WO2017142316A1 - 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물 - Google Patents

해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물 Download PDF

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WO2017142316A1
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skin
skin improvement
sea
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김범준
김희수
유광호
박문서
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가톨릭관동대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a skin improvement composition containing the sea cucumber extract as an active ingredient, and more particularly, to a skin improvement composition containing the sea cucumber extract prepared by repeating lyophilization twice as an active ingredient.
  • Sea cucumbers are marine invertebrates belonging to the ethos, the sea cucumber river (holothuroidea). In Korea, there are 4 families and 14 species including blue sea ginseng, black sea ginseng, and red sea ginseng. Sea cucumber, along with ginseng, has been the subject of food nutrition research since ancient times. Jagibo, Herb, and Dongbobom have been described for their effects on restorative energy, nerve stability, etc., and have been widely used since ancient times. In recent studies, saponin has been found to be effective in food nutrition.
  • sea cucumber has an effect on skin regeneration and skin whitening
  • an object of the present invention is to provide a skin improvement composition containing a sea cucumber extract prepared by repeating lyophilization as an active ingredient.
  • the skin improvement composition according to an aspect of the present invention contains a sea cucumber extract prepared by repeating lyophilization as an active ingredient.
  • the sea cucumber extract is a step of lyophilizing the sea cucumber, pulverizing lyophilized sea cucumber to prepare a powder, crushing the lyophilized sea cucumber to prepare a powder, incubating the ground powder, incubation It may be prepared by a manufacturing method comprising the step of evaporating concentrated sea cucumber, filtering and condensing the evaporated sea cucumber and the second freeze-drying of the condensed sea cucumber.
  • the skin improvement composition may further include deep-freezing the sea cucumber to -70 ° C to -100 ° C before the first lyophilization step.
  • the first freeze-drying step may be prepared by a method comprising the step of cooling the sea cucumber to -20 °C to -100 °C and drying the cooled sea cucumber for 36 to 84 hours.
  • the incubation step may be prepared by a method of incubating for 1 hour to 3 hours by putting 55% to 95% ethanol in sea cucumber powder.
  • the evaporation concentration step may be prepared by a manufacturing method comprising the step of evaporation concentration for 1.5 hours to 5 hours at 55 °C to 100 °C.
  • the sea cucumber may be blue sea ginseng and / or black sea ginseng.
  • the sea cucumber extract may be extracted using only sea cucumber guts.
  • the sea cucumber extract may be prepared by a manufacturing method further comprising the step of dissolving the second freeze-dried sea cucumber in a solvent to make a solution.
  • the solvent may be one or more selected from the group consisting of butylene glycol, water, ethyl hexanediol, and hexanediol (1,2-hexanediol).
  • the skin improvement may be skin regenerating activity.
  • the skin regeneration activity may be an increase in the expression level of collagen type 4, an increase in the cell activator (ki-67) and / or a decrease in the amount of matrixase secretion.
  • the skin improvement may be skin whitening.
  • the skin whitening may be one that inhibits melanin production.
  • the skin improvement composition containing the sea cucumber extract of the present invention as an active ingredient has an effect of regenerating the skin, such as increasing the expression level of collagen type 4, reducing the amount of matrixase secretion, and skin whitening effect such as inhibiting melanin production Has
  • Figure 1 shows a manufacturing process for extracting sea cucumber extract.
  • Figure 2 shows a process for preparing a sea cucumber extract as a solution.
  • Figure 3 shows the expression levels of collagen type 4 and ki-67 of Comparative Examples 1,2 and 4.
  • Figure 4 shows the expression levels of collagen type 4 and ki-67 of Examples 3 and 4.
  • 5 shows a graph comparing the expression rate of ki-67.
  • the present invention provides a skin cosmetic composition that is effective for skin regeneration activity and skin whitening.
  • Skin improvement composition contains a sea cucumber extract prepared by repeating lyophilization as an active ingredient.
  • the sea cucumber is a marine organism belonging to aspiodchirotida, stichopodidae, and stichopus, and 1,500 species inhabit the world.
  • the sea cucumbers in Korea have the scientific name stichopus japonicus, and 4 and 14 species live there.
  • the sea cucumber may be preferably blue sea ginseng, black sea ginseng.
  • Cheonghaesam is a sea cucumber that lives in rock, gravel, and sanisil areas of the open sea.
  • Black sea cucumber is a sea cucumber that lives in eutrophic waters and strong land.
  • the sea cucumber may be one or more sites selected from the group consisting of the entire sea cucumber, parts of the intestines and excluding the intestines.
  • the drying method of the seafood is natural drying, pressure drying, atmospheric pressure drying, vacuum drying, the freeze drying is a drying method belonging to vacuum drying.
  • the freeze drying is a drying method in which a sublimation of ice is removed by freezing and depressurizing a material containing a large amount of water to remove moisture to obtain a dried product. Lyophilization has the advantage of minimizing damage to heat-sensitive materials and drying them, and the dried material forms a structure that facilitates moisture penetration and enables rapid rehydration of frozen materials.
  • the sea cucumber is easy to occur the deformation of the tissue by the heat, it is suitable to dry the sea cucumber by lyophilization because of the high moisture content. Lyophilized sea cucumbers can be dried while maintaining their own tissues and are excellent in water rehydration.
  • the active ingredient means that the main ingredient of the skin improvement composition is sea cucumber extract. That is, sea cucumber extract is to directly or indirectly express the skin cosmetic function of the composition.
  • the composition is a skin improving composition.
  • Skin improvement means skin whitening, skin wrinkle improvement, and a function that helps protect skin from ultraviolet rays.
  • the skin improvement composition containing the sea cucumber extract may contain only sea cucumber extract as an active ingredient, or may contain other necessary ingredients as an active ingredient, depending on the desired skin improvement function and formulation.
  • the skin cosmetic composition may be used as an external preparation for skin, or may be used as a food such as health food or a drug such as an injection.
  • the sea cucumber extract is the first step of freezing and drying the sea cucumber (S110), pulverizing the lyophilized sea cucumber to prepare a powder (S120), incubating the ground powder (S130), evaporating the incubated sea cucumber It may be prepared by a manufacturing method comprising the step (S140), the step of filtering the evaporated sea cucumber (S150) and condensation (condensation) (S160) and the second freeze-drying of the condensed sea cucumber (S170).
  • the skin improvement composition may be prepared by a manufacturing method comprising the step of deep-freezing (deep-freezing) the sea cucumber to -70 °C to -100 °C before the first lyophilization step.
  • Moisture of sea cucumbers can be completely removed by deep-freezing, and the cells of sea cucumbers can be kept intact without being destroyed due to the cryogenic freezing.
  • the deep freezing may be performed by a quick freezing method of rapidly passing a temperature range of -1 to -5 ° C., which is the maximum ice crystal generation zone.
  • the sea cucumber dried by the first freeze drying (S110) is concentrated in nutrients.
  • the dried sea cucumbers contain highly concentrated nutrients compared to raw sea cucumbers. Therefore, even a small amount can exhibit an excellent skin improvement effect.
  • the first freeze drying step (S110) may be prepared by a manufacturing method comprising the step of freezing the sea cucumber to -10 °C to -110 °C and drying the frozen sea cucumber for 36 to 84 hours.
  • the freezing temperature of the first freeze drying step (S110) may be preferably -10 ° C to -110 ° C, more preferably -20 ° C to -100 ° C. Lyophilization changes the freezing time depending on the freezing temperature. The lower the freezing temperature, the shorter the freezing time, the smaller the pore size and the dense the tissue. This is because rapid freezing results in smaller ice particles because they quickly pass through the ice crystal forming zone.
  • the freezing temperature is lower than -110 °C, the freeze-drying time is shortened, but because the ice crystal production rate is faster and the ice crystals become smaller, the rate of water penetration into the first freeze-dried sea cucumber and absorbed by the dried sea cucumber It may slow down, resulting in low sign language resilience.
  • the freezing temperature is higher than -10 °C, the pores inside the sea cucumber is increased to improve the hydration resilience, but the freeze-drying time is longer, the process of preparing the extract may be longer.
  • the first frozen sea cucumber may preferably be dried for 36 to 84 hours, more preferably for 48 to 72 hours.
  • the drying means sublimation drying and / or secondary drying.
  • Sublimation drying refers to drying moisture by reducing the pressure below the triple point of water after freezing to change from solid to gas directly.
  • Secondary drying refers to dehumidification of drying moisture remaining after sublimation drying, such as water inside a cell. it means.
  • the drying time is shorter than 36 hours, the moisture in the sea cucumber may not be sufficiently dried, and when it is longer than 72 hours, the moisture may be excessively dried to deteriorate the hydration restoring force.
  • the first freeze-dried sea cucumber is ground to prepare a powder (S120).
  • the size of the powder may preferably be 0.01 nm to 1 mm depending on the purpose of use.
  • lyophilized sea cucumber is made into powder, it can be absorbed into the body because of its small size, and the surface area can be increased to easily react with other substances contained in the skin improvement composition.
  • Incubating the pulverized powder (S130) may be prepared by a method of incubating for 1 hour to 3 hours by putting 55% to 95% ethanol in sea cucumber powder.
  • the ethanol may be preferably 55% to 95% purity, more preferably 65% to 85% purity.
  • incubation may preferably be carried out for 1 hour to 3 hours, more preferably for 1.5 hours to 2.5 hours.
  • the incubation step (S130) decomposes the substrate protein of sea cucumber, and the degraded substrate protein may activate the skin cosmetic function of the sea cucumber extract. If the purity of the ethanol is less than 55% can be incubated containing contaminants, if more than 95% sea cucumber protein can be coagulated due to the high purity of ethanol.
  • the substrate protein of the sea cucumber may not be decomposed enough to make an extract, and if it is more than 3 hours, the skin beauty function of the sea cucumber may be lost due to decomposition of the substrate protein of the sea cucumber. have.
  • the evaporation concentration step (S140) may be prepared by a manufacturing method comprising the step of evaporating the incubated sea cucumber for 1.5 to 5 hours at 55 °C to 100 °C.
  • the evaporation concentration may preferably be performed at 55 ° C. to 100 ° C. for 1.5 hours to 5 hours, and more preferably at 65 ° C. to 90 ° C. for 2 hours to 4.5 hours.
  • the evaporation concentration is less than 55 ° C, impurities may remain in the sea cucumber extract due to low volatilization, and if the evaporation concentration is higher than 100 ° C, the skin improvement component of the sea cucumber may be destroyed due to the high temperature.
  • the evaporation concentration time is less than 1.5 hours, ethanol, contaminants, etc. may not be sufficiently evaporated due to a short time, and if it is more than 5 hours, protein modification of sea cucumber components may occur even at low temperature due to long time heating. .
  • Filtration (S150) and condensation (S160) of the incubated sea cucumber is a step for obtaining a high-purity sea cucumber extract by filtering and concentrating the remaining impurities from the evaporated sea cucumber.
  • the second step of freeze-drying the condensed sea cucumber (S170) is a step for obtaining a high purity sea cucumber extract by secondary freeze-drying the condensed sea cucumber. Since the second freeze-drying step is to repeat the first freeze-drying step again, a detailed description thereof will be omitted.
  • the sea cucumber may preferably be blue sea ginseng and / or black sea ginseng, more preferably may be blue sea ginseng and / or black sea ginseng inhabiting the coast near the west coast of Baeknyeongdo.
  • Cheonghae and black sea cucumbers belong to resistant sea cucumbers, and red sea cucumbers belong to external sea cucumbers.
  • Cheonghae and black sea cucumbers, which are resistant to sea cucumbers, have thick and short polyan vesicles, a blunt-shaped tip, less shrinkage, and simple tentacles (ossicles).
  • the red sea ginseng which is an external sea cucumber, has a thin and long polycynosis, its tip has a pointed shape, contraction is severe, and the tentacles are complicated in shape.
  • the blue sea ginseng and black sea ginseng have a variety of nutritional ingredients compared to the red sea ginseng because it consumes a variety of food compared to the red sea ginseng mainly eat red algae.
  • the sea cucumber extract may be extracted using only sea cucumber guts.
  • Sea cucumber intestines have a high antioxidant power compared to parts except intestines due to the effect of seaweeds in the intestines.
  • Antioxidant means the action of preventing oxidation.
  • the antioxidant power of the sea cucumber gut can help remove the free radicals in the human body and prevent aging of the cells due to the oxidation of the cells, which can help skin beauty. Therefore, the skin improvement composition containing the extract extracted only from the gut of sea cucumber as an active ingredient can exert an excellent function in skin regeneration activity and skin whitening.
  • the sea cucumber extract may be a skin improvement composition prepared by a manufacturing method further comprising the step (S180) of dissolving the secondary lyophilized sea cucumber in a solvent.
  • Skin improvement compositions containing sea cucumber extract as an active ingredient can be used in various formulations.
  • the skin improving composition may contain sea cucumber extract of the solution.
  • the solvent may be one or more solvents selected from the group consisting of polar, nonpolar, organic and inorganic solvents.
  • the solvent may be preferably one or more selected from the group consisting of butylene glycol, water, ethyl hexanediol and hexanediol (1,2-hexanediol).
  • Butylene glycol, ethanol diol, and hexanediol are alcoholic compounds that can dissolve various components of sea cucumber, thereby making a solution that can effectively exert the skin improving function of the skin improving composition containing sea cucumber extract.
  • the skin improvement may be skin regenerating activity.
  • the skin regeneration activity may preferably be an increase in the expression level of collagen type IV, an increase in cell activator (ki-67) and / or a decrease in the amount of matrix metalloproteinases secreted.
  • the skin regeneration activity may be an increase in the expression level of collagen type 4.
  • the expression amount of the collagen type 4 may be preferably 200% to 500% compared to the negative control prepared with dimethyl sulfoxide, and may be 103% to 110% compared to ascorbic acid.
  • Collagen is a major protein constituting the flesh and connective tissue of mammals, accounting for 25% to 35% of the protein constituting the body. Collagen has been identified to 29 types so far, collagen type 4 is a major component of the basement membrane and glomerular interstitial matrix. Collagen type 4 is composed of four regions: 7S collagen region, non collagenous 1 (NC1) region, non collagenous 2 (NC2) region, and triple helix (TH) region. The four molecules of collagen type 4 are connected to each other by the NH2 terminal site, and the double disulfide bond (SS) is a 7S collagen region, which is not degraded by various proteolytic enzymes such as bacterial collagen degrading enzyme. .
  • NC1 non collagenous 1
  • NC2 non collagenous 2
  • TH triple helix
  • the basement membrane is a thin membrane between the epidermis and the dermis that is responsible for skin regeneration.
  • the skin improving composition may have a function for skin regeneration activity through a mechanism for strengthening the basement membrane by increasing the expression level of collagen type 4 which is a main component of the basement membrane.
  • the skin regeneration activity may be an increase in cell activator (ki-67).
  • the expression level of the cell activator (ki-67) is preferably 200% to 500% compared to the negative control 0.1% dimethyl sulfoxide (dimethyl sulfoxide).
  • Cell activator (ki-67) is a protein used as a marker of cell proliferation and is expressed in G1, G2, S and M phases of the cell cycle.
  • Skin improvement composition containing sea cucumber extract as an active ingredient affects the skin cells to increase the regenerative activity. Therefore, cell regeneration of the stratum corneum of the skin where the skin improving composition is used is activated, and the expression level of the cell activator (ki-67) is increased.
  • the skin regeneration activity may be a decrease in the amount of matrixase secretion.
  • the substrate secretion secretion reduction may preferably be 50% to 90% of the amount of stromatase expression of the negative control prepared with dimethyl sulfoxide, and 60% to 90% of the amount of stromatase expression of ascorbic acid. Can be.
  • Matrixase refers to type IV collagenase and stromelysin (MMP-3) that degrade collagen type 4.
  • Type 4 collagenase consists of gelatinase A (MMP-2) and gelatinase B (MMP-9).
  • MMP-2 is made from fibroblasts, endothelial cells, macrophages, etc.
  • MMP-9 is made from both normal and cancer cells
  • stromelysin (MMP-3) is made from cancer cells.
  • the sea cucumber extract may have a function for skin regeneration activity through a mechanism of inhibiting the breakdown of collagen type 4 by reducing the secretion amount of the matrixase.
  • the skin improvement may be skin whitening.
  • Skin whitening means making the skin white and beautiful by preventing melanogenesis by the melanin pigment.
  • the skin cosmetic composition may function for skin whitening before, during or after the synthesis of melanin. Before melanin synthesis, through tyrosinase transcription and glycosylation control, during melanin synthesis, through tyrosinase inhibition, peroxidase inhibition, reducing agent and active oxygen scavenging after melanin synthesis Can whiten function.
  • the skin whitening may be one that inhibits melanin production.
  • Melanin secretion of the skin improvement composition containing the sea cucumber extract as an active ingredient is preferably reduced by 12% to 15% compared to the melanin secretion of the negative control group made of 1X PBS, negative control group made of dimethyl sulfoxide 2% to 6% of the melanin secretion may be reduced.
  • the inhibition of melanin production is that melanin is converted into dopa, dopaquinone by tyrosine, which is an intracellular substance, and then, tyrosinase-related proteins TRP-2 (dopachrome tautomerase) and TRP-1 (5,6-) It is produced by the dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase and the automated process.
  • the skin improving composition may inhibit the production of melanin by interfering with the mechanism by which tyrosine is formed into melanin by increasing tyrosinase inhibitory activity and / or decreasing tyrosinase expression.
  • Comparative Examples 1 to 3 are the maintenance medium provided by Tego Science, 0.1% dimethyl sulfoxide provided by Tego Science, and 1X PBS (phosphate buffer saline) provided by Tego Science. Made a negative control.
  • Comparative Example 4 was made of ascorbic acid (L-Ascorbin acid), Comparative Example 5 was made a positive control group with arbutin (arbutin).
  • Example 1 low concentration sea cucumber extract
  • Blue sea ginseng and black sea ginseng collected in the waters near Baengnyeong-do were washed, cooled at -30 ° C, and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours, and then concentrated by evaporation at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber was lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • Blue sea ginseng and black sea ginseng collected in the waters near Baengnyeong-do were washed, cooled at -30 ° C, and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours, and then concentrated by evaporation at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber was lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • the internal organs of the blue sea ginseng and black sea ginseng collected from the waters near Baeknyeong-do were washed and deep-freezed using a deep freezer at -80 ° C.
  • the frozen sea cucumber viscera was pulverized and cooled to a temperature of -30 ° C. and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber viscera powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours and then evaporated to distill at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • Using a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber viscera were lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • the internal organs of the blue sea ginseng and black sea ginseng collected from the waters near Baeknyeong-do were washed and deep-freezed using a deep freezer at -80 ° C.
  • the frozen sea cucumber viscera was pulverized and cooled to a temperature of -30 ° C. and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber viscera powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours and then evaporated at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • Using a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber viscera were lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • Blue sea ginseng and black sea ginseng collected in the waters near Baengnyeong-do were washed, cooled at -30 ° C, and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours, and then concentrated by evaporation at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber was lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • the second freeze-dried sea cucumber extract was mixed with a butylene glycol, water, ethyl hexanediol and hexanediol (1,2-hexanediol) solvent to make a 5% concentration of sea cucumber extract solution.
  • Blue sea ginseng and black sea ginseng collected in the waters near Baengnyeong-do were washed, cooled at -30 ° C, and dried for 48 hours.
  • the sea cucumber powder was incubated in 75% ethanol for 2 hours, and then concentrated by evaporation at 70 ° C. for 3 hours, and then filtered through cotton.
  • a vacuum evaporator (EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan) was concentrated at a low concentration of 50mg / ml for 5 hours.
  • the concentrated sea cucumber was lyophilized at -30 ° C for 48 hours.
  • the second freeze-dried sea cucumber extract was mixed with a butylene glycol, water, ethyl hexanediol and hexanediol (1,2-hexanediol) solvent to make a 20% concentration of sea cucumber extract solution.
  • Test materials stored at -20 ° C were prepared by thawing immediately before treatment and diluted in the maintenance medium (see Table 1 below).
  • the control and test groups were treated with 3.5 ml of medium layer per well of 3D skin culture model (Neoderm®, Tego Science Co., Ltd.), 30 ⁇ l over the cell layer surface, and then incubated in a CO2 incubator (10% CO2, 37 ° C.) for 24 hours. It was.
  • the medium was replaced and the control and test groups were treated with 3.5 ml of medium layer per well of 3D skin culture model (Neoderm®, Tego Science Co., Ltd.) and 30 ⁇ l on the cell layer surface, followed by CO2 incubator (10% CO 2, at 37 ° C.) was further incubated for 24 hours, for a total of 48 hours. After 48 hours of incubation, the cultures of all groups were collected and stored at -70 ° C, and the tissues prepared frozen blocks.
  • 3D skin culture model Neoderm®, Tego Science Co., Ltd.
  • Examples 3 and 4 markedly increased the expression of collagen type 4 compared to Comparative Example 2 which is a negative control.
  • 3.9 times increased to 49.1 ( ⁇ 7.8)%, and ki-67 expression rate of Example 4 increased from 12.5 ( ⁇ 3.6)% to 48.3 ( ⁇ 10.2)% of Comparative Example 2 which is negative control.
  • the protocol of the human MMP-9 ELISA kit (R & D systems / DMP900) was performed.
  • 20ng / ml MMP-9 standard stock solution was diluted in 1X calibrator diluent step by step to prepare a standard solution is shown in Table 3 below.
  • MMP-9 secretion was quantitatively analyzed using an ELISA kit using the collected culture solution. MMP-9 standard solution absorbance results are shown in Table 4 and FIG. 6, and MMP-9 secretion is shown in Table 5 and FIG.
  • the average secretion amount of MMP-9 was measured as 14.4 ( ⁇ 3.1) ng / ml
  • Comparative Example 2 was 17.9 ( ⁇ 1.6) ng / ml
  • Comparative Example 1 is a positive control Example 4 measured 14.8 ( ⁇ 2.5) ng / ml
  • the average MMP-9 secretion in Example 3 was 12.0 ( ⁇ 1.4) ng / ml, which was 0.7-fold lower than that of Comparative Example 2, which was a negative control.
  • the skin cosmetic composition containing sea cucumber extract as an active ingredient was found to have an equivalent or more efficacy compared to ascorbic acid (L-Ascorbin acid).
  • test substance stored at -20 ° C was thawed immediately before treatment and diluted with 1X PBS (Diluent) to prepare as shown in Table 6 below.
  • test material was treated with 100 ⁇ l per well on the surface of the 3D skin culture model (Neoderm, Tego Science Co., Ltd.). After 48 hours of incubation in a CO 2 incubator (10% CO 2 , 37 ° C.), the remaining test substance remaining on the surface of the 3D skin culture model was removed using a pipette.
  • the 3D skin culture model was then washed twice with 200 ⁇ l PBS and separated using a blade as if cut out from the insert edge of the 3D skin culture model.
  • the tissues of the isolated 3D skin culture model were placed in 1.5 ml e-tube, and PBS was completely removed.
  • 360 ⁇ l of lysis buffer Solvable TM
  • 3D skin culture tissue model tissue was separated from the membrane and removed. After incubation for 45 minutes at 95 °C, heat block and centrifugation for 10 minutes at 13,000rpm, the supernatant was transferred to a new eppendorf tube.
  • 100 ⁇ l / ml melanin solution was prepared using 20mg / ml NH 4 OH, and 100 ⁇ l / ml melanin solution was prepared by diluting step by step using lysis buffer as shown in Table 7 below. .
  • the results obtained by measuring the absorbance at 450 nm by transferring 200 ⁇ l of blank, standard solution and test substance to 96 well plates by 200 ⁇ l were shown in Table 8.
  • the results of analyzing the melanin amount were quantified using a melanin standard curve. 9 is shown.
  • Examples 1 to 4 were shown to have a similar level of whitening efficacy to arbutin.

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Abstract

해삼 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 개선 조성물이 개시된다. 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물은 피부 재생활성과 피부 미백에 효과가 있다.

Description

해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물
본 발명은 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물에 관한 것으로서, 특히 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물을 유효성분을 함유하는 피부 개선 조성물에 관한 발명이다.
해삼은 극피동물문 해삼강(holothuroidea)에 속하는 해양 무척추동물로서, 한국에는 청해삼, 흑해삼, 홍해삼 등 4과 14종이 서식하고 있다. 해삼은 인삼과 함께 대표적인 보양식품으로서 옛날부터 지금까지 식품 영양학적 연구의 대상이 되었다. 자산어보, 본초강목, 동의보감 등에는 원기회복, 신경 안정 등에 대한 효과가 기재되어 있어 옛날부터 널리 사용되었음을 알 수 있고, 최근 연구에서는 사포닌 성분을 발견하여 식품 영양학적으로 우수한 효과가 있음이 밝혀지고 있다.
최근에는 해삼의 식품 영양학적인 연구뿐 아니라 천연물 신약으로서의 연구도 활발하게 이루어지고 있고, 특히 최근 연구 결과에서는 해삼의 피부 재생 또는 피부 미백에 대한 효능이 입증되었다. 하지만 피부 재생 및 피부 미백에 대한 연구의 대부분은 해삼과 다른 원료에서 추출한 추출물을 동시에 사용하였다. 따라서 해삼만이 가지고 있는 피부 재생 및 피부 미백에 대한 효능을 확인하기 어려웠다. 또한 해삼만 연구한 경우에는 해삼의 종류, 부위, 추출방법 등에 따라 피부 활성에 어떠한 차이가 있는지 상세한 연구가 보고된 바는 없고, 대부분 동물실험에 의한 효과를 제시하고 있어서 실제 인간 피부 모델에서 피부 재생 및 피부 미백에 대한 효과가 있는지 정확하게 제시하지 못하고 있는 문제점이 있다.
따라서 해삼이 피부 재생 및 피부 미백에 대한 효과를 갖는지 연구할 필요가 있었고, 실제 인간 피부가 해삼의 피부 재생 및 미백에 대한 효과가 가 있음을 확인할 필요도 있었다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 창출된 것으로서, 본 발명의 목적은 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물을 제공하는 것이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일측면에 따른 피부 개선 조성물은 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물을 유효성분으로 함유한다.
여기서, 상기 해삼 추출물은 해삼을 1차 동결건조하는 단계, 동결건조된 해삼을 분쇄하여 분말을 제조하는 단계, 동결건조된 해삼을 분쇄하여 분말을 제조하는 단계, 분쇄된 분말을 인큐베이션하는 단계, 인큐베이션된 해삼을 증발농축하는 단계, 증발농축된 해삼을 여과 및 응축하는 단계 및 응축된 해삼을 2차 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 피부 개선 조성물은 상기 1차 동결건조 단계 전에 해삼을 -70℃ 내지 -100℃로 딥-프리징(deep-freezing)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 1차 동결건조 단계는 해삼을 -20℃ 내지 -100℃로 냉각하는 단계 및 냉각된 해삼을 36시간 내지 84시간 동안 건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 인큐베이션 단계는 해삼 분말에 55% 내지 95%의 에탄올을 넣어 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션 하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 증발농축 단계는 55℃ 내지 100℃에서 1.5시간 내지 5시간 동안 증발 농축하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 해삼은 청해삼 및/또는 흑해삼일 수 있다.
상기 해삼 추출물은 해삼 내장만 사용하여 추출한 것일 수 있다.
상기 해삼 추출물은 2차 동결건조된 해삼을 용매에 용해시켜 용액을 만드는 단계를 더 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 용매는 부틸렌글라이콜(butylene glycol), 물, 에칠헥산디올(ethyl hexanediol) 및 헥산디올(1,2-hexanediol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 피부 개선은 피부 재생 활성인 것일 수 있다.
상기 피부 재생 활성은 콜라겐 타입4의 발현량 증가, 세포활성인자(ki-67)의 증가 및/또는 기질분해효소 분비량 감소인 것일 수 있다.
상기 피부 개선은 피부 미백인 것일 수 있다.
상기 피부 미백은 멜라닌 생성 저해인 것일 수 있다.
본 발명의 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물은 콜라겐 타입4의 발현량 증가, 기질분해효소 분비량 감소 등 피부를 재생하는 효과가 있으며, 멜라닌 생성 저해 등 피부의 흑화를 방지하는 피부 미백 효과를 가진다.
도 1은 해삼 추출물을 추출하는 제조공정을 나타낸다.
도 2는 해삼 추출물을 용액으로 제조하는 공정을 나타낸다.
도 3은 비교예 1,2 및 4의 콜라겐 타입4 및 ki-67의 발현량을 나타낸다.
도 4는 실시예 3 및 4의 콜라겐 타입4 및 ki-67의 발현량을 나타낸다.
도 5는 ki-67의 발현율 비교 그래프를 나타낸다.
도 6은 MMP-9의 표준 곡선 그래프를 나타낸다.
도 7은 MMP-9의 분비량 비교 그래프를 나타낸다.
도 8은 멜라닌 표준 곡선을 나타낸다.
도 9는 비교예2 및 3, 실시예 1 내지 6의 멜라닌량 비교 그래프를 나타낸다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 피부 재생 활성과 피부 미백에 효능이 있는 피부 미용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 피부 개선 조성물은 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물을 유효성분으로 함유한다.
상기 해삼은 순수목(aspiodchirotida), 돌기해삼과(stichopodidae), 돌기해삼속(stichopus)에 속하는 해양 생물로서, 세계적으로 1,500종이 서식하고 있다. 대한민국에서 서식하는 해삼은 학명이 stichopus japonicus이며, 4과 14종이 서식하고 있다.
상기 해삼은 바람직하게는 청해삼, 흑해삼일 수 있다. 청해삼은 외해수역의 암반, 자갈, 사니질 지역 서식하고 해삼이고, 흑해삼은 부영양 수역, 육상의 영향이 강한 곳에 서식하는 해삼이다.
상기 해삼은 해삼 전체, 내장 및 내장을 제외한 부위로 이루어진 군에서 선택되는 1이상의 부위일 수 있다.
해산물의 건조 방법으로는 자연건조, 가압건조, 상압건조, 진공건조가 있는데, 상기 동결건조는 진공 건조에 속하는 건조 방식이다. 상기 동결건조는 다량의 수분을 함유한 재료를 동결 및 감압함으로써 얼음을 승화시켜 수분을 제거하여 건조물을 얻는 건조 방식이다. 동결건조는 열에 민감한 물질의 손상을 최소화하여 건조하며, 건조된 물질이 수분 침투가 용이한 구조를 형성해 동결된 물질의 신속한 재수화(rehydration)가 가능한 장점이 있다.
상기 해삼은 열에 의해 조직의 변형이 일어나기 쉬우며, 수분함량이 많기 때문에 동결건조로 해삼을 건조하는 것이 적합하다. 동결건조된 해삼은 고유의 조직을 유지하면서 건조될 수 있으며, 물에 대한 재수화가 뛰어나다.
상기 유효성분이란 피부 개선 조성물의 주성분이 해삼 추출물인 것을 의미한다. 즉, 해삼 추출물이 조성물의 피부 미용 기능을 직접 또는 간접적으로 발현시키는 것이다.
상기 조성물은 피부 개선 조성물이다. 피부 개선이란 피부 미백, 피부 주름개선, 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 기능 등을 의미한다.
상기 해삼 추출물을 함유하는 피부 개선 조성물은 목적하는 피부 개선 기능 및 제형에 따라서 해삼 추출물만을 유효성분으로 함유할 수도 있고, 해삼 추출물과 동시에 기타 필요한 성분을 유효성분으로 함유할 수도 있다. 또한 상기 피부 미용 조성물은 피부 외용제로 사용될 수 있고, 건강식품 같은 음식물 또는 주사제형같은 약물 등으로도 사용될 수도 있다.
상기 해삼 추출물은 해삼을 1차 동결건조하는 단계(S110), 동결건조된 해삼을 분쇄하여 분말을 제조하는 단계(S120), 분쇄된 분말을 인큐베이션하는 단계(S130), 인큐베이션된 해삼을 증발농축하는 단계(S140), 증발농축된 해삼을 여과(S150) 및 응축(condensation)(S160)하는 단계 및 응축된 해삼을 2차 동결건조하는 단계(S170)를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 피부 개선 조성물은 상기 1차 동결건조 단계 전에 해삼을 -70℃ 내지 -100℃로 딥-프리징(deep-freezing)하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다. 딥-프리징에 의해 해삼의 수분이 완전히 제거될 수 있으며, 극저온으로 급속 냉동하기 때문에 해삼의 세포가 파괴되지 않고 온전히 유지될 수 있다. 상기 딥-프리징은 최대 얼음결정생성대인 -1 내지 -5℃의 온도대역을 급속히 통과시키는 방식의 급속냉동(quick freezing) 방식으로 수행될 수 있다.
상기 1차 동결건조(S110)로 건조된 해삼은 영양분이 농축된다. 즉, 무게의 90%이상이 물로 이루어진 생 해삼에서 동결건조로 수분이 빠지게 되면, 건조된 해삼은 생 해삼에 비해서 같은 무게 대비 고도로 농축된 영양분을 함유하게 된다. 따라서 적은 양으로도 우수한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있다.
상기 1차 동결건조 단계(S110)는 해삼을 -10℃ 내지 -110℃로 동결하는 단계 및 상기 동결된 해삼을 36시간 내지 84시간 동안 건조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 1차 동결건조 단계(S110)의 동결 온도는 바람직하게 -10℃ 내지 -110℃일 수 있고, 보다 바람직하게는 -20℃ 내지 -100℃일 수 있다. 동결건조는 동결 온도에 따라 동결 시간이 변한다. 동결 온도가 낮을수록 동결 시간이 짧아지며, 공극의 크기가 작고 치밀한 조직을 갖는다. 이는 급속동결을 하면 빙결정 형성대를 빠르게 지나가기 때문에 보다 작은 얼음입자가 생성되기 때문이다. 상기 동결 온도가 -110℃보다 낮은 경우에 동결건조 시간은 짧아지지만, 빙결정 생성속도가 빨라지고 빙결정이 작아지기 때문에 1차 동결건조된 해삼 내부로 물이 침투하고 건조된 해삼에 흡수되는 속도가 느려져 수화복원력이 낮게 나타날 수 있다. 또한 상기 동결 온도가 -10℃보다 높은 경우에는 해삼 내부의 공극이 커져 수화복원력은 좋아지지만, 동결건조 시간이 길어져 추출물을 제조하는 과정이 길어질 수 있다.
상기 1차 동결된 해삼은 바람직하게 36시간 내지 84시간 동안 건조될 수 있고, 보다 바람직하게는 48시간 내지 72시간 동안 건조될 수 있다. 상기 건조는 승화건조 및/또는 2차 건조를 의미한다. 승화건조란 동결 후에 압력을 물의 3중점 이하로 감소시켜서 고체에서 직접 기체로 변화시켜서 수분을 건조하는 것을 의미하고, 2차 건조는 세포 내부의 물 등과 같이 승화 건조 후에도 남아있는 수분을 건조하는 탈습을 의미한다. 상기 건조 시간이 36시간 보다 짧으면 해삼 내의 수분이 충분히 건조되지 않을 수 있고, 72시간보다 길면 수분이 과도하게 건조되어 수화복원력이 나빠질 염려가 있을 수 있다.
상기 1차 동결건조된 해삼을 분쇄하여 분말을 제조한다(S120). 분말의 크기는 사용 목적에 따라 바람직하게 0.01nm 내지 1mm일 수 있다. 동결건조된 해삼을 분말로 만들면 사이즈가 작아지므로 체내로 잘 흡수될 수 있으며, 표면적이 증가하여 피부 개선 조성물에 함유되는 다른 물질과 쉽게 반응할 수 있다.
상기 분쇄된 분말을 인큐베이션하는 단계(S130)는 해삼 분말에 55% 내지 95%의 에탄올을 넣어 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션하는 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 에탄올은 바람직하게 55% 내지 95% 순도일 수 있고, 보다 바람직하게는 65% 내지 85%의 순도일 수 있다. 그리고 인큐베이션은 바람직하게 1시간 내지 3시간 동안 할 수 있고, 보다 바림직하게는 1.5시간 내지 2.5시간 동안 할 수 있다. 상기 인큐베이션 단계(S130)는 해삼의 기질 단백질을 분해시키며, 분해된 기질 단백질은 해삼 추출물의 피부 미용 기능을 활성화시킬 수 있다. 상기 에탄올의 순도가 55% 미만인 경우에 오염물질이 포함되어 인큐베이션될 수 있고, 95% 초과인 경우에는 고순도의 에탄올로 인하여 해삼 단백질이 응고될 수 있다. 상기 인큐베이션 시간이 1시간 미만인 경우에 해삼의 기질 단백질이 추출물을 만들 수 있을 정도로 충분히 분해되지 않을 수 있고, 3시간 초과인 경우에는 해삼의 기질 단백질의 분해로 인하여 해삼의 피부 미용 기능을 상실할 수 있다.
상기 증발농축단계(S140)는 인큐베이션된 해삼을 55℃ 내지 100℃에서 1.5 내지 5시간 동안 증발농축하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것일 수 있다.
상기 증발 농축은 바람직하게 55℃ 내지 100℃에서 1.5시간 내지 5시간 동안 할 수 있고, 보다 바람직하게는 65℃ 내지 90℃에서 2시간 내지 4.5시간 동안 할 수 있다. 상기 증발농축 단계를 통해 에탄올, 기름성분, 중금속 등 오염성분을 제거하여 순수한 해삼만 얻을 수 있다. 증발농축 온도가 55℃ 미만인 경우에 낮은 온도로 인해 오염성분이 휘발되지 않아서 해삼 추출물에 불순물이 남아있을 수 있고, 100℃ 초과인 경우 고온으로 인하여 해삼의 피부 개선 성분이 파괴될 수 있다. 그리고 증발농축 시간이 1.5시간 미만인 경우에 짧은 시간으로 인해 에탄올, 오염성분 등이 충분히 증발되지 않을 수 있고, 5시간 초과인 경우에는 오랜 시간 가열로 인해 낮은 온도에서도 해삼 성분의 단백질 변형을 일으킬 수 있다.
상기 인큐베이션된 해삼을 여과(S150) 및 응축(condensation)(S160)하는 단계는 증발농축된 해삼에서 남아있는 불순물을 거르고 농축시켜 고순도의 해삼 추출물을 얻기 위한 단계이다.
상기 응축된 해삼을 2차 동결건조하는 단계(S170)는 응축된 해삼을 2차 동결건조하여 고순도의 해삼 추출물을 얻기 위한 단계이다. 2차 동결건조 단계는 1차 동결건조 단계를 다시 반복하는 것이므로 이하 자세한 설명은 생략한다.
상기 해삼은 바람직하게 청해삼 및/또는 흑해삼일 수 있고, 보다 바람직하게는 서해안 백령도 근처 해안에서 서식하는 청해삼 및/또는 흑해삼일 수 있다. 청해삼 및 흑해삼은 내만성 해삼에 속하며, 홍해삼은 외해성 해삼에 속한다. 내만성 해삼인 청해삼 및 흑해삼은 폴리씨낭(polian vesicle)이 두텁고 짧으며, 선단은 둔원형으로 생겼으며, 수축성이 적으며, 촉수골편(ossicle)은 형태가 단순하다. 반면에 외양성 해삼인 홍해삼은 폴리씨낭이 가늘고 길며, 선단은 뾰족한 모양으로 생겼으며, 수축성이 심하며, 촉수골편은 형태가 복잡하다. 상기 청해삼 및 흑해삼은 홍조류만 주로 먹는 홍해삼에 비하여 다양한 먹이를 섭취하기 때문에 홍해삼에 비해서 다양한 영양 성분을 가지고 있는 장점이 있다.
상기 해삼 추출물은 해삼 내장만 사용하여 추출한 것일 수 있다. 해삼 내장은 내장 내에 존재하는 해조류의 영향으로 내장을 제외한 부위와 비교하여 높은 항산화력을 가진다. 항산화란 산화를 방지하는 작용을 의미한다. 해삼 내장의 항산화력은 인체 내의 활성 산소를 제거하여 세포의 산화로 인한 세포의 노화를 방지할 수 있어 피부 미용에 도움을 줄 수 있다. 따라서 해삼의 내장에서만 추출한 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 개선 조성물은 피부 재생 활성 및 피부 미백에 우수한 기능을 발휘할 수 있다.
상기 해삼추출물은 상기 2차 동결건조된 해삼을 용매에 용해시켜 용액을 만드는 단계(S180)를 더 포함하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물일 수 있다. 해삼 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 개선 조성물은 다양한 제형으로 사용이 가능하다. 따라서 사용 목적 및 방법에 따라 피부 개선 조성물은 용액의 해삼 추출물을 함유할 수도 있다. 상기 용매는 극성, 비극성, 유기 및 무기 용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매일 수 있다.
상기 용매는 바람직하게 부틸렌글라이콜(butylene glycol), 물, 에칠헥산디올(ethyl hexanediol) 및 헥산디올(1,2-hexanediol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
부틸렌글라이콜, 에칠헨산디올 및 헥산디올은 알코올계 화합물로서 해삼의 다양한 성분을 용해시킬 수 있어 해삼 추출물을 함유한 피부 개선 조성물의 피부 개선 기능을 효과적으로 발휘할 수 있는 용액을 만들 수 있다.
상기 피부 개선은 피부 재생 활성인 것일 수 있다. 상기 피부 재생 활성은 바람직하게 콜라겐 타입4(collagen type IV)의 발현량 증가, 세포활성인자(ki-67)의 증가 및/또는 기질분해효소(matrix metalloproteinases) 분비량 감소인 것일 수 있다.
상기 피부 재생 활성은 콜라겐 타입4의 발현량 증가일 수 있다. 상기 콜라겐 타입4의 발현량은 바람직하게 다이메틸설폭사이드로 제조한 음성대조군에 비하여 200% 내지 500%일 수 있고, 아스코르빈산에 비하여 103% 내지 110%일 수 있다.
콜라겐(collagen)은 포유동물의 살과 결합조직을 구성하는 주요 단백질로서, 신체를 구성하는 단백질 중 25% 내지 35%를 차지한다. 콜라겐은 현재까지 29종의 타입이 밝혀졌으며, 콜라겐 타입4는 기저막과, 사구체 간질 기질의 주요 구성성분이다. 콜라겐 타입4는 7S 콜라겐 영역, NC1(non collagenous 1)영역, NC2(non collagenous 2)영역 및 TH(triple helix)영역 등 4개의 영역으로 구성되어 있다. 콜라겐 타입4의 4개 분자들은 NH2 말단 부위로 서로 연결되어 있는데, 이중 이황화결합(S-S)이 많은 곳이 7S 콜라겐 영역이고, 이 영역은 세균성 콜라겐 분해효소 등의 다양한 단백질 분해 효소에 의해 분해되지 않는다. 기저막이란 표피와 진피 사이에 존재하는 얇은 막으로서 피부 재생을 담당한다. 기저막이 손상되면 표피층에서 진피로 콜라겐을 분해하는 효소가 침입하여 콜라겐 섬유를 파괴하기 때문에 피부의 주름이 생성된다. 상기 피부 개선 조성물은 기저막의 주요 구성성분인 콜라겐 타입4의 발현량을 증가시켜 기저막을 강화하는 기전을 통해 피부 재생 활성에 대한 기능을 가질 수 있다.
상기 피부 재생 활성은 세포활성인자(ki-67)의 증가일 수 있다. 상기 세포활성인자(ki-67)의 발현량은 바람직하게 음성대조군인 0.1% 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 비하여200% 내지 500%일 수 있다. 세포활성인자(ki-67)은 세포 증식의 표지자로 사용되는 단백질로서 세포 주기 중 G1, G2, S, M기에서 발현된다. 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물은 피부 세포에 영향을 주어 재생 활성을 증가시킨다. 따라서 피부 개선 조성물이 사용되는 피부의 각질층 등의 세포 재생이 활발해져 세포활성인자(ki-67)의 발현량이 증가하게 된다.
상기 피부 재생 활성은 기질분해효소 분비량 감소일 수 있다. 상기 기질분해효소 분비량 감소는 바람직하게 다이메틸설폭사이드로 제조한 음성대조군의 기질분해효소 발현량의 50% 내지 90%일 수 있고, 아스코르빈산의 기질분해효소 발현량의 60% 내지 90%일 수 있다.
기질분해효소는 콜라겐 타입4를 분해하는 타입4 콜라게나아제(type IV collagenase), 스트로멜리신(stromelysin, MMP-3)을 의미한다. 타입4 콜라게나아제는 겔라티나아제 A(gelatinase A, MMP-2) 및 겔라티나아제 B(gelatinase B, MMP-9)로 구성되어 있다. MMP-2는 섬유아세포, 내피세포, 대식세포 등에서 만들어지며, MMP-9은 정상세포와 암세포 모두에서 만들어지며, 스트로멜리신(MMP-3)은 암세포에서 만들어진다. 상기 해삼 추출물은 상기 기질분해효소의 분비량을 감소시켜 콜라겐 타입4의 분해를 억제하는 기전을 통해서 피부 재생 활성에 대한 기능을 가질 수 있다.
상기 피부 개선은 피부 미백일 수 있다. 피부 미백은 멜라닌 색소에 의해 피부가 흑화(melanogenesis)되는 것을 방지하여 피부를 희고 아름답게 만드는 것을 의미한다.
상기 피부 미용 조성물은 멜라닌 합성 전, 합성 중 또는 합성 후에 피부 미백 기능을 할 수 있다. 멜라닌 합성 전에는 티로시나제(tyrosinase) 전사조절과 당화조절을 통해서, 멜라닌 합성 중에는 티로시나제 저해, 과산화효소 저해, 환원제 및 활성산소소거를 통해서, 멜라닌 합성 후에는 티로시나제 분해, 멜라닌소체 이동 저해, 박리 촉진을 통해서 피부 미백 기능을 할 수 있다.
상기 피부 미백은 멜라닌 생성 저해인 것일 수 있다. 해삼 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 개선 조성물의 멜라닌 분비량 감소는 바람직하게 1X PBS로 제조된 음성대조군의 멜라닌 분비량에 비해 12% 내지 15% 감소되는 것일 수 있고, 다이메틸설폭사이드로 제조한 음성대조군의 멜라닌 분비량에 비해 2% 내지 6% 감소하는 것일 수 있다.
상기 멜라닌 생성 저해는 멜라닌은 세포내 물질인 티로신이 티로시나제에 의해 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환되고 이후 티로시나제 관련 단백질인 TRP-2(dopachrome tautomerase)와 TRP-1(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase)작용과 자동화과정을 통해 생성된다. 상기 피부 개선 조성물은 티로시나아제 저해 활성 증가 및/또는 티로시나아제 발현 감소로 티로신이 멜라닌으로 형성되는 기전을 방해하여 멜라닌의 생성을 저해할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
비교예 1 내지 3 : 음성대조군
비교예 1 내지 3는 각각 테고사이언스㈜에서 제공한 유지배양액(maintenance medium), 테고사이언스㈜에서 제공한 0.1% 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 테고사이언스㈜에서 제공한 1X PBS(phosphate buffer saline)으로 음성대조군을 만들었다.
비교예 4 및 5 : 양성대조군
비교예 4는 아스코르빈산(L-Ascorbin acid)으로, 비교예 5는 알부틴(arbutin)으로 양성대조군을 만들었다.
실시예 1 : 저농도 해삼 추출물
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼을 세척하여 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다.
실시예 2 : 고농도 해삼 추출물
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼을 세척하여 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다.
실시예 3 : 저농도 해삼 내장 추출물
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼의 내장을 세척하여 -80℃에서 딥-프리저를 이용하여 딥-프리징하였다. 딥-프리징한 해삼 내장을 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼 내장을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 내장 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증류하는 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼 내장을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다.
실시예 4 : 고농도 해삼 내장 추출물
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼의 내장을 세척하여 -80℃에서 딥-프리저를 이용하여 딥-프리징하였다. 딥-프리징한 해삼 내장을 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼 내장을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 내장 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼 내장을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다.
실시예 5 : 저농도 해삼 추출물 액체
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼을 세척하여 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다. 2차 동결건조된 해삼 추출물을 부틸렌글라이콜(butylene glycol), 물, 에칠헥산디올(ethyl hexanediol) 및 헥산디올(1,2-hexanediol) 용매와 혼합하여 5% 농도의 해삼 추출물 용액을 만들었다.
실시예 6 : 고농도 해삼 추출물 액체
백령도 인근 해역에서 채취한 청해삼 및 흑해삼을 세척하여 -30℃에서 냉각하여 48시간 건조하는 1차 동결건조 단계 후, 동결된 해삼을 분쇄하여 분말로 제조하였다. 해삼 분말을 75%의 에탄올에 넣어 2시간 동안 인큐베이션한 후에 70℃에서 3시간 동안 증발농축한 후, cotton을 통과시켜 여과하였다. vacuum evaporator(EYELA N-12, EYEKA CA-1112, Tokyo, Japan)을 이용하여 5시간 동안 50mg/ml의 저농도로 농축하였다. 상기 농축된 해삼을 -30℃, 48시간 조건으로 2차 동결건조하였다. 2차 동결건조된 해삼 추출물을 부틸렌글라이콜(butylene glycol), 물, 에칠헥산디올(ethyl hexanediol) 및 헥산디올(1,2-hexanediol) 용매와 혼합하여 20% 농도의 해삼 추출물 용액을 만들었다.
실험예 1 : 주름 개선 시험
-20℃로 보관한 시험물질은 처리 직전 해동하여 maintenance medium에 희석하여 준비하였다(하기 표1 참조). 대조군과 시험군을 3D피부배양모델(Neoderm®, 테고사이언스㈜) well 당 배지층으로 3.5ml씩, 세포층 표면 위로 30 ㎕씩 처리한 후, CO2 인큐베이터(10% CO2, 37℃)에서 24시간 배양하였다. 배양 24시간 후, 배지를 교체하며 대조군과 시험군을 3D피부배양모델(Neoderm®, 테고사이언스㈜) well 당 배지층으로 3.5ml씩, 세포층 표면 위로 30㎕씩 반복 처리한 후에 CO2 인큐베이터(10% CO2, 37℃)에서 24시간 추가 배양하여 총 48시간 배양하였다. 배양 48시간 후, 모든 군의 배양액을 수집하여 -70℃에 보관하였고, 조직은 frozen block을 제작하였다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000001
콜라겐 타입4의 경우 상기 0.5% triton X-100을 이용하여 permeabilization 한 과정을 생략한 것을 제외하고 콜라겐 타입4와 같이 실험하였고, 표피층 내 기저층에 위치한 전체 세포수 대비 ki-67 양성세포수를 백분율로 분석하여 하기 표 2 및 도 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000002
상기 표2에 나타난 바와 같이, 실시예 3 및 4는 음성대조군인 비교예2에 비하여 콜라겐 타입4의 발현이 뚜렷하게 증가하였다. 실시예 3 및 4의 N=3에서의 ki-67 발현이 음성대조군인 비교예 2에 비하여 증가하였으며, 실시예 3에 의한 ki-67 발현율이 음성대조군인 비교예 2의 12.5(±3.6)%에서 49.1(±7.8)%로 3.9배 증가하였고, 실시예 4의 ki-67 발현율이 음성대조군인 비교예 2의 12.5(±3.6)%에서 48.3(±10.2)%로 3.9배 증가하였다.
실험예 1-2 : MMP -9 ELISA
human MMP-9 ELISA kit(R&D systems/DMP900)의 프로토콜에 따라 수행하였다. MMP-9의 표준 곡선을 위하여 20ng/ml MMP-9 standard stock solution을 1X calibrator diluent로 단계별 희석하여 표준 용액을 제작하여 하기 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000003
human MMP-9 microplate 각 well에 assay diluent를 100μl씩 넣고, blank, standard 및 시험용액을 100μl씩 첨가하여 상온에서 2시간 반응하였다. 반응액을 버리고, well당 400μl의 wash buffer 첨가 후 제거하는 과정을 총 3회 반복하였다. well당 200μl의 MMP-9 conjugate를 넣고 빛을 차단시킨 상태로 상온에서 1시간 반응하였다. 반응액을 버리고, well 당 400μl을 wash buffer 첨가 후 제거하는 과정을 총 3회 반복하였다. substrate solution은 사용하기 직전 kit에 포함된 color reagent A와 B를 동량으로 혼합하여 만들어 준비하고, 이를 well당 200μl씩 첨가하여 빛을 차단시킨 상태로 상온에서 30분간 반응하였다. well당 50μl의 stop solution을 첨가하여 30분 이내에 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, MMP-9 표준곡선을 이용하여 시험 용액의 MMP-9 분비량을 분석하였다.
Immunofluorescence staining은 frozen block을 이용하여 자체 시험법에 따라 콜라겐 타입4에 대하여 수행하였다. MMP-9 분비량은 수집한 배양액을 이용하여 ELISA kit을 이용하여 정량분석했다. MMP-9 표준용액 흡광도 결과를 하기 표 4 및 도 6에, MMP-9 분비량을 하기 표 5 및 도 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000004
Figure PCTKR2017001690-appb-T000005
상기 표 4 및 5에 나타난 바와 같이, MMP-9의 평균 분비량은 비교예 1이 14.4(±3.1)ng/ml, 비교예2가 17.9(±1.6)ng/ml로 측정되었고, 양성대조군인 비교예 4는 14.8(±2.5)ng/ml로 측정되어 음성대조군인 비교예 1 및 2에 비하여 MMP-9의 분비량이 변하지 않았다. 실시예 3의 평균 MMP-9 분비량이 12.0(±1.4)ng/ml로 음성대조군인 비교예 2에 비하여 0.7배 감소하였다.
따라서 실험예 1-1 및 1-2에서 나타난 바와 같이 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미용 조성물은 아스코르빈산(L-Ascorbin acid)과 비교 시 동등 이상의 효능을 가지는 것으로 나타났다.
실험예 2 : 피부 미백 시험
-20℃로 보관한 시험물질은 처리 직전 해동하여 1X PBS(Diluent)로 희석하여 하기 표 6과 같이 준비하였다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000006
시험물질을 3D피부배양모델(Neoderm, 테고사이언스㈜) 표면 위로 well당 100μl씩 처리하였다. CO2 인큐베이터(10% CO2, 37℃)에서 48시간 배양 후 3D피부배양모델 표면 위에 남아있는 잔여 시험물질을 파이펫을 이용하여 제거하였다.
그 후 3D피부배양모델을 200μl PBS로 2회 세척하고, blade를 이용하여 3D피부배양모델의 insert 가장자리로부터 도려내듯이 분리하였다. 분리한 3D피부배양모델 조직을 1.5ml e-tube에 담고 PBS를 완전히 제거한 후, 3D피부배양모델에 lysis buffer(SolvableTM) 360μl씩 첨가하였다. lysis buffer에서 5분간 반응시킨 후, 3D피부배양조직모델 조직을 멤브레인으로부터 분리하여 제거하였다. 95℃, heat block에서 45분간 인큐베이션하고 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리 후, 상층액을 새 eppendorf tube에 옮겼다. 20mg/ml NH4OH를 이용하여 100μl/ml의 멜라닌 용액을 만든 후 제조한 100μl/ml 멜라닌 용액을 표 7과같이 lysis buffer을 이용하여 단계별 희석하여 표준용액을 만든 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 표준용액을 96well plate에 blank, standard 용액 및 시험물질을 200μl씩 옮겨 450nm에서 흡광도를 측정한 결과를 표 8에 나타내었고, 멜라닌 표준곡선을 이용하여 정량화하여 멜라닌양을 분석한 결과를 하기 표 9 및 도 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2017001690-appb-T000007
Figure PCTKR2017001690-appb-T000008
Figure PCTKR2017001690-appb-T000009
상기 표에서 나타난 바와 같이, 실시예 5의 N=3의 평균 멜라닌량이 19.3(±009)μg/ml로 측정되어 비교예 3 대비 13.6%감소하였고, 실시예 6의 N=3의 평균 멜라닌량이 19.2(±0.4)μg/ml로 측정되어 비교예 3 대비 13.8%감소하였다. 실시예1의 N=3의 평균 멜라닌량이 20.6(±1.0)μg/ml로 측정되었으며 비교예2 대비 2.2%감소하였고, 실시예 2의 N=3의 평균 멜라닌량이 19.8(±0.7)μg/ml로 측정되었으며 비교예 2 대비 6.3% 감소하였다. 실시 예3의 N=3의 평균 멜라닌량이 20.2(±1.4)μg/ml로 측정되었으며, 비교예 2 대비 4.5% 감소하였고, 실시예 4의 N=3의 평균 멜라닌량이 21.0(±0.6)μg/ml로 측정되었으며 비교예 2 대비 0.4% 감소하였다. 실시예 1 내지 4는 알부틴(arbutin)과 유사수준의 미백 효능을 가지는 것으로 나타났다.
이상과 같은 본 발명에 대한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 동결건조를 2회 반복하여 제조된 해삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 개선 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 해삼 추출물은,
    해삼을 1차 동결건조하는 단계;
    상기 동결건조된 해삼을 분쇄하여 분말을 제조하는 단계;
    상기 분쇄된 분말을 인큐베이션하는 단계;
    상기 인큐베이션된 해삼을 증발농축하는 단계;
    상기 증발농축된 해삼을 여과 및 응축하는 단계; 및
    상기 응축된 해삼을 2차 동결건조하는 단계
    를 포함하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 피부 개선 조성물은,
    상기 1차 동결건조 단계 전에 해삼을 -70℃ 내지 -100℃로 딥-프리징(deep-freezing)하는 단계
    를 포함하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 1차 동결건조 단계는,
    해삼을 -20℃ 내지 -100℃로 냉각하는 단계; 및
    상기 냉각된 해삼을 36시간 내지 84시간 동안 건조하는 단계
    를 포함하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 인큐베이션 단계는,
    상기 분쇄된 분말에 55% 내지 95%의 에탄올을 넣어 1시간 내지 3시간 동안 인큐베이션 하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 증발농축하는 단계는,
    55℃ 내지 100℃에서 1.5시간 내지 5시간 동안 증발 농축하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 해삼은 청해삼 및/또는 흑해삼인 것인 피부 개선 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 해삼 추출물은,
    해삼 내장(sea cucumber viscera)만 사용하여 추출한 것인 피부 개선 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 해삼 추출물은,
    상기 2차 동결건조된 해삼을 용매에 용해시켜 용액을 만드는 단계
    를 더 포함하는 제조방법으로 제조된 것인 피부 개선 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 용매는,
    부틸렌글라이콜(butylene glycol), 물, 에칠헥산디올(ethyl hexanediol) 및 헥산디올(1,2-hexanediol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 피부 개선 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은,
    피부 재생 활성인 것인 피부 개선 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 피부 재생 활성은,
    콜라겐 타입4의 발현량 증가, 세포활성인자(ki-67)의 증가 및/또는 기질분해효소(matrix metalloproteinase) 분비량 감소인 것인 피부 개선 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은,
    피부 미백인 것인 피부 개선 조성물.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 피부 미백은,
    멜라닌 생성 저해인 것인 피부 개선 조성물.
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