）にて精製し、１３４（１９４ｍｇ、０．８６９ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。
　上記のようにして得られた１３４（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１８時間、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を追加して更に６０℃で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～６／９４）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３５（１５１ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ、収率８０％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２３時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（１／１）の混合溶媒で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｄ－３（１１８ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ、収率５８％）を黄色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.68(s, 1H), 10.78(s, 1H), 9.69(s, 1H), 9.00(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 6.91(t, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.10-6.05(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.42(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例１９］ｋ－１：Ｅ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
　アミノフェノール（１３７）（５００ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．７７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．６１ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。同温で２時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ、収率８９％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１２／８８）で精製して１３９（６６４ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率９７％）を薄黄色固体として得た。
　上記のようにして得られた１３９（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１６時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９～５／９５）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ－１：Ｅ－１（１９．７ｍｇ、０．０５９８ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ 9.70(s, 1H), 9.60(s, 1H), 9.38(s, 1H), 8.73(s, 1H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 6.82(d, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 2H), 5.76(s, 1H), 2.69(q, J=8.0Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).
［合成例２０］ｋ－１：Ｆ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
　ヒドラジン一水和物（０．５８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ヘキサメチレンジイソシアネート（１４０）（０．４８ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１．５時間、ヒドラジン一水和物（０．２９ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を追加して２時間撹拌した。生じた固体をろ取、減圧下乾燥し、１４１（０．６０ｇ、２．６ｍｍｏｌ、収率８７％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４１（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ｋ－１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２０時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを加えて不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた固体を塩化メチレンおよび水で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｆ－１（８８．６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ 9.44(s,4H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.40-6.30(m, 2H), 3.13(q, J=8.0Hz, 4H), 2.63 (q, J=8.0Hz, 4H),1.97(s, 6H), 1.47(m, 4H), 1.38(m, 4H),1.07(t, J=8.0Hz, 6H).
［合成例２１］ｋ－１：Ｇ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　Ｎ－メチル－アニリン（１４２）（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）をエタノール（９ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．９７ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）にて精製し１４３（４９６ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ、収率５５％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１４３（０．４９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４４（３８９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ、収率８３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４４（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｇ－１（９２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.64(s, 1H), 10.86(s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.24(d, J=10.8Hz, 1H), 7.15(t, J=10.8Hz, 2H), 6.71(d, J=8.1Hz, 2H), 6.62(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.23(s, 2H), 3.04(s, 3H), 2.89(q, J=8.1Hz, 2H), 1.93(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２２］ｋ－１：Ｌ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
　上記の合成例２１に準じた方法により、レゾルシノールを出発原料とし、ｋ－１：Ｌ－１（６５ｍｇ、白色固体）を合成した。
1H-NMR(270MHz);δ 13.63(s, 1H), 10.99(s, 1H), 9.74(s, 1H), 9.46(s, 1H), 7.28(d, J=8.1Hz, 1H), 7.07(t, J=8.1Hz, 1H), 6.45-6.35(m, 4H), 4.72(s, 2H), 2.81(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２３］ｋ－１：Ｍ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
　上記の合成例２１に準じた方法により、３－メルカプトフェノールを出発原料とし、ｋ－１：Ｍ－１（１１９ｍｇ、白色固体）を合成した。
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.96(s, 1H), 9.72(s, 1H), 9.57(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(t, J=8.1Hz, 1H), 6.82(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.62(d, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 3.88(s, 2H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.06(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２４］ｋ－１：Ｇ－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　Ｎ－エチル－アニリン（１４５）（０．５０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をエタノール（８ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．８６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５０ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００～５／９５）にて精製し１４６（４７３ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、収率５６％）を薄黄色液体として得た。
　上記のようにして得られた１４６（０．４７ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をメタノール（４．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．４４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４７（３０９ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、収率７０％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４７（１４０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｇ－２（９６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.82(s, 1H), 9.68(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 7.13(t, J=8.1Hz, 2H), 6.65(d, J=8.1Hz, 2H), 6.59(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=10.8Hz, 1H), 4.17(s, 2H),3.46(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２５］ｋ－１：Ｊ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
　氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３－シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４９（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～３５／６５）にて精製し１５０（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で洗浄後、減圧下乾燥し、１５１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ－１：Ｊ－１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 9.57(s, 1H), 9.53(s, 1H), 9.36(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80-6.60(m, 4H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.25(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２６］ｋ－１：Ｊ－５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
　４－ベンジル－３－チオセミカルバジド（１５５）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５～８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～５０／５０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ－１：J－５（４９．９ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、収率２６％）を白色固体として得た。
1H-NMR(400MHz);δ10.61(brs, 1H), 9.69(s, 1H), 8.43(brs, 1H), 7.40-7.20(m, 6H), 6.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.78(d, J=8.0Hz, 2H), 2.74(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.09(t, J=8.1Hz, 3H). (NHの一つのシグナルは観測されなかった。)
［合成例２７］ｋ－１：Ｊ－６の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
　チオセミカルバジド（１５２）（０．５０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に懸濁させ、ヨウ化メチル（０．４１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１．５時間、反応容器のふたを開けて７０℃で５０分撹拌した。放冷後、ベンジルアミン（０．６１ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣をＩＰＥ／塩化メチレン（１／４）の混合溶媒で洗浄した。得られた粗精製物を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１５／８５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、１５６（６２６ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ、収率６９％）を橙色固体として得た。
　上記のようにして得られた１５６（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ－１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０～８０／２０）にて精製し、得られた粗精製物に塩化メチレン、水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０～６０／４０）にて精製しｋ－１：Ｊ－６（２９．９ｍｇ、０．０９１６ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色アモルファスとして得た。
1H-NMR(270MHz);δ14.51(brs, 1H), 9.39(s, 1H), 7.36-7.05 (m, 6H), 6.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20 (m, NH), 5.30(brs, NH), 4.34(d, J=5.4Hz, 2H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 0.96(t, J=8.1Hz, 3H).
［合成例２８］ｋ－１：Ｎ－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000094
　２－ヒドロキシベンジルアルコール（１．０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（２．０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。徐々に室温まで昇温して５．５時間撹拌し、塩化メチレン（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８～３５／６５）にて精製し、３－（ヒドロキシメチル）フェニル　フェニル　カーボネート（１．４５ｇ、５．９４ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた３－（ヒドロキシメチル）フェニル　フェニル　カーボネートを塩化メチレン（７ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（０．７２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰを少量加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．９０ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２時間撹拌し、塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７～２５／７５）にて精製し、３－［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル　フェニル　カーボネート（２．２０ｇ、６．０４ｍｍｏｌ、収率１０２％）を無色液体として得た。
　上記のようにして得られた３－［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル　フェニル　カーボネート（２．２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（２．９ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００～１０／９０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで懸濁洗浄して３－ヒドロキシベンジル　ヒドラジンカルボキシレート（８０８ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ、収率７４％）を白色固体として得た。
　上記のようにして得られた３－ヒドロキシベンジル　ヒドラジンカルボキシレート（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’－ジヒドロキシ－３’－メチルプロピオフェノン（１００）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝２／９８～３０／７０）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取し、ｋ－１：Ｎ－１（８５．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ、収率４５％）を白色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 10.78(brs, 1H), 9.63 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.21(d, J=8.1Hz, 1H), 7.18(t, J=8.1Hz, 1H), 6.84(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.73(d, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 5.14(s, 2H), 2.75(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
　以下に、本発明に用いられる化合物を用いて行った作用試験の結果を記載する。
［試験例１］各化合物の細胞増殖活性の検討
　本発明に用いられる化合物を３次元培地に添加した際の細胞の増殖促進効果を検討した。具体的には、前培養（接着培養）したＳＫＯＶ３細胞（ヒト卵巣がん由来細胞株）を回収し、３次元細胞培養培地（「ＦＣｅＭ（登録商標）」（日産化学株式会社））に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液を３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／４０μＬ／ウェルになるように播種した。プレートに播種された細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２下で一晩静置した。次いで、本発明に用いられる化合物のＤＭＳＯ希釈溶液を、終濃度５μＭ（または、５μＭおよび１０μＭの２段階）となるように４．４４μＬを添加した（添加後撹拌なし）。各化合物の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で４日間静置培養した。５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４４．４μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、細胞増殖を評価した。
　結果を第５表および第６表に示す。なお、増殖率は、対照（本発明に用いられる化合物を含まないＤＭＳＯを添加した細胞）を基準（１００％）として算出した。また、表に示される値は、２試験の結果の平均値である。
［第５表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
［第６表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
［試験例２］本発明に用いられる化合物のＳＫＯＶ３細胞に対する作用の検討１
　特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をホモミキサーにて調製した。また、対照として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／４０μＬ／ウェルになるように分注した（３次元培養（３Ｄ））。単層培養（２Ｄ）は、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３７１２）のウェルに１ウェル当たり４００個／４０μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養1日目に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度０、０．５、１、５、１０、２０μＭになるように、それぞれ４．４μＬずつ添加し、引き続き培養を４日間継続した。５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４４．４μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第７表に示す。本試験の結果、ＳＫＯＶ３細胞を３次元培養（３Ｄ）した条件において、ｋ－１：Ｈ－７およびｋ－１：Ｈ－１０が幅広い濃度で細胞増殖促進作用を示し、さらにＳＫＯＶ３細胞は培地内でスフェアを形成していた。一方、ＳＫＯＶ３細胞を単層培養（２Ｄ）下で培養した場合は、ｋ－１：Ｈ－７およびｋ－１：Ｈ－１０を培地に添加しても、良好な細胞増殖促進効果は見られなかった。
［第７表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
［試験例３］本発明に用いられる化合物のＳＫＯＶ３細胞に対する作用の検討２
　特許文献１（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三昌株式会社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）の組成物をＦＣｅＭ－ｓｅｒｉｅｓ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（和光純薬工業社製）にて調製した。また、単層培養として、脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。次いで、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３８２７）のウェルに１ウェル当たり１０００ ｃｅｌｌｓ／３６μＬ／ウェルになるように分注した（３次元培養（３Ｄ））。単層培養（２Ｄ）は、ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に懸濁した後、３８４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３７１２）のウェルに１ウェル当たり４００ｃｅｌｌｓ／３６μＬになるように分注した。分注後に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度０、１、５、１０、２０μＭになるように、それぞれ４μＬずつ添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で４日間培養した。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第８表に示す。
［第８表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　本試験の結果、ＳＫＯＶ３細胞を３次元培養（３Ｄ）した条件において、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－２、ｋ－１：Ｉ－１０、及びｋ－１：Ｎ－１が幅広い濃度で細胞増殖促進作用を示し、さらにＳＫＯＶ３細胞は培地内でスフェアを形成していた。一方、ＳＫＯＶ３細胞を単層培養（２Ｄ）下で培養した場合は、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、ｋ－１：Ｄ－２、ｋ－１：Ｉ－１０、及びｋ－１：Ｎ－１を培地に添加しても、良好な細胞増殖促進効果は見られなかった。
［試験例４］本発明に用いられる化合物の小腸オルガノイドへの作用の検討
　マウス小腸約２０ｃｍを摘出し、氷上で脂肪組織及び血管組織を取り除いた後、ＰＢＳで内容物を十分に洗浄、ハサミで切り開き２ｍｍ程度に断片化した。１５ｍＬのＰＢＳで２０回洗浄し、上清を除去後、２５ｍＬのＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）を添加し２０ｒｐｍで撹拌しながら１５分間室温にてインキュベーションした。上清を除去後、沈殿物に１０ｍＬの冷０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し３回ピペッティングを行い、上清を７０μｍセルストレイナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で濾過し、ろ液を回収した。残った沈殿物へ同様に０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳの添加とピペッティング、濾過を３回繰り返し、ろ液を４段階分調製した。各ろ液を４℃、２９０ｇにて５分間遠心し、上清除去後、１０ｍＬの冷０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで再度懸濁し、４℃、２００ｇにて３分間遠心した。上清を除去後、１０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２（和光純薬社製）を添加して懸濁し、１ｍＬを分取して顕微鏡下で観察し、小腸断片（陰窩、Ｃｒｙｐｔ）が十分にあるろ液を選択し、Ｃｒｙｐｔ数を血球計算板にて計数した。細胞懸濁液と等量の冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を添加、混合し、すばやく３７℃に温めておいた２４ウェルプレートに５００ｃｒｙｐｔｓ／５０μＬ／ウェルとなるよう分注した。プレートを３７℃で１０分間静置し、ゲル化を完了させ、各ウェルに７５０μＬのＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ（登録商標）Ｏｒｇａｎｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を添加し、さらにＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる化合物を終濃度５μＭになるよう加えた。コントロールとして化合物未添加のウェルを作成した。７日間培養後、形成された小腸オルガノイドの数と直径を顕微鏡下で計測し、無添加（対照）と比較したものを第９表に示す。本試験の結果、ｋ－１：Ｈ－７がマウスの小腸オルガノイド培養においてオルガノイド形成を促進することが明らかになった。この際、オルガノイドの直径は大きく変わっておらず、ｋ－１：Ｈ－７の添加によりＣｒｙｐｔからのオルガノイド形成率が向上した。
［第９表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
［試験例５］本発明に用いられる化合物の各種ヒトがん細胞への作用１
　各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（以下、ＡＴＣＣと記載する。）社製、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＤＭＥＭと略称する。）（和光純薬工業社製））、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、ＮＥＡＡと略称する。）（和光純薬工業社製））含有Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＥＭＥＭと略称する。）（和光純薬工業社製））、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ(ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ'ｓ Ｆ－１２（和光純薬工業社製））、ヒト前立腺がん由来細胞株ＬＮＣａＰ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業社製））、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマアルドリッチ社製））、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－1ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて１～５分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
　前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％、ただしＲＰＭＩ１６４０のみ０．０２０ ｗ／ｖ ％）、１０００～１２０００ ｃｅｌｌｓ／１３５ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて一晩静置培養後、本発明に用いられる化合物のＤＭＳＯ溶液を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、１５μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。引き続き３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、ＷＳＴ－８溶液（同仁化学研究所社製）を１５μＬ／ウェルにて添加し、同インキュベーターで１～２時間反応後、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。更に化合物無添加（対照）の吸光度を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを－、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１０表に示す。
［第１０表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
　本試験の結果、複数のがん細胞株においてｋ－１：Ｈ－７およびｋ－１：Ｈ－１０が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもがん細胞株は、スフェアを形成していた。
［試験例６］本発明に用いられる化合物の各種ヒトがん細胞への作用２
　各種ヒト由来がん細胞を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。ヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製））、ヒト肺胞基底上皮腺がん由来細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト胃腺がん由来細胞株ＡＧＳ(ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有Ｈａｍ'ｓ Ｆ－１２（和光純薬工業社製））、ヒト前立腺がん由来細胞ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて１～５分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁後、各々単細胞にて回収した。
　前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００～２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬４０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを－、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１１表及び第１２表に示す。試験未実施は空欄とした。
［第１１表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
［第１２表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
　本試験の結果、複数のがん細胞株においてｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、及びｋ－１：Ｊ－１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもがん細胞株は、スフェアを形成していた。
［試験例７］本発明に用いられる化合物のＭＤＣＫ細胞への作用１
　イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１０％ ＦＢＳ及び１％ ＮＥＡＡ含有ＥＭＥＭ培地にて前培養した。冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を２４穴プレートに５０μＬずつ塗り広げ、３７℃にて１５分間インキュベートし固化させた。前述のＭＤＣＫ細胞を２００００ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で培地に懸濁し、さらに冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲを２０μＬ／ｍＬ加えて１ｍＬ／ウェルにて播種した。終濃度１０μＭとなるように培地に溶解した本発明に用いられる化合物を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターにて７日間培養した。対照（化合物無添加）として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。７日後、ＰＢＳで洗浄後（１ｍＬ／ウェル）、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（和光純薬社製）を添加し（１ｍＬ／ウェル）、室温にて２０分間固定した。その後、上清を除去し、ＩＦバッファー（０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社製）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマアルドリッチ社製）含有ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し３０分間静置し、除去した。浸透化バッファー（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し、室温で３０分間インキュベートした。上清を除去し、ＩＦバッファーにて５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）／ＩＦバッファー）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間インキュベートした。上清を除去し、ブロッキングバッファーに抗βカテニン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００倍希釈して２５０μＬ／ウェルで添加し、４℃、遮光にて一晩インキュベートした。翌日、ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファーに２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各々２５０倍希釈し２５０μＬ／ウェルにて添加し、室温、遮光下で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を滴下し蛍光顕微鏡（ＡｒｒａｙＳｃａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて観察及び解析を行った。
　本試験の結果、ＭＤＣＫ細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ上で内腔を有するＣｙｓｔを形成する際に、化合物ｋ－１：Ｈ－７存在下でＣｙｓｔ１つあたりの面積がＣｏｎｔｒｏｌ対象を１００とした時２０％以上増大していることが明らかになった。第１３表にその結果を示した。
［第１３表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103
［試験例８］本発明に用いられる化合物のＭＤＣＫ細胞への作用２
　イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１０％ ＦＢＳ及び１％ ＮＥＡＡ含有ＥＭＥＭ培地にて前培養した。冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を２４穴プレートに５０μＬずつ塗り広げ、３７℃にて１５分間インキュベートし固化させた。前述のＭＤＣＫ細胞を１００００ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培地に懸濁し、さらに冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ ＧＦＲを２０μＬ／ｍＬ加えて１ｍＬ／ウェルにて播種した。終濃度５μＭ及び１０μＭとなるように培地に溶解した本発明に用いられる化合物を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、インキュベーターにて６日間培養した。対照（化合物無添加）として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。６日後、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ（スクリーン社製）にて形成したＣｙｓｔの大きさ及び個数を測定した。全体のＣｙｓｔのうち、７０μｍ以上のＣｙｓｔの割合を第１４表に示す。
［第１４表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
　また、ＰＢＳで洗浄後（１ｍＬ／ウェル）、４％ Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（和光純薬社製）を添加し（１ｍＬ／ウェル）、室温にて２０分間固定した。その後、上清を除去し、ＩＦバッファー（０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（シグマアルドリッチ社製）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（シグマアルドリッチ社製）含有ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し３０分間静置し、除去した。浸透化バッファー（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳ）を１ｍＬ／ウェル添加し、室温で３０分間インキュベートした。上清を除去し、ＩＦバッファーにて５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ（シグマアルドリッチ社製）／ＩＦバッファー）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間インキュベートした。上清を除去し、ブロッキングバッファーに抗βカテニン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１００倍希釈して２５０μＬ／ウェルで添加し、室温で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄し、ブロッキングバッファーに２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を各々２５０倍希釈し２５０μＬ／ウェルにて添加し、室温、遮光下で６０分間インキュベートした。ＩＦバッファーで５分置きに３回洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を滴下し共焦点蛍光顕微鏡（ＦＶ１２００　ＩＸ８３、オリンパス社製）にて観察を行った。
　本試験の結果、ＭＤＣＫ細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ上で内腔を有するＣｙｓｔを形成する際に、化合物ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１存在下で全体のＣｙｓｔのうち、７０μｍ以上のＣｙｓｔの割合が増大していることが明らかになった（表１３）。また、共焦点蛍光顕微鏡での観察の結果、化合物ｋ－１：Ｉ－１、又はｋ－１：Ｂ－１存在下で、正常なＣｙｓｔを形成していることが確認された（図１）。
［試験例９］本発明組成物のヒト間葉系幹細胞への作用１
　ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、東洋紡社製）を、ＭＦ－ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。３次元培養法（３Ｄ）では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にｈＭＳＣを懸濁した後、６ウェル平底超低接着表面プレート（コーニング社製、＃３４７１）に１．２×１０５ cells／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に４．０×１０４ cells／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度１０μＭとなるように、培地に溶解した本発明に用いられる化合物の溶液を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて７日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。７日後、３次元培養法ではウェルから細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄して上清を除去後、トリプシン０．２５ ｗ／ｖ ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて２～５分間インキュベートしてスフェアを単細胞に分散させ、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁して全自動セルカウンターＴＣ２０（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。
　単層培養法では細胞をＰＢＳ洗浄後、０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ溶液を添加して３７℃にて２～５分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ－２０（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。
　上記細胞懸濁液に、ＣＤ３４抗体（ＡＰＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＣＤ７３（ＢＶ４２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＣＤ２９（ＢＢ５１５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。２％ ＳＭバッファー（２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）で２回洗浄した後、１μｇ／ｍＬのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を含むＳＭを添加し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）にて解析を行った。第１５表に化合物無添加（対照）の細胞数を１としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。第１６表に無添加並びに化合物添加条件で３次元培養（３Ｄ）した細胞のＣＤ３４、ＣＤ７３、及びＣＤ２９の陽性率または陰性率を示した。
［第１５表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
［第１６表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
　本試験の結果、ｋ－１：Ｈ－７およびｋ－１：Ｈ－１０は、２次元及び３次元細胞培養条件でｈＭＳＣの細胞数を増加させる効果が認められた。３次元細胞培養条件では、ｈＭＳＣはスフェアを形成していた。その際、細胞表面マーカーであるＣＤ３４の陰性率、ＣＤ７３、及びＣＤ２９の陽性率は化合物添加によって変化しなかった（第１６表）。以上の結果より、ｋ－１：Ｈ－７およびｋ－１：Ｈ－１０はｈＭＳＣの未分化性を維持したまま細胞増殖を亢進させることが明らかになった。
［試験例１０］本発明に用いられる化合物のヒト間葉系幹細胞への作用２
　骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ、プロモセル社製）を、間葉系幹細胞増殖培地（プロモセル社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。３次元培養法（３Ｄ）では、脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物にｈＭＳＣを懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面プレート（コーニング社製、＃３４７４）に６０００ cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。また、ＥＺＳＰＨＥＲＥを用いた３次元培養法（ＥＺＳＰＨＥＲＥ）では、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、９６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（旭テクノグラス社製、＃４８６０－９００）に２０００cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、ｈＭＳＣを脱アシル化ジェランガム不含培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５８５）に２０００cells／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭ及び２０μＭとなるように、培地に溶解した本発明に用いられる化合物を１０μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。４日後、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、 Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、２分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌し、１０分間室温にて静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出し、その結果を第１７表に示す。
［第１７表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
　本試験の結果、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、及びｋ－１：Ｊ－１は、３次元細胞培養条件でＢＭ－ｈＭＳＣの増殖活性を亢進させることが明らかになった。３次元細胞培養条件では、ＢＭ－ｈＭＳＣはスフェアを形成していた。また、ｋ－１：Ｂ－１及びｋ－１：Ｊ－１は、２次元細胞培養条件においてもｈＭＳＣの増殖活性を亢進させることが明らかになった。
［試験例１１］本発明に用いられる化合物の線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２への作用
　マウス胚線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）は、１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）とＬ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン安定化溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＢＭＥ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて培養を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
　前述の各種細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％、７００～２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）に播種した（３Ｄ培養）。播種後、ＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度１μＭまたは５μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを－、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第１８表に示す。試験未実施は空欄とした。
［第１８表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
　本試験の結果、線維芽細胞においてｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、及びｋ－１：Ｊ－１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレートを用いたとき線維芽細胞は、スフェアを形成していた。
［試験例１２］本発明に用いられる化合物のハンギングドロップ法で培養した細胞への作用
　ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製）は、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））を用いて培養を行った。また、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞（ＢＭ－ｈＭＳＣ、プロモセル社製）は、間葉系幹細胞増殖培地（プロモセル社製）を用いて培養を行った。対数増殖期にあるそれぞれの上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン－1ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。
　引き続き、それぞれの細胞を上記培地に１０００００ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬとなるように懸濁し、更にＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度５μＭとなるように培地に添加した。本細胞懸濁液を３．５ｃｍディッシュ（ファルコン社製、＃３５１００８）のフタの裏面に１０μＬずつ１５滴播種し、液滴を作成した。この際、対照としてはＤＭＳＯを添加した培地（ＤＭＳＯ終濃度０．０５％）を１０μＬずつ１５滴播種した。このフタを２ｍＬのＰＢＳを添加した３．５ｃｍディッシュに戻し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて２日間培養した。培養した液滴を１．５ｍＬのチューブに回収し、最終容量が１５０μＬになるように培地を添加した。更にＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第１９表及び第２０表に示す。
［第１９表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
［第２０表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
　本試験の結果、ｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、及びｋ－１：Ｂ－１は、ハンギングドロップ法で３次元細胞培養した条件においてもＡ４３１細胞株及び骨髄由来ヒト間葉系幹細胞の細胞数を増加させる効果が認められた。この際、Ａ４３１細胞株及び骨髄由来ヒト間葉系幹細胞はハンキングドロップ法で液滴の中にスフェアを形成していた。
［試験例１３］本発明化合物のヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）に対する作用
　ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）は、ビトロネクチンＶＴＮ－Ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をコーティングしたディッシュ上にてｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地（ステムセルテクノロジーズ社製）を用いて培養を行った。増殖期にある上記細胞をＰＢＳ（富士フイルム和光純薬社製）にて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離液を除去した後、培地を添加してピペッティングにより剥離した。この後、遠心して上清を除去した。
　前述の細胞を１０μＭのＹ－２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を含有する培地に懸濁し、１００００ ｃｅｌｌｓ／２００ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴ＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８６０－９００）に播種した。播種後、希釈したＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度５μＭとなるように各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は、２μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．０５％）。毎日半量の培地交換を行い、合わせて化合物濃度が一定になるように各化合物溶液も添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日間培養後、培養上清液を１００μＬ除去した後、残った培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、１５０μＬを９６穴プレート　平底　白色／透明（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＤＭＳＯ添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を第２１表に示す。
［第２１表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000111
　本試験の結果、ヒト多能性幹細胞においてｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、ｋ－１：Ｊ－１、及びｋ－１：Ｉ－１０が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。
［試験例１４］本発明化合物の血管内皮細胞への作用
　ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）をＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）培地にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞はＤｅｔａｃｈＫｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
　前述の細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００～２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を［第２２表］に示す。
［第２２表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
　本試験の結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞においてｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、及びｋ－１：Ｊ－１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いてもヒト臍帯静脈内皮細胞は、スフェアを形成していた。
［試験例１５］本発明化合物の動物細胞株への作用
　各種動物細胞株を下記の通り各々の培地にて前培養（単層培養）を行った。チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株ＣＨＯ－Ｋ１（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（富士フイルム和光純薬社製））、アフリカミドリザル腎臓上皮由来細胞株Ｖｅｒｏ（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲、５％ＦＢＳ含有Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄後、接着細胞は０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して同培地で再懸濁した。
　前述の各種動物細胞を脱アシル化ジェランガム含有または不含の各培地に懸濁し（脱アシル化ジェランガム濃度はＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地は０．０２ ｗ／ｖ ％、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地は０．０１５ ｗ／ｖ ％）、７００～２０００ ｃｅｌｌｓ／９０ μＬ／ウェルの細胞濃度にて、９６穴低接着Ｕ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４５２０、脱アシル化ジェランガム不含培地）、または低接着平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４、脱アシル化ジェランガム含有培地）に播種した（いずれも３Ｄ培養）。引き続き、ＤＭＳＯに溶解させた本発明に用いられる化合物を、終濃度５μＭまたは１０μＭとなるように、各培地に添加した。各化合物溶液の添加量は１０μＬ／ウェルであった。対照としては培地に溶解したＤＭＳＯ溶液を添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、１５分間プレートシェーカー（アズワン社製、Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｍｉｘｅｒ　ＮＳ－Ｐ）で室温にて撹拌した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を算出した。化合物無添加（対照）と比較した際に、１１９％以下の値を示すものを－、１２０％以上の値を示すものを○、１５０％以上の値を示すものを◎として第２３表及び第２４表に示す。
［第２３表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
［第２４表］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
　本試験の結果、複数の動物細胞株においてｋ－１：Ｈ－１、ｋ－１：Ｈ－７、ｋ－１：Ｉ－１、ｋ－１：Ｂ－１、ｋ－１：Ｄ－１、及びｋ－１：Ｊ－１が３次元条件下で増殖活性を亢進させることが明らかになった。この際、低接着Ｕ底プレート、低接着平底プレートのどちらを用いても動物細胞株は、スフェアを形成していた。
　本発明によれば、細胞増殖の促進、スフェア形成の促進、オルガノイド形成の促進、およびＣｙｓｔ形成の促進のいずれかまたはこれらの任意の組合せを達成することができる。本発明により調製された細胞等は、例えば、創薬の分野において非常に有用である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１７－１４７０７１（出願日：２０１７年７月２８日）および特願２０１７－２３９１０２（出願日：２０１７年１２月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (32)

  1. 　下記式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩を含む、培地添加用組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝
  2. 　Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、請求項１記載の組成物。
  3. 　Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　アリール基が、フェニル基である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、単結合または炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　アリール基が、フェニル基である、請求項６に記載の組成物。
  8. 　Ｚが、メチレン基である、請求項６または７に記載の組成物。
  9. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、酸素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　アリール基が、フェニル基であり、Ｚが、メチレン基である、請求項９に記載の組成物。
  11. 　化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    および、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  12. 　化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項１～３、６、及び７のいずれか一項に記載の組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    および、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     
  13. 　化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１～３、９及び１０のいずれか一項に記載の組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     
  14. 　細胞増殖促進用である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 　細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１４記載の組成物。
  16. 　スフェア形成、オルガノイド形成、またはＣｙｓｔ形成の促進に用いられる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を含む、培地。
  18. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の培地添加用組成物を培地へ添加することを含む、細胞増殖を促進させる方法。
  19. 　細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
  20. 　下記式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    ｛式中、Ｘは、単結合、－ＣＨ２ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、または－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１～６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが－ＮＨＣＯ－であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝
  21. 　Ｘが、－ＮＨＣＯ－である、請求項２０記載の化合物またはその塩。
  22. 　Ｒ２が、炭素数１～６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項２０または２１に記載の化合物またはその塩。
  23. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、メチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
  24. 　アリール基が、フェニル基である、請求項２３に記載の化合物またはその塩。
  25. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、単結合または炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
  26. 　アリール基が、フェニル基である、請求項２５に記載の化合物またはその塩。
  27. 　Ｚが、メチレン基である、請求項２５または２６に記載の化合物またはその塩。
  28. 　Ｒ１が、－Ｙ－Ｗ－Ｚ－Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、酸素原子であり、Ｚが、炭素数１～６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～６のアルキル基または炭素数１～６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
  29. 　アリール基が、フェニル基であり、Ｚが、メチレン基である、請求項２８に記載の化合物またはその塩。
  30. 　以下からなる群より選択される、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
    および、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  31. 　以下からなる群から選択される、請求項２０～２２、２５及び２６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
    および、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  32. 　以下で示される化合物またはその塩である、請求項２０～２２、２８及び２９のいずれか一項に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
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