WO2017043868A1 - 황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물 Download PDF

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김재훈
이승기
임주혁
김연숙
문원강
최치호
윤광준
문성호
이성현
염명훈
안수미
김경욱
성미경
장영표
김진주
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Definitions

  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a natural plant extract for relieving inflammation caused by yellow dust and fine dust, more specifically one or more extracts selected from the group consisting of tangerine peel extract, bracken extract and white parasitic extract It relates to a composition for alleviating skin inflammation caused by the harmful environment of the atmosphere.
  • Inflammatory response in the skin begins as an action to defend against skin damage caused by physical stimuli, chemicals, bacteria, etc., in response to keratinocytes or Langeshans cells ( In Langerhans Cell, inflammatory reactions are initiated by the release of various types of cytokine, including Interleukin-8 (IL-8), Interleukin-6 (IL-6), and Interleukin-1.
  • IL-8 Interleukin-8
  • IL-6 Interleukin-6
  • TNF-1 Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • TNF- ⁇ Tumor Necrosis Factor- ⁇
  • the macrophages activated by these are nitric oxide (NO) or prostaglandin (Prostaglandin E2). Excessive production of PGE2) further aggravates the inflammatory process.
  • Fine dust is generally referred to as dust having a particle size of 10 ⁇ m or less, abbreviated as PM10 (Particulate Matter 10), and also includes PM2.5 (Particulate Matter 2.5), which is ultrafine dust of 2.5 ⁇ m or less. It mainly occurs when burning fossil fuels, and fine dust from China, which has 70% dependence on coal, accounts for a large part.
  • yellow sand is a phenomenon in which small sand, loess or dust of desert and ocher areas in the center of Asian continent such as China or Mongolia floats in the sky and flies far away by upper wind and moves to Jeju Island with long-distance mobile air pollutants. This is possible.
  • Fine dust average is 1 ⁇ g / m was symptoms of Dermatitis average increase of 0.4% each time by 3, as the total volatile organic compounds (TVOC) benzene, one of the air pollutants in increments of 0.1 ppb, respectively Symptoms It increased 2.59% and 2.74%.
  • TVOC total volatile organic compounds
  • dust dust is smaller than ordinary dust, which can penetrate deep into the pores of the skin, causing skin problems, worsening various symptoms such as dry skin, irritant dermatitis, allergic dermatitis, acne, blemishes, and freckles. Therefore, the occurrence of dermatitis caused by yellow dust and fine dust is expected to increase, and the need for a material to alleviate the skin inflammatory response caused by yellow dust and fine dust will be increased.
  • the present inventors have performed a thorough study on natural-derived materials that can alleviate the skin inflammation caused by yellow dust and fine dust, and solve the problems of existing skin inflammation treatment agents, tangerine peel extract, bracken extract And it was confirmed that the white parasitic extract to relieve skin inflammation caused by yellow dust or fine dust and completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a composition for alleviating skin inflammation caused by yellow dust or fine dust comprising at least one extract selected from the group consisting of tangerine peel extract, bracken extract and white parasitic extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for alleviating skin inflammation using the composition.
  • Another problem to be solved by the present invention is to provide a method for reducing the degree of redness of the skin, skin erythema amount or transdermal moisture loss, comprising the step of applying the composition to the skin.
  • the present invention provides a composition for alleviating skin inflammation caused by yellow dust or fine dust comprising at least one extract selected from the group consisting of tangerine peel extract, bracken extract and white parasitic extract as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of alleviating skin inflammation using the composition.
  • the present invention also provides a method for reducing the degree of redness of the skin, the amount of skin erythema or the amount of transdermal moisture loss, comprising applying the composition to the skin.
  • the present invention provides a composition for alleviating skin inflammation caused by harmful environment of the atmosphere comprising at least one extract selected from the group consisting of tangerine peel extract, bracken extract and white parasitic extract as an active ingredient.
  • the native native tangerine jingyul and jingyul is means jingyul Jeju Native Native tangerine, and is distinguished from the Japanese species of citrus (Citrus Unshiu) is popularly used in recent years.
  • the unique flavor and flavor of the fruit made it one of the specialties of Jeju's local specialty, which had been cherished by the king. It is called as a product in Jeju area, and it is also called as wild mandarin.
  • the Fern Sceptridium Ternatum or Botrychium Ternatum
  • the Fern is a perennial plant belonging to the Fern and gosarisam (Ophioglossaceae) gosarisam of the neck (Ophioglossales), also called fern flower. It grows wild in Korea, Japan, Taiwan, and China. It is hairless and 15 ⁇ 40cm high. Roots are thick, fleshy, spread all over, and one stem stands straight.
  • the horticulture (Korthalsella Japonica ) is an evergreen semi-parasitic shrub that lives on camellia, and belongs to the mistletoe ( Loranthaceae ) together with the above-mentioned (mulberry mistletoe), creeper (mallow mistletoe) and trout (pine mistletoe).
  • White parasites can be found on the islands of Jeju Island and southern part of Korea.
  • the leaves are 6 ⁇ 15cm long, and the leaves are degenerated, hanging on both ends of the node.
  • the skin inflammation may include, without limitation, any skin inflammatory disease involving an inflammatory response that may occur when yellow dust or fine dust contacts the skin, and may be contact dermatitis, but is not limited thereto.
  • the skin inflammation may be determined by measuring the degree of redness of the skin, skin erythema or transdermal moisture loss, but is not limited thereto.
  • the extract may be obtained by extracting with water, lower alcohols of C1 to C4 or a mixed solvent thereof, the lower alcohol may be ethanol or methanol, more specifically ethanol.
  • the present invention provides a composition for alleviating skin inflammation caused by the harmful environment of the atmosphere containing a tangerine peel extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for alleviating skin inflammation caused by the harmful environment of the atmosphere containing fern extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for alleviating skin inflammation caused by the harmful environment of the atmosphere containing a white parasitic extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for alleviating the skin inflammation caused by the harmful environment of the atmosphere further comprising any one or more of the tangerine peel extract or bracken extract to white parasitic extract.
  • the extract is i) Hesperidine (Hesperidine), Tetramethyl-O-Isoscutellarein (Tetramethyl-O-Isoscutellarein), Nobiretin (Nobiletin) and Tangerine (Tangeretin) Tangerine peel extract comprising one or more compounds selected from the group; ii) Quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -Rhamnoside-7-O- ⁇ -Rhamnoside (Quercetin-3-O- ⁇ -Glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -Rhamnoside -7-O- ⁇ -Rhamnoside), quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -rhamnoside-7-O- ⁇ -glucoside (Quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl 1 ⁇ 2) - ⁇ -Rhamnoside-7-O- ⁇ -Glucoside, Ternatumoside VI Ternatumoside XI and Ter
  • the tangerine peel extract of the present invention is an active ingredient Hesperidine (Hesperidine), Tetramethyl-O-Isoscutellarein, Nobiretin and Tangerine (Tangeretin) It may include one or more compounds selected from the group consisting of
  • bracken extract of the present invention is quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -rhamnoside-7-O- ⁇ -rhamnoside (Quercetin-3) as an active ingredient -O- ⁇ -Glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -Rhamnoside-7-O- ⁇ -Rhamnoside), quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -rhamnoside-7-O- ⁇ -glucoside (Quercetin-3-O- ⁇ -glucosyl (1 ⁇ 2) - ⁇ -Rhamnoside-7-O- ⁇ -Glucoside), Ternatumoside VI Ternatumoside XI ) And ternatumoside XII, and one or more compounds selected from the group consisting of Ternatumoside XII.
  • the white parasitic extract of the present invention as an active ingredient group consisting of lusennin-2 (Lucenin-2), bisenin-2 (Vicenin-2) and Stellarin-2 (Stellarin-2) It may include one or more compounds selected from.
  • the extract may be a mixture of both tangerine peel extract, fern extract and white parasitic extract.
  • Citrus peel, Fern ginseng and White Parasitic ethanol extracts have a difference in relative effect on the inhibition of the production of each inflammatory source. Therefore, by using a mixture of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract, it is possible to give a complementary effect to the skin irritation caused by the harmful environment of the atmosphere mixed with various harmful substances such as yellow dust and fine dust. .
  • the inflammatory agent means a factor associated with an inflammatory response in vivo, such as proinflammatory mediator NO or inflammatory cytokines.
  • the mixture is Citrus Sunki peel extract: Fern ( Sceptridium Ternatum or Botrychium Ternatum ) extract:
  • the composition ratio of Korthalsella Japonica extract may be 1: 1: 1 to 2: 1: 1 weight ratio.
  • the harmful environment of the atmosphere may be yellow dust or fine dust.
  • the harmful environment of the air refers to an atmospheric environment including heavy metals, fine dust, yellow dust, and the like, containing harmful substances in the air.
  • the yellow sand is a long-distance mobile air pollutant, a small sand, loess or dust of deserts and ocher areas in the center of the Asian continent such as China and Mongolia that floats in the sky and then flies far away by upper winds or dripping sand dust.
  • the fine dust may include one or more fine dust selected from the group consisting of TSP, PM10 and PM2.5.
  • the dust or fine dust G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO- ⁇ , IL-1 ⁇ IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 , IL-15, MCP-1, MCP-2 and TNF- ⁇ may increase the production of one or more cytokines selected from the group consisting of.
  • the fine dust is generally referred to as dust having a particle size of 10 ⁇ m or less, abbreviated as PM10 (Particulate Matter 10), and also includes PM2.5 (Particulate Matter 2.5) which is ultrafine dust of 2.5 ⁇ m or less. It mainly occurs when burning fossil fuels, and fine dust from China, which has 70% dependence on coal, accounts for a large part. In addition, total suspended dust (typically all suspended particles in air below 50 ⁇ m, Total Suspended Particles (TSP)) is also widely included in fine dust.
  • the extract may inhibit the production of NO, a proinflammatory mediator.
  • the extract may reduce the amount of production of factors associated with inflammatory responses in vivo, such as inflammatory cytokines.
  • the extract is a representative inflammatory cytokine can reduce the production of IL-1 ⁇ , IL-2, IL-6, IL-8, GRO- ⁇ , GM-CSF and TNF- ⁇ .
  • the inflammatory cytokines include G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), GRO (Growth-Regulated Protein), GRO- ⁇ (Growth-Regulated Protein- ⁇ ), IL-1 ⁇ (Interleukin-1 ⁇ ), IL-2 (Interleukin-2), IL-3 (Interleukin-3), IL-5 (Interleukin-5), IL-6 (Interleukin-6), IL-7 (Interleukin-7) , IL-8 (Interleukin-8), IL-10 (Interleukin-10), IL-13 (Interleukin-13), IL-15 (Interleukin-15), INF- ⁇ (Interferon- ⁇ ), MCP-1 ( Monocyte Chemoattractant Protein-1), MCP-2 (Monocyte Chemoattractant Protein-2), MCP-3 (Monocyte Chemoattractant Protein-3), CXCL9 (Chemokine Ligand 9; M
  • the tangerine peel extract, bracken extract and white parasitic extract may be prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step 3 Concentrating the filtered extract of step 2) under reduced pressure, respectively, and drying to prepare a powder.
  • the tangerine peel, bracken, or white parasite of step 1) may be used without limitation, such as cultivated or commercially available.
  • the extraction method conventional methods in the art, such as filtration, hot water extraction, dipping extraction, reflux cooling extraction, ultrasonic extraction, supercritical extraction, can be used, and conventional temperature and pressure known in the art can be used. Can be prepared under conditions.
  • the extraction solvent may be obtained by extraction with water, a lower alcohol of C1 to C4, or a mixed solvent thereof, the lower alcohol may be ethanol or methanol.
  • the extraction solvent may be extracted by adding 1 to 20 times the amount of each of the tangerine peel, bracken, or white parasitic, specifically, may be extracted by adding 5 to 15 times, but is not limited thereto.
  • the extraction temperature may be 20 to 70 °C, specifically may be 25 to 65 °C, more specifically may be 30 to 60 °C, but is not limited thereto.
  • the extraction time may be 1 to 40 hours, specifically 10 to 30 hours, but is not limited thereto.
  • the extract of step 2) may be filtered 1 to 5 times.
  • the filtration method may be a conventional method in the art, such as sieve filtration, suction filtration, ultrafiltration, filter press, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) may use a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying may be a reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the composition may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition, or a nutraceutical composition.
  • the cosmetic composition may include components conventionally used in the cosmetic composition, and in one embodiment include conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art.
  • the formulation may be any one selected from the group consisting of a high viscosity emulsifier type, a low viscosity emulsifier type, and a solubilized formulation, but is not limited thereto.
  • a cosmetic composition blending components commonly used in the art.
  • formulations as solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, packs, massage creams and sprays, and the like. It may be, but is not limited to such.
  • flexible lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, sun lotion, sun cream, makeup base, BB cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, stick form product, balm It can be prepared in the form of Balm type products, sprays or powders.
  • water phase components, oil phase components, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents, preservatives, fragrances and the like may be selected and added.
  • the pharmaceutical composition may further contain pharmaceutical supplements such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and various oral methods according to conventional methods. It may be formulated in the form of a dosage form or parenteral dosage form. In the case of parenteral administration, it can be administered topically to the skin, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration and the like.
  • pharmaceutical supplements such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and various oral methods according to conventional methods. It may be formulated in the form of a dosage form or parenteral dosage form. In the case of parenteral administration, it can be administered topically to the skin, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection,
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be an external dermal formulation.
  • the external dermal formulation may be a powder, gel, ointment, cream, lotion, liquid or aerosol formulation, but is not limited thereto.
  • the health functional food composition is not particularly limited in formulation, for example, it may be formulated as a tablet, granules, drinks, caramel, diet bar and the like.
  • Health functional food composition of each formulation can be selected by the person skilled in the art according to the formulation or purpose of use, in addition to the active ingredient, the components commonly used in the field without difficulty, synergistic effect when applied simultaneously with other raw materials Can happen.
  • the tangerine peel extract, bracken extract, white parasitic extract each or a mixture thereof may be included in 0.001 to 30% by weight relative to the total composition weight.
  • the tangerine peel extract, bracken extract, white parasitic extract each or a mixture thereof is less than 0.001% by weight of the total composition weight does not appear to alleviate skin inflammation, when the content exceeds 30% by weight to reduce skin inflammation The degree of effect increase is insignificant, there is a problem in formulation stability, and it is not economical.
  • tangerine peel extract, fern ginseng extract, white parasitic extract and mixtures thereof inhibit yellow dust and fine dust by inhibiting NO production and inflammatory cytokines produced by yellow dust or fine dust which is a harmful environment of the atmosphere. And it was confirmed that the excellent effect on the prevention and improvement of skin inflammation caused by and other harmful substances.
  • the tangerine peel extract, fern ginseng extract, white parasitic extract, and mixtures thereof have an excellent effect on improving skin inflammation caused by fine dust through clinical trials.
  • the present invention also provides a method for alleviating skin inflammation using the composition.
  • the method may comprise applying to the skin.
  • the skin inflammation may include without limitation all skin inflammatory diseases involving an inflammatory response that may occur by contact with the yellow dust or fine dust, may be contact dermatitis (Contact Dermatitis) However, it is not limited thereto.
  • the present invention is to provide a method for reducing the degree of redness of the skin, skin erythema amount or hard epidermal moisture loss, comprising applying the composition to the skin.
  • the method comprises: i) reducing the degree of redness of the skin by about 20.0% after 7 days of application of the fine dust solution compared to the uncoated group; ii) about 16.8% of skin erythema; Or iii) a method of reducing hard skin moisture loss by about 33.2%.
  • the term "application” means any method of contacting the composition of the present invention with the skin of an individual in any suitable manner, through which the purpose is to absorb the composition into the skin.
  • the natural plant extract of the present invention suppresses NO production caused by yellow dust and fine dust and inhibits the production of inflammatory cytokines, it has an excellent effect on preventing or improving skin inflammation caused by yellow dust, fine dust and other harmful substances. have.
  • 1 to 3 is the effect of inhibiting the NO production caused by yellow sand, TSP, PM10, PM2.5 of tangerine peel ethanol extract (FIG. 1), bracken ethanol extract (FIG. 2), white parasitic ethanol extract (FIG. 3) Is a graph.
  • FIG. 7 to 9 shows the production of TNF- ⁇ induced by yellow dust, TSP, PM10, PM2.5 of tangerine peel ethanol extract (FIG. 7), bracken ethanol extract (FIG. 8), white parasitic ethanol extract (FIG. 9). It is a graph showing the effect of suppressing.
  • FIG. 10 to 12 are chromatograms analyzed by HPLC-UVD of tangerine peel ethanol extract (FIG. 10), bracken ethanol extract (FIG. 11), and white parasitic ethanol extract (FIG. 12).
  • Figure 13 is a graph showing the NO production, IL-8 and TNF- ⁇ production inhibitory effect of the three types of flavonoid glycosides isolated from the baekgi paraethanol extract by yellow dust and fine dust.
  • FIG. 14 is a cytokine array test result performed to determine whether inflammatory cytokines are generated according to types of yellow dust and fine dust.
  • Distilled water, ethanol, and chloroform were added to the filter cut to a size of about 1 m 2 , and extracted with stirring for 12 hours.
  • the extract was separated and the extraction solvent was added again to the extraction residue and extracted again by ultrasonic for 4 hours.
  • the extracts were combined, concentrated under reduced pressure, the extractant was evaporated and removed, and the sample extracted with distilled water and ethanol was redissolved with each solvent, and the sample extracted with chloroform was dissolved in DMSO.
  • NO is a pro-inflammatory mediator that is produced by various inflammatory stimuli and is known to induce a continuous inflammatory response and contribute to tissue damage. Therefore, it was confirmed whether yellow dust and fine dust extract induced NO production.
  • Raw 264.7 cells were dispensed into 96 well plates at 6 x 10 4 cells / well and incubated at 37, 5% CO2 for 24 hours. Yellow sand, TSP, PM10, PM2.5 samples were diluted by concentration and treated, and then incubated for 24 hours. Cell culture was then mixed 1: 1 with Greases Reagent and measured for absorbance at 540 nm with a Microplate Reader to measure NO production. No cytotoxicity was found for Raw 264.7 cells.
  • IL-8, TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-6, GRO- ⁇ , and GM-CSF are representative inflammatory cytokines, and yellow dust and fine dust extracts are responsible for the production of TNF- ⁇ and IL-8.
  • HaCaT was dispensed at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 96 well plate, and then incubated at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours.
  • Citrus peel, fern and white parasitic ethanol extracts were tested in the following ways to determine whether they were cytotoxic.
  • Raw 264.7 cells and HaCaT cells were cultured at 6.0 x 10 4 cells / well and 2.5 x 10 4 cells / well and incubated at 37 ° C and 5% CO2 for 24 hours.
  • Cellular viability was measured by treating tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract at a concentration of 50-1,600 ⁇ g / ml, and treating the reaction with WST-1 solution after 24 hours and measuring the absorbance at 450 nm with a microplate reader. It was confirmed that, the results for tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract are shown in Tables 5 to 7.
  • Raw 264.7 cells were dispensed into 96 well plates at 6 x 10 4 cells / well, and then cultured at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours.
  • the tangerine peel, bracken ginseng and white parasitic ethanol extracts were treated at 100, 200, 400 ⁇ g / ml concentration, and treated with 100 times dilution of yellow sand, TSP, PM10, and PM2.5 distilled water extracts, followed by incubation for another 24 hours.
  • Cell culture was then mixed 1: 1 with Greases Reagent and measured for absorbance at 540 nm using a Microplate Reader to measure NO production. Yellow dust, TSP, PM10,
  • the results of tangerine peel, bracken, white parakeet, and ethanol extracts of Machi on the degree of reducing NO production when the group treated only with PM2.5 were shown in FIGS. 1 to 3.
  • HaCaT was dispensed at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 96 well plate, and then incubated at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours. Each cytokine was treated with the above irritant, and then incubated for 24 hours. Cultures were then taken to quantify these cytokines using an ELISA kit (Kit) for the determination of IL-1 ⁇ , IL-2, IL-6, IL-8, GRO- ⁇ , GM-CSF, TNF- ⁇ . .
  • bracken ginseng ethanol extract for yellow sand and bracken ginseng and white parasitic ethanol extract for PM2.5 were relatively superior to other extracts according to the harmful concentrations of each atmosphere at the same concentration in inhibiting IL-8 production.
  • the tangerine peel ethanol extract for yellow sand and bracken ethanol extract for TSP, PM10 and PM2.5 were relatively superior to other extracts. It was. It was confirmed that Fernsam ethanol extract was relatively superior to other extracts for PM2.5 and TSP at the same concentration in the inhibitory effect of IL-1 ⁇ production.
  • bracken and tangerine ethanol extracts for yellow sand and PM10 and bracken ethanol extracts for PM2.5 and TSP were relatively superior to IL-2 production inhibitory effects at the same concentration. It was confirmed that Fernsam ethanol extract was relatively superior to other extracts for all atmospheric harmful substances at the same concentration in inhibiting IL-6 and GRO- ⁇ production. In the inhibitory effect of IL-6 production, it was confirmed that bracken ethanol extract was relatively superior to other extracts. In the inhibitory effect of GM-CSF production, it was confirmed that the effect of the tangerine peel and ethanol extract on all the harmful substances in the air at the same concentration is relatively superior to the other extracts.
  • the same 100-fold distilled distilled water extract used in Experimental Example 3 (1) was used as a stimulant for NO and mixed with bracken, white parasitic and tangerine peel ethanol extracts in the same ratio (hereinafter, 1: 1: 1 mixture)
  • 1: 1: 1 mixture A mixture of two or more citrus peeled ethanol extracts from fern and white parasitic ethanol extracts (hereinafter, 2: 1: 1 mixture) was prepared and used, respectively.
  • Fermented ginseng, white parasitic, and tangerine peel ethanol extract and the mixture was treated with 52.5 ⁇ g / ml, 105 ⁇ g / ml, 210 ⁇ g / ml to evaluate the NO production inhibitory ability as follows.
  • HaCaT was dispensed at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 96 well plate, and then incubated at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours.
  • Fermented ginseng, white parasitic and tangerine peel ethanol extracts and mixtures were treated at concentrations of 52.5, 105 and 210 ⁇ g / ml, and 100% distilled yellow dust, PM10, PM2.5 and TSP distilled water extracts were incubated for another 24 hours. It was. The culture was then taken to quantify the amount of NO using NO assay, and the results for the mixture of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract are shown in Table 13 below.
  • the mixture of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract showed a concentration-dependent NO inhibitory effect
  • the mixture with the existing bracken, white parasitic, tangerine peel ethanol extract showed the same tendency to inhibit NO production Confirmed.
  • the 2: 1: 1 mixture tended to be more effective than the 1: 1: 1 mixture.
  • the effect of inhibiting NO production it was confirmed that the mixture was more effective than the single extract for TSP at the same concentration.
  • Fermented ginseng, white parasite, tangerine peel ethanol extract and the concentration of the mixture was treated with 52.5 ⁇ g / ml, 105 ⁇ g / ml, 210 ⁇ g / ml to evaluate the inhibitory activity of inflammatory cytokine production as follows.
  • HaCaT was dispensed at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well in a 96 well plate, and then incubated at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours.
  • the tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract and the mixture were treated at concentrations of 52.5, 105, and 210 ⁇ g / ml, and each cytokine was treated with the above irritant, and then incubated for 24 hours. Cultures were then taken to quantify these cytokines using an ELISA kit (Kit) for the quantification of IL-1 ⁇ , IL-2, IL-6, IL-8, GRO- ⁇ , GM-CSF, TNF- ⁇ .
  • Citrus peel, bracken, white parasitic ethanol extract and the results for the mixture are shown in Tables 14 to 19.
  • the chromatogram of the tangerine peel ethanol extract obtained in Example 1 was analyzed at HPLC-UVD 280 nm using a C18 column having a diameter of 4.6 mm and a length of 25 cm at a concentration gradient of acetonitrile and distilled water. Analysis of spectroscopic data using major HPLC and HPLC-ESI-MS shows that each peak is Hesperidine (peak number 1), Tetramethyl-O-Isoscutellarein (peak number). 2), it was confirmed that the nobiretin (Nobiletin) (peak number 3) and Tangeretetin (Tangeretin) (peak number 4).
  • the chromatogram analyzed by HPLC-UVD 350nm using a bracken ginseng ethanol extract obtained in Example 1 using a C18 column having a diameter of 4.6 mm and a length of 10 cm under a concentration gradient of methanol and distilled water is shown in FIG.
  • the flavonoid glycosides were identified by analyzing spectroscopic data through HPLC-ESI-MS for and are shown in Table 20 below.
  • the chromatogram of the white parasitic ethanol extract obtained in Example 1 was analyzed by HPLC-UVD 330 nm using a C18 column having a diameter of 3.9 mm and a length of 30 cm at a concentration gradient of acetonitrile and distilled water. Comparison of spectroscopic data through HPLC-ESI-MS, MS / MS and previous literature (Ferreres et al., 2003, Parejo et al., 2004) for major peaks was performed using Lucenenin-2 ( Three flavonoid glycosides were identified and separated: peak number 1), Vicen-2-2 (peak number 2), and Stellarin-2 (peak number 3). Shown in
  • cytokine array experiments were conducted to determine how cytokines are additionally generated and how they vary depending on the type of yellow dust and fine dust.
  • HaCaT was dispensed in a 6-well plate at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well, and then incubated at 37 ° C. and 5% CO2 for 24 hours. 100% dilution of yellow sand, TSP, and PM2.5 distilled water extracts were treated, followed by incubation for an additional 24 hours, followed by incubation of the culture medium, using human cytokine antibody kit (Human Cytokine Antibody Array Kit, Raybiotech) for G-CSF (Granulocyte).
  • human cytokine antibody kit Human Cytokine Antibody Array Kit, Raybiotech
  • Colony Stimulating Factor GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), GRO (Growth-Regulated Protein), GRO- ⁇ (Growth-Regulated Protein- ⁇ ), IL-1 ⁇ (Interleukin-1 ⁇ ), IL-2 ( Interleukin-2), IL-3 (Interleukin-3), IL-5 (Interleukin-5), IL-6 (Interleukin-6), IL-7 (Interleukin-7), IL-8 (Interleukin-8), IL-10 (Interleukin-10), IL-13 (Interleukin-13), IL-15 (Interleukin-15), INF- ⁇ (Interferon- ⁇ ), MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), MCP-2 (Monocyte Chemoattractant Protein-2), MCP-3 (Monocyte Chemoattractant Protein-3), CXCL9 (Chemokine Ligand 9; MIG), CCL5 (Chemokine Ligand 5; RANTES), TGF
  • Yellow dust, TSP, PM2.5 distilled water extract is shown in Table 21 and Figure 14 the results of the production rate of each cytokine compared to the untreated control.
  • the positive control was treated with a biotinylated antibody to confirm that the experiment proceeded well, and the negative control was a buffer to identify the response baseline. Only blanks were processed, and blanks were not processed to see the background response.
  • the yellow dust extract is produced in G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-6, IL-8, MCP-1, TSP extract
  • Production amount of G-CSF, GM-CSF, IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-15, MCP-2, PM2.5 extract is G-CSF, GM- CSF, GRO.
  • tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extracts have a relative effect on the inhibition of NO production and inflammatory cytokine production depending on the harmful substances (yellow dust, TSP, PM10, PM2.5) of each atmosphere that cause inflammation There is a difference in effectiveness. Therefore, it is possible to prepare a cosmetic composition comprising a mixture of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract.
  • a high viscosity emulsion formulation of a mixture containing each or all of the tangerine peel, bracken, and parasitic ethanol extracts obtained in Example 1 was prepared in a conventional manner according to the composition components and composition ratios shown in Tables 22 to 25 below.
  • Addition phase I is a phase in which a mixture containing each or all of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract is dissolved. At 50 ° C., the addition phase I was added and mixed, followed by mixing the addition phase II. .
  • a low viscosity emulsion formulation of a mixture containing each or all of the tangerine peel, bracken, and parasitic ethanol extracts obtained in Example 1 was prepared in a conventional manner according to the composition ingredients and composition ratios shown in Tables 26 to 29 below.
  • Addition phase I is a phase in which a mixture containing each or all of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract is dissolved. At 50 ° C., the addition phase I was added and mixed, followed by mixing the addition phase II. .
  • a solubilized formulation of a mixture containing each or all of the tangerine peel, bracken, and parasitic ethanol extracts obtained in Example 1 was prepared in a conventional manner according to the composition ingredients and composition ratios shown in Tables 30 to 33 below.
  • Soluble image was added to the aqueous phase and mixed to obtain an oil-in-water emulsion.
  • Addition phase I is a phase in which a mixture containing each or all of tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract is dissolved. After solubilization, the addition phase I is added to the mixed phase of 2 and mixed with the addition phase II. To complete.
  • the cosmetic compositions of Formulation Examples 1, 2, and 3 are stored at 4 ° C., 30 ° C., 45 ° C. for 12 weeks under conditions of daylight, and the color, odor, and property changes of the formulation are observed through visual and sensory evaluation. 34 to 36 are shown.
  • Cosmetic composition comprising tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract
  • clinical evaluation was conducted in two stages, 1st and 2nd. A total of 20 patients (11 males, 9 females) were tested in the first trial, and a total of 22 (9 males, 13 females) in the second trial.
  • SLS sodium lauryl sulfate
  • SLS + fine dust solution are applied to different sites, and then before application Thereafter, two days after application, a change in the degree of skin redness (a *), which is a factor for confirming the occurrence of a skin inflammatory response, was measured.
  • the SLS + fine dust solution and the SLS + fine dust solution + test product are respectively applied to different sites. 1 day after use, 2 days after use, 7 days after use, skin redness (a *), erythema amount skin erythema amount (EI), hard epidermal moisture loss amount (TEWL) ) was measured.
  • Example 2 SLS used 98% concentration product manufactured by Wako Inc, Japan, and the fine dust solution was prepared in Example 2, yellow dust extract, TSP extract, and PM2.5 extract. 100-500-fold diluted PM10 extract was used.
  • the cosmetic composition containing the tangerine peel, bracken, white parasitic ethanol extract of Table 25 of Formulation Example 1 was used. The application of the primary test was performed on the left biceps region of the subject, and the application of the secondary test was performed on the right biceps region of the subject.
  • visit 1 measures before using the product, attaches skin damage patches, visit 2 performs patch removal, skin measurement immediately after induction of damage, and the application of fine dust solution.
  • Visit 3 was measured 1 day after the application of the fine dust
  • visit 4 was measured 2 days after the application of the fine dust, confirmed the adverse reaction.
  • Visit 1 was performed before the product was used, and the skin damage patch was applied.
  • Visit 2 was the patch removal, skin measurement immediately after induction of the damage, fine dust solution application, and product application.
  • Visit 3 was measured 1 day after the application of fine dust
  • visit 4 was performed 2 days after the application of fine dust
  • visit 5 was measured 7 days after the application of fine dust, confirmed the adverse reaction.
  • Chroma Meter CM700d (Kroma Meter CM700d, Konica Minolta Sensing Americas) measures the skin color before, immediately after, 1 day after and 2 days after , Inc, USA). The redness of the skin of the same site was measured three times for each measurement, and the average value was used as an evaluation data. The redness of the skin was expressed by measuring a * value representing redness in the CIE L * a * b * color space based on human color perception. Increasing the a * value means visually redder. The skin redness measurement results of 20 subjects were expressed as mean ⁇ standard deviation (SE), and are shown in Table 37 below.
  • SE standard deviation
  • composition containing the natural plant extract of the present invention is effective against skin inflammation caused by fine dust (second test)
  • Chroma meter which is a skin color measuring instrument before and immediately after application, 2 days after application, and 7 days after application, in order to confirm the change in the degree of redness of the skin by application of SLS + fine dust solution and SLS + fine dust solution + test product It was measured using a CM700d (Chroma Meter CM700d). The skin redness of the same site was measured three times for each measurement. The skin redness measurement results of 22 subjects were expressed as the average value ⁇ Standard Error (SE), and are shown in Table 38 below.
  • SE Standard Error
  • the SLS + fine dust application measured significantly increased (p ⁇ 0.025) after 1 day of application, and significantly decreased (p ⁇ 0.025) after 7 days of application.
  • the SLS + fine dust + test product application measurements decreased significantly (p ⁇ 0.025) 2 days after application and 7 days after application.
  • the test product is a skin irritation factor (a *), skin erythema amount (EI), hard skin epidermal moisture loss (TEWL) all 7 days after the use of fine dust It was confirmed that the reduction, and through this, the test product was confirmed to alleviate the skin inflammation caused by fine dust.
  • a * skin irritation factor
  • EI skin erythema amount
  • TEWL hard skin epidermal moisture loss

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Abstract

본 발명은 황사와 미세먼지에 의해 유발된 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 식물 추출물은 황사 및 미세먼지의 의해 유발된 NO 생성 및 염증성 사이토카인 생성을 억제하므로, 황사, 미세먼지 및 기타 유해물질에 의해 유발된 피부 염증의 예방 또는 개선에 우수한 효과가 있다.

Description

황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물
본 발명은 황사와 미세먼지에 의해 유발된 염증을 완화시키는 천연식물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물에 관한 것이다.
피부에서의 염증반응(Inflammatory Response)은 물리적 자극이나 화학 물질, 세균 등에 의해 피부손상이 유발될 때 이를 방어하기 위한 작용으로서 시작되며, 이에 대한 반응으로 각질형성세포(Keratinocyte) 또는 랑게스한스 세포(Langerhans Cell)에서는 다양한 종류의 cytokine을 내보냄으로써 염증반응이 시작되는데, 인터루킨-8(Interleukin-8;IL-8), 인터루킨-6(Interleukin-6;IL-6), 인터루킨-1(Interleukin-1;IL-1), 종양 괴사인자-α (Tumor Necrosis Factor-α; TNF-α) 등이 대표적이며, 이들로 인해 활성화된 대식세포(Macrophage)는 일산화질소(Nitricoxide;NO)나 프로스타글란딘 (Prostaglandin E2; PGE2)를 과도하게 생성하여 염증 과정을 더욱 심화시킨다.
미세먼지는 입자크기 10 ㎛ 이하인 먼지를 통칭하고 PM10(Particulate Matter 10)으로 약칭하며, 2.5 ㎛이하의 초미세먼지인 PM2.5(Particulate Matter 2.5)도 포함된다. 주로 화석연료를 연소할 때 발생하며, 석탄의존도가 70%인 중국발 미세먼지가 상당부분을 차지한다. 또한, 황사는 중국이나 몽골 등 아시아 대륙의 중심부에 있는 사막과 황토 지대의 작은 모래나 황토 또는 먼지가 하늘에 떠다니다가 상층 바람을 타고 멀리까지 날아가 떨어지는 현상을 말하며 장거리 이동성 대기오염물질로 제주도까지 이동이 가능하다.
산업국가 질병의 약 25 ~ 33%가 환경위해요인에 의해 발생하며, 유럽에서는 오염된 공기로 연간 약 31만 명이 조기에 사망하는 것으로 추정되고 있으며, 미국 암학회에서는 초미세먼지가 m3당 10 ㎍ 증가할 경우 전체 사망률은 7% 증가한다는 연구결과가 발표되었다. 2013년 환경부의 공동연구 결과(Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132(2), 2013, 495-498)에 따르면, 미세먼지 또는 대기오염물질의 농도가 상승할 시 피부염의 증상이 더욱 악화되는 것으로 나타났다. 미세먼지(PM10)가 1 ㎍/m3증가할 때마다 피부염의 증상이 평균 0.4% 증가하였고, 대기오염물질 중 하나인 총 휘발성유기화합물(TVOC)과 벤젠이 0.1 ppb씩 증가할수록 증상이 각각 평균 2.59%, 2.74% 증가하였다. 또한 황사가 발생하면 흙먼지가 대기를 황갈색으로 오염시켜 대기의 먼지량이 평균 4배나 증가하여, 피부가 쉽게 지치고 생기를 잃기 쉽다. 또한 황사 먼지는 일반 먼지보다 입자가 작아 피부 모공 속에 깊숙이 들어가 피부 트러블을 일으킬 수 있으며, 피부 건조증, 자극성 피부염, 알레르기 피부염, 여드름, 기미, 주근깨 등 각종 증상을 더욱 악화시킨다. 따라서, 황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부염 발생은 증가할 것으로 판단되며, 황사와 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증 반응을 완화시킬 소재에 대한 필요성은 증가될 것이다.
피부 염증을 치료하기 위하여, 스테로이드제가 주로 이용되고 있지만 장기간 투여 시 피부의 위축이나 성장 지연 가능성 등 여러 가지 부작용을 일으키고 있어 최근에는 비-스테로이드제의 사용이 증가하고 있다. 그러나 비-스테로이드제 역시 홍반, 가려움 등의 증상과 면역력 약화 등의 부작용을 나타내고 있어 피부염의 원천적 치료가 어려운 실정이다. 따라서, 안전성이 입증된 천연물유래 소재로부터 치료효과가 높고 부작용이 적은 새로운 물질을 찾고자 하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 대표적으로 마가목 추출물(등록특허 10-0563548), 오배자 추출물(등록특허 10-1309172), 스피루리나 추출물(공개특허 10-2009-0079468), 해방풍 추출물(등록특허 10-0919852) 등이 있으나, 황사와 미세먼지에 의해 유발되는 염증을 완화시켜주는 효과를 가진 추출물은 개발되지 않았다.
따라서, 안전성이 입증된 천연물 유래 소재로부터 치료효과가 높고 부작용이 적은 새로운 물질의 필요성이 증가되고 있으나, 아직 황사와 미세먼지에 의해 유발되는 염증을 완화시켜주는 효과를 가진 천연물 유래 소재에 관한 연구결과는 아직 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 황사와 미세먼지에 의해 유발되는 피부 염증을 완화시켜주며, 기존의 피부 염증 치료제가 가지는 문제점을 해결해줄 수 있는 천연물 유래 소재에 대한 예의 연구를 수행한 결과, 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물이 황사 또는 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증을 완화시켜주는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 해결하려는 과제는 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 황사 또는 미세먼지로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하려는 다른 과제는 상기 조성물을 사용하여 피부 염증을 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하려는 다른 과제는 상기 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 붉은 정도, 피부 홍반량 또는 경표피수분손실량을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 황사 또는 미세먼지로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 사용하여 피부 염증을 완화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 붉은 정도, 피부 홍반량 또는 경표피수분손실량을 감소시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
상기 진귤과피는 제주자생 재래귤인 진귤의 껍질을 의미하며, 진귤(Citrus Sunki)은 제주자생 재래귤 중 진귤을 의미하고 근래 대중적으로 사용되는 일본종 감귤(Citrus Unshiu)과는 구별된다. 열매의 향과 맛이 독특하여 지난 날 임금에게 진상하던 제주도 지방 특산물 중에서도 상품에 속했다. 제주지역에서 산물로 불리는 것으로 다른 이름으로는 산귤로 불리기도 하며 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과에 속한다.
상기 고사리삼(Sceptridium Ternatum or Botrychium Ternatum)은 꽃고사리라고도 불리며 고사리삼목(Ophioglossales)의 고사리삼과(Ophioglossaceae)에 속하는 다년생 양치식물이다. 한국, 일본, 타이완, 중국의 산에 자생하며 전체에 털이 없고 높이가 15~40cm이다. 뿌리는 굵고 육질이며 사방으로 퍼지고 1개의 줄기가 나와 곧게 선다.
상기 백기생(Korthalsella Japonica)은 동백나무에 기생하는 상록 반기생 관목으로, 상기생(뽕나무 겨우살이), 오기생(오리나무 겨우살이), 송라(소나무 겨우살이)와 함께 겨우살이과(Loranthaceae)에 속한다. 백기생은 우리나라 제주도 및 남부 지방의 일부의 섬에서 볼 수 있으며 길이는 6~15cm정도로 잎은 퇴화되어 마디 양 끝에 돌기 모양으로 달려 있고 가지는 녹색을 띈다.
상기 피부 염증은, 황사 또는 미세먼지가 피부에 접촉함으로써 발생할 수 있는 염증성 반응을 수반하는 모든 피부 염증성 질환을 제한 없이 포함할 수 있으며, 접촉성 피부염(Contact Dermatitis)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 피부 염증은 피부 붉은 정도, 피부 홍반량 또는 경표피수분손실량을 측정하여 그 발생 유무를 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득할 수 있으며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있고, 보다 구체적으로 에탄올일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 진귤과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 고사리삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 백기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 백기생 추출물에 진귤과피 추출물 또는 고사리삼 추출물 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 대기의 유해환경으로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서 본 발명은 상기 추출물은 i) 헤스페리딘(Hesperidine), 테트라메틸-O-아이소스쿠텔라레인(Tetramethyl-O-Isoscutellarein), 노비레틴(Nobiletin) 및 탄게레틴(Tangeretin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 진귤과피 추출물; ii) 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-α-람노사이드(Quercetin-3-O-β-Glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-α-Rhamnoside), 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-β-글루코시드(Quercetin-3-O-β-glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-β-Glucoside), 테르나튜모시드 VI(Ternatumoside VI) 테르나튜모시드 XI(Ternatumoside XI) 및 테르나튜모시드 XII(Ternatumoside XII)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 고사리삼 추출물; 또는 iii) 루세닌-2(Lucenin-2), 비세닌-2(Vicenin-2) 및 스텔라린-2(Stellarin-2)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 백기생 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 진귤과피 추출물은 유효성분으로 헤스페리딘(Hesperidine), 테트라메틸-O-아이소스쿠텔라레인(Tetramethyl-O-Isoscutellarein), 노비레틴(Nobiletin) 및 탄게레틴(Tangeretin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 고사리삼 추출물은 유효성분으로 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-α-람노사이드(Quercetin-3-O-β-Glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-α-Rhamnoside), 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-β-글루코시드(Quercetin-3-O-β-glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-β-Glucoside), 테르나튜모시드 VI(Ternatumoside VI) 테르나튜모시드 XI(Ternatumoside XI) 및 테르나튜모시드 XII(Ternatumoside XII)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 백기생 추출물은 유효성분으로 루세닌-2(Lucenin-2), 비세닌-2(Vicenin-2) 및 스텔라린-2(Stellarin-2)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출물은 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물을 모두 혼합한 혼합물일 수 있다. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물은 각 염증원인 물질 생성 억제에 있어 상대적인 효과 차이가 존재한다. 따라서, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 모두 혼합한 혼합물을 이용하여 황사, 미세먼지 등 다양한 유해물질이 혼합된 대기의 유해환경에 의해 유발되는 피부 염증 완화에 상보적 효과를 부여할 수 있다.
상기 염증원인 물질은 전염증성 매개인자인 NO 또는 염증성 사이토카인과 같은 생체 내 염증 반응과 관련된 인자를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 혼합물은 진귤(Citrus Sunki)과피 추출물:고사리삼(Sceptridium Ternatum 또는 Botrychium Ternatum) 추출물:백기생(Korthalsella Japonica) 추출물의 조성비율이 1:1:1 내지 2:1:1 중량비일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 대기의 유해환경은 황사 또는 미세먼지일 수 있다.
상기 대기의 유해환경은 대기 유해물질을 포함하는 것으로 중금속, 미세먼지 및 황사 등이 포함된 대기 환경을 말한다.
상기 황사는 장거리 이동성 대기오염물질로 중국이나 몽골 등 아시아 대륙의 중심부에 있는 사막과 황토 지대의 작은 모래나 황토 또는 먼지가 하늘에 떠다니다가 상층 바람을 타고 멀리까지 날아가 떨어지는 현상 또는 강하하는 모래먼지를 말한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 미세먼지는 TSP, PM10 및 PM2.5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미세먼지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 황사 또는 미세먼지는 G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO-α, IL-1α IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL-15, MCP-1, MCP-2 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 생성량을 증가시킬 수 있다.
상기 미세먼지는 입자크기 10 ㎛ 이하인 먼지를 통칭하고 PM10(Particulate Matter 10)으로 약칭하며, 2.5 ㎛이하의 초미세먼지인 PM2.5(Particulate Matter 2.5)도 포함된다. 주로 화석연료를 연소할 때 발생하며, 석탄의존도가 70%인 중국발 미세먼지가 상당부분을 차지한다. 또한 총부유먼지(일반적으로 50 ㎛ 이하의 공기 중에 떠있는 모든 먼지, Total Suspended Particle, TSP)도 넓게는 미세먼지에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출물은 전염증성 매개인자인 NO 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출물은 염증성 사이토카인과 같은 생체 내 염증 반응과 관련된 인자의 생성량을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출물은 대표적 염증성 사이토카인으로 IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, GRO-α, GM-CSF 및 TNF-α의 생성량을 감소시킬 수 있다.
상기 염증성 사이토카인은 G-CSF(Granulocyte Colony Stimulating Factor), GM-CSF(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), GRO(Growth-Regulated Protein), GRO-α(Growth-Regulated Protein-α), IL-1α(Interleukin-1α), IL-2(Interleukin-2), IL-3(Interleukin-3), IL-5(Interleukin-5), IL-6(Interleukin-6), IL-7(Interleukin-7), IL-8(Interleukin-8), IL-10(Interleukin-10), IL-13(Interleukin-13), IL-15(Interleukin-15), INF-γ(Interferon-γ), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), MCP-2(Monocyte Chemoattractant Protein-2), MCP-3(Monocyte Chemoattractant Protein-3), CXCL9(Chemokine Ligand 9;MIG), CCL5(Chemokine Ligand 5;RANTES), TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α) 및 TNF-β(Tumor Necrosis Factor-β)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물 및 백기생 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
1) 진귤과피, 고사리삼 또는 백기생에 추출용매를 가하여 각각 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 각각 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 각각 감압 농축한 후 건조하여 분말을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 진귤과피, 고사리삼 또는 백기생은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있고, 당업계에 공지된 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서 제조될 수 있다. 또한, 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득할 수 있으며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 상기 추출용매는 진귤과피, 고사리삼 또는 백기생 각각 분량의 1 내지 20 배 첨가하여 추출할 수 있고, 구체적으로 5 내지 15 배 첨가하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출온도는 20 내지 70℃ 일 수 있고, 구체적으로 25 내지 65℃ 일 수 있으며, 보다 구체적으로 30 내지 60℃ 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 40 시간일 수 있고, 구체적으로 10 내지 30 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 추출물을 1 내지 5회 여과할 수 있다. 또한, 여과방법으로는 체 여과, 흡인여과, 한외여과, 필터프레스 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 조성물은 화장료 조성물, 약학 조성물, 또는 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 구체예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 일 구체예로 고점도 유화제형, 저점도 유화제형 및 가용화 제형으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제조하고자 하는 제형에 따라 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 화장료 조성물 배합 성분을 포함할 수 있다. 일 구체예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 선로션, 선크림, 메이크업 베이스, 비비크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스틱상 제품, 밤(Balm) 타입 제품, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 제조하고자 하는 제형에 따라 추가로 수상성분, 유상성분, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 점증제, 킬레이트제, 방부제, 향료 등을 선택하여 배합 첨가할 수 있다.
상기 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 피부외용 제형일 수 있다. 상기 피부외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 드링크제, 캬라멜, 다이어트바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 건강기능식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 최적의 성분을 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물, 백기생 추출물 각각 또는 이들의 혼합물은 총 조성물 중량 대비 0.001 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물, 백기생 추출물 각각 또는 이들의 혼합물이 총 조성물 중량 대비 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부 염증 완화효과가 나타나지 않으며, 30 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 염증 완화효과 증대 정도가 미미하고, 제형상의 안정성에 문제가 있으며, 경제적이지 않다.
본 발명의 일 구체예에서, 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물, 백기생 추출물 및 이의 혼합물이 대기의 유해환경인 황사 또는 미세먼지에 의해 유발된 NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 황사, 미세먼지 및 기타 유해물질에 의해 유발된 피부 염증 예방 및 개선에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 진귤과피 추출물, 고사리삼 추출물, 백기생 추출물 및 이의 혼합물이 임상 시험을 통해 미세먼지에 의해 유발된 피부 염증 개선에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 사용하여 피부 염증을 완화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 피부에 도포하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 피부 염증은 황사 또는 미세먼지가 피부에 접촉함으로써 발생할 수 있는 염증성 반응을 수반하는 모든 피부 염증성 질환을 제한 없이 포함할 수 있으며, 접촉성 피부염(Contact Dermatitis)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은, 상기 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 붉은 정도, 피부 홍반량 또는 경표피수분손실량을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 무도포 군에 비해 미세먼지액 도포 7일 후 i) 피부 붉은 정도를 약 20.0% 감소시키는 방법; ii) 피부 홍반량을 약 16.8%; 또는 iii) 경표피수분손실량을 약 33.2% 감소시키는 방법인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도포"는 어떠한 적절한 방법으로 개체의 피부에 본 발명에 따른 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통해 해당 조성물을 피부 내부로 흡수시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 천연식물 추출물은 황사 및 미세먼지의 의해 유발된 NO 생성 억제 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하므로, 황사, 미세먼지 및 기타 유해물질에 의해 유발된 피부 염증의 예방 또는 개선에 우수한 효과가 있다.
도 1 내지 3은 진귤과피 에탄올 추출물(도 1), 고사리삼 에탄올 추출물(도 2), 백기생 에탄올 추출물(도 3)의 황사, TSP, PM10, PM2.5에 의해 유발된 NO 생성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 6은 진귤과피 에탄올 추출물(도 4), 고사리삼 에탄올 추출물(도 5), 백기생 에탄올 추출물(도 6)의 황사, PM2.5에 의해 의해 유발된 IL-8 생성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7 내지 도 9는 진귤과피 에탄올 추출물(도 7), 고사리삼 에탄올 추출물(도 8), 백기생 에탄올 추출물(도 9)의 황사, TSP, PM10, PM2.5에 의해 의해 유발된 TNF-α 생성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10 내지 도 12는 진귤과피 에탄올 추출물(도 10), 고사리삼 에탄올 추출물(도 11), 백기생 에탄올 추출물(도 12)을 HPLC-UVD로 분석한 크로마토그램이다.
도 13은 백기생 에탄올 추출물에서 분리한 3종의 플라보노이드 배당체의 황사 및 미세먼지에 의한 NO 생성, IL-8 및 TNF-α 생성 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 황사 및 미세먼지의 종류에 따른 염증성 사이토카인의 생성여부를 알아보기 위해 실시한 사이토카인 어레이(Cytokine Array) 실험결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 하기의 실시예는 단지 본 발명의 예시적인 기재일 뿐으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 추출물의 제조
건조 분쇄된 진귤과피, 고사리삼, 백기생 50 g 각각에 70% 에탄올(정제수와 에탄올을 부피비 30:70으로 혼합)을 500 ml 가하고 상온에서 20시간 동안 진탕하며 추출하였다. 추출액을 여과하고 감압농축하여 에탄올을 제거한 다음 동결건조하여 진귤과피 에탄올 추출물을 17.9%, 고사리삼 에탄올 추출물을 18.3%, 백기생 에탄올 추출물을 15%의 수율로 수득하였다.
실시예 2. 황사 및 미세먼지 추출물의 제조
(1) 황사 및 미세먼지의 채취
2013년 3월 경기도 부천시에 설치된 로우볼륨에어샘플러(Low Volume Air Sampler)를 이용하였으며, 47 mm 테프론 필터가 장착된 샘플러(Sampler)에서 분당 16.7 L의 유속으로 24시간 동안 채취한 샘플을 이용하였다. 필터의 종류에 따라 황사, TSP, PM10, PM2.5로 구분하여 채취하였다.
(2) 황사 및 미세먼지 추출물의 제조
약 1 m2의 크기로 자른 필터에 증류수, 에탄올, 클로로포름을 각각 가하고 12시간 동안 교반하며 추출하였다. 추출액을 분리하고 추출잔사에 추출용매를 재차 가하여 다시 4시간 동안 초음파로 추출하였다. 추출액을 합하고 감압농축하여 추출용매를 증발시켜 제거한 다음 증류수, 에탄올로 추출한 샘플은 각각의 용매로 재용해하였고, 클로로포름으로 추출한 샘플은 DMSO에 용해하였다.
실험예 1. 황사 및 미세먼지 추출물의 염증유발능 평가
황사, TSP, PM10, PM2.5 추출물이 세포에서 염증을 유발하는 것을 확인하기 위해 아래와 같은 실험을 진행하였다.
(1) NO 생성유발 평가
NO는 전염증 매개 물질로 다양한 염증성 자극에 의해 생성되며, 연속적인 염증 반응을 유발하고 조직 손상에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 황사 및 미세먼지 추출물이 NO 생성을 유발하는지 확인하였다. Raw 264.7 cell을 96 웰 플레이트(Well Plate)에 6 x 104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 황사, TSP, PM10, PM2.5 시료를 농도별로 희석하여 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 그리스 시약(Griess Reagent)과 1:1로 혼합하고 마이크로플레이트리더기(Microplate Reader)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성을 측정하였고, 이 때, NO 생성을 유발하기 위한 샘플의 Raw 264.7 cell에 대한 세포독성은 발견되지 않았다.
하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 황사, TSP, PM10, PM2.5 증류수 추출물이 피부 염증 반응을 유발하는 것을 확인하였다. 추출 용매 별로는 증류수로 추출하였을 때, NO 생성을 가장 많이 유발시키는 것으로 나타났다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000001
(2) 염증성 사이토카인 IL-8, TNF -α. IL- 1α , IL-2, IL-6, GRO -α, GM- CSF 생성유발 평가
IL-8, TNF-α, IL-1α, IL-2, IL-6, GRO-α, GM-CSF는 대표적인 염증성 사이토카인으로, 황사 및 미세먼지 추출물이 TNF-α와 IL-8의 생성을 유발하는 것을 확인하고자 다음 방법과 같이 수행하였다. 96 웰 플레이트(Well Plate)에 HaCaT을 2.5x104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 황사, TSP, PM10, PM2.5 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 24시간 후, 배양액을 취하여 IL-1α, IL-2, IL-6, GRO-α, GM-CSF, IL-8과 TNF-α의 정량에 대한 ELISA 키트(Kit)를 이용하여 이들 사이토카인 생성유발능을 평가하였으며, 이에 대한 결과는 표 2 내지 4에 나타내었다. 이 때, IL-1α, IL-2, IL-6, GRO-α, GM-CSF, IL-8과 TNF-α의 생성을 유발하기 위한 샘플의 HaCaT cell에 대한 세포독성은 발견되지 않았다.
하기 표 2와 3에서 나타난 바와 같이, IL-8의 경우 황사와 PM2.5만이 생성을 유발시켰으며 황사는 증류수로 추출하였을 때 가장 많이 유발되었다. TNF-α의 경우 클로로포름으로 추출한 황사, TSP 및 PM10과 증류수로 추출한 PM2.5가 생성을 많이 유발시키는 것임을 확인하였다.
표 4에서 나타난 바와 같이, 증류수로 추출한 황사, PM10, PM2.5, TSP 추출물에 의해 IL-1α, IL-2, IL-6, GM-CSF가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 GRO-α의 경우, 황사와 PM2.5의 증류수 추출물만이 생성을 유발시키는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000002
Figure PCTKR2016010037-appb-T000003
Figure PCTKR2016010037-appb-T000004
실험예 2. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 추출물의 세포독성 확인
진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물이 세포 독성이 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험하였다. Raw 264.7 cell 및 HaCaT cell 을 6.0 x 104 cells/well, 2.5 x 104 cells/well로 분주한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 50~1,600 ㎍/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 WST-1 용액을 처리하고 반응시켜 마이크로플레이트리더기(Microplate Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포생존율을 확인하였으며, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물에 대한 결과를 하기 표 5 내지 7에 나타내었다.
하기 표 5 내지 7에 나타난 바와 같이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물은 50~400 ㎍/ml에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000005
Figure PCTKR2016010037-appb-T000006
Figure PCTKR2016010037-appb-T000007
실험예 3. 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 추출물의 황사 및 미세먼지에 의해 유발된 염증 완화능 평가
(1) 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 NO 생성억제능 평가
상기 실험예 1에서 황사, TSP, PM10, PM2.5가 세포 내 NO 생성을 유발시키는 것을 확인하였으며, 그 결과 각 샘플에 대한 증류수 추출물이 가장 많이 NO 생성을 유발시켰기 때문에, 100배 희석한 황사, TSP, PM10, PM2.5 증류수 추출물을 자극 유발제로 사용하고 진귤과피, 고사리삼, 백기생 추출물을 세포 독성이 없는 농도인 100~400 ㎍/ml로 처리하여 NO 생성억제능을 다음과 같은 방법으로 평가하였다. 일반적으로 피부를 진정시켜주고 항염작용이 뛰어난 것으로 알려진 마치현 추출물을 염증 완화효과에 대한 양성대조군으로 함께 처리하였다.
Raw 264.7 cell을 96 웰 플레이트(Well Plate)에 6 x 104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 100, 200, 400 ㎍/ml의 농도로 처리하고 황사, TSP, PM10, PM2.5 증류수 추출물을 100배 희석하여 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 그리스 시약(Griess Reagent)과 1:1로 혼합하고 마이크로플레이트리더기(Microplate Reader)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성을 측정하였고, 대기의 유해물질인 황사, TSP, PM10, PM2.5만 처리한 군을 대조군으로 하였을 때 NO 생성량을 감소시키는 정도에 대한 진귤과피, 고사리삼, 백기생, 마치현 에탄올추출물의 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.
도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성 억제효과를 나타내었고 동일한 농도에서 마치현 추출물보다도 더 우수한 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물이 효과적으로 전염증성 매개인자인 NO를 억제할 수 있음을 확인하였다.
또한, NO 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라, 황사 및 TSP에 대해서는 백기생 에탄올 추출물이, PM10에 대해서는 고사리삼 에탄올 추출물이, PM2.5에 대해서는 진귤과피 및 백기생 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다.
(2) 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 사이토카인 생성억제능 평가
상기 실험예 1에서 나타난 바와 같이 IL-8와 GRO-α의 경우 증류수로 추출한 황사 추출물과 PM2.5 추출물이 생성을 유발시켰으며, TNF-α의 경우 클로로포름으로 추출한 황사, TSP 및 PM10 추출물과 증류수로 추출한 PM2.5 추출물이 생성을 유발시켰다. 또한, IL-1α, IL-2, IL-6, GM-CSF의 경우 증류수로 추출한 황사, PM10, PM2.5, TSP 추출물이 생성을 유발시켰다. 따라서, 100배 희석한 황사 및 PM2.5 증류수 추출물을 IL-8와 GRO-α에 대한 자극 유발제로, 100배 희석한 황사, TSP 및 PM10 클로로포름 추출물과 100배 희석한 PM2.5의 증류수 추출물을 TNF-α에 대한 자극 유발제로 사용하였고, 나머지 사이토카인인 IL-1α, IL-2, IL-6, GM-CSF에 대한 자극 유발제로는 황사, PM10, PM2.5, TSP의 1OO배 희석한 증류수 추출물을 사용하였다. 상기 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 100~400 ㎍/ml로 처리하여 염증성 사이토카인 생성억제능을 다음과 같이 평가하였다.
96 웰 플레이트(Well Plate)에 HaCaT을 2.5x104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 각 사이토카인에 상기의 자극 유발제를 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 취하여 IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, GRO-α, GM-CSF, TNF-α의 정량에 대한 ELISA 키트(Kit)를 이용하여 이들 사이토카인을 정량하였다.
IL-8, TNF-α의 경우 추가적으로 일반적으로 피부를 진정시켜주고 항염작용이 뛰어난 것으로 알려진 마치현 추출물을 염증 완화효과에 대한 양성대조군으로 함께 처리하였고 대기의 유해물질인 황사, TSP, PM10, PM2.5만 처리한 군을 대조군으로 하였을 때 IL-8, TNF-α의 생성량을 감소시키는 정도에 대한 결과를 도 4 내지 9로 나타내었다.
IL-1α, IL-2, IL-6, GRO-α, GM-CSF의 경우, 무처리군, 대기의 유해물질인 황사, TSP, PM10, PM2.5만 처리한 군과 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 100, 200, 400 ㎍/ml의 농도로 처리한 군의 IL-1α, IL-2, IL-6, GRO-α, GM-CSF 생성량을 측정하여 하기 표 8 내지 12로 나타내었다.
도 4 내지 9에 나타낸 바와 같이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 IL-8 및 TNF-α 생성 억제효과를 나타내었고 동일한 농도에서 마치현 추출물 보다도 우수한 효과를 나타내었다. 또한 하기 표 8 내지 12에 나타낸 바와 같이, 대기의 유해물질로 인해 증가된 IL-1α, IL-2, IL-8, GRO-α에서도 고사리삼, 백기생 및 진귤과피 에탄올 추출물에 의해 농도 의존적으로 생성량이 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 고사리삼 및 백기생 에탄올 추출물이 효과적으로 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, GRO-α, GM-CSF 및 TNF-α를 억제할 수 있음을 확인하였다. 진귤과피의 경우 IL-6 실험 진행에 문제가 있어 결과를 얻지 못하였으며, IL-6을 제외한 염증성 사이토카인인 IL-1α, IL-2, IL-8, GRO-α, GM-CSF 및 TNF-α를 억제할 수 있음을 확인하였다.
IL-8 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라, 황사에 대해서는 고사리삼 에탄올 추출물이, PM2.5에 대해서는 고사리삼 및 백기생 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다. TNF-α 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라, 황사에 대해서는 진귤과피 에탄올 추출물이, TSP, PM10, PM2.5에 대해서는 고사리삼 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다. IL-1α 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라, PM2.5, TSP에 대해서는 고사리삼 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다. IL-2 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라 황사, PM10에 대해서는 고사리삼과 진귤과피 에탄올 추출물이, PM2.5, TSP에 대해서는 고사리삼 에탄올 추출물이 상대적으로 우수함을 확인하였다. IL-6 및 GRO-α 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 모든 대기의 유해물질에 대하여 고사리삼 에탄올 추출물이 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다. IL-6 생성 억제 효과에 있어서 고사리삼 에탄올 추출물의 효과가 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다. GM-CSF 생성 억제 효과에 있어서, 동일한 농도에서 모든 대기의 유해물질에 대하여 진귤과피 에탄올 추출물의 효과가 다른 추출물에 비해 상대적으로 우수함을 확인하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000008
Figure PCTKR2016010037-appb-T000009
Figure PCTKR2016010037-appb-T000010
Figure PCTKR2016010037-appb-T000011
Figure PCTKR2016010037-appb-T000012
실험예 4. 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 추출물의 혼합물의 황사 및 미세먼지에 의해 유발된 염증 완화능 평가
상기 실험예 3에서 확인된 바와 같이, 대기의 유해물질과 염증성 사이토카인에 따라 진귤과피, 고사리삼, 백기생 추출물의 효과는 우열이 존재하므로, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 추출물의 혼합물을 사용할 경우 모든 대기의 유해물질에 의해 생성 유발되는 염증성 사이토카인에 대해 효과를 발휘할 수 있을 것으로 판단하여, 혼합물에 대한 NO 생성억제능 및 염증성 사이토카인 생성억제능 실험을 진행하였다. 또한 혼합물의 상승효과를 확인하고자 동일 용량으로 각 추출물에 대하여서도 실험을 진행하였다.
(1) 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 혼합물의 NO 생성억제능 평가
상기 실험예 3(1)에서 사용한 동일한 100배 희석한 증류수 추출물을 NO에 대한 자극 유발제로 사용하였고, 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물을 동일 비율로 혼합(이하, 1:1:1 혼합물)하거나 진귤과피 에탄올 추출물을 고사리삼 및 백기생 에탄올 추출물에 비해 2배 비율로 혼합(이하, 2:1:1 혼합물)한 혼합물을 각각 제조하여 사용하였다. 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물과 혼합물의 농도는 52.5 ㎍/ml, 105 ㎍/ml, 210 ㎍/ml로 처리하여 NO 생성억제능을 다음과 같은 방법으로 평가하였다.
96 웰 플레이트(Well Plate)에 HaCaT을 2.5x104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물과 혼합물을 52.5, 105, 210 ㎍/ml의 농도로 처리하고 황사, PM10, PM2.5 및 TSP 증류수 추출물을 100배 희석하여 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 취하여 NO assay 이용하여 NO량을 정량하였으며, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 혼합물에 대한 결과를 하기 표 13으로 나타내었다.
하기 표 13에서 나타낸 바와 같이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 혼합물은 농도 의존적으로 NO 생성 억제효과를 나타내었으며, 기존 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물과 혼합물이 동일한 NO 생성 억제 경향을 확인하였다. 동일 농도에서는 1:1:1 혼합물 보다 2:1:1 혼합물이 효과가 우수한 경향을 보였다. 또한, NO 생성 억제 효과에 있어서 동일한 농도에서 TSP에 대해서는 혼합물이 단일 추출물 보다 효과가 우수함을 확인하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000013
(2) 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 혼합물의 사이토카인 생성억제능 평가
상기 실험예 1 에서 나타난 바와 같이, 100배 희석한 황사 및 PM2.5 증류수 추출물을 IL-8와 GRO-α에 대한 자극 유발제로, 100배 희석한 황사, TSP 및 PM10 클로로포름 추출물과 100배 희석한 PM2.5의 증류수 추출물을 TNF-α에 대한 자극 유발제로 사용하였고, IL-1α, IL-2, GM-CSF에 대한 자극 유발제로는 황사, PM10, PM2.5, TSP의 증류수 추출물을 사용하였다. 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물의 1:1:1 혼합물과 2:1:1 혼합물을 각각 제조하여 사용하였다. 고사리삼, 백기생, 진귤과피 에탄올 추출물과 혼합물의 농도는 52.5 ㎍/ml, 105 ㎍/ml, 210 ㎍/ml로 처리하여 염증성 사이토카인 생성억제능을 다음과 같이 평가하였다.
96 웰 플레이트(Well Plate)에 HaCaT을 2.5x104 cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물과 혼합물을 52.5, 105, 210 ㎍/ml의 농도로 처리하고 각 사이토카인에 상기의 자극 유발제를 처리한 후, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 취하여 IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, GRO-α, GM-CSF, TNF-α의 정량에 대한 ELISA 키트(Kit)를 이용하여 이들 사이토카인을 정량하였으며, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물과 혼합물에 대한 결과를 하기 표 14 내지 19으로 나타내었다.
하기 표 14 내지 19에 나타낸 바와 같이, 진귤과피 에탄올 추출물의 영향이 큰 IL-6를 제외한 IL-1α, IL-2, IL-8, GRO-α, GM-CSF, TNF-α에서는 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물의 혼합물은 농도 의존적으로 생성 억제효과를 나타내었으며, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물 단일과 혼합물이 동일한 사이토카인 생성 억제 경향을 가짐을 확인하였다. 동일 농도에서는 1:1:1 혼합물 보다 2:1:1 혼합물이 효과가 우수한 경향을 보였다. 또한 동일한 농도에서 각 대기의 유해물질에 따라, IL-1α의 황사, TNF-α, IL-2, GM-CSF의 PM10, IL-1α, IL-2의 TSP에서 단일 추출물보다 혼합물에서 상대적으로 효과가 우수함을 확인하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000014
Figure PCTKR2016010037-appb-T000015
Figure PCTKR2016010037-appb-T000016
Figure PCTKR2016010037-appb-T000017
Figure PCTKR2016010037-appb-T000018
Figure PCTKR2016010037-appb-T000019
실험예 5. 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 추출물의 활성물질 분리 및 동정
(1) 진귤과피 에탄올 추출물의 활성물질 분리 및 동정
실시예 1을 통해 수득한 진귤과피 에탄올 추출물을 아세토니트릴, 증류수의 농도구배 조건에서 지름 4.6mm, 길이 25cm의 C18 칼럼을 이용해 HPLC-UVD 280nm에서 분석한 크로마토그램을 도 10에 나타내었고, 4개의 major peak에 대해 HPLC-ESI-MS를 통한 분광학적 데이터를 분석하여 각각의 peak가 헤스페리딘(Hesperidine)(peak 번호 1), 테트라메틸-O-아이소스쿠텔라레인(Tetramethyl-O-Isoscutellarein)(peak 번호 2), 노비레틴(Nobiletin)(peak 번호 3) 및 탄게레틴(Tangeretin)(peak 번호 4)임을 확인하였다.
(2) 고사리삼 에탄올 추출물의 활성물질 분리 및 동정
실시예 1을 통해 수득한 고사리삼 에탄올 추출물을 메탄올, 증류수의 농도구배 조건에서 지름 4.6mm, 길이 10cm의 C18 칼럼을 이용해 HPLC-UVD 350nm에서 분석한 크로마토그램을 도 11에 나타내었고, 4개의 major peak에 대해 HPLC-ESI-MS를 통한 분광학적 데이터를 분석하여 플라보노이드 배당체를 동정하였으며, 하기의 표 20에 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000020
(3) 백기생 에탄올 추출물의 활성물질 분리 및 동정
실시예 1을 통해 수득한 백기생 에탄올 추출물을 아세토니트릴, 증류수의 농도구배 조건에서 지름 3.9mm, 길이 30cm의 C18 칼럼을 이용해 HPLC-UVD 330nm에서 분석한 크로마토그램을 도 12에 나타내었고, 3개의 major peak에 대해 HPLC-ESI-MS, MS/MS를 통한 분광학적 데이터와 기존 문헌(Ferreres et al., 2003, Parejo et al., 2004)을 비교 분석하여 루세닌-2(Lucenin-2)(peak 번호 1), 비세닌-2(Vicenin-2)(peak 번호 2), 스텔라린-2(Stellarin-2)(peak 번호 3)의 3가지 플라보노이드 배당체를 동정 및 분리하였으며 그 화학구조식을 화학식 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-C000001
실험예 6. 백기생 에탄올 추출물로부터 분리한 활성물질의 황사 또는 미세먼지에 의해 유발된 염증 완화능 평가
백기생 에탄올 추출물로부터 분리한 3종의 플라보노이드 배당체가 이들 항염증 효과를 나타내는 주요성분인지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
Raw 264.7 cell과 HaCaT cell을 24시간 배양하고 각 물질을 세포독성이 나타나지 않는 농도 범위인 125~1000㎍/ml로 처리하였다. 이어서 황사 증류수 추출물과 황사 클로로포름 추출물을 100배 희석하여 처리하고 다시 24시간동안 배양하였다. 실험예 3과 같이 NO, IL-8 및 TNF-α 생성억제 효과를 측정하였고 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서 나타낸 바와 같이, 백기생 에탄올 추출물로부터 분리한 3종의 플라보노이드 배당체는 농도 의존적으로 NO, IL-8 및 TNF-α 생성 억제효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해 백기생 에탄올 추출물로부터 분리한 3종의 플라보노이드 배당체가 효과적으로 NO, IL-8 및 TNF-α를 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 황사 및 미세먼지에 의한 기타 염증성 사이토카인 생성여부 확인
상기 실험예 1에서 확인한 황사 및 미세먼지에 의해 생성되는 염증성 사이토카인 외에 어떠한 사이토카인들이 추가로 생성되는지, 황사 및 미세먼지의 종류에 따라 어떻게 달라지는지 알아보기 위해 cytokine array 실험을 진행하였다. 6 웰 플레이트(Well Plate)에 HaCaT을 2.0x105cells/well로 분주한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 황사, TSP, PM2.5 증류수 추출물을 100배 희석하여 각각 처리하고 24시간 추가로 배양한 후 배양액을 취하고 인간 사이토카인 항체 에레이 키트(Human Cytokine Antibody Array Kit, Raybiotech)을 이용하여 G-CSF(Granulocyte Colony Stimulating Factor), GM-CSF(Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor), GRO(Growth-Regulated Protein), GRO-α (Growth-Regulated Protein-α), IL-1α(Interleukin-1α), IL-2(Interleukin-2), IL-3(Interleukin-3), IL-5(Interleukin-5), IL-6(Interleukin-6), IL-7(Interleukin-7), IL-8(Interleukin-8), IL-10(Interleukin-10), IL-13(Interleukin-13), IL-15(Interleukin-15), INF-γ(Interferon-γ), MCP-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1), MCP-2(Monocyte Chemoattractant Protein-2), MCP-3(Monocyte Chemoattractant Protein-3), CXCL9(Chemokine Ligand 9;MIG), CCL5(Chemokine Ligand 5;RANTES), TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α) 및 TNF-β(Tumor Necrosis Factor-β)에 대한 생성량을 측정하였다.
황사, TSP, PM2.5 증류수 추출물이 처리되지 않은 대조군 대비 각 사이토카인의 생성율 결과를 표 21과 도 14에 나타내었다. 양성 대조군(Positive Control)에는 실험이 잘 진행되었는지를 확인하기 위한 비오틴화된 항체(Biotinylated Antibody)가 처리되어 있었으며, 음성 대조군(Negative control)에는 반응 기저(Response Baseline)을 알아보기 위한 완충액(Buffer)만 처리되어 있었고, 블랭크(Blank)에는 배경 반응(Background Response)를 알아보기 위해 아무것도 처리되어 있지 않았다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000021
* 상기표의 수치는 대조군 100 대비 각 사이토카인의 생성율을 나타냄
표 21 및 도 14에 나타난 바와 같이 황사 추출물은 G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO-α, IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, MCP-1의 생성량, TSP 추출물은 G-CSF, GM-CSF, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-15, MCP-2의 생성량, PM2.5 추출물은 G-CSF, GM-CSF, GRO. GRO-α, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL-15, MCP-2 및 TNF-α의 생성량을 대조군에서의 생성량에 비해 증가시키는 것으로 나타났다.
이를 통해 황사와 미세먼지의 종류에 따라 서로 다른 사이토카인 생성이 일어나는 것으로 확인하였다. 이는 자극유발물질에 따라 성격이 다른 염증반응이 일어난다는 것을 말하며 황사 및 미세먼지에 의해 유발된 염증반응이 일반 염증반응과도 분명한 차이가 있음을 의미한다.
제조예 : 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 포함하는 화장료 조성물
상기의 실험예를 근거로 하여, 하기 표 22 내지 33에서 기재된 조성대로 실시예 1에서 수득한 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 포함하는 여러 제형의 화장료 조성물을 제조하였다. 하기 제형예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 예시로서, 본 발명이 하기 예시에만 한정되는 것은 아니다.
상기 실험예에서 확인하였듯이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물은 염증원인이 되는 각 대기의 유해물질(황사, TSP, PM10, PM2.5)에 따라 NO 생성 및 염증성 사이토카인 생성 억제에 있어 상대적인 효과의 차이가 존재한다. 따라서, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 모두 혼합한 혼합물을 포함하는 화장료 조성물을 제조할 수 있다.
제형예 1. 고점도 유화 제형
실시예 1에서 얻은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 각각 또는 모두 함유하는 혼합물의 고점도 유화 제형을 하기의 표 22 내지 25에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.
<고점도 유화 제형의 제조방법>
① 수상과 유상을 가온하여 각각 균일하게 혼합 및 용해시켰다.
② 75℃에서 수상에 유상을 넣고 혼합시켜 가용화시켰다
③ 첨가상 I은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물 각각 또는 모두 함유하는 혼합물을 용해시킨 상으로서, 50℃에서 상기 ②의 혼합 상에 첨가상 I을 투입하고 혼합시킨 후 첨가상 II를 혼합하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000022
Figure PCTKR2016010037-appb-T000023
Figure PCTKR2016010037-appb-T000024
Figure PCTKR2016010037-appb-T000025
제형예 2. 저점도 유화 제형
실시예 1에서 얻은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 각각 또는 모두 함유하는 혼합물의 저점도 유화 제형을 하기의 표 26 내지 29에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.
<저점도 유화 제형의 제조방법>
① 수상과 유상을 가온하여 각각 균일하게 혼합 및 용해시켰다.
② 75℃에서 수상에 유상을 넣고 혼합시켜 가용화시켰다
③ 첨가상 I은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물 각각 또는 모두 함유하는 혼합물을 용해시킨 상으로서, 50℃에서 상기 ②의 혼합 상에 첨가상 I을 투입하고 혼합시킨 후 첨가상 II를 혼합하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000026
Figure PCTKR2016010037-appb-T000027
Figure PCTKR2016010037-appb-T000028
Figure PCTKR2016010037-appb-T000029
제형예 3. 가용화 제형
실시예 1에서 얻은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 각각 또는 모두 함유하는 혼합물의 가용화 제형을 하기의 표 30 내지 33에 나타낸 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.
<가용화 제형의 제조방법>
① 수상과 가용화상을 각각 균일하게 혼합 및 용해시켰다.
② 수상에 가용화상을 넣고 혼합시켜 수중유형 유화를 얻었다.
③ 첨가상 I은 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 각각 또는 모두 함유하는 혼합물을 용해시킨 상으로서, 가용화 한 후 상기 ②의 혼합 상에 첨가상 I을 투입하여 혼합시킨 후 첨가상 II를 혼합하여 완료하였다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000030
Figure PCTKR2016010037-appb-T000031
Figure PCTKR2016010037-appb-T000032
Figure PCTKR2016010037-appb-T000033
실험예 7. 화장료 조성물의 제형 안정성(Stability)
상기 제형예 1, 2, 3의 화장료 조성물을 4℃, 30℃, 45℃, 일광의 조건에 12주 동안 보관하며, 육안평가와 관능평가를 통해 제형의 색, 취, 성상변화를 관찰하여 표 34 내지 36에 나타내었다.
표 34 내지 36에 나타난 바와 같이, 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 각각 또는 모두 함유하는 혼합물의 고점도 유화 제형, 저점도 유화 제형, 가용화 제형 화장료 조성물을 고온 및 일광조건에서 장기간 보관하여도 변색, 변취 및 성상 변화가 나타나지 않는 우수한 안정성을 확인하였다.
<안정성 평가 기준>
변화 무: ○
약간의 변화: △
유의적 변화: Ｘ
Figure PCTKR2016010037-appb-T000034
Figure PCTKR2016010037-appb-T000035
Figure PCTKR2016010037-appb-T000036
실험예 8. 황사 또는 미세먼지에 의한 피부자극 유발 후 진귤과피 , 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 자극완화 유효성 임상 평가
진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 유효성 평가를 위하여 1차 및 2차로 2번에 나누어 임상 평가를 진행하였다. 1차 시험은 총 20명(남성 11명, 여성 9명)으로 2차 시험은 총 22명(남성 9명, 여성 13명)으로 수행하였다.
1차 시험으로 황사 또는 미세먼지로부터 피부 염증 반응이 유발되는지 확인하기 위하여, 쇼듐 라우릴 설페이트액(Sodium Lauryl Sulfate, SLS))과 SLS+미세먼지액을 각각 다른 부위에 도포하여 도포 전, 도포 1일 후, 도포 2일 후에 피부 염증 반응 발생 유무를 확인할 있는 요소인 피부 붉은 정도(a*)변화를 측정하였다.
2차 시험으로 황사 또는 미세먼지로부터 유발된 피부 염증에 대해 본 발명의 천연식물 추출물을 포함하는 조성물이 효과가 있는지 확인하기 위하여, SLS+미세먼지액과 SLS+미세먼지액+시험제품을 각각 다른 부위에 도포하여, 사용 1일 후, 사용 2일 후, 사용 7일 후에 피부 염증 반응 발생 유무를 확인할 있는 요소인 피부 붉은 정도(a*), 홍반량피부 홍반량(E.I), 경표피수분손실량(TEWL)을 측정하였다.
1차 및 2차 시험에서, SLS는 와코사(Wako Inc, Japan)에서 제조한 98% 농도 제품을 사용하였으며, 미세먼지액은 실시예 2에서 제조한 것으로 황사 추출물, TSP 추출물, PM2.5 추출물, PM10 추출물을 100 내지 500배 희석한 것을 사용하였다. 시험 제품으로는 상기 제형예 1의 표 25의 진귤과피, 고사리삼, 백기생 에탄올 추출물을 포함하는 화장료 조성물 사용하였다. 상기 1차 시험의 도포는 피험자의 왼쪽 이두근 부위에 상기 2차 시험의 도포는 피험자의 오른쪽 이두근 부위에 수행하였다.
1차 실험의 경우 총 4회 방문하였으며, 방문 1은 제품 사용 전 측정, 피부 손상 패치 부착 작업을 수행하고 방문 2는 패치 제거, 손상 유도 직후 피부 측정, 미세먼지액을 도포하는 작업을 수행하고, 방문 3은 미세먼지액 도포 1일 후 측정을 수행하고, 방문 4는 미세먼지액 도포 2일 후 측정,이상반응을 확인을 수행하였다.
2차 실험의 경우 총 5회 방문하였으며, 방문 1은 제품 사용 전 측정, 피부 손상 패치 부착 작업을 수행하고, 방문 2는 패치 제거, 손상 유도 직후 피부 측정, 미세먼지액 도포, 제품 도포를 수행하고, 방문 3은 미세먼지액 도포 1일 후 측정을 수행하고, 방문 4는 미세먼지액 도포 2일 후 측정을 수행하고, 방문 5는 미세먼지 도포 7일 후 측정, 이상반응을 확인을 수행하였다.
실험예 8-1. 미세먼지액 도포를 통한 미세먼지로부터 피부 염증 반응 유발 여부 확인(1차 시험)
(1) 피부 붉은 정도(a*) 변화 확인
SLS 도포 및 SLS+미세먼지액 도포에 의한 피부 붉은 정도의 변화를 확인하기 위하여 도포 전, 도포 직후, 도포 1일 후, 도포 2일 후의 피부색을 측정기인 크로마 미터 CM700d(Chroma Meter CM700d, Konica Minolta Sensing Americas, Inc, USA)를 이용하여 측정하였다 매 측정 시마다 동일한 부위에 대한 피부 붉은 정도를 3회씩 측정하여 그 평균값을 평가 자료로 사용하였다. 상기 피부 붉은 정도는 인간의 색 지각을 바탕으로 한 CIE L*a*b* 색공간에서 붉은 정도를 나타내는 a* 값을 측정하여 나타내었다. a* 값이 증가하는 경우 시각적으로 더 붉은 것을 의미한다. 피험자 20명에 대한 피부 붉은 정도 측정 결과를 평균값±표준편차(Standard Error, SE)로 표시하여 하기 표 37로 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000037
*: p<0.05 정규성 검정에 따라 모수적 방법인 ANOVA로 반복하여 측정한 비모수적검정의 사후 검정결과
#: p<0.025 정규성 검정에 따라 비모수적 방법인 Friedman test로 검정하고 비모수적 검정방법으로 사후 검정한 결과
+: p<0.05 독립표본 t 검정결과
표 37에서 나타난 바와 같이, SLS 도포 및 SLS+미세먼지액 도포 측정값이 도포 1일 후 유의하게 증가(p<0.025, p<0.05) 하였으며, SLS+미세먼지액 도포는 도포 2일 후에도 유의하게 증가(p<0.05)하였다. SLS+미세먼지액 도포는 SLS 도포와 비교하여 미세먼지 도포 1일 후, 2일 후 유의하게 높음(p<0.05)을 확인할 수 있었다.
따라서, 미세먼지액을 추가 도포한 경우가 SLS 도포에 비해 유의하게 피부 붉은 정도가 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 황사 또는 미세먼지(TSP, PM2.5, PM10)를 포함하는 미세먼지액이 유의하게 염증 반응 요소인 피부 피부 붉은 정도 증가됨을 확인하였다.
실험예 8-2. 미세먼지로부터 유발된 피부 염증에 대해 본 발명의 천연식물 추출물을 포함하는 조성물이 효과 확인(2차 시험)
상기 실험예 8-1의 피부 붉은 정도(a*) 변화에서 확인한 바와 같이 미세먼지액에 의해 피부에 유의적인 염증 반응이 나타남을 확인하였으며, 이하 본 발명의 천연식물 추출물이 미세먼지로부터 유발된 피부 염증에 대해 효과가 있는지 임상시험을 수행하였다.
(1) 피부 붉은 정도(a*) 변화 확인
SLS+미세먼지액 도포 및 SLS+미세먼지액+시험제품 도포에 의한 피부 붉은 정도의 변화를 확인하기 위하여 도포 전, 도포 직후, 도포 1일 후, 도포 2일 후, 도포 7일 후의 피부색 측정기인 크로마 미터 CM700d(Chroma Meter CM700d)를 이용하여 측정하였다. 매 측정 시마다 동일한 부위에 대한 피부 붉은 정도를 3회씩 측정하였다. 피험자 22명에 대한 피부 붉은 정도 측정 결과를 평균값±표준편차(Standard Error, SE)로 표시하여 하기 표 38로 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000038
*: p<0.05 정규성 검정에 따라 모수적 방법인 ANOVA로 반복하여 측정한 비모수적검정의 사후 검정결과
#: p<0.025 정규성 검정에 따라 비모수적 방법인 Friedman test로 검정하고 비모수적 검정방법으로 사후 검정한 결과
+: p<0.05 독립표본 t 검정결과
표 38에서 나타난 바와 같이, SLS + 미세먼지액 도포, SLS+미세먼지액+시험제품 도포 측정값이 도포 1일 후 유의하게 증가(p<0.05)했고, SLS+미세먼지액+시험제품도포에서 사용 7일 후 유의하게 감소(p<0.05)하였다. SLS+미세먼지액+시험제품 도포는 SLS + 미세먼지액 도포와 비교하여 미세먼지 도포 7일 후 유의하게 감소(p<0.05)함을 확인할 수 있었다.
따라서, 시험제품을 추가 도포한 경우가 유의하게 피부 붉은 정도를 감소시킴을 확인하였으며, SLS + 미세먼지액 도포와 비교하였을 때 SLS+미세먼지액+시험제품 도포한 경우가 도포 7일 후 약 20.0% 감소시킴을 확인하였다.
(2) 피부 홍반량(E.I) 변화 확인
SLS+미세먼지액 도포 및 SLS+미세먼지액+시험제품 도포에 의한 피부 홍반량의 변화를 확인하기 위하여 도포 전, 도포 직후, 도포 1일 후, 도포 2일 후, 도포 7일 후의 피부 홍반량을 멕사미터(Mexameter, Courage+Khazaka Electronic GmbH, Germany)라는 좁은 영역의 파장만을 이용하는 피부색 측정기(Narrow-band reflectance spectrophotometer)로 프로브(probe)에서 568nm(녹색), 660nm(적색), 880nm(근적외선)의 반사 빛을 이용하여 피하의 헤모글로빈의 양을 측정하였다. 매 측정 시마다 동일한 부위에 대한 피부 홍반량(E.I)를 3회씩 측정하여 그 평균값을 평가 자료로 사용하였다. 피험자 22명에 대한 피부 홍반량 변화 측정 결과를 평균값±표준편차(Standard Error, SE)로 표시하여 하기 표 39로 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000039
*: p<0.05 정규성 검정에 따라 모수적 방법인 ANOVA로 반복하여 측정한 비모수적검정의 사후 검정결과
#: p<0.025 정규성 검정에 따라 비모수적 방법인 Friedman test로 검정하고 비모수적 검정방법으로 사후 검정한 결과
+: p<0.05 독립표본 t 검정결과
표 39에 나타난 바와 같이, SLS+미세먼지 도포, SLS+미세먼지+시험제품 도포 측정값이 도포 1일 후, 2일 후 유의하게 증가(p<0.05)했고, SLS+미세먼지 도포에서 사용 7일 후에도 유의하게 증가(p<0.05) 하였다. SLS+미세먼지액+시험제품 도포는 SLS+미세먼지도포와 비교하여 미세먼지 도포 7일 후 유의하게 감소(p<0.05)함을 확인할 수 있었다.
따라서, 시험제품을 추가 도포한 경우가 유의하게 피부 홍반량(E.I)을 감소시킴을 확인하였으며, SLS + 미세먼지액 도포와 비교하였을 때 SLS+미세먼지액+시험제품 도포한 경우가 도포 7일 후 약 16.8% 감소시킴을 확인하였다.
(3) 경표피수분손실량 ( TEWL ) 변화 확인
SLS+미세먼지액 도포 및 SLS+미세먼지액+시험제품 도포에 의한 경표피수분손실량(TEWL)의 의 변화를 확인하기 위하여 도포 전, 도포 직후, 도포 1일 후, 도포 2일 후, 도포 7일 후의 경표피수분손실량(TEWL)을 수분증산계(Vapometer, Delfin Technologies Ltd, Finland)를 이용하여 측정하였다. 매 측정 시마다 동일한 부위에 대한 경표피수분손실량(TEWL)을 3회씩 측정하여 그 평균값을 평가 자료로 사용하였다. 피험자 22명에 대한 피부 경표피수분손실량 변화 측정 결과를 평균값±표준편차(Standard Error, SE)로 표시하여 하기 표 40로 나타내었다.
Figure PCTKR2016010037-appb-T000040
*: p<0.05 정규성 검정에 따라 모수적 방법인 ANOVA로 반복하여 측정한 비모수적검정의 사후 검정결과
#: p<0.025 정규성 검정에 따라 비모수적 방법인 Friedman test로 검정하고 비모수적 검정방법으로 사후 검정한 결과
+: p<0.05 독립표본 t 검정결과
**: p<0.05 맨-휘트니 U 검정결과
표 40에 나타난 바와 같이, SLS+미세먼지액 도포 측정값이 도포 1일 후 유의하게 증가(p<0.025)했고, 도포 2일 후, 도포 7일 후에 유의하게 감소(p<0.025)하였다. SLS+미세먼지액+시험제품 도포 측정값이 도포 2일 후, 7일 후 유의하게 감소(p<0.025)하였다. SLS+미세먼지액+시험제품 도포는 SLS+미세먼지도포와 비교하여 미세먼지 도포 2일 후, 7일 후 유의하게 경표피수분손실량(TEWL) 감소(p<0.05)시킴을 확인할 수 있었다.
따라서, 시험제품을 추가 도포한 경우가 유의하게 경표피수분손실량(TEWL)을 감소시킴을 확인하였으며, SLS + 미세먼지액 도포와 비교하였을 때 SLS+미세먼지액+시험제품 도포한 경우가 도포 7일 후 약 33.2% 감소시킴을 확인하였다.
(4) 소결
상기 실험예 7-2에서 확인한 바와 같이, 시험제품은 사용 7일 후 미세먼지에 의한 피부 염증 요소인 피부 붉은 정도(a*), 피부 홍반량(E.I), 경표피수분손실량(TEWL)을 모두 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여, 시험 제품이 미세먼지로부터 유발되는 피부 염증에 완화시킴을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 진귤(Citrus Sunki)과피 추출물, 고사리삼(Sceptridium Ternatum 또는 Botrychium Ternatum) 추출물 및 백기생(Korthalsella Japonica) 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 황사 또는 미세먼지로부터 유발되는 피부 염증 완화용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 백기생(Korthalsella Japonica) 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 진귤(Citrus Sunki)과피 추출물 또는 고사리삼(Sceptridium Ternatum 또는 Botrychium Ternatum) 추출물 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 피부 염증 완화용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 진귤(Citrus Sunki)과피 추출물, 고사리삼(Sceptridium Ternatum 또는 Botrychium Ternatum) 추출물 및 백기생(Korthalsella Japonica) 추출물을 혼합한 혼합물인 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혼합물은 진귤(Citrus Sunki)과피 추출물:고사리삼(Sceptridium Ternatum 또는 Botrychium Ternatum) 추출물:백기생(Korthalsella Japonica) 추출물의 조성비율이 1:1:1 내지 2:1:1 중량비 임을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 i) 헤스페리딘(Hesperidine), 테트라메틸-O-아이소스쿠텔라레인(Tetramethyl-O-Isoscutellarein), 노비레틴(Nobiletin) 및 탄게레틴(Tangeretin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 진귤과피 추출물; ii) 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-α-람노사이드(Quercetin-3-O-β-Glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-α-Rhamnoside), 퀘르세틴-3-O-β-글루코실(1→2)-α-람노사이드-7-O-β-글루코시드(Quercetin-3-O-β-glucosyl(1→2)-α-Rhamnoside-7-O-β-Glucoside), 테르나튜모시드 VI(Ternatumoside VI) 테르나튜모시드 XI(Ternatumoside XI) 및 테르나튜모시드 XII(Ternatumoside XII)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 고사리삼 추출물; 또는 iii) 루세닌-2(Lucenin-2), 비세닌-2(Vicenin-2) 및 스텔라린-2(Stellarin-2)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 백기생 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 황사 또는 미세먼지는 G-CSF, GM-CSF, GRO, GRO-α, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8, IL-15, MCP-1, MCP-2 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세먼지는 TSP(Total Suspended Particle), PM10(Particulate Matter 10) 및 PM2.5(Particulate Matter 2.5)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 미세먼지를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 NO 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  10. 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, GRO-α, GM-CSF 및 TNF-α로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인의 생성량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  11. 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 총 조성물의 중량 대비 0.001 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  12. 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 염증은 접촉성 피부염(contact dermatitis)인 것을 특징으로 하는 피부 염증 완화용 조성물.
  13. 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 염증 완화 방법.
  14. 제1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 붉은 정도, 피부 홍반량 또는 경표피수분손실량을 감소시키는 방법.
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