WO2017082181A1 - 乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法 - Google Patents

乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法 Download PDF

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WO2017082181A1
WO2017082181A1 PCT/JP2016/082907 JP2016082907W WO2017082181A1 WO 2017082181 A1 WO2017082181 A1 WO 2017082181A1 JP 2016082907 W JP2016082907 W JP 2016082907W WO 2017082181 A1 WO2017082181 A1 WO 2017082181A1
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lactic acid
acid bacteria
polyhydric alcohol
ester
interferon
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PCT/JP2016/082907
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悠希子 加藤
雅也 金山
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キリン株式会社
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    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
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    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to a method for enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria using a composition for enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria that enhances the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria having an immunostimulatory effect.
  • the gramineous grain is a granular substance, and when used for food and drink, precipitation occurs.
  • it is necessary to ferment the processed asparagus with lactic acid bacteria, which is troublesome and costly, and also causes a problem in flavor.
  • Fucoidan is a high-molecular polysaccharide and has high viscosity, making it difficult to handle.
  • Fucoidan hydrolyzate is a mixture of a plurality of oligosaccharides and may have a flavor problem.
  • Ascorbic acid is sensitive to heat and vitamin E is fat-soluble and difficult to handle.
  • the above-described method or the like enhances the production of interferon ⁇ , and no type I interferon that is most important for preventing viral infection is shown.
  • the amount of lactic acid bacteria used can be reduced while maintaining activity, resulting in the development range of lactic acid bacteria-containing compositions as a result. Can be spread.
  • type I interferon as an immunostimulatory action, it is possible to provide a composition having a strong effect of protecting against virus infection.
  • the present inventors previously used a composition for enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria that enhances the immunostimulatory action of lactic acid bacteria having an immunostimulatory action, which can sufficiently exhibit the effect of lactic acid bacteria even when added in a small amount, and the composition.
  • a method to enhance the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria has been developed. In the method, the immunostimulatory action of lactic acid bacteria is enhanced by bringing an ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid into contact with lactic acid bacteria.
  • a polylactic alcohol-fatty acid ester bond product is brought into contact with a lactic acid bacterium, and the lactic acid bacteria composition in a state where the polyhydric alcohol-fatty acid ester bond product is mixed as it is is used as a medicine or a food or drink.
  • the ester bond product of polyhydric alcohol and fatty acid has an emulsifying action, and lactic acid bacteria sometimes harden.
  • an object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having an enhanced immunostimulatory effect in a state where a polyhydric alcohol and a fatty acid ester conjugate are not mixed.
  • the present inventors have found an effect of enhancing the immunostimulatory action of lactic acid bacteria on the ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid.
  • the present inventors contacted the lactic acid bacteria with an ester conjugate of a polyhydric alcohol and a fatty acid, When the lactic acid bacteria are washed and the ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid is removed, it is examined whether the immunostimulatory action of the lactic acid bacteria is enhanced, and the immunostimulatory action of the lactic acid bacteria is enhanced even after washing, It has been found that lactic acid bacteria can be used as a composition containing lactic acid bacteria, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a composition for enhancing immunostimulatory effect of lactic acid bacteria comprising an ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid as an active ingredient is contacted with a lactic acid bacterium having immunostimulatory action.
  • the polyhydric alcohol is selected from the group consisting of monoglycerol, polyglycerol and sucrose.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the fatty acid is selected from the group consisting of caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and behenic acid.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein an ester bond product of a polyhydric alcohol and a fatty acid is not subjected to organic acid modification.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the concentration of the ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid is brought into contact with a concentration of lactic acid bacteria having an immunostimulatory effect in the range of 0.002 to 8.
  • An ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid enhances the immunostimulatory action of lactic acid bacteria having an immunostimulatory action. That is, by causing lactic acid bacteria to coexist with an ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid by culturing or the like, the effect of lactic acid bacteria acting on interferon-producing cells to induce interferon production is enhanced. This immunostimulatory action is also observed after lactic acid bacteria are cultured in the presence of a polyhydric alcohol and fatty acid ester bond, and then washed to remove the polyhydric alcohol and fatty acid ester bond.
  • the lactic acid bacterium with enhanced immunostimulatory action obtained by the method of the present invention can be used as an active ingredient of a lactic acid bacterium-containing composition having an immunostimulatory action.
  • the present invention is a method for enhancing the immunostimulatory action of a lactic acid bacterium, comprising contacting a lactic acid bacterium immunostimulating composition containing a polyhydric alcohol and a fatty acid ester conjugate with a lactic acid bacterium, washing the lactic acid bacterium, Including removal of the ester bond of a monohydric alcohol and a fatty acid.
  • the ester bond product of a polyhydric alcohol and a fatty acid is composed of a hydrophilic portion and a lipophilic portion, and has a structure in which a polyhydric alcohol that is a hydrophilic portion and a fatty acid that is a lipophilic portion are bonded by an ester bond.
  • the polyhydric alcohol in the ester bond product of polyhydric alcohol and fatty acid is an alcohol having two or more hydroxyl groups in the molecule, and the number of hydroxyl groups is not limited, for example, those having 2 to 15 hydroxyl groups. Use.
  • the polyhydric alcohol may have an aldehyde group or a ketone group.
  • the polyhydric alcohol having an aldehyde group or a ketone group is a sugar or a sugar alcohol.
  • the carbon number of the polyhydric alcohol contained in the composition for enhancing immunity activation of lactic acid bacteria used in the method for enhancing the activation activity of lactic acid bacteria of the present invention is 2-20, preferably 3-20.
  • the molecular weight of the polyhydric alcohol is preferably as large as possible, and the molecular weight is 50 or more, preferably 60 or more, more preferably 90 or more.
  • sucrose molecular weight 342
  • triglycerin molecular weight 240
  • diglycerin molecular weight 166
  • monoglycerin molecular weight 92
  • polyhydric alcohol examples include divalent ethylene glycol (C 2 H 6 O 2 ), propylene glycol (C 3 H 8 O 2 ), trivalent monoglycerin (C 3 H 8 O 3 ), and tetravalent diethylene glycol. (C 4 H 10 O 3 ), pentavalent diglycerin (C 6 H 14 O 5 ), triglycerin (C 9 H 20 O 7 ), polyglycerin and the like. Also, polyethylene glycol having a large number of hydroxyl groups can be used. Further, the polyhydric alcohol is a sugar, sucrose (C 12 H 22 O 11), and the like.
  • examples of the polyhydric alcohol that is a sugar alcohol include xylitol (C 5 H 12 O 5 ), sorbitol (C 6 H 14 O 6 ), mannitol (C 6 H 14 O 6 ), and sorbitan.
  • polyglycerol or sucrose is preferable.
  • the number of carbon atoms of the fatty acid contained in the composition for enhancing immunity activation of lactic acid bacteria used in the method for enhancing the activation effect of lactic acid bacteria of the present invention is 8-30.
  • Fatty acids include unsaturated and saturated fatty acids.
  • caprylic acid octanoic acid (C8), capric acid (decanoic acid) (C10), lauric acid (dodecanoic acid) (C12), myristic acid (tetradecanoic acid) (C14), pentadecylic acid (pentadecanoic acid) ) (C15), palmitic acid (hexadecanoic acid) (C16), margaric acid (heptadecanoic acid) (C17), oleic acid (C18), stearic acid (octadecanoic acid) (C18), arachidic acid (icosanoic acid) (C20) , Behenic acid (docosanoic acid) (C22), lignoceric acid (tetradocosanoic acid) (C24), serotic acid (hexadocosanoic acid) (C26), montanic acid (octadocosanoic acid) (C26), me
  • caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and behenic acid can be preferably used.
  • palmitic acid, stearic acid, or oleic acid is preferable.
  • composition for enhancing immunity activation of lactic acid bacteria used in the method for enhancing the activation activity of lactic acid bacteria of the present invention is a composition comprising, as an active ingredient, an ester bond in which the hydroxyl group of the polyhydric alcohol and the carboxyl group of the fatty acid are bonded by an ester bond. It is.
  • the number of fatty acids bonded to one molecule of polyhydric alcohol is not limited, and the fatty acid may be bonded to only one hydroxyl group. Further, fatty acids may be bonded to a plurality of hydroxyl groups that are not all hydroxyl groups. For example, a monoester having one fatty acid in a polyhydric alcohol, two diesters, three triesters, and the like. When a plurality of fatty acids are bonded to one molecule of polyhydric alcohol, the plurality of fatty acids may be the same type of fatty acid or different types of fatty acids may be bonded.
  • a composition comprising an ester bond of a polyhydric alcohol and a fatty acid as an active ingredient is 45 (w / v)% or more, preferably 50 (w / v)% or more, more preferably an ester bond of a polyhydric alcohol and a fatty acid. 60 (w / v)% or more, more preferably 70 (w / v)% or more, more preferably 80 (w / v)% or more, more preferably 90 (w / v)% or more, particularly preferably 95 (w / v)% or more. It may contain more than w / v)%, and may contain 100 (w / v)%.
  • ester bond examples include glycerin fatty acid ester (monoglyceride), polyglycerin fatty acid ester such as diglycerin fatty acid ester and triglycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, and sucrose fatty acid ester.
  • glycerin fatty acid ester monoglyceride
  • polyglycerin fatty acid ester such as diglycerin fatty acid ester and triglycerin fatty acid ester
  • propylene glycol fatty acid ester propylene glycol fatty acid ester
  • sorbitan fatty acid ester examples of the ester bond
  • sucrose fatty acid ester examples include glycerin fatty acid ester (monoglyceride), polyglycerin fatty acid ester such as diglycerin fatty acid ester and triglycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, sorb
  • glycerin caprylic acid ester glycerin capric acid ester, glycerin lauric acid ester, glycerin myristic acid ester, glycerin palmitic acid ester, glycerin stearic acid ester, glycerin behenic acid ester, diglycerin caprylic acid ester, diglycerin Capric acid ester, diglycerin lauric acid ester, diglycerin myristic acid ester, diglycerin palmitic acid ester, diglycerin stearic acid ester, diglycerin behenic acid ester, triglycerin caprylic acid ester, triglycerin capric acid ester, triglycerin Lauric acid ester, Triglycerin myristic acid ester, Triglycerin palmitic acid ester, Triglycerin stearic acid ester Triglycerin behenic acid ester, tetraglycer
  • the polyhydric alcohol and fatty acid ester bond or a composition containing the ester bond has a function as a surfactant, and is an ester-type nonionic surfactant or polyhydric alcohol-type surfactant. It can also be called an agent.
  • the above-described polyhydric alcohol and fatty acid ester bond or a composition containing the ester bond as an active ingredient has a function as an emulsifier, and a commercially available emulsifier can be used.
  • Examples of an emulsifier containing an ester bond of a polyhydric alcohol and a fatty acid include the following.
  • the type of the ester bond is described in parentheses after the trade name of each emulsifier, but most of the ester bonds in the parentheses are included.
  • the ester bond content (w / v) is 45% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.
  • glycerin fatty acid ester conjugates glycerin fatty acid ester or polyglycerin fatty acid ester Emulsy P-100 (monoglycerin palmitate and monoglycerin stearate), Poem M-100 (glycerin monocaprylate), Poem M- 200 (glycerin monocapric acid ester), Poem M-300 (glycerin monolauric acid ester), Poem V-100 (glycerin monostearic acid ester), Riquemar B-100 (glycerin monobehenic acid ester), Poem V-200 ( Glycerol mono-distearate), Poem B-200 (glycerin mono-dibehenate), Poem DL-100 (diglyceryl monolaurate), Poem DM-100 (diglyceryl monomyristate), Poem DS-100A (Jiguri Phosphorus monostearate), Poem DP-95RF
  • Riquemar PL-100 propylene glycol monolaurate
  • Riquemar PP-100 propylene glycol monopalmitate
  • Riquemar PS-100 propylene glycol monostearate
  • Riquemar PB-100 Food emulsifiers such as (propylene glycol monobehenate) (all Riken Vitamin Co., Ltd.) can be mentioned.
  • Riquemar L-250A sorbitan laurate
  • Riquemar P-300 sorbitan palmitate
  • Poem S-60V sorbitan stearate
  • Poem S-65V sulfitan tristearic acid
  • Riquemar B-150 sulfitan tribehenate
  • Riquemar C-250 sorbitan caprate
  • Ryoto (registered trademark) sugar ester S-1570 (sucrose stearate), Ryoto (registered trademark) sugar ester O-1570 (sucrose oleate), Ryoto (registered trademark) sugar Esters S-1670 (sucrose stearate), Ryoto (registered trademark) sugar ester P-1570, P-1670 (sucrose palmitate), Ryoto (registered trademark) sugar ester M-1695 (sucrose myristic ester) ), Ryoto (registered trademark) sugar ester L-1695 (sucrose laurate), Ryoto (registered trademark) sugar ester B-370 (sucrose behenate) (all Mitsubishi Chemical Foods) Emulsifiers.
  • Poem W-60 diacetyltartaric acid fatty acid monoglyceride
  • Poem B-15V diacetyltartaric acid fatty acid monoglyceride
  • Poem BS-20 succinic acid fatty acid monoglyceride
  • Poem K-30 citric acid Fatty acid monoglycerides
  • the lactic acid bacterium that enhances the immunostimulatory action by the method of enhancing the immunostimulatory action of the lactic acid bacterium of the present invention is a lactic acid bacterium that originally has an immunostimulatory action even in the absence of the composition of the present invention.
  • having an immunostimulatory effect means that lactic acid bacteria have an activity of promoting interferon production by acting on immunocompetent cells that are interferon-producing cells in vitro and in vivo.
  • the immunostimulatory action is sometimes referred to as interferon production inducing action.
  • immunocompetent cells include spleen cells and bone marrow cells.
  • plasma cytoid dendritic cells pDC: plasmacytoid dendritic cell
  • Interferons include Type I interferon (Type I interferon), Type II interferon (Type II interferon), and Type III interferon (Type III interferon).
  • Type I interferon refers to cytokines that are effective for viral infection, such as interferon- ⁇ (1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17, 21), interferon- ⁇ , etc. Is included.
  • Type II interferon contains interferon- ⁇
  • Type III interferon contains interferon- ⁇ .
  • lactic acid bacteria having the ability to induce production of Type I interferon and Type III interferon, and particularly the ability to induce production of interferon- ⁇ , which is Type I interferon, are preferred.
  • small lactic acid bacteria are preferable.
  • Lactococcus genus Lactococcus genus, Leuconostoc genus, Pediococcus genus, Streptococcus genus, Lactobacillus genus, Enterococcus genus Enterococcus genus as lactic acid bacteria having interferon producing ability
  • the lactic acid cocci to which it belongs are mentioned.
  • lactic acid bacteria include, but are not limited to, lactic acid bacteria that can promote interferon production of plasmacytoid dendritic cells (pDC).
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • Lactic acid bacteria that can activate plasmacytoid dendritic cells (pDC: ⁇ plasmacytoid dendritic cell) and promote interferon production of pDC are preferably lactic acid cocci, more preferably Lactococcus genus, Leuconostoc (leucoostococcus) Nostock), Pediococcus genus, Streptococcus genus Streptococcus.
  • Lactococcus garvieae Lactococcus lactis subsp.cremoris (Lactococcus lactis subspices cremolith), Lactococcus lactis subsp.lactis (Lactococcus lactis subspices lactis), Lactococsp (Lactococcus lactis subspecies Holdniae), Leuconostoc lactis (Leuconostoc lactis), Pediococcus damnosus, Streptococcus thermophilus (Streptococcus thermophilus).
  • plasmacytoid dendritic cells are activated by lactic acid bacteria, cell processes characteristic of activated dendritic cells appear and produce Type ⁇ I interferon and Type III interferon.
  • lactic acid strains include Lactococcus garvieae NBRC100934, Lactococcus lactis subsp.cremoris JCM16167, Lactococcus lactis subsp.cremoris NBRC100676, Lactococcus lactis subsp.hordniae JRC1180, Lactococspcus , Lactococcus lactis subsp.lactis NRIC1150, Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805, Lactococcus lactis subsp.lactis JCM20101, Leuconostoc lactis NBRC12455, Leuconostoc lactis NRIC1540, Pediococcus Lactococcus lactis subsp.lactis, which is a highly inducible cocci, can be used. Furthermore, Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805 and Lactococcus lact
  • Examples of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus include Lactobacillus brevis subsp. Can be mentioned.
  • examples of lactic acid bacteria belonging to the genus Enterococcus include Enterococcus faecalis (Enterococcus faecalis), and specific strains include Enterococcus faecalis NF-1011, Enterococcus faecalis FK-23, and Enterococcus ecfaecalis NT.
  • a lactic acid bacterium that enhances the immunostimulatory effect by the lactic acid bacterium immunostimulatory effect enhancing composition of the present invention a lactic acid bacterium having an interferon-inducing action on a living body is preferable even when ingested.
  • the above-mentioned Lactococcus lactis JCM5805 can exert a large interferon production inducing action on the living body even when taken orally.
  • Lactococcus garvieae NBRC100934 Lactococcus lactis subsp.cremoris JCM16167, Lactococcus lactis subsp.cremoris NBRC100676, Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM1180, Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM11040, Lactococcus lactis subsp.lactis NBRC12007, Lactococcus lactis subsp.lactis NRIC1150, Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805, Lactococcus lactis subsp.lactis JCM20101, Leuconostoc lactis NBRC12455, Leuconostoc lactis NRIC1540, Pediococcus damnosus JCM5886, Streptococcus thermophilus TA-45, Lactobasubspoc A strain
  • the lactic acid bacteria may be cultured in the presence of the lactic acid bacteria immunostimulatory composition, or the lactic acid bacteria immunostimulatory composition is added to the liquid containing the lactic acid bacteria. May be. Further, both the lactic acid bacterium and the lactic acid bacterium immunostimulatory enhancing composition may be included in the composition, and in this state, the composition can be stored at room temperature, or refrigerated or frozen.
  • the contact between the lactic acid bacterium and the lactic acid bacterium immunopotentiating composition may be performed at room temperature to 60 ° C. for 10 minutes to 48 hours, preferably 15 minutes to several hours, more preferably about 20 minutes to 2 hours.
  • Washing is carried out by adding water, physiological saline, phosphate buffered saline, buffer solution to a mixture of lactic acid bacteria and lactic acid bacteria immunostimulatory action enhancing composition, mixing, centrifuging, and discarding the supernatant. This can be done by repeating several times.
  • the lactic acid bacterium immunostimulatory enhancing composition of the present invention may be used at a concentration of 0.002 to 8, preferably 0.004 to 8, and more preferably 0.02 to 8, with respect to lactic acid bacteria concentration 1.
  • concentration of lactic acid bacteria is expressed as the weight of lactic acid bacteria (dry weight) / volume of liquid containing lactic acid bacteria (w / v), and the weight of lactic acid bacteria is measured by centrifuging the lactic acid bacteria suspension, precipitating the lactic acid bacteria and drying it. Good.
  • 1 mg / ml to 100 mg / ml (0.1 (w / v)% to 10 (w / v)%) lactic acid bacteria and 0.05 mg / ml to 50 mg / ml (0.005 (w / v)% to 5 (w / v) v)%) lactic acid bacteria immunostimulating composition may be mixed.
  • 2.5 mg / ml to 50 mg / ml lactic acid bacteria and 0.1 to 20 mg / ml lactic acid bacteria immunostimulating composition may be mixed.
  • the concentration ratio of the lactic acid bacterium capable of enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria and the composition enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria is very high.
  • composition containing lactic acid bacteria after washing is not mixed with the composition for enhancing immunity of lactic acid bacteria is that the number of lactic acid bacteria per weight of the lactic acid bacteria composition after washing is measured, What is necessary is just to compare with the lactic acid bacteria which are not made to contact.
  • the number of lactic acid bacteria per weight is equivalent to that of lactic acid bacteria that have not been brought into contact with the lactic acid bacteria immunostimulatory composition, it can be determined that the lactic acid bacteria immunostimulatory composition could be removed by washing.
  • the immunostimulatory effect on a small amount of lactic acid bacteria can be enhanced by the method of enhancing the immunostimulatory effect of lactic acid bacteria of the present invention.
  • an equivalent immunostimulatory effect can be obtained with a small amount of lactic acid bacteria, compared to the immunostimulatory effect when using lactic acid bacteria whose immunostimulatory action is not enhanced by the method of the present invention.
  • Lactic acid bacteria with enhanced immunostimulatory action act on immunocompetent cells, which are interferon-producing cells contained in intestinal cells, bone marrow cells, spleen cells, and the like, and promote interferon production of the cells.
  • immunocompetent cells which are interferon-producing cells contained in intestinal cells, bone marrow cells, spleen cells, and the like, and promote interferon production of the cells.
  • production of any interferon of Type I interferon (type I interferon), Type II interferon (type II interferon), or Type III interferon (type III interferon) can be promoted.
  • the production of interferon- ⁇ is particularly promoted among Type I interferons.
  • production of Type II II interferon such as interferon- ⁇ from NK cells or Th1 cells can be promoted by the method for enhancing the immunostimulatory action of lactic acid bacteria of the present invention.
  • the method of enhancing the immunostimulatory action of lactic acid bacteria of the present invention can simultaneously promote the production of Type I interferon and Type III interferon, that is, the production of interferon- ⁇ , interferon- ⁇ and interferon- ⁇ simultaneously. Can be promoted.
  • the lactic acid bacterium obtained by the method for enhancing the immunostimulatory action of the lactic acid bacterium of the present invention can activate plasmacytoid dendritic cells (pDC: plasmacytoid dendritic cell). When plasmacytoid dendritic cells are activated, cell processes characteristic of activated dendritic cells appear and produce Type I interferon and Type III interferon.
  • the present invention comprises contacting the lactic acid bacterium immunostimulatory composition comprising a polyhydric alcohol and fatty acid ester bond with a lactic acid bacterium, and then washing the lactic acid bacterium to remove the polyhydric alcohol and fatty acid ester bond. It is also a method for producing lactic acid bacteria with enhanced immunostimulatory action. The obtained lactic acid bacteria do not contain a polyhydric alcohol and fatty acid ester bond product.
  • Whether or not the immunostimulatory action of lactic acid bacteria was enhanced by the method of enhancing the immunostimulatory action of lactic acid bacteria of the present invention was determined by culturing lactic acid bacteria in the presence of the composition for enhancing lactic acid bacteria immunostimulatory action, and then washing and washing the lactic acid bacteria.
  • the increase in interferon production may be measured, for example, by measuring the amount of interferon in the culture solution using ELISA.
  • the amount of interferon- ⁇ produced by the interferon-producing cells by the lactic acid bacteria with enhanced immunostimulatory action is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 40% or more, particularly preferably 80% or more.
  • the degree of enhancement can be indicated by, for example, the concentration of interferon- ⁇ in the lactic acid bacterium medium when the amount of interferon- ⁇ produced is measured in vitro.
  • the lactic acid bacterium whose immunostimulatory effect is enhanced by the method of enhancing the immunostimulatory effect of the lactic acid bacterium of the present invention can be used as a pharmaceutical that induces the production of interferon and enhances the immune activity of the living body. That is, lactic acid bacteria whose immunostimulatory action is enhanced by a method of enhancing the immunostimulatory action of lactic acid bacteria can be used as a composition containing lactic acid bacteria such as an immunopotentiator and an immunostimulator.
  • the drug is already known as an indication for Type IV interferon, such as renal cancer, multiple myeloma, chronic myelogenous leukemia, hairy cell leukemia, glioblastoma, medulloblastoma, astrocytoma, malignant melanoma, Cancer including mycosis fungoides, adult T-cell leukemia, subacute sclerosing panencephalitis, HTLV-1 myelopathy, hepatitis B, hepatitis C, viral infections, chlamydia (sexually transmitted disease), mycobacterium (Tuberculosis), Listeria (sepsis, etc.), Staphylococcus (food poisoning), Helicobacter (gastritis) and other bacterial infections, multiple sclerosis and other autoimmune diseases can be used as preventive or therapeutic agents.
  • Type IV interferon such as renal cancer, multiple myeloma, chronic myelogenous leukemia, hairy cell leukemia,
  • the medicament is useful as a virus infection protection and virus infection therapeutic agent.
  • the function of inhibiting differentiation from osteoblasts to osteoclasts is known as the activity of Type I interferon, it can also be used as a preventive or therapeutic agent for osteoporosis.
  • an antigen corresponding to a specific disease in a lactic acid strain whose immunostimulatory action is enhanced by the method of enhancing the immunostimulatory action of the lactic acid bacteria of the present invention can be used as a vaccine.
  • a vaccine can do.
  • the cell wall of lactic acid bacteria has a function of protecting the antigen from stomach acid
  • such a heterologous antigen-expressing strain is suitable as a host for an oral vaccine.
  • live vaccines, whole-particle inactivated vaccines, and split vaccines are at risk of virus poisoning, and all-particle inactivated vaccines have side effects due to impurities and are the safest.
  • a high split split vaccine has problems with effectiveness.
  • the form of the lactic acid bacteria containing composition in which the immunostimulatory action was enhanced by the method for enhancing the immunostimulatory action of the lactic acid bacteria of the present invention is not particularly limited. Examples include powders, granules, tablets, syrups, injections, drops, powders, suppositories, suspensions, ointments and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally, or may be administered parenterally such as intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration, etc., but oral administration is preferred.
  • the interferon production inducer may contain an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, a colorant and the like.
  • Excipients include glucose, lactose, corn starch, sorbit, etc.
  • Disintegrants include starch, sodium alginate, gelatin powder, calcium carbonate, calcium citrate, dextrin, and binders include dimethylcellulose, polyvinyl alcohol, and polyvinyl ether.
  • examples of the lubricant include talc, magnesium stearate, polyethylene glycol, hydrogenated vegetable oil and the like.
  • the dose can be appropriately determined according to the age, weight, sex, disease difference, and symptom level of the patient to be administered, and it may be administered once or divided into several times a day to make the number of bacteria once.
  • An amount of culture corresponding to 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 12 cells may be administered.
  • 1 to 1000 mg may be administered once in terms of the weight of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria whose immunostimulatory action is enhanced by the method for enhancing the immunostimulatory action of the lactic acid bacteria of the present invention can be used by being included in foods and drinks.
  • fermented milk products such as yogurt and cheese, and a lactic acid bacteria drink.
  • lactic acid bacteria having an immunostimulatory effect When used as a fermented food or drink, a required amount of lactic acid bacteria having an immunostimulatory effect can be added to the fermented food or drink as dead bacteria, and a fermented food or drink can also be produced using a lactic acid bacteria starter.
  • the food / beverage products of the present invention include a health food / beverage product, a food / beverage product for specified health use, a nutritional function food / beverage product, a health supplement food / beverage product and the like.
  • the food and drink for specified health use refers to food and drink that is ingested for the purpose of specific health in the eating habits and displays that the purpose of the health can be expected by the intake.
  • These foods and drinks for example, enhance the body's immune function, activate the body's immune function, make it difficult to catch a cold, make it less susceptible to infection with viruses such as influenza virus, norovirus or rotavirus, and prevent carcinogenesis. An indication such as having an effect may be attached.
  • Example 1 Conjugate of a polyhydric alcohol having a hydrophobic group and a fatty acid Concentration study 1 ⁇ Method> Lactic acid bacteria (JCM5805 strain) were raised from the glycerol stock and cultured in MRS medium. After washing the cultured lactic acid bacteria (JCM5805 strain) with pure water and concentrating 20 times, the bacterial body and the ester bond product of polyhydric alcohol and fatty acid having the concentration shown in Table 1 (Ryoto Sugar ester P-1670) ) was mixed at a ratio of 1:19 to give the same bacterial cell concentration of 2.5 mg / ml after the end of the current culture.
  • Spleen cells of female 129 / SV mice were collected according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
  • the obtained spleen cells were suspended in RPMI medium (manufactured by SIGMA) containing 10% FBS and 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • RPMI medium manufactured by SIGMA
  • FBS 10% FBS
  • 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • To the resulting cell suspension 500 [mu] l, it was added such that the lactic acid bacteria to prepare a (JCM5805 strain) to a final concentration of 10 [mu] g / ml, 37 ° C. in a C0 2 incubator, and cultured in 5% CO 2.
  • Non-treated JCM5805 a polyhydric alcohol with a hydrophobic group and a fatty acid ester bond, shows interferon- ⁇ -inducing activity
  • a polyhydric alcohol with a hydrophobic group and a fatty acid ester bond (Ryoto Sugar ester P-1670) is 1 JCM5805 prepared by mixing at ⁇ 20 mg / ml showed significantly higher interferon- ⁇ -inducing activity than untreated JCM5805, which is an ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid having a hydrophobic group.
  • the immunostimulatory effect of the JCM5805 strain can be obtained by mixing polyhydric alcohol having a hydrophobic group and fatty acid ester conjugate (Ryoto Sugar Ester P-1670) in the range of 1-20 mg / ml at the time of lactic acid bacteria production. was found to be enhanced. Further, by measuring the number of bacteria per weight of the prepared powder, the remaining amount of the ester bond product of a polyhydric alcohol having a hydrophobic group and a fatty acid was examined. As shown in Table 2, since there was no difference in the number of bacteria per weight, it was found that the ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid having a hydrophobic group did not remain.
  • Example 2 Polyester alcohol with a hydrophobic group and fatty acid ester conjugate Concentration study 2 ⁇ Method> Lactic acid bacteria (JCM5805 strain) were raised from the glycerol stock and cultured in MRS medium. After washing and concentrating the cultured lactic acid bacteria (JCM5805 strain) with pure water, an ester-bound product (Ryoto Sugar ester P-1670) of polyhydric alcohol and fatty acid having a hydrophobic group concentration shown in Table 3 is used. The mixture was mixed at a ratio of 1:19 to give the same bacterial cell concentration of 2.5 mg / ml after the end of this culture.
  • an ester-bound product Rosto Sugar ester P-1670
  • Spleen cells of female 129 / SV mice were collected according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
  • the obtained spleen cells were suspended in RPMI medium (manufactured by SIGMA) containing 10% FBS and 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • RPMI medium manufactured by SIGMA
  • FBS 10% FBS
  • 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • To the resulting cell suspension 500 [mu] l, it was added such that the lactic acid bacteria to prepare a (JCM5805 strain) to a final concentration of 10 [mu] g / ml, 37 ° C. in a C0 2 incubator, and cultured in 5% CO 2.
  • the JCM5805 prepared by mixing 0.01 mg / ml of a polyhydric alcohol having a hydrophobic group and a fatty acid ester bond is significantly more interferon- ⁇ than the untreated JCM5805 polyhydric alcohol having a hydrophobic group and a fatty acid ester bond. Inductive activity was not observed. Based on this result, the immunostimulatory effect of JCM5805 strain was obtained by mixing polyhydric alcohol having a hydrophobic group and fatty acid ester conjugate (Ryoto Sugar ester P-1670) in the range of 0.1 to 5 mg / ml when producing lactic acid bacteria. was found to be enhanced.
  • Lactic acid bacteria (JCM5805 strain) were raised from the glycerol stock and cultured in MRS medium.
  • the cultured lactic acid bacteria (JCM5805 strain) are washed with pure water, concentrated by centrifugation, and then mixed with a polyhydric alcohol-fatty acid ester conjugate (Ryoto Sugar Ester P-1670) solution having the concentration shown in Table 5.
  • Lactic acid bacteria were resuspended, and the bacterial cell concentration concentrated 20 times after the end of the culture was adjusted to 50 mg / ml. Thereafter, sterilization was performed at 105 ° C. for 30 minutes.
  • Spleen cells of female 129 / SV mice were collected according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
  • the obtained spleen cells were suspended in RPMI medium (manufactured by SIGMA) containing 10% FBS and 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • RPMI medium manufactured by SIGMA
  • FBS 10% FBS
  • 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol so as to be 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • To the resulting cell suspension 500 [mu] l, it was added such that the lactic acid bacteria to prepare a (JCM5805 strain) to a final concentration of 10 [mu] g / ml, 37 ° C. in a C0 2 incubator, and cultured in 5% CO 2.
  • the immunostimulatory effect can be enhanced by mixing lactic acid bacteria (JCM5805 strain) at a concentration of 50 mg / ml during the production of lactic acid bacteria. Further, by measuring the number of bacteria per weight of the prepared powder, the remaining amount of the ester bond product of a polyhydric alcohol having a hydrophobic group and a fatty acid was examined. As shown in Table 6, since there was no difference in the number of bacteria per weight, it was found that the ester conjugate of polyhydric alcohol and fatty acid having a hydrophobic group did not remain.
  • Lactic acid bacteria samples were prepared by mixing each polyhydric alcohol shown in Table 7 and 2.5 mg / ml of fatty acid ester conjugate for 30 minutes in 1 mg / ml of sterilized lactic acid bacteria (JCM5805 strain), and then washing with PBS to obtain polyhydric alcohol. And the fatty acid ester-bound product were removed and the suspension was resuspended in PBS so that the concentration of lactic acid bacteria was 1 mg / ml.
  • Bone marrow cells of female 129 / SV mice were collected according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
  • the obtained bone marrow cells were suspended in RPMI medium (manufactured by SIGMA) containing 10% FBS, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / ml mouse Flt-3 ligand at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml. did.
  • 1 ml of the obtained cell suspension was seeded on a plate and cultured for 1 week at 37 ° C., 5% CO 2 in a CO 2 incubator to induce bone marrow-derived dendritic cells.
  • Sample (1) untreated lactic acid bacteria of polyhydric alcohol and fatty acid ester conjugate (JCM5805) showed interferon- ⁇ -inducing activity, and any kind of ester conjugate (Ryoto Sugar ester P-1670 (sucrose) Palmitic acid ester), Ryoto sugar ester S-1670 (sucrose stearate ester), Ryoto sugar ester O-1570 (sucrose oleate ester)) also enhanced interferon- ⁇ -inducing activity. That is, it was found that various types of hydrophobic groups can be used as the hydrophobic portion of the ester conjugate that enhances the immunostimulatory action of lactic acid bacteria, instead of a specific type.
  • Lactic acid bacteria samples were prepared by mixing each polyhydric alcohol shown in Table 8 and 2.5 mg / ml fatty acid ester conjugates for 30 minutes with sterilized lactic acid bacteria (JCM5805 strain) 1 mg / ml, and then washing with PBS to obtain polyhydric alcohol. And the fatty acid ester-bound product were removed and the suspension was resuspended in PBS so that the concentration of lactic acid bacteria was 1 mg / ml.
  • Bone marrow cells of female 129 / SV mice were collected according to a conventional method and subjected to erythrocyte removal treatment.
  • the obtained bone marrow cells were suspended in RPMI medium (manufactured by SIGMA) containing 10% FBS, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / ml mouse Flt-3 ligand at 1 ⁇ 10 6 cells / ml. did. 1 ml of the obtained cell suspension was seeded on a plate and cultured for 1 week at 37 ° C., 5% CO 2 in a CO 2 incubator to induce bone marrow-derived dendritic cells.
  • Polyester alcohol and fatty acid ester conjugates Untreated lactic acid bacteria (JCM5805) show interferon- ⁇ -inducing activity, and any type of ester conjugate (Ryoto polyglycerate SWA-15D (polyglycerin stearate), Ryo) Interferon- ⁇ -inducing activity was also enhanced by topopolyglycerin S-28D (polyglycerin stearate). That is, it was found that various types of hydrophilic groups can be used instead of a specific type as the hydrophilic portion of the ester conjugate that enhances the immunostimulatory action of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria whose immunostimulatory action is enhanced by the method of the present invention can be used as an active ingredient of the composition for enhancing immunostimulatory action.

Abstract

多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物が混合されていない状態の、免疫賦活作用が増強された乳酸菌の提供。　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を有効成分として含む乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と免疫賦活作用を有する乳酸菌とを接触させ、その後乳酸菌を洗浄し、前記乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を取り除くことを含む、免疫賦活作用が増強され多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含まない乳酸菌を製造する方法。

Description

乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法
　本発明は、免疫賦活作用を有する乳酸菌の免疫賦活作用を増強する乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を用いた乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法に関する。
　風邪やインフルエンザは主にウイルスの感染により発病し体への不調をきたす。新型インフルエンザ等の流行もあり、風邪やインフルエンザを予防するために免疫賦活効果を有する飲食物が求められている。乳酸菌株である、Lactococcus lactis subsp. lactis JCM5805株（特許文献１を参照）、Lactobacillus bulgaricus OLL1073R-1株（特許文献２を参照）、Enterococcus faecalis（特許文献３を参照）、Lactobacillus brevis subsp. coagulans（特許文献４を参照）、Lactobacillus gasseri（特許文献５を参照）などは免疫賦活効果を示すことが知られており、複数の飲食物に用いられている。しかしながら、該菌体の効果を発揮するためには一定量以上の菌株重量が必要であり、飲料に多量に添加すると沈殿が生じる、香味が悪くなるなどの商品価値の低下を招いていた。以上のことより、より少量でも乳酸菌の効果を十分に発揮させるための方法が必要とされていた。近年では、乳酸菌の免疫賦活効果を高める方法や免疫効果を高めた物についても報告されている。例えば、乳酸菌とイネ科穀粒とを組み合わせた免疫増強用飲食品(特許文献５を参照)、フコイダン又はフコイダン加水分解生成物と免疫賦活素材とを含む組成物(特許文献６を参照）、アスパラガスを処理したものを含有する培地に、乳酸菌を接種し乳酸発酵して得られる培養物(特許文献７を参照）、アスコルビン酸と乳酸菌とを併用する方法(特許文献８を参照）、ビタミンEと乳酸菌を併用する方法(特許文献９を参照）などである。
国際公開第WO2012/091081号 特開2011-37888号公報 特開平5-97689号公報 特開平6-206826号公報 特開2012-184261号公報 国際公開第W02007/013613号 特開2007-302628号公報 特開2007-204488号公報 特開2002-080364号公報
　しかしながら、イネ科穀粒は粒状の物質であり飲食物に用いると沈殿が生じてしまう。アスパラガスを用いた方法では、アスパラガス処理物を乳酸菌で発酵する必要があり手間やコストがかかる上に、香味上の問題が生じる。フコイダンは高分子多糖であり粘性が高いことから扱いが難しく、フコイダン加水分解物は複数のオリゴ糖の混合物であり香味上の問題が考えられる。アスコルビン酸は熱に弱く、ビタミンEは脂溶性であり扱いが難しい。また、上記の方法などはインターフェロンγの産生を増強するものであり、ウイルス感染の予防に最も重要となるＩ型インターフェロンに関しては示されていない。
　そこで、乳酸菌の免疫賦活作用を相乗的に高め、香味に大きく影響しない水溶性成分があれば、活性を維持したまま乳酸菌の使用量を減らすことができ、結果として乳酸菌含有組成物の開発範囲を広げることができる。免疫賦活作用として特にＩ型インターフェロンに着目することで、ウイルス感染防御効果の強い組成物を提供することができる。
　本発明者らは先に少量の添加でも十分に乳酸菌の効果を発揮することのできる、免疫賦活作用を有する乳酸菌の免疫賦活作用を増強する乳酸菌免疫賦活作用増強組成物及び該組成物を用いた乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法を開発した。その方法においては、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を乳酸菌と接触させることにより、乳酸菌の免疫賦活作用を増強させる。該方法においては、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を乳酸菌と接触させ、そのまま多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物が混合した状態の乳酸菌組成物を医薬や飲食品として用いる。
　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物は乳化作用を有し、乳酸菌が固まってしまうことがあった。
　そこで、本発明は多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物が混合されていない状態の、免疫賦活作用が増強された乳酸菌の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物に乳酸菌の免疫賦活作用を増強する効果を見出した。本発明者らは、乳化作用を有する多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を乳酸菌を含む組成物に含有させることを避けるため、乳酸菌を多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物に接触させた後に、乳酸菌を洗浄し多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を取り除いた場合の、乳酸菌の免疫賦活作用が増強されているか否かを検討し、洗浄後も乳酸菌の免疫賦活作用が増強されており、該乳酸菌を乳酸菌含有組成物として用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を有効成分として含む乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と免疫賦活作用を有する乳酸菌とを接触させ、その後乳酸菌を洗浄し前記乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を取り除くことを含む、免疫賦活作用が増強され多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含まない乳酸菌を製造する方法。
[２]　多価アルコールが、モノグリセリン、ポリグリセリン及びショ糖からなる群から選択される、[１]の方法。
[３]　脂肪酸がカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びベヘニン酸からなる群から選択される、[１]又は[２]の方法。
[４]　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物が有機酸修飾を受けていない、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　免疫賦活作用を有する乳酸菌濃度１に対して、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の濃度を0.002～８の範囲として接触させる、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　免疫賦活作用を有する乳酸菌がインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生を誘導し得る乳酸菌である、[１]～[５]のいずれかの方法。
[７]　免疫賦活作用を有する乳酸菌がLactococcus garvieae（ラクトコッカス・ガルビエアエ）、Lactococcus lactis subsp.cremoris（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）、Lactococcus lactis subsp.lactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Lactococcus lactis subsp.hordniae （ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ）、Leuconostoc lactis（ロイコノストック・ラクティス）、Pediococcus damnosus(ぺディオコッカス・ダムノーサス)、Streptococcus thermophilus(ストレプトコッカス・サーモフィラス)、Lactobacillus brevis subsp. coagulans（ラクトバチルス・ブレービス・サブスピーシーズ・コアギュランス）及びEnterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカリス）からなる群から選択される[１]～[６]のいずれかの方法。
[８]　免疫賦活作用を有する乳酸菌がLactococcus lactis JCM5805である、[６]又は[７]の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-220653号の開示内容を包含する。
　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物は免疫賦活作用を有する乳酸菌の免疫賦活作用を増強する。すなわち、乳酸菌を多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物と培養等により共存させることにより、乳酸菌がインターフェロン産生細胞に作用しインターフェロン産生を誘導する効果が増強される。この免疫賦活作用は、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の存在下で乳酸菌を培養した後に、乳酸菌を洗浄し多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を取り除いた後も認められる。また、乳酸菌を多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の存在下で培養し、その後洗浄して乳酸菌の免疫賦活作用を増強させる場合、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の存在下での乳酸菌の培養時の乳酸菌と多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の存在比の幅は大きく、広い幅で効果が得られる。
　本発明の方法で得られた免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、免疫賦活作用を有する乳酸菌含有組成物の有効成分として用いることができる。
乳酸菌に対する多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の濃度を変えた場合のインターフェロン-α産生誘導効果を示す図である（その１）。 乳酸菌に対する多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の濃度を変えた場合のインターフェロン-α産生誘導効果を示す図である（その２）。 多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物に対する乳酸菌濃度を変えた場合のインターフェロン-α産生誘導効果を示す図である。 異なる疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の効果の検討の結果を示す図である。 異なる親水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の効果の検討の結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、乳酸菌の有する免疫賦活作用を増強させる方法であって、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含む乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を乳酸菌と接触させた後に、乳酸菌を洗浄し、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を取り除くことを含む。
　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物は、親水性部分と親油性部分からなり、親水性部分である多価アルコールと親油性部分である脂肪酸がエステル結合で結合した構造を有する。多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物中の多価アルコールは、分子中に２個以上の水酸基を有するアルコールであり、水酸基の数は限定されず、例えば２個～15個有しているものを用いる。多価アルコールは、アルデヒド基やケトン基を有していてもよい。アルデヒド基やケトン基を有する多価アルコールは糖又は糖アルコールである。
　本発明の乳酸菌の賦活作用を増強させる方法に用いる乳酸菌免疫賦活作用増強組成物が含む多価アルコールの炭素数は、２～20、好ましくは３～20である。また、多価アルコールの分子量は大きいほどよく、分子量は50以上、好ましくは60以上、さらに好ましくは90以上である。例えば、ショ糖（分子量342）、トリグリセリン（分子量240）、ジグリセリン（分子量166）及びモノグリセリン（分子量92）の増強効果を比較した場合、この順で効果が大きい。
　多価アルコールとして、例えば、２価のエチレングリコール（C2H6O2)、プロピレングリコール（C3H8O2)、３価のモノグリセリン（C3H8O3）、４価のジエチレングリコール（C4H10O3)、５価のジグリセリン（C6H14O5)、トリグリセリン（C9H20O7）、ポリグリセリン等が挙げられる。また、多数の水酸基を有するポリエチレングリコールを用いることもできる。また、糖である多価アルコールとして、ショ糖（C12H22O11）等が挙げられる。さらに、糖アルコールである多価アルコールとして、キシリトール（C5H12O5)、ソルビトール（C6H14O6)、マンニトール（C6H14O6)、ソルビタン等が挙げられる。この中でも、ポリグリセリン又はショ糖が好ましい。
　多価アルコールに、コハク酸、酒石酸等の有機酸が結合している場合、乳酸菌の免疫賦活作用増強効果は低下する。ただし、有機酸が結合している場合でも、免疫賦活作用増強効果は認められるので、有機酸が結合した多価アルコールを用いることはできる。しかし、好ましくは有機酸が結合していない多価アルコールを用いる。
　本発明の乳酸菌の賦活作用を増強させる方法に用いる乳酸菌免疫賦活作用増強組成物が含む脂肪酸の炭素数は、８～30である。脂肪酸は不飽和脂肪酸も飽和脂肪酸も含む。具体的には、カプリル酸（オクタン酸）(C8）、カプリン酸（デカン酸）（C10)、ラウリン酸（ドデカン酸）（C12)、ミリスチン酸（テトラデカン酸）（C14）、ペンタデシル酸（ペンタデカン酸）(C15)、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）（C16)、マルガリン酸（ヘプタデカン酸）（C17)、オレイン酸（C18)、ステアリン酸（オクタデカン酸）（C18)、アラキジン酸（イコサン酸）（C20）、ベヘニン酸（ドコサン酸）（C22）、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）（C24)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）（C26)、モンタン酸（オクタドコサン酸）（C26)、メリシン酸（C28)等が挙げられる。この中でも、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸及びベヘニン酸を好適に用いることができる。この中でも、パルミチン酸、ステアリン酸又はオレイン酸が好ましい。
　本発明の乳酸菌の賦活作用を増強させる方法に用いる乳酸菌免疫賦活作用増強組成物は、上記の多価アルコールの水酸基と脂肪酸のカルボキシル基がエステル結合により結合したエステル結合物を有効成分として含む組成物である。
　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物において、多価アルコール１分子に結合する脂肪酸の数は限定されず、１個の水酸基のみに脂肪酸が結合していてもよい。また、総ての水酸基ではない複数の水酸基に脂肪酸が結合していてもよい。例えば、多価アルコールに脂肪酸が１個ついたモノエステル、２個ついたジエステル、３個ついたトリエステル等が挙げられる。また、１分子の多価アルコールに複数個の脂肪酸が結合する場合、複数個の脂肪酸は同じ種類の脂肪酸でもよいし、異なる種類の脂肪酸が結合していてもよい。
　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を有効成分として含む組成物は多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を45(w/v)％以上、好ましくは50(w/v)％以上、さらに好ましくは60(w/v)％以上、さらに好ましくは70(w/v)％以上、さらに好ましくは80(w/v)％以上、さらに好ましくは90(w/v)％以上、特に好ましくは95(w/v)％以上含み、100(w/v)％含んでいてもよい。
　上記のエステル結合物として、グリセリン脂肪酸エステル（モノグリセリド）、ジグリセリン脂肪酸エステルやトリグリセリン脂肪酸エステル等のポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。具体的には、グリセリンカプリル酸エステル、グリセリンカプリン酸エステル、グリセリンラウリン酸エステル、グリセリンミリスチン酸エステル、グリセリンパルミチン酸エステル、グリセリンステアリン酸エステル、グリセリンベヘニン酸エステル、ジグリセリンカプリル酸エステル、ジグリセリンカプリン酸エステル、ジグリセリンラウリン酸エステル、ジグリセリンミリスチン酸エステル、ジグリセリンパルミチン酸エステル、ジグリセリンステアリン酸エステル、ジグリセリンベヘニン酸エステル、トリグリセリンカプリル酸エステル、トリグリセリンカプリン酸エステル、トリグリセリンラウリン酸エステル、トリグリセリンミリスチン酸エステル、トリグリセリンパルミチン酸エステル、トリグリセリンステアリン酸エステル、トリグリセリンベヘニン酸エステル、テトラグリセリンカプリル酸エステル、テトラグリセリンカプリン酸エステル、テトラグリセリンラウリン酸エステル、テトラグリセリンミリスチン酸エステル、テトラグリセリンパルミチン酸エステル、テトラグリセリンステアリン酸エステル、テトラグリセリンベヘニン酸エステル、デカグリセリンカプリル酸エステル、デカグリセリンカプリン酸エステル、デカグリセリンラウリン酸エステル、デカグリセリンミリスチン酸エステル、デカグリセリンパルミチン酸エステル、デカグリセリンステアリン酸エステル、デカグリセリンベヘニン酸エステル、ショ糖カプリル酸エステル、ショ糖カプリン酸エステル、ショ糖ラウリン酸エステル、ショ糖ミリスチン酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、ショ糖ベヘニン酸エステル等が挙げられる。
　上記の多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物又は該エステル結合物を含む組成物は、界面活性剤としての機能を有しており、エステル型の非イオン性界面活性剤又は多価アルコール型界面活性剤ということもできる。また、上記の多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物又は該エステル結合物を有効成分として含む組成物は、乳化剤としての機能を有しており、市販の乳化剤を用いることができる。
　そのような多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含む乳化剤として、以下のものが挙げられる。以下の記載においては、各乳化剤の商品名の後のかっこ内にエステル結合物の種類を記載してあるが、かっこ内のエステル結合物を最も多く含んでいる。エステル結合物の含量（w/v)は、45％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上である。
　グリセリン脂肪酸エステル結合物として、グリセリン脂肪酸エステルあるいはポリグリセリン脂肪酸エステルであるエマルジーP-100（モノグリセリンパルミチン酸エステル及びモノグリセリンステアリン酸エステル）、ポエムM-100（グリセリンモノカプリル酸エステル）、ポエムM-200（グリセリンモノカプリン酸エステル）、ポエムM-300（グリセリンモノラウリン酸エステル）、ポエムV-100（グリセリンモノステアリン酸エステル）、リケマールB-100（グリセリンモノベヘニン酸エステル）、ポエムV-200（グリセリンモノ・ジステアリン酸エステル）、ポエムB-200（グリセリンモノ・ジベヘニン酸エステル）、ポエムDL-100（ジグリセリンモノラウリン酸エステル）、ポエムDM-100（ジグリセリンモノミリスチン酸エステル）、ポエムDS-100A（ジグリセリンモノステアリン酸エステル）、ポエムDP-95RF(ジグリセリンパルミチン酸エステル）、リケマールL-71-D（ジグリセリンラウリン酸エステル）、リケマールS-71-D（ジグリセリンステアリン酸エステル）、ポエムTRP-97RF（トリグリセリンモノパルミチン酸エステル）、ポエムJ-4081V（テトラグリセリンステアリン酸エステル）、ポエムJ-0021（デカグリセリンラウリン酸エステル）、ポエムJ-0081HV（デカグリセリンステアリン酸エステル）（すべて、理研ビタミン株式会社）やリョートー（登録商標）ポリグリエステルSWA-15D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルS-28D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルS-24D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルSWA-20D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルSWA-10D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルCE-19D（ポリグリセリンカプリル酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルCA-F4（ポリグリセリンラウリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルL-10D（ポリグリセリンラウリン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルM-10D（ポリグリセリンミリスチン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルO-50D（ポリグリセリンオレイン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルO-15D（ポリグリセリンオレイン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルB-100D（ポリグリセリンベヘニン酸エステル）、リョートー（登録商標）ポリグリエステルB-70D（ポリグリセリンベヘニン酸エステル）（すべて、三菱化学フーズ株式会社）等の食品用乳化剤が挙げられる。
　プロピレングリコール脂肪酸エステル結合物として、リケマールPL-100（プロピレングリコールモノラウリン酸エステル）、リケマールPP-100（プロピレングリコールモノパルミチン酸エステル）、リケマールPS-100（プロピレングリコールモノステアリン酸エステル）、リケマールPB-100（プロピレングリコールモノベヘニン酸エステル）（すべて、理研ビタミン株式会社）等の食品用乳化剤が挙げられる。
　ソルビタン脂肪酸エステル結合物として、リケマールL-250A（ソルビタンラウリン酸エステル）、リケマールP-300（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ポエムS-60V（ソルビタンステアリン酸エステル）、ポエムS-65V（スルビタントリステアリン酸エステル）、リケマールB-150（スルビタントリベヘニン酸エステル）、リケマールC-250（ソルビタンカプリン酸エステル）（すべて、理研ビタミン株式会社）等の食品用乳化剤が挙げられる。
　ショ糖脂肪酸エステル結合物として、リョートー（登録商標）シュガーエステルS-1570（ショ糖ステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルO-1570（ショ糖オレイン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルS-1670（ショ糖ステアリン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルP-1570、P-1670（ショ糖パルミチン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルM-1695（ショ糖ミリスチン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルL-1695（ショ糖ラウリン酸エステル）、リョートー（登録商標）シュガーエステルB-370（ショ糖ベヘニン酸エステル）（すべて、三菱化学フーズ株式会社）等の食品用乳化剤が挙げられる。
　また、多価アルコールに有機酸が結合した食品用乳化剤として、ポエムW-60（ジアセチル酒石酸脂肪酸モノグリセリド）、ポエムB-15V及びポエムBS-20（コハク酸脂肪酸モノグリセリド）、ポエムK-30（クエン酸脂肪酸モノグリセリド）（すべて、理研ビタミン株式会社)等が挙げられる。
　本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用を増強させる乳酸菌は、本発明の組成物が存在しない状態でも元々免疫賦活作用を有している乳酸菌である。ここで、免疫賦活作用を有しているとは、乳酸菌がin vitro及びin vivoで、インターフェロン産生細胞である免疫担当細胞に作用しインターフェロン産生を促進する活性を有していることをいう。免疫賦活作用をインターフェロン産生誘導作用と呼ぶこともある。免疫担当細胞としては、脾臓細胞や骨髄細胞が挙げられる。また、免疫担当細胞の中でも、プラズマサイトイド樹状細胞（pDC: plasmacytoid dendritic cell）が挙げられる。
　インターフェロンには、Type Iインターフェロン（I型インターフェロン）、Type IIインターフェロン（II型インターフェロン）、Type IIIインターフェロン（III型インターフェロン）が含まれる。Type Iインターフェロンはウイルス感染に有効とされるサイトカインをいい、インターフェロン-α（１、２、４、５、６、７、８、１０、１３、１４、１６、１７、２１）、インターフェロン-β等が含まれる。Type IIインターフェロンにはインターフェロン-γが含まれ、Type III インターフェロンにはインターフェロン-λが含まれる。特に、Type Iインターフェロン及び Type IIIインターフェロンの産生誘導能、その中でもとりわけType Iインターフェロンであるインターフェロン-αの産生誘導能を有する乳酸菌が好ましい。
　また、乳酸菌の中でも小型の乳酸菌が好ましい。例えば、乳酸菌１個の直径が５μm以下、好ましくは２μm以下、更に好ましくは１μm以下の乳酸菌が挙げられる。
　インターフェロン産生能を有する乳酸菌として、Lactococcus(ラクトコッカス)属、Leuconostoc(ロイコノストック)属、Pediococcus(ぺディオコッカス)属、Streptococcus(ストレプトコッカス)属、Lactobacillus（ラクトバチルス）属、Enterococcus（エンテロコッカス）属に属する乳酸球菌が挙げられる。
　これらの乳酸菌中には、プラズマサイトイド樹状細胞（pDC: plasmacytoid dendritic cell）のインターフェロン産生を促進し得る乳酸菌が含まれるがこれには限定されない。
　プラズマサイトイド樹状細胞（pDC: plasmacytoid dendritic cell）を活性化し、pDCのインターフェロン産生を促進し得る乳酸菌として、好ましくは乳酸球菌が挙げられ、さらに好ましくは、Lactococcus(ラクトコッカス)属、Leuconostoc(ロイコノストック)属、Pediococcus(ぺディオコッカス)属、Streptococcus(ストレプトコッカス)属に属する乳酸球菌が挙げられる。特に、Lactococcus garvieae（ラクトコッカス・ガルビエアエ）、Lactococcus lactis subsp.cremoris（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）、Lactococcus lactis subsp.lactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Lactococcus lactis subsp.hordniae （ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ）、Leuconostoc lactis（ロイコノストック・ラクティス）、Pediococcus damnosus(ぺディオコッカス・ダムノーサス)、Streptococcus thermophilus(ストレプトコッカス・サーモフィラス)が挙げられる。プラズマサイトイド樹状細胞が乳酸菌により活性化されると、活性化樹状細胞の特徴である細胞突起が出現し、Type I インターフェロン及びType III インターフェロンを産生する。
　このような、乳酸菌株として具体的には、Lactococcus garvieae　NBRC100934、Lactococcus lactis subsp.cremoris JCM16167、Lactococcus lactis subsp.cremoris NBRC100676、Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM1180、Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM11040、Lactococcus lactis subsp.lactis NBRC12007、Lactococcus lactis subsp.lactis NRIC1150、Lactococcus lactis subsp.lactis　JCM5805、Lactococcus lactis subsp.lactis　JCM20101、Leuconostoc lactis NBRC12455、Leuconostoc lactis NRIC1540、Pediococcus damnosus JCM5886、Streptococcus thermophilus TA-45が挙げられ、この中でも特にインターフェロン-α産生誘導能が高い球菌であるLactococcus lactis subsp.lactisを用いることができる。さらに、Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805及びLactococcus lactis subsp.lactis JCM20101、特にLactococcus lactis JCM5805を好適に用いることができる。
　また、Lactobacillus属に属する乳酸菌として、Lactobacillus brevis subsp. coagulans（ラクトバチルス・ブレービス・サブスピーシーズ・コアギュランス）（特開平6-206826号公報）が挙げられ、具体的な株としてLactobacillus brevis subsp. Coagulans KB290が挙げられる。また、Enterococcus属に属する乳酸菌として、Enterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカリス）が挙げられ、具体的な株としてEnterococcus faecalis NF-1011、Enterococcus faecalis FK-23、Enterococcus faecalis NTなどが挙げられる。
　さらに、本発明の乳酸菌免疫賦活作用増強組成物により免疫賦活作用を増強させる乳酸菌として、経口摂取した場合にも、生体に対してインターフェロン誘導作用を有する乳酸菌が好ましい。上記のLactococcus lactis JCM5805は経口摂取した場合にも、生体に対して大きなインターフェロン産生誘導作用を発揮し得る。
　また、Lactococcus garvieae NBRC100934、Lactococcus lactis subsp.cremoris JCM16167、Lactococcus lactis subsp.cremoris NBRC100676、Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM1180、Lactococcus lactis subsp.hordniae JCM11040、Lactococcus lactis subsp.lactis NBRC12007、Lactococcus lactis subsp.lactis NRIC1150、Lactococcus lactis subsp.lactis JCM5805、Lactococcus lactis subsp.lactis JCM20101、Leuconostoc lactis NBRC12455、Leuconostoc lactis NRIC1540、Pediococcus damnosus JCM5886、Streptococcus thermophilus TA-45、Lactobacillus brevis subsp. Coagulans KB290、Enterococcus faecalis NF-1011、Enterococcus faecalis FK-23、Enterococcus faecalis NTと同等の菌株を用いることができる。ここで、同等の菌株とは、上記の菌株から由来している菌株又は上記の菌株が由来する菌株若しくはその菌株の子孫菌株をいう。同等の菌株は他の菌株保存機関に保存されている場合もある。
　本発明の乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を、上記乳酸菌に添加し、両者を接触させ、その後乳酸菌を洗浄し、乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を取り除くことにより乳酸菌の免疫賦活作用を増強することができる。
　乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と乳酸菌を接触させるには、乳酸菌を乳酸菌免疫賦活作用増強組成物の存在下で培養してもよいし、乳酸菌を含む液体中に乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を添加してもよい。また、乳酸菌と乳酸菌免疫賦活作用増強組成物の両方を組成物中に含ませてもよく、この状態で室温で、あるいは冷蔵や冷凍により保存することもできる。乳酸菌と乳酸菌免疫賦活作用増強組成物との接触は、室温から60℃で10分間～48時間、好ましくは15分～数時間、さらに好ましくは20分～２時間程度行えばよい。
　洗浄は、乳酸菌と乳酸菌免疫賦活作用増強組成物の混合物に水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、緩衝液を添加し、混合した後に遠心分離を行い、上清を捨てることを１～数回繰り返すことにより行うことができる。
　本発明の乳酸菌免疫賦活作用増強組成物は、例えば、乳酸菌濃度１に対して、0.002～8、好ましくは0.004～８、さらに好ましくは0.02～８の濃度で用いればよい。ここで乳酸菌濃度は乳酸菌重量（乾燥重量）／乳酸菌を含む液体の体積（w/v)で表し、乳酸菌の重量は乳酸菌懸濁液を遠心し、乳酸菌を沈殿後乾燥させた状態で測定すればよい。例えば、１mg/ml～100mg/ml（0.1(w/v)％～10(w/v)％)の乳酸菌と0.05mg/ml～50mg/ml（0.005(w/v)％～５(w/v)％）の乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を混合すればよい。好ましくは、2.5mg/ml～50mg/mlの乳酸菌と0.1～20mg/mlの乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を混合すればよい。
　本発明の乳酸菌と乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を接触させて乳酸菌の免疫賦活作用を増強させる方法において、乳酸菌の免疫賦活作用を増強し得る乳酸菌と乳酸菌免疫賦活作用増強組成物の濃度比は非常に大きく、両者の混合比を厳密に調製しなくとも、免疫賦活作用が増強された乳酸菌を得ることができる。
　洗浄後の乳酸菌を含む組成物中に乳酸菌免疫賦活作用増強組成物が混在していないことは、洗浄した後の乳酸菌組成物について重量当たりの乳酸菌数を測定し、乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と接触させていない乳酸菌と比較すればよい。重量当たりの乳酸菌数が乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と接触させていない乳酸菌と同等の場合、乳酸菌免疫賦活作用増強組成物が洗浄により取り除くことができたと判断することができる。
　本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により、少量の乳酸菌に対して免疫賦活作用を増強させることができる。この結果、本発明の方法により免疫賦活作用を増強させていない乳酸菌を用いた場合の免疫賦活効果に比べ、少量の乳酸菌で同等の免疫賦活効果を得ることができる。
　免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、腸管細胞、骨髄細胞や脾臓細胞等に含まれるインターフェロン産生細胞である免疫担当細胞に作用し、該細胞のインターフェロン産生を促進する。この結果、Type Iインターフェロン（I型インターフェロン）、Type IIインターフェロン（II型インターフェロン）、Type IIIインターフェロン（III型インターフェロン）のいずれのインターフェロンの産生も促進され得る。その中でも特にType Iインターフェロンその中でもとりわけインターフェロン-αの産生が促進される。また、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法によりNK細胞やTh1細胞からのインターフェロン-γ等のType IIインターフェロンの産生も促進され得る。インターフェロン産生を促進することにより生体の免疫活性が上昇する。また、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により、Type I インターフェロン、Type IIIインターフェロンの産生を同時に促進することができ、すなわち、インターフェロン-α、インターフェロン-β及びインターフェロン-λの産生を同時に促進することができる。さらに、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により得られた乳酸菌はプラズマサイトイド樹状細胞（pDC: plasmacytoid dendritic cell）を活性化し得る。プラズマサイトイド樹状細胞が活性化されると、活性化樹状細胞の特徴である細胞突起が出現し、Type Iインターフェロン及びType IIIインターフェロンを産生する。
　本発明は、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含む乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を乳酸菌と接触させた後に、乳酸菌を洗浄し、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を取り除くことを含む、免疫賦活作用が増強された乳酸菌の製造方法でもある。得られた乳酸菌は、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含まない。
　本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により乳酸菌の免疫賦活作用が増強されたかどうかは、乳酸菌を乳酸菌免疫賦活作用増強組成物の存在下で培養し、その後、乳酸菌を洗浄し、洗浄した乳酸菌とインターフェロン産生細胞である免疫担当細胞を混合して、免疫担当細胞のインターフェロン産生が免疫賦活作用増強組成物の存在下で培養していない乳酸菌と比較して促進されたか否かを測定すればよい。インターフェロン産生の増加は、例えば、ELISAを用いて培養液中のインターフェロン量を測定すればよい。本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により乳酸菌の免疫賦活作用を増強した場合、免疫賦活作用が増強された乳酸菌によりインターフェロン産生細胞のインターフェロン-αの産生量は、10％以上、好ましくは20％以上、さらに好ましくは40％以上、特に好ましくは80％以上増強される。増強の程度は、例えば、in vitroでインターフェロン-α産生量を測定した場合の、乳酸菌培地中のインターフェロン-α濃度で示すことができる。
　本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、インターフェロンの産生を誘導し、生体の免疫活性を高める医薬として用いることができる。すなわち、乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、免疫増強剤、免疫賦活化剤等乳酸菌含有組成物として用いることができる。該医薬は、既にType Iインターフェロンの適応疾患と知られている、腎癌・多発性骨髄腫・慢性骨髄性白血病・ヘアリー細胞白血病・膠芽腫・髄芽腫・星細胞腫・悪性黒色腫・菌状息肉症・成人T細胞性白血病などを含むガン、亜急性硬化性全脳炎・HTLV-1脊髄症・B型肝炎・C型肝炎などを含むウイルス感染症、クラミジア（性病）・マイコバクテリウム（結核）・リステリア（敗血症など）・スタフィロコッカス（食中毒）・ヘリコバクター（胃炎）等の細菌による感染症、多発性硬化症などを含む自己免疫疾患の予防あるいは治療薬として用いることができる。特に前記医薬はウイルス感染防御及びウイルス感染治療剤として有用である。また、Type I インターフェロンの活性として骨芽細胞から破骨細胞への分化抑制機能が知られていることから、骨そしょう症の予防あるいは治療薬としても用いることができる。
　さらに、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌株中に特定の疾患に対応する抗原を遺伝子工学的手法を用いて発現させることにより、ワクチンとして用いることができる。特に乳酸菌の細胞壁は胃酸から抗原を守る働きがあるため、このような異種抗原発現菌株は経口ワクチンのホストとして好適である。一般的にワクチンには生ワクチン、全粒子不活化ワクチン及びスプリットワクチンがあるが、生ワクチンにはウイルス強毒化の危険性があり、全粒子不活化ワクチンでは不純物による副作用懸念があり、最も安全性の高いスプリットワクチンでは有効性に問題がある。このような問題を克服するために目的の抗原のみを発現する組み換えワクチンの開発が進められているが、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌に発現させればアジュバント効果も合わせて得られることとなり、極めて有用性が高い。
　本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌含有組成物の形態は特に限定されない。例えば、粉末、顆粒、錠剤、シロップ、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、懸濁剤、軟膏剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、経口で投与してもよく、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよいが、経口投与が好ましい。前記インターフェロン産生誘導剤は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、着色剤等を含んでいても良い。賦形剤としてはブドウ糖、乳糖、コーンスターチ、ソルビット等が、崩壊剤としてはデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン等が、結合剤としてはジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が、滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油等がそれぞれ挙げられる。投与量は、投与する患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度により適宜決定することができ、１日１回又は数回に分けて投与すればよく、１回菌数にして1×109～1×1012細胞に相当する量の培養物を投与すればよい。あるいは、乳酸菌体の重量換算で１回1～1000mgを投与すればよい。
　また、本発明の乳酸菌の免疫賦活作用を増強する方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、飲食品に含ませて用いることもでき、飲食品に含ませることによってその飲食品をインターフェロン産生誘導用飲食品、免疫増強用飲食品、免疫賦活用飲食品、ウイルス感染防御用飲食品等として用いることができる。対象となる飲食品として、乳・乳製品；飲料；調味料；酒類；農産・林産加工食品；菓子・パン類；穀粉・麺類；水産加工品；畜産加工品；油脂・油脂加工品；調理冷凍食品；レトルト食品；インスタント食品；食品素材などが挙げられる。この中でも、ヨーグルト、チーズ等の発酵乳製品や乳酸菌飲料に用いることができる。発酵飲食品として用いる場合、免疫賦活作用を有する乳酸菌を発酵飲食品に死菌として所要量添加するほか、乳酸菌スターターとして用いて発酵飲食品を製造することもできる。
　本発明の飲食品は、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等を含む。ここで、特定保健用飲食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする飲食品をいう。これらの飲食品には、例えば、体の免疫機能を増強する、体の免疫機能を賦活する、風邪をひきにくくする、インフルエンザウイルス、ノロウイルスあるいはロタウイルス等のウイルスに感染しにくくする、発がん予防に効果を有する等の表示が付されていてもよい。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物 濃度の検討１
<方法>
　乳酸菌（JCM5805株）をグリセロールストックから起こし、MRS培地で培養した。培養した乳酸菌（JCM5805株）を純水で洗浄して20倍濃縮したのち、菌体と表１に示す濃度の疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）を１：１９の割合で混合し今回の培養終了後と同じ菌体濃度2.5 mg/mlとした。30分間乳酸菌と疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を混合した後、遠心により20倍濃縮して上清を除き、再び菌体濃度2.5 mg/mlになるよう純水を加え洗浄した。遠心により20倍濃縮して上清を除き、50 mg/mlになるよう純水を加えて懸濁し、105℃で30分間殺菌処理を行った。殺菌終了後、遠心分離により上清を除き、凍結乾燥させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　雌129/SVマウスの脾臓細胞を常法に従って回収し赤血球除去処理を行った。得られた脾臓細胞を10％FBS、50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地（SIGMA社製）に、4×1O6個/mlとなるように懸濁した。得られた細胞懸濁液500μlに、作製した乳酸菌（JCM5805株）を終濃度10μg/mlになるよう添加し、C02インキュベータ内で37℃、５％CO2にて培養した。24時間後に培養上清を回収しインターフェロン-α測定キット(PBL社製)にてインターフェロン-α濃度を測定した。
<結果>
　図１に結果を示す。疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理のJCM5805でインターフェロン-α誘導活性を示し、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）を1～20 mg/mlで混合して作製したJCM5805は疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理JCM5805より有意に高いインターフェロン-α誘導活性を示した。この結果より、乳酸菌作製時に1～20 mg/mlの範囲で疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物 （リョートーシュガーエステルP-1670）を混合することで、JCM5805株の免疫賦活作用が高められることが分かった。また、作製した粉末の重量当たりの菌数を測定することで、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の残存量を調べた。表２に示したとおり、重量当たりの菌数に差がないことから、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物は残存していないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物 濃度の検討２
<方法>
　乳酸菌（JCM5805株）をグリセロールストックから起こし、MRS培地で培養した。培養した乳酸菌（JCM5805株）を純水で洗浄して濃縮したのち、菌体と表３に示す濃度の疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）を１：１９の割合で混合し今回の培養終了後と同じ菌体濃度2.5 mg/mlとした。30分間乳酸菌と疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を混合した後、遠心により20倍濃縮して上清を除き、再び菌体濃度2.5 mg/mlになるよう純水を加え洗浄した。遠心により20倍濃縮して上清を除き、50 mg/mlになるよう純水を加えて懸濁し、105℃で30分間殺菌処理を行った。殺菌終了後、遠心分離により上清を除き、凍結乾燥させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　雌129/SVマウスの脾臓細胞を常法に従って回収し赤血球除去処理を行った。得られた脾臓細胞を10％FBS、50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地（SIGMA社製）に、4×1O6個/mlとなるように懸濁した。得られた細胞懸濁液500μlに、作製した乳酸菌（JCM5805株）を終濃度10μg/mlになるよう添加し、C02インキュベータ内で37℃、５％CO2にて培養した。24時間後に培養上清を回収しインターフェロン-α測定キット(PBL社製)にてインターフェロン-α濃度を測定した。
<結果>
　図２に結果を示す。疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理のJCM5805でインターフェロン-α誘導活性を示し、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）を0.1～5 mg/mlで混合して作製したJCM5805は疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理JCM5805より有意に高いインターフェロン-α誘導活性を示した。疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物0.01 mg/mlで混合して作製したJCM5805では、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理JCM5805と比べて有意なインターフェロン-α誘導活性は見られなかった。この結果より、乳酸菌作製時に0.1～5 mg/mlの範囲で疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）を混合することで、JCM5805株の免疫賦活作用が高められることが分かった。また、作製した粉末の重量当たりの菌数を測定することで、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の残存量を調べた。表４に示したとおり、重量当たりの菌数に差がないことから、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物は残存していないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例３　乳酸菌濃度の検討
<方法>
　乳酸菌（JCM5805株）をグリセロールストックから起こし、MRS培地で培養した。培養した乳酸菌（JCM5805株）を純水で洗浄し、遠心により濃縮したのち、表５に示す濃度の疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670）溶液で乳酸菌を再懸濁し、培養終了後から20倍濃縮した菌体濃度50 mg/mlとした。その後、105℃で30分間殺菌処理を行った。殺菌後、菌体濃度2.5 mg/mlになるよう純水を加え、遠心により上清を除くことで疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を洗い流し、凍結乾燥させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　雌129/SVマウスの脾臓細胞を常法に従って回収し赤血球除去処理を行った。得られた脾臓細胞を10％FBS、50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地（SIGMA社製）に、4×1O6個/mlとなるように懸濁した。得られた細胞懸濁液500μlに、作製した乳酸菌（JCM5805株）を終濃度10μg/mlになるよう添加し、C02インキュベータ内で37℃、５％CO2にて培養した。24時間後に培養上清を回収しインターフェロン-α測定キット(PBL社製)にてインターフェロン-α濃度を測定した。
<結果>
　図３に結果を示す。疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理のJCM5805でインターフェロン-α誘導活性を示し、乳酸菌濃度1～20 mg/mlで疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物と混合して作製したJCM5805は疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理JCM5805より有意に高いインターフェロン-α誘導活性を示した。この結果より、乳酸菌作製時に50 mg/ml濃度の乳酸菌（JCM5805株）を混合することで、免疫賦活作用が高められることが分かった。また、作製した粉末の重量当たりの菌数を測定することで、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の残存量を調べた。表６に示したとおり、重量当たりの菌数に差がないことから、疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物 は残存していないことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例４　異なる疎水基を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物での検討
<方法>
　乳酸菌サンプルは、殺菌した乳酸菌（JCM5805株）1 mg/mlに表７に示した各多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物2.5 mg/mlを30分間混合した後、PBSで洗浄して多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を除き、乳酸菌濃度1 mg/mlになるようPBSで再懸濁した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　雌129/SVマウスの骨髄細胞を常法に従って回収し赤血球除去処理を行った。得られた骨髄細胞を10％FBS、50μM β-メルカプトエタノール、100 ng/mlマウスFlt-3 ligandを含有するRPMI培地（SIGMA社製）に、1×1O6個/mlとなるように懸濁した。得られた細胞懸濁液1 mlをプレートに播種し、C02インキュベータ内で37℃、５％CO2にて1週間培養して骨髄由来樹状細胞を誘導した。1週間培養後、上記の乳酸菌サンプルを乳酸菌濃度10μg/mlになるように添加した。24時間後に培養上清を回収しインターフェロン-α測定キット(PBL社製)にてインターフェロン-α濃度を測定した。
<結果>
　図４に結果を示す。サンプル（１）（多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理の乳酸菌（JCM5805）)でインターフェロン-α誘導活性を示し、更にいずれの種類のエステル結合物（リョートーシュガーエステルP-1670（ショ糖パルミチン酸エステル）、リョートーシュガーエステルS-1670（ショ糖ステアリン酸エステル）、リョートーシュガーエステルO-1570（ショ糖オレイン酸エステル））によってもインターフェロン-α誘導活性が高められた。すなわち、乳酸菌の免疫賦活作用を高めるエステル結合物の疎水性部分として特定の種類ではなく、様々な種類の疎水性基を用いることができることが分かった。
実施例５　異なる親水性部分を持つ多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物での検討
<方法>
　乳酸菌サンプルは、殺菌した乳酸菌（JCM5805株）1 mg/mlに表８に示した各多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物2.5 mg/mlを30分間混合した後、PBSで洗浄して多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を除き、乳酸菌濃度1 mg/mlになるようPBSで再懸濁した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　雌129/SVマウスの骨髄細胞を常法に従って回収し赤血球除去処理を行った。得られた骨髄細胞を10％FBS、50μM β-メルカプトエタノール、100 ng/ml マウスFlt-3 ligandを含有するRPMI培地（SIGMA社製）に、1×1O6個/mlとなるように懸濁した。得られた細胞懸濁液1 mlをプレートに播種し、C02インキュベータ内で37℃、５％CO2にて1週間培養して骨髄由来樹状細胞を誘導した。1週間培養後、上記の乳酸菌サンプルを乳酸菌濃度10μg/mlになるように添加した。24時間後に培養上清を回収しインターフェロン-α測定キット(PBL社製)にてインターフェロン-α濃度を測定した。
<結果>
　図５に結果を示す。多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物未処理の乳酸菌（JCM5805）でインターフェロン-α誘導活性を示し、更にいずれの種類のエステル結合物（リョートーポリグリエステルSWA-15D（ポリグリセリンステアリン酸エステル）、リョートーポリグリエステルS-28D（ポリグリセリンステアリン酸エステル））によってもインターフェロン-α誘導活性が高められた。すなわち、乳酸菌の免疫賦活作用を高めるエステル結合物の親水性部分として特定の種類ではなく様々な種類の親水性基を用いることができることが分かった。
　本発明の方法により免疫賦活作用が増強された乳酸菌は、免疫賦活作用増強用組成物の有効成分として用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (8)

  1. 　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を有効成分として含む乳酸菌免疫賦活作用増強組成物と免疫賦活作用を有する乳酸菌とを接触させ、その後乳酸菌を洗浄し前記乳酸菌免疫賦活作用増強組成物を取り除くことを含む、免疫賦活作用が増強され多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物を含まない乳酸菌を製造する方法。
  2. 　多価アルコールが、モノグリセリン、ポリグリセリン及びショ糖からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
  3. 　脂肪酸がカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びベヘニン酸からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物が有機酸修飾を受けていない、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　免疫賦活作用を有する乳酸菌濃度１に対して、多価アルコールと脂肪酸のエステル結合物の濃度を0.002～８の範囲として接触させる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　免疫賦活作用を有する乳酸菌がインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生を誘導し得る乳酸菌である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　免疫賦活作用を有する乳酸菌がLactococcus garvieae（ラクトコッカス・ガルビエアエ）、Lactococcus lactis subsp.cremoris（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス）、Lactococcus lactis subsp.lactis（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス）、Lactococcus lactis subsp.hordniae （ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ホールドニアエ）、Leuconostoc lactis（ロイコノストック・ラクティス）、Pediococcus damnosus(ぺディオコッカス・ダムノーサス)、Streptococcus thermophilus(ストレプトコッカス・サーモフィラス)、Lactobacillus brevis subsp. coagulans（ラクトバチルス・ブレービス・サブスピーシーズ・コアギュランス）及びEnterococcus faecalis（エンテロコッカス・フェカリス）からなる群から選択される請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　免疫賦活作用を有する乳酸菌がLactococcus lactis JCM5805である、請求項６又は７に記載の方法。
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