CN114605368B - 一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法，包括步骤：(1)称取木犀草素原料药溶于有机溶剂中，得到木犀草素溶液；(2)将CO2以一定流速通过同轴喷嘴打入结晶釜，调节结晶釜内温度和压力；(3)继续通入CO2，维持结晶釜内的温度和压力不变，同时将步骤(1)制备的木犀草素溶液通过高压输液泵以一定流速从结晶釜顶部通过同轴喷嘴打入结晶釜内部；(4)进样完毕后，继续通入CO2一定时间，同时通过转子流量计调节CO2流速使得维持在一定流速内，最后卸压至标准大气压，取下并打开结晶釜，收集产物。该方法可得到粒径小、比表面积大、分布均匀、抗氧化和溶出性能明显改善的木犀草素超细微粒。
Description
技术领域
本发明属于制药工程领域，具体涉及一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法。
背景技术
木犀草素(Luteolin)又名黄色黄素、黄示灵，分子式为C15H10O6，是一种天然黄酮类化合物，多以糖苷形式存在于多种植物中，具有消炎、抗菌、抗尿酸、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒等药理活性。它对咳嗽中枢具有选择性的抑制作用，主要是抑制脑干部位的咳嗽中枢而发挥镇咳效应，同时对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、绿脓杆菌有抑制作用。因此，目前市面上有主要成分为木犀草素的独一味胶囊、脉舒胶囊、小春花口服液等成药用于慢性支气管消炎、降血脂、镇咳、祛痰等。但是木犀草素水溶性差，在肠胃中溶出吸收性能差，进而口服效果差，生物利用度大大降低，限制了在临床上其药理活性的广泛应用。需要采取有效的技术手段来提高木犀草素的水溶性，从而提高它的生物利用度，发挥其药理活性，增加它在医药领域的应用。
近年来，药物微粉化技术被广泛应用于改善难溶性药物的溶出度。传统的微粉化技术存在诸多不足，比如温度高、加工时间长、粒度大分布宽且溶剂残留高。现如今，超临界流体结晶技术凭借所制制剂生物活性高，有机溶剂残留少，绿色安全，环境友好等优势广泛应用于微粉化领域。
超临界流体强化溶液分散技术(Solution Enhanced Dispersion bySupercritical Fluid，SEDS)技术是指把溶质溶于有机溶液中形成溶液，利用溶质在溶剂中的溶解度远大于在超临界CO2的溶解度，超临界CO2扩散到溶液中，导致溶剂体积迅速膨胀，溶质在溶剂中的溶解度迅速下降，在较短时间内形成较高的过饱和度，促使溶质成核结晶形成微粒。该技术核心在于采用同轴双道喷嘴，使溶液在进结晶釜前，借助高速的超临界CO2在进入混合腔后形成湍流，超临界CO2和溶液充分混合形成更小的喷射液滴，实现了更好的雾化液滴和迅速混合的同步操作，这样更好的减小了成核粒径，加快成核结晶最终形成粒径更小分布更均匀的超细微粒。该技术相比其他制粒技术，它能制备出粒径较小的超细微粒，是一种比较理想的微粒制备方法。相比传统工艺，比如物理研磨、气流粉碎等技术，它具有操作条件易于控制，制备所得的微粒粒径小且分布窄，微粒比表面积增大，同时有机溶剂残留少，纯度高，杂质少，绿色安全，环境友好等优点。
目前，没有现有技术报道超临界流体强化溶液分散技术应用木犀草素超细微粒的制备。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法，包括如下步骤：
(1)配制木犀草素溶液：称取木犀草素原料药溶于有机溶剂中，得到木犀草素溶液；
(2)将CO2以一定流速通过同轴喷嘴打入结晶釜，调节结晶釜内温度和压力；
(3)继续通入CO2，维持结晶釜内的温度和压力不变，同时将步骤(1)制备的木犀草素溶液通过高压输液泵以一定流速从结晶釜顶部通过同轴喷嘴打入结晶釜内部；
(4)进样完毕后，继续通入CO2一定时间，同时通过转子流量计调节CO2流速使得维持在一定流速内，最后卸压至标准大气压，取下并打开结晶釜，收集产物；
其中：步骤(1)中有机溶剂为乙醚与2-甲基四氢呋喃按体积比20:1配成的混合溶剂。
优选地，步骤(2)中同轴喷嘴的孔径为50μm。
优选地，步骤(2)中结晶釜内温度为32-48℃。
优选地，步骤(2)中结晶釜内压力为9-21MPa。
优选地，步骤(3)中溶液进样流速为1.0-3.0mL/min。
优选地，步骤(1)中溶液质量浓度为5-25mg/mL。
优选地，步骤(4)中继续通入CO290min。
优选地，步骤(4)中CO2流速为3.9±0.3L/min。
有益效果：
本发明通过超临界CO2抗溶剂法制备得到了木犀草素超细微粒为肉眼可见的蓬松絮状固体，经FTIR、DSC及XRD检测，证明了木犀草素结构完好未被改变；体外溶出度实验表明，在前90min，就可以看出SEDS工艺制得的木犀草素超细微粒相比原料药的溶出性能明显提高，最终在250min左右时，累积溶出度能够达到60％左右，而木犀草素原料药在30％左右，因此可以判断出木犀草素经过SEDS技术制备出的超细微粒溶出度显著提高。
本发明提供的超临界流体强化溶液分散技术可以制备得到粒径小、比表面积大、分布均匀、抗氧化和溶出性能明显改善的木犀草素超细微粒，从而提高木犀草素的生物利用度，改善其药理成药性能，并可以克服传统技术普遍存在的有机溶剂残留问题，操作条件温和易于控制，生物成分不易失活，过程绿色，环境友好，具有较高的安全性。
附图说明
图1为实验设备结构示意图，其中：1-CO2钢瓶；2-高压泵；3-低温恒温槽；4-预热器；4-溶液瓶；5-高效输液泵；6-喷嘴雾化器；7-结晶釜；8-空气阀；9-微调阀；10-溶剂回收瓶；11-转子流量计；
图2为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的粒径分布图；
图3为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的SEM对比图；
图4为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的XRD对比图；
图5为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的FTIR对比图；
图6为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的DSC对比图；
图7为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒抗氧化性能对比图。
图8为木犀草素原料药和实施例中最优组制备的木犀草素超细微粒的溶出性能对比图。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料与仪器
实验材料：
木犀草素(纯度>98％，安耐吉化学有限公司)；CO2(纯度>99％，南京上元工业气体厂)；乙醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)；2-甲基四氢呋喃(分析纯，山东辰宇化工有限公司)；二氯甲烷(分析纯，南京化学试剂有限公司)；二甲亚砜(分析纯，南京化学试剂有限公司)；丙酮(分析纯，南京化学试剂有限公司)；乙醚(分析纯，南京化学试剂有限公司)；0.1％吐温80溶液(自制)；蒸馏水(中国药科大学自制)。
Helix超临界微粒制备系统(美国Applied Separations公司)；Helix Series1500型高压输液泵(美国Applied Separations公司)；TYW-2型空气压缩泵(苏州市同一机电有限公司)；SDC-6型低温恒温槽(南京新辰生物科技有限公司)；UV-1800型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；SSX-550扫描电子显微镜(SHIMADZU岛津)；DSC 204F1型差示扫描量热仪(德国耐驰公司)；D8 Advance型X-射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)；FT/IR-4100型傅里叶变换红外光谱仪(日本JASCO公司)；RC-8HD型智能溶出实验仪(天津精拓仪器科技有限公司)。
二、实验方法和结果
超临界流体强化溶液分散技术制备流程图参见图1，操作流程如下：
(1)首先对整个系统进行气密性检查，确保没有泄漏。打开低温恒温槽和结晶釜的加热装置，待温度达到设定值，打开CO2的进口阀，打开空气压缩泵和设备泵对整个系统进行加压操作直至达到实验要求值。
(2)待结晶釜的压力和温度都稳定后，打开结晶釜底部的CO2出口阀门，同时通过微调转子流量计阀门控制CO2的流速，使CO2的流量稳定流速排气。
(3)待系统整体稳定后将配置好的样品溶液通过高效液相泵以一定流速从结晶釜顶部喷嘴以一定的流速喷入结晶釜内部，同时也需要通过控制转子流量计使得CO2流速在定值范围内，超临界CO2将有机溶剂带走并最终在溶剂回收釜回收。
(4)进样完毕后，继续通入CO290min，通过转子流量计调节CO2流速使得维持在一定流速内，除尽残留溶剂。最后关闭CO2进口阀及空气压缩泵，卸压，待结晶釜内的气体排空和压力降至一个大气压后，打开结晶釜，收集产物；
实施例1：
1、溶剂种类对木犀草素超细微粒粒径的影响
存在合适的溶剂是超临界流体强化溶液分散技术制备超细微粒的前提，如果没有合适的溶剂，难溶性化合物是不适用超临界流体强化溶液分散技术制备超细微粒的；如果没有合适的溶剂，再怎么优化方法参数都是徒劳。但是本领域技术人员在实验之前根本不知道待研究的难溶性化合物是否存在这样一种合适的溶剂。这也是超临界流体强化溶液分散技术一直无法广泛推广的重要原因。在寻找不到合适的溶剂时，有时会通过加入载体再应用超临界流体强化溶液分散技术将难溶性化合物制成包合物或微囊形式的微粒，但这会大大提高制剂成本。
申请人分别以乙醇、丙酮、二氯甲烷:二甲亚砜＝20:1、乙醚:四氢呋喃＝20:1在内的若干种溶剂/溶剂组合为木犀草素的溶剂，其他参数为结晶压力14MPa，结晶温度40℃，溶液质量浓度10mg/mL，溶液进样流速为1.5mL/min、CO2流速为3.3±0.3L/min。比如，当溶剂为乙醇时，结晶釜内无法收集到有效絮状微粒产物；溶剂为丙酮或二氯甲烷:二甲亚砜＝20:1时，仅能收集到块状产物。当溶剂为乙醚:2-甲基四氢呋喃＝20:1时，才能够收集到形貌好分布均匀的絮球状微粒，粒径为11.529μm。
2、同轴喷嘴孔径对木犀草素超细微粒粒径的影响
在结晶压力14MPa，结晶温度40℃，溶液质量浓度10mg/mL，溶液进样流速为1.5mL/min，CO2流速为3.3±0.3L/min的条件下，考察喷嘴孔径流速分别为500μm、200μm、100μm、50μm、20μm对木犀草素超细微粒粒径的影响。结果粒径分别为11.473μm、9.698μm、8.235μm、6.334μm、8.093μm，结果超细微粒粒径在喷嘴孔径50μm时最小。
因此确定实验所用同轴喷嘴的孔径为50μm。
3、CO2流速对木犀草素超细微粒粒径的影响
在溶剂和喷嘴孔径确定且结晶压力14MPa，结晶温度40℃，溶液质量浓度10mg/mL，溶液进样流速为1.5mL/min的条件下，考察CO2流速分别为2.7±0.3、3.3±0.3、3.9±0.3、4.5±0.3、5.1±0.3L/min对木犀草素超细微粒粒径的影响。当CO2流速＜2.4L/min时，产物为粘稠块状，无法收集到有效微粒产物；同时当CO2流速＞5.3L/min时，产物为极少量针状结晶。在2.4-5.3L/min范围内，收集到产物粒径分别为12.141μm、10.502μm、6.683μm、9.474μm、11.881μm，结果超细微粒粒径在CO2流速3.9±0.3L/min时最小。
因此确定最优CO2流速为3.9±0.3L/min。
4、单因素实验：结晶温度对木犀草素超细微粒粒径的影响
在结晶压力14MPa，溶液质量浓度10mg/mL，溶液进样流速为1.5mL/min，CO2流速为3.9±0.3L/min的条件下，考察结晶温度分别为32、36、40、44、48℃对木犀草素超细微粒粒径的影响。结果粒径分别为8.279μm、9.103μm、6.135μm、8.825μm、10.726μm，结果超细微粒粒径在结晶温度为40℃时最小。因此确定最优结晶温度为40℃。
5、单因素实验：结晶压力对木犀草素超细微粒粒径的影响
在结晶温度40℃，溶液质量浓度10mg/mL，溶液进样流速为1.5mL/min，CO2流速为3.9±0.3L/min的条件下，考察结晶压力分别为9、12、15、18、21MPa对木犀草素超细微粒粒径的影响。结果粒径分别为10.672μm、8.696μm、7.506μm、6.252μm、6.341μm，结果超细微粒粒径在结晶压力为18MPa时最小。因此确定最优结晶压力为18MPa。
6、单因素实验：溶液进样流速对木犀草素超细微粒粒径的影响
在结晶温度40℃、结晶压力为18MPa，溶液质量浓度10mg/mL，CO2流速为3.9±0.3L/min的条件下，考察溶液进样流速分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min对木犀草素超细微粒粒径的影响。结果粒径分别为5.775μm、7.251μm、9.765μm、10.985μm、11.792μm，结果超细微粒粒径在溶液进样流速为1.0mL/min时最小。因此确定最优进样流速为1.0mL/min。
7、单因素实验：溶液质量浓度对木犀草素超细微粒粒径的影响
结晶温度40℃、结晶压力为18MPa，溶液进样流速为1.0mL/min，CO2流速为3.9±0.3L/min的条件下，考察溶液质量浓度分别为5、10、15、20、25mg/mL时，对木犀草素超细微粒粒径的影响。结果粒径分别为10.106μm、9.282μm、5.805μm、8.882μm、11.474μm，结果超细微粒粒径在质量浓度为15mg/mL最小。因此确定最优体积流量为质量浓度为15mg/mL。
实施例2：
采用最优工艺条件制备木犀草素超细微粒，包括如下步骤：
(1)配制木犀草素溶液：称取木犀草素原料药溶于有机溶剂中，得到木犀草素溶液；
(2)将CO2以一定流速通入结晶釜，调节结晶釜内温度和压力；
(3)继续通入CO2，维持结晶釜内的温度和压力不变，同时将步骤(1)制备的木犀草素溶液通过高压输液泵从结晶釜顶部通过喷嘴喷入结晶釜内部；
(4)进样完毕后，继续通入CO290min，同时通过转子流量计调节CO2流速使得维持在一定流速内，最后卸压至标准大气压，取下并打开结晶釜，收集絮状超细微粒。
其中，药物溶液溶剂为乙醚:2-甲基四氢呋喃＝20:1，同轴喷嘴孔径为50μm，CO2流速为3.9±0.3L/min，结晶温度为40℃，结晶压力为18MPa，溶液进样流速为1.0mL/min，溶液质量浓度为15mg/mL。
RSD工艺验证
在溶剂和喷嘴孔径确定情况下，对其他工艺条件进行工艺验证确保工艺可行性，具体为结晶温度为40℃、结晶压力为18MPa、溶液进样流速为1.0mL/min、溶液质量浓度为15mg/mL、CO2流速为3.9±0.3L/min，重复三次试验结果如表1，粒径平均值为4.366μm，RSD为0.076％，其RSD＜2％，表明超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒工艺稳定可行。
表1
木犀草素超细微粒的表征分析：
粒径分析：木犀草素原料药和木犀草素超细微粒的粒径对比图如图2所示，木犀草素原料药粒径为48.239μm且分布宽。木犀草素超细微粒粒径为4.358μm，粒径显著降低，分布窄而均匀。
SEM分析：木犀草素原料药和木犀草素超细微粒的SEM对比图如图3所示，木犀草素超细微粒与不规则块状原料药相比，相貌呈现均匀的线条状。
XRD分析：木犀草素原料药和木犀草素超细微粒的XRD对比图如图4所示，木犀草素超细微粒的衍射特征峰与木犀草素原料药的大体一致，表明应用超临界流体强化溶液分散技术制备出的木犀草素超细微粒晶型没有发生改变。
FTIR分析：木犀草素原料药和木犀草素超细微粒的FTIR对比图如图5所示，木犀草素超细微粒的红外特征峰与木犀草素原料药基本一致，因此表明应用超临界流体强化溶液分散技术制备出的木犀草素超细微粒化学结构没有发生改变。
DSC分析：木犀草素原料药和木犀草素超细微粒的DSC对比图如图6所示，木犀草素超细微粒的熔点特征峰与木犀草素原料药基本一致，因此表明应用超临界流体强化溶液分散技术制备出的木犀草素超细微粒化学结构没有改变。
抗氧化实验
称取适量的木犀草素原料药和木犀草素超细微粒乙醇定容配置成(10-50μg/mL)溶液，后取适量分别加入配置好的0.1μg/mL的DPPH中混合均匀在黑暗室温中静置30min，后用离心机离心5分钟取上清液用紫外分光光度计在517nm处测前后吸光值后根据公式计算对比。结果如图7所示，经过SEDS工艺制备的超细微粒相比原料药的抗氧化能力有所提高。
体外溶出度实验
分别量取适量木犀草素原料药、最优工艺下制备出的木犀草素超细微粒，应用桨法于温度(37±0.5℃)、转速50r/min、溶出介质为0.1％吐温80溶液，250min内累积溶出度，比较其溶出性能，结果如图8所示，分析可知在250min内木犀草素超细微粒的累积溶出性能明显高于木犀草素原料药，应用超临界流体强化溶液分散技术可以使得木犀草素原料药的溶出性能得到明显的改善。
上述实验结果表明，本发明提供的超临界流体强化溶液分散技术可以制备得到粒径更小、分布窄且更均匀、抗氧化活性及溶出性能明显改善的木犀草素超细微粒，增加了药物微粒的比变面积，从而增强了药物在肠胃中的释放利用，提高了木犀草素的生物利用度，改善其成药性能，增加它在未来医药领域中的应用。并可以克服传统技术普遍存在的有机溶剂残留问题，操作条件易于控制，生物成分不易失活，过程绿色环保高效，具有较高的安全性。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (5)
1.一种应用超临界流体强化溶液分散技术制备木犀草素超细微粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制木犀草素溶液：称取木犀草素原料药溶于有机溶剂中，得到木犀草素溶液；
（2）将CO2以一定流速通过同轴喷嘴打入结晶釜，调节结晶釜内温度和压力；
（3）继续通入CO2，维持结晶釜内的温度和压力不变，同时将步骤（1）制备的木犀草素溶液通过高压输液泵以一定流速从结晶釜顶部通过同轴喷嘴打入结晶釜内部；
（4）进样完毕后，继续通入CO2一定时间，同时通过转子流量计调节CO2流速使得维持在一定流速内，最后卸压至标准大气压，取下并打开结晶釜，收集产物；
其中：步骤（1）中有机溶剂为乙醚与2-甲基四氢呋喃按体积比20:1配成的混合溶剂；步骤（2）中结晶釜内温度为32-48℃，结晶釜内压力为9-21MPa；步骤（4）中CO2流速为3.9±0.3L/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中同轴喷嘴的孔径为50μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中溶液进样流速为1.0-3.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中溶液质量浓度为5-25mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中继续通入CO2 90min。
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