WO2016159243A1 - 抗血栓性金属材料 - Google Patents

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WO2016159243A1
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metal material
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derivative
antithrombotic
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功治 門脇
雅規 藤田
有佳 阪口
一裕 棚橋
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東レ株式会社
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    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment

Definitions

  • the present invention relates to an antithrombotic metal material.
  • Medical devices that come into contact with blood (specifically, artificial kidneys, artificial lungs, artificial blood vessels, artificial valves, stents, stent grafts, catheters, free thrombus capture devices, vascular endoscopes, sutures)
  • Blood circuits, tubes, cannulas, blood bags, syringes, etc. are required to have high antithrombogenicity in order to prevent functional deterioration due to blood coagulation.
  • a medical device made of a metal material such as a stent is easily recognized as a foreign substance to blood and easily forms a thrombus.
  • a method of coating or chemically bonding heparin or a heparin derivative, which is an anticoagulant, on the surface of the metal material has been reported.
  • a technique for coating or chemically bonding heparin or a heparin derivative to the surface of the metal material mainly, 1) a method of immobilizing the functional group introduced on the surface of the metal material by covalently bonding the heparin or heparin derivative And 2) a method in which an ionic complex is formed between an organic cation mixture and heparin or a heparin derivative and dissolved in an organic solvent to coat the surface of the metal material, and 3) the positive charge introduced on the surface of the metal material.
  • a method of immobilizing a charged cationic compound and heparin or a heparin derivative by ionic bonding There is known a method of immobilizing a charged cationic compound and heparin or a heparin derivative by ionic bonding.
  • Patent Document 3 a method of forming an ionic complex between an organic cation mixture such as a quaternary ammonium salt and heparin or a heparin derivative, and dissolving it in an organic solvent and coating the surface of the metal material has been reported.
  • Patent Document 4 As a method of 3), after introducing an amine group consisting of diaminocyclohexane on the surface of a metal material by plasma treatment, heparin is immobilized on the introduced amine group by ionic bond (Patent Document 4). .
  • Patent Document 5 a method has been reported in which adsorption to a cell surface is inhibited by binding a non-protein-adsorbing substance having a negative charge such as heparin to the surface of a substrate.
  • heparin or a heparin derivative is immobilized on the surface of a metal material by being covalently bonded to a polymer or a low molecular weight compound, so that the degree of freedom decreases. Therefore, it is difficult to obtain the required anticoagulant activity.
  • an ionic complex is formed between an organic cation mixture such as a quaternary ammonium salt and heparin or a heparin derivative, dissolved in an organic solvent, and coated on the surface of the metal material.
  • an organic cation mixture such as a quaternary ammonium salt
  • heparin or a heparin derivative dissolved in an organic solvent
  • the highly hydrophilic portion in the ionic complex avoids the organic solvent and aggregates to cause phase separation, so that the metal material surface cannot be coated uniformly.
  • an organic cation mixture such as a quaternary ammonium salt is easily eluted by contact with a body fluid such as blood, and the elution rate of heparin or a heparin derivative cannot be controlled.
  • Patent Document 4 a cationic compound having an amino group is introduced on the surface of a metal material, and heparin, which is a compound having an anionic anticoagulant activity, is ion-bonded to the cationic compound and fixed.
  • heparin which is a compound having an anionic anticoagulant activity
  • it does not describe the amount of appropriate heparin or heparin derivative to be introduced.
  • the appropriate amount of the cationic compound introduced into the surface of the metal material has not been studied. When the amount of the cationic compound to be coated is too small, high antithrombogenicity cannot be obtained, and when it is too large, hemolytic toxicity may be exhibited.
  • Patent Document 5 conventionally, it is known that heparin or the like adheres to a base material, and thus cell adhesion to the surface of the base material is reduced.
  • the antithrombotic material used is used for an artificial blood vessel, a stent, a stent graft, or the like, the thrombus can be prevented, but there is a case where the biologicalization due to adhesion / proliferation of endothelial cells or the like may be inhibited.
  • an object of the present invention is to provide an antithrombotic metal material that exhibits enhanced safety against low hemolytic toxicity and exhibits high antithrombogenicity for a long period of time.
  • an object of the present invention is to provide an antithrombotic metal material that has antithrombogenicity and does not reduce cell adhesion to the surface.
  • a phosphonic acid derivative or a catechol derivative a polymer containing as a constituent monomer a compound selected from the group consisting of alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride;
  • the surface of the metal material is coated with a coating material containing a compound having a coagulation activity, the polymer is covalently bonded to the phosphonic acid derivative or the catechol derivative, and the phosphonic acid derivative or the catechol derivative has its own phosphonic acid.
  • the ratio of the abundance of nitrogen atoms to the abundance of all atoms measured by X-ray electron spectroscopy (XPS) on the surface is 4.0 to 13.0 atoms bonded to the metal material via an acid group or a catechol group.
  • Antithrombotic metal material that is a few percent.
  • (2) The antithrombotic metal according to (1), wherein the abundance ratio of sulfur atoms to the abundance of all atoms measured by X-ray electron spectroscopy (XPS) on the surface is 3.0 to 6.0 atomic% material.
  • the coating material is an anionic polymer containing a compound selected from the group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, ⁇ -glutamic acid, ⁇ -glutamic acid and aspartic acid as a constituent monomer, or oxalic acid, malonic acid, succinic acid
  • An anionic compound selected from the group consisting of acids, fumaric acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, malic acid, tartaric acid and citric acid, (1) to (4) An antithrombotic metal material according to any one of the above.
  • the metal material is composed of iron, titanium, aluminum, tin, gold, silver, copper, platinum, chromium, cobalt, nickel, zinc, tungsten and alloys thereof, and oxides and hydroxides of these metals.
  • a medical device for indwelling produced from the antithrombotic metal material according to any one of (1) to (8).
  • the antithrombotic metal material of the present invention has a phosphonic acid derivative or catechol derivative bonded to a metal surface via a phosphonic acid group or catechol group that the phosphonic acid derivative or catechol group has, and a polymer is covalently bonded to the phosphonic acid derivative or catechol derivative.
  • the antithrombotic metal material of the present invention includes a phosphonic acid derivative or a catechol derivative, a polymer containing a compound selected from the group consisting of alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride as a constituent monomer, sulfur
  • the surface of the metal material is coated with a coating material containing an anionic anticoagulant compound containing an atom, and the polymer is covalently bonded to the phosphonic acid derivative or the catechol derivative, and the phosphonic acid derivative or the above
  • the catechol derivative is bonded to the metal material through its own phosphonic acid group or catechol group, and the abundance ratio of nitrogen atoms to the abundance of all atoms measured by X-ray electron spectroscopy (XPS) on the surface is 4 0.0-13.0 atomic% It is.
  • XPS X-ray electron spectroscopy
  • the antithrombogenicity is a property that blood does not coagulate on the surface in contact with blood, and inhibits blood coagulation that progresses by, for example, platelet aggregation and activation of blood coagulation factors represented by thrombin.
  • the antithrombotic metal material is a metal material to which antithrombogenicity is imparted, and is not particularly limited.
  • medical devices medical devices and medical instruments
  • It can be used as a material constituting a stent, a stent graft, or the like. Since these medical devices come into contact with blood, blood coagulation tends to proceed on the surface of the medical devices, and it is necessary to use an antithrombotic metal material.
  • the metal material in the present invention is not particularly limited, but is preferably a metal having high biocompatibility, for example, iron, titanium, aluminum, tin, gold, silver, copper, platinum, chromium, cobalt, It is preferably selected from the group consisting of nickel, zinc, tungsten and their alloys, and their metal oxides and hydroxides.
  • SUS304, SUS316L, SUS420J2, SUS630 and the like are preferably an alloy selected from the group consisting of stainless steel, cobalt-chromium alloy, nickel-titanium alloy and zinc-tungsten alloy, and a metal oxide of the alloy, SUS304, Stainless steel such as SUS316L, SUS420J2, and SUS630 is more preferable, and SUS304 is more preferable.
  • the metal material preferably has an oxide or hydroxide on the surface.
  • the coating material is a material that coats at least a part of the surface of the metal material.
  • the coating material includes a phosphonic acid derivative or a catechol derivative, and an alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine, and diallyldimethyl.
  • a polymer containing a compound selected from the group consisting of ammonium chloride as a constituent monomer (hereinafter referred to as “polymer constituting the coating material”) and a compound having an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom are included.
  • the phosphonic acid derivative constituting the coating material is an organic compound in which a phosphonic acid group (—PO 3 H 2 ) is bonded to a carbon atom in the compound.
  • the phosphonic acid derivative is not particularly limited as long as it is a compound in which a phosphonic acid group (—PO 3 H 2 ) is bonded to a carbon atom in the compound, but by covalently bonding to the polymer constituting the coating material of the present invention. Since it is particularly preferable that the coating can be stabilized to exhibit high antithrombogenicity and the elution of the polymer can be suppressed, it is preferable to have a reactive functional group capable of reacting with the polymer. For example, carboxyalkylphosphonic acid or aminoalkylphosphonic acid is preferable, and carboxyalkylphosphonic acid is more preferable.
  • the number of carbon atoms in the carboxyalkylphosphonic acid derivative is not particularly limited, and examples thereof include compound A (the following general formula (I)) and compound B (the following general formula (II)).
  • the catechol derivative constituting the coating material is an organic compound in which a catechol group represented by the following general formula (III) is bonded to a carbon atom in the compound. [Wherein n represents an integer of 1 to 5. ]
  • the catechol derivative is not particularly limited as long as it is a compound in which the catechol group represented by the general formula (III) is bonded to the carbon atom in the compound.
  • the catechol derivative is not covalently bonded to the polymer constituting the coating material of the present invention. Since it is particularly preferable that it can be stabilized to exhibit high antithrombogenicity and suppress elution of the polymer, it preferably has a reactive functional group capable of reacting with the polymer.
  • the terminal preferably has a carboxyl group or an amino group, and more preferably has a carboxyl group. [Wherein n represents an integer of 1 to 5. ]
  • the number of carbon atoms of the catechol derivative is not particularly limited.
  • compound C the following general formula (IV)
  • compound D the following general formula (V)
  • compound E the following general formula (VI)
  • compound F the following general formula (VII)
  • the presence of the composition constituting the coating material on the surface of the antithrombotic metal material can be determined by time-of-flight secondary ion mass spectrometry (hereinafter “GCIB-TOF-SIMS”).
  • GCIB-TOF-SIMS time-of-flight secondary ion mass spectrometry
  • Pulsed primary ions are irradiated on the surface of the antithrombotic metal material in an ultra-high vacuum, and the secondary ions released from the surface of the antithrombotic metal material obtain a constant kinetic energy to obtain a time-of-flight type.
  • To the mass spectrometer Since a mass spectrum is obtained according to the mass of the secondary ion, information on the abundance can be obtained from the identification of the organic and inorganic substances present on the surface of the antithrombotic metal material and the peak intensity. Further, by using an Ar gas cluster ion beam in combination, depth direction analysis is also possible.
  • the presence of the phosphonic acid derivative on the surface of the antithrombotic metal material indicates that the 31 P ⁇ peak, 47 PO ⁇ peak, 63 PO 2 ⁇ peak, 79 PO 3 ⁇ peak of the negative secondary ion observed by GCIB-TOF-SIMS. , 94 CH 3 PO 3 - peak, 107 C 2 H 4 PO 3 - peak, 265 C 11 H 22 PO 5 - peak, 65 PH 2 O 2 + peak positive secondary ion, 82 PH 3 O 3 + peak, This can be confirmed by detecting at least one kind of peak selected from the group consisting of 96 CH 5 PO 3 + peak, 249 C 11 H 22 PO 4 + peak, and 277 C 12 H 22 PO 5 + peak.
  • catechol derivatives on the surface of the anti-thrombotic metallic material 98 C of the negative secondary ions observed by GCIB-TOF-SIMS 4 H 4 NO 2 - peak, 116 C 4 H 6 NO 3 - peak, 122 C 7 H 6 O 2 - peak, 135 C 8 H 7 O 2 - peak, 252 C 12 H 14 NO 5 - peak, 137 C 8 H 9 O 2 + peak positive secondary ion, 154 C 8 H 12 NO 2 It can be confirmed from detection of at least one peak selected from the group consisting of + peak, 208 C 12 H 18 NO 2 + peak and 254 C 12 H 16 NO 5 + peak.
  • a compound having an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom is heparin
  • the presence of heparin at the surface of the anti-thrombotic metallic material, 80 SO 3 negative secondary ion - peak, 97 SO 4 H - peak, 71 C 3 H 3 O 2 - peak and 87 C 3 H 3 O 3 - can be confirmed from the detection of at least one peak selected from the group consisting of peaks.
  • PEI polyethylene imine
  • PAA polyacrylic acid
  • the presence of PAA on the surface of the antithrombotic metal material is negative 2 observed by GCIB-TOF-SIMS. 71 C 3 H 3 of secondary ions O 2 - can be confirmed from the detection of a peak.
  • the polymer constituting the coating material is a polymer containing as a constituent monomer a compound selected from the group consisting of alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride. Since these constituent monomers have a cationic nitrogen atom, the polymer becomes cationic.
  • the compound having an anticoagulant activity containing a sulfur atom is anionic and can be ionically bonded.
  • anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom examples include heparin or heparin derivatives, dextran sulfate, polyvinyl sulfonic acid and polystyrene sulfonic acid, and heparin or heparin derivatives are more preferable.
  • the heparin or heparin derivative is not particularly limited as long as it can inhibit the blood coagulation reaction, and heparin, unfractionated heparin and low molecular weight heparin which are generally widely used in clinical practice, and antithrombin III. High affinity heparin and the like are also included.
  • the polymer constituting the coating material Since the polymer constituting the coating material has a cationic property and may develop cytotoxicity, it is not preferable to elute it in a body fluid such as blood. Therefore, the polymer constituting the coating material is covalently bonded to the phosphonic acid derivative or catechol derivative, and the phosphonic acid derivative or catechol derivative is bonded to the surface of the metal material through its own phosphonic acid group or catechol group. Thus, it is stably fixed on the surface of the metal material.
  • the metal atom and the phosphorus atom are preferably covalently bonded via an oxygen atom (metal-OP), and in the metal and catechol group, It is preferable that the metal atom and the carbon atom in the benzene ring are covalently bonded (metal-O-Ph) through an oxygen atom. Confirmation of the covalent bond between the metal material and the phosphonic acid derivative or catechol derivative can be determined from the fact that it does not elute even if it is washed with a solvent that dissolves the polymer.
  • the covalent bond refers to a chemical bond generated by sharing electrons between atoms, and may be a single bond or a multiple bond.
  • the kind of the covalent bond between the phosphonic acid derivative or the catechol derivative and the polymer constituting the coating material is not limited, and examples thereof include an amine bond, an azide bond, an amide bond, and an imine bond.
  • an amide bond is more preferable from the viewpoint of easy formation of a covalent bond and stability after bonding.
  • the polymer constituting the coating material may be a homopolymer or a copolymer.
  • the polymer When the polymer is a copolymer, it may be a random copolymer, a block copolymer, a graft copolymer or an alternating copolymer.
  • a block copolymer In the case of a block copolymer, it contains a nitrogen atom.
  • it is more preferable to interact with a block portion having repeating units and an anionic anticoagulant-containing compound containing a sulfur atom, so that a block copolymer is more preferable because strong ionic bonding occurs.
  • the homopolymer means a polymer compound obtained by polymerizing one kind of constituent monomer
  • the copolymer means a polymer compound obtained by copolymerization of two or more kinds of monomers.
  • the block copolymer is a copolymer having a molecular structure in which at least two kinds of polymers having different repeating units are connected by covalent bonds to form a long chain.
  • a block constitutes a block copolymer.
  • the polymer structure may be linear or branched.
  • a branched polymer is more preferable because it can form more stable ionic bonds at multiple points with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom.
  • the polymer has at least one functional group among primary to tertiary amino groups and quaternary ammonium groups.
  • the quaternary ammonium group is a primary group.
  • the ionic interaction with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom rather than a tertiary amino group is stronger, and the elution rate of the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is controlled. This is preferable because
  • the number of carbon atoms of the three alkyl groups constituting the quaternary ammonium group is not particularly limited. However, if the number is too large, the hydrophobicity is high and the steric hindrance increases. Thus, an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom can not be ionically bonded. In addition, since too much cytotoxicity is likely to occur, the number of carbon atoms per alkyl group bonded to the nitrogen atom constituting the quaternary ammonium group is preferably 1 to 12, and more preferably 2 to 6 Is preferred. The three alkyl groups bonded to the nitrogen atom constituting the quaternary ammonium group may all have the same carbon number or may be different.
  • polyalkyleneimine is preferably used as the polymer because of the large amount of adsorption based on ionic interaction with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom.
  • examples of the polyalkyleneimine include PEI, polypropyleneimine and polybutyleneimine, and further alkoxylated polyalkyleneimine. Among them, PEI is more preferable.
  • PEI examples include “LUPASOL” (registered trademark) (manufactured by BASF) and “EPOMIN” (registered trademark) (manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd.). It may be a copolymer with another monomer or a modified product.
  • the modified body as used herein refers to a polymer in which the monomer repeating units are the same, but, for example, a part thereof undergoes radical decomposition, recombination, etc. by irradiation with radiation.
  • the constituent monomer for forming the copolymer used in addition to alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride is not particularly limited.
  • Ions of an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom if too many constituent monomers are used in addition to alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride. Since the bond becomes weak, the content is preferably 10% by weight or less.
  • the weight-average molecular weight of the polymer constituting the coating material is too small, the molecular weight is smaller than that of the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom, so that stable ionic bonds are formed on the surface of the metal material. It is not formed, and the desired antithrombogenicity is difficult to obtain.
  • the weight average molecular weight of the polymer is too large, an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is encapsulated by the polymer and is not exposed on the outermost surface of the coating material.
  • the weight average molecular weight of the polymer constituting the coating material is preferably 600 to 2,000,000, more preferably 1,000 to 1,000,000, and even more preferably 10,000 to 1,000,000.
  • the weight average molecular weight of the polymer can be measured by, for example, a gel permeation chromatography (GPC) method or a light scattering method.
  • examples of the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom constituting the coating material are not limited as long as they can inhibit the blood coagulation reaction, and are commonly used in clinical practice.
  • antithrombin III also contains heparin, dextran sulfate and the like having high affinity.
  • Specific examples of heparin include “heparin sodium” (Organon API). The heparin or heparin derivative may or may not be purified.
  • the anticoagulant activity of a compound having an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom is sustained for a long period of time while suppressing elution of components other than the compound having an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom.
  • XPS X-ray electron spectroscopy
  • the abundance ratio of sulfur atoms to the abundance of all atoms by XPS on the surface of the antithrombotic metal material is preferably 3.0 to 6.0 atom number%, and 3.2 to 5.5 atoms. Several percent is more preferred, and 5.0 to 5.5 atomic percent is even more preferred.
  • the ratio of sulfur atoms to the total amount of atoms is less than 3.0% by number, the amount of the anionic anticoagulant compound containing sulfur atoms decreases, so the desired antithrombogenicity is obtained. I can't.
  • the abundance ratio of sulfur atoms to the abundance of all atoms on the surface of the antithrombotic metal material can be determined by XPS.
  • Apparatus ESCALAB 220iXL (manufactured by VG Scientific)
  • the surface of the antithrombotic metal material here is a measurement surface that is detected when the X-electron escape angle under the XPS measurement conditions, that is, the inclination of the detector with respect to the surface of the antithrombotic metal material is measured as 90 °. To a depth of up to 10 nm.
  • the metal material may or may not contain a sulfur atom.
  • the metal material may or may not contain nitrogen atoms.
  • the atomic information on the surface of the antithrombotic metal material is obtained from the binding energy value of the bound electrons in the substance obtained by irradiating the surface of the antithrombotic metal material with X-rays and measuring the energy of the generated photoelectrons.
  • information on the valence and the bonding state can be obtained from the peak energy shift of each bonding energy value.
  • quantitative determination using the area ratio of each peak that is, the existence ratio of each atom, valence, and bonding state can be calculated.
  • the S2p peak indicating the presence of a sulfur atom is observed at a binding energy value near 161 eV to 170 eV, and in the present invention, the area ratio of the S2p peak to the total peak is 3.0 to 6.0 atomic%. It was found that it is preferable.
  • the abundance ratio of sulfur atoms to the abundance of all atoms is calculated by rounding off the second decimal place.
  • the ratio of nitrogen atoms to the total amount of atoms measured by XPS on the surface of the antithrombotic metal material is preferably 4.0 to 13.0 atomic% in order to increase the antithrombogenicity. It is more preferably 0.0 to 10.0 atomic%.
  • the abundance ratio of nitrogen atoms with respect to the abundance of all atoms is 4.0 atomic% or more, the amount of the polymer present on the surface of the metal material becomes a sufficient amount, so that ions are bonded through the polymer.
  • the coating amount of an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom such as heparin or a heparin derivative is also the optimum ion binding amount for obtaining a preferable antithrombotic property.
  • an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom such as heparin or a heparin derivative
  • the coating amount of an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is also the optimum ion binding amount for obtaining a preferable antithrombotic property.
  • the abundance ratio of nitrogen atoms to the abundance of all atoms is 13.0 atomic% or less, it has anticoagulant activity including sulfur atoms due to the excessive amount of polymer present on the metal material surface. Since a large amount of polymer exposed as the compound elutes has a cationic property, it can prevent hemolysis toxicity.
  • the N1s peak indicating the presence of a nitrogen atom is observed in the vicinity of a binding energy value of 396 eV to 403 eV.
  • the area ratio of the N1s peak to the total peak is 4.0 to 13.0 atomic%. It was found that it is preferable.
  • the N1s peak is mainly composed of an n1 component (near 399 eV) attributed to a carbon-nitrogen (hereinafter “CN”) bond, an ammonium salt, CN (a structure different from n1), or a nitrogen oxide.
  • the peak can be divided into n2 components (near 401 to 402 eV) belonging to (hereinafter “NO”).
  • the existence ratio of each divided peak component is calculated by the following formula 1.
  • the abundance ratio of nitrogen atoms to the abundance of all atoms and the abundance ratio of each divided peak component are calculated by rounding off the first decimal place.
  • Division ratio N1s ratio ⁇ (division percent / 100) Equation 1
  • Split ratio Abundance ratio of each split peak component (%)
  • N1s ratio abundance ratio of nitrogen atom to abundance of all atoms (%)
  • Divided percent Ratio of each divided peak component in N1s peak (%)
  • the n2 component attributed to NO obtained by splitting the N1s peak indicates the presence of a quaternary ammonium group, and the ratio of the n2 component to the total components of the N1s peak, that is, split percent (n2) It was found that 20 to 70 atomic% is preferable, 25 to 65 atomic% is more preferable, and 30 to 60 atomic% is more preferable. When the split percent (n2) is 20 atomic% or more, the quaternary ammonium group is present in a sufficient amount, so that an ionic interaction with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is preferable. The optimal dissolution rate is obtained to obtain a preferable antithrombogenicity.
  • the divided percent (n2) is 70 atomic% or less, the ionic interaction with the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is not too strong, and the degree of freedom due to the formation of the ionic complex is not increased. Since the decrease can be prevented, the elution rate does not become too slow, and an optimum elution rate for obtaining a more preferable anticoagulant activity can be obtained.
  • the abundance ratio of the n2 component, that is, the division ratio (n2) is calculated by the equation 1, it is preferably 1.4 to 8.4 atomic% for the above reasons, and 1.8 to 7.2 atoms. Several percent is more preferred, and 2.4 to 6.0 atomic percent is even more preferred.
  • the C1s peak indicating the presence of carbon atoms is seen in the vicinity of a binding energy value of 282 to 292 eV, and the C1s peak is mainly a carbon-hydrogen (hereinafter “CHx”) bond that suggests the presence of saturated hydrocarbons or the like.
  • CHx carbon-hydrogen
  • Division ratio C1s ratio ⁇ (division percentage / 100) Equation 2
  • Split ratio Abundance ratio of each split peak component (%)
  • C1s ratio abundance ratio of carbon atoms to abundance of all atoms (%)
  • Divided percent Ratio of each divided peak component in C1s peak (%)
  • the c3 component attributed to the C ⁇ O bond obtained by splitting the C1s peak indicates the presence of an amide group in the present invention.
  • the ratio of the c3 component to the total components of the C1s peak ie, the present
  • the abundance ratio of the amide group measured by XPS on the surface of the antithrombotic metal material is preferably 3.0 atomic% or more, more preferably 8.0 atomic% or more, and 10.0 atomic% or more. Has been found to be even more preferred.
  • the abundance ratio of the amide group is 3.0 atomic% or more, the covalent bond due to the amide bond is sufficiently generated between the polymer constituting the coating material and the phosphonic acid derivative or catechol derivative. It is possible to prevent the ion binding state with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom from being deteriorated due to the influence of the configuration on the surface of the metal material, and to obtain more preferable antithrombogenicity.
  • the antithrombotic metal material of the present invention can be suitably used for medical devices such as medical devices and medical instruments, but is particularly preferably used as a material for stents and stent grafts.
  • the method for producing the antithrombotic metal material of the present invention is shown below.
  • the target metal material may be added to a solution containing an anionic compound having an anticoagulant activity, and the coating may be performed with the coating material.
  • the phosphonic acid derivative or the catechol derivative, and the polymer Further, the surface of the metal material may be coated with a coating material obtained by reacting all or a part of the compound between an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom.
  • the phosphonic acid derivative or catechol derivative is added to the metal material via its own phosphonic acid group or catechol group.
  • a phosphonic acid derivative or catechol derivative containing a polymer containing as a constituent monomer a compound selected from the group consisting of alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride A method in which an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is ion-bonded to the polymer after the covalent bond with the polymer is more preferable.
  • the polymer contains a primary to tertiary amino group
  • the ionic interaction with the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is strengthened, and the anionic antistatic agent containing a sulfur atom is strengthened.
  • a step of quaternizing the polymer after the second coating step may be added.
  • the first coating step after the phosphonic acid derivative or catechol derivative is bonded to the surface of the metal material through its own phosphonic acid group or catechol group, as the second coating step, alkyleneimine, vinylamine, allylamine, A polymer containing a compound selected from the group consisting of lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride as a constituent monomer is covalently bonded to a phosphonic acid derivative or a catechol derivative, and then an anionic antistatic agent containing a sulfur atom as a third coating step.
  • a production method using a method in which a compound having a coagulation activity is ionically bonded to the above polymer is shown below.
  • the method of bonding the phosphonic acid derivative to the surface of the metal material through its own phosphonic acid group is not particularly limited, but the following methods are exemplified.
  • the metal material is subjected to ultrasonic cleaning in the order of water, acetone, and methanol, and then vacuum-dried. It is immersed in a tetrahydrofuran (hereinafter referred to as THF) solution of a phosphonic acid derivative at room temperature, concentrated by an evaporator, and then vacuum-dried. After heating at 120 ° C., the mixture is allowed to cool, ultrasonically washed with methanol, washed with water, and then vacuum dried. Alternatively, the washed metal material is immersed in an ethanol solution of a phosphonic acid derivative at 37 ° C. overnight, washed with ethanol and water, and then vacuum-dried.
  • THF tetrahydrofuran
  • the method for bonding the catechol derivative to the surface of the metal material is not particularly limited, and for example, the following method is used.
  • the metal material is subjected to ultrasonic cleaning in the order of water, acetone, and methanol, and then vacuum-dried.
  • a tris-HCl buffer solution (pH 8.5) of a catechol derivative at room temperature the solution is concentrated by an evaporator and then vacuum-dried.
  • the mixture is allowed to cool and then ultrasonically washed with water, followed by vacuum drying.
  • the washed metal material is immersed in a tris-HCl buffer solution (pH 8.5) of a catechol derivative overnight at 37 ° C., washed with water, and then vacuum-dried.
  • the method for covalently bonding the polymer constituting the coating material and the phosphonic acid derivative or catechol derivative is not particularly limited, but the phosphonic acid derivative or catechol derivative has a functional group (hydroxyl group, thiol group, amino group, carboxyl group, In the case of having an aldehyde group, a vinyl group, a halogenated alkyl group, an isocyanate group, a thioisocyanate, or the like, there is a method of covalently bonding with a polymer by a chemical reaction.
  • a polymer having a hydroxyl group, a thiol group, or an amino group may be covalently bonded to the phosphonic acid derivative or catechol derivative, or the hydroxyl group, thiol group, or amino group And the like, and a method of covalently bonding to a phosphonic acid derivative or catechol derivative having a carboxyl group and the like after covalently bonding a compound having the above to a polymer.
  • a phosphonic acid derivative or a catechol derivative and a polymer containing as a constituent monomer a compound selected from the group consisting of alkyleneimine, vinylamine, allylamine, lysine, protamine and diallyldimethylammonium chloride After the covalent bond, as the second step, after binding to the surface of the metal material via the phosphonic acid group or catechol group of the phosphonic acid derivative or catechol derivative, an anion containing a sulfur atom as the third coating step It is also possible to use a method in which a compound having a specific anticoagulant activity is ionically bonded to the polymer.
  • an anion containing, as a constituent monomer, a compound selected from the group consisting of acrylic acid, methacrylic acid, ⁇ -glutamic acid, ⁇ -glutamic acid and aspartic acid in order to develop high antithrombogenicity for a longer period of time.
  • the first additional step is performed after the second coating step.
  • the polymer contains a primary to tertiary amino group
  • the ionic interaction with an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is strengthened, and an anionic compound containing a sulfur atom is added.
  • a step of quaternizing the polymer may be added after the second additional step.
  • you may perform a 3rd and 4th additional process using an anionic polymer or an anionic compound, and a polymer as needed.
  • the anionic polymer is not particularly limited, but the higher the weight ratio of the anionic functional group, the higher the coating amount due to the covalent bond with the metal material, the phosphonic acid derivative or the catechol derivative or the above polymer.
  • Polymethacrylic acid, poly ⁇ -glutamic acid, poly ⁇ -glutamic acid, and polyaspartic acid are preferably used, and PAA is more preferable.
  • PAA examples include “polyacrylic acid” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like, but may be a copolymer with other monomers as long as the effects of the present invention are not hindered. It may be a body.
  • the anionic polymer is not particularly limited, but may form a copolymer with other constituent monomers, such as ethylene glycol, propylene glycol, vinyl pyrrolidone, vinyl alcohol, vinyl caprolactam, vinyl acetate. , Styrene, methyl methacrylate, hydroxyethyl methacrylate, siloxane and the like. If the amount of the constituent monomer forming the copolymer with the anionic polymer is too large, the coating amount due to the covalent bond with the metal material, the phosphonic acid derivative or the catechol derivative or the above polymer is reduced, and it is preferably 10% by weight or less. .
  • the coating amount by the covalent bond with the metal material or the polymer becomes a more preferable value, so that high antithrombogenicity is obtained.
  • the weight average molecular weight of the anionic polymer is 2,000,000 or less, it is preferable because the size of the anionic polymer is too large to reduce the possibility that the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is buried.
  • the weight average molecular weight of the anionic polymer is preferably from 600 to 2,000,000, more preferably from 10,000 to 1,000,000.
  • the anionic compound is not particularly limited, but the higher the weight ratio of the anionic functional group, the more the coating amount due to the covalent bond with the metal material, the phosphonic acid derivative, the catechol derivative, or the polymer described above. It is preferable to use acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, malic acid, tartaric acid and citric acid, and succinic acid is more preferable.
  • the second coating step as a method of covalently bonding the polymer and the phosphonic acid derivative or catechol derivative, there is a method of performing a condensation reaction using, for example, a dehydrating condensing agent.
  • the type of the dehydrating condensing agent to be used is not particularly limited.
  • the dehydration condensation agent may be used together with a dehydration condensation accelerator.
  • the dehydration condensation accelerator used is not particularly limited.
  • pyridine 4-dimethylaminopyridine (hereinafter “DMAP”), triethylamine, isopropylamine, 1-hydroxybenzotriazole, or N-hydroxysuccinic acid.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • Examples include imide.
  • the polymer constituting the coating material, the dehydration condensation agent and the dehydration condensation accelerator may be reacted in the form of a mixed aqueous solution, or may be added in order and reacted.
  • the polymer constituting the coating material contains a primary to tertiary amino group
  • the ionic interaction with the anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom is strengthened, and the sulfur atom is
  • a step of quaternizing the polymer may be added.
  • the polymer may be quaternized ammonium before being covalently bonded to the phosphonic acid derivative or catechol derivative, or the polymer may be converted into a phosphonic acid derivative or catechol derivative.
  • a quaternary ammonium may be formed after covalent bonding.
  • the quaternary ammonium group of the polymer is present on the surface side of the coating material.
  • an alkyl halide compound such as ether chloride or ethyl bromide or a glycidyl group-containing quaternary ammonium salt may be directly contacted. It may be dissolved in an aqueous solution or an organic solvent and contacted.
  • the third coating step for ion-bonding a compound having an anionic anticoagulant activity containing a sulfur atom to the polymer constituting the coating material is not particularly limited, but a method of contacting in the state of an aqueous solution is preferable. .
  • the anti-factor Xa activity on the surface of the antithrombotic metal material was measured.
  • the anti-factor Xa activity is an index representing the degree to which the activity of factor Xa that promotes the conversion of prothrombin to thrombin is inhibited.
  • the anionic anti-thrombotic metal material contains an anionic anti-factor.
  • the compound having coagulation activity is heparin or a heparin derivative
  • the surface amount of the active unit can be known.
  • “Test Team (registered trademark) Heparin S” manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • the anti-factor Xa activity is preferably in the 15 mIU / cm 2 or more, more preferably 30mIU / cm 2 or more, and even more preferred is a 100 mIU / cm 2.
  • the surface amount by anti-factor Xa activity here refers to the value measured after being immersed in physiological saline at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the antithrombotic metal material of the present invention has an initial surface amount after being immersed in physiological saline for 30 minutes, although the total amount of heparin or heparin derivative coated on the surface of the metal material is small due to the anti-factor Xa activity. Is characterized by high.
  • the total coating amount is a total amount of all the elution amounts measured by the anti-factor Xa activity and the surface amount remaining on the surface of the antithrombotic metal material. If it is too much, the coating material becomes thick, and the stent On the other hand, if it is too low, the desired antithrombogenicity is hardly obtained.
  • the total coating amount by the anti-factor Xa activity on the surface of the antithrombotic metal material is 10000 mIU / cm 2 or less, and the initial surface amount after being immersed in physiological saline for 30 minutes is 15 mIU / cm 2 or more.
  • it is 10000 mIU / cm 2 or less, more preferably the initial surface amount after being immersed in physiological saline for 30 minutes is 30 mIU / cm 2 or more, and the total coverage is 5000 mIU / cm 2 or less.
  • the initial surface amount after being immersed in physiological saline for 30 minutes is 100 mIU / cm 2 or more.
  • the amount eluted here refers to the amount eluted in human plasma after being immersed in human plasma at 37 ° C. for 24 hours.
  • “Test Team (registered trademark) Heparin S” manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd. was used.
  • an anionic anticoagulant compound containing a sulfur atom elutes, but the exposed polymer has a cationic property at that time.
  • hemolytic toxicity As an index indicating hemolysis toxicity, the hemolysis rate calculated by the following formula 3 was used. The hemolytic toxicity is determined according to the hemolytic toxicity test in accordance with the guideline issued by the Ministry of Health, Labor and Welfare, “Basic Concept of Biological Safety Evaluation Necessary for Application for Marketing Approval of Medical Devices” as shown in Table 1. Graded by value.
  • the hemolytic toxicity in the present invention is preferably graded into non-hemolytic and mild hemolytic, and more preferably graded into non-hemolytic.
  • Hemolysis rate (%) [(At-An) / (Ap-An)] ⁇ 100 Formula 3 At: Absorbance of specimen An: Absorbance of negative control Ap: Absorbance of positive control
  • Example 1 A SUS304 plate (length: 1 cm, width: 0.5 cm) was used as the metal material. SUS304 was subjected to ultrasonic cleaning in the order of water, acetone, and methanol and then vacuum-dried. The washed SUS304 is immersed in a 1 mM compound A (the following general formula (I)) ethanol solution overnight at 37 ° C., washed with ethanol and water, and then vacuum-dried to share compound A on the surface of SUS304. Bonded (first coating step).
  • a 1 mM compound A the following general formula (I)
  • SUS304 was added to an aqueous solution of 0.5 wt% DMT-MM (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 5.0 wt% PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF) which is a part of the coating material. It was immersed and reacted at 30 ° C. for 2 hours to covalently bond PEI to compound A by a condensation reaction (second coating step). The aqueous solution after the reaction was removed and washed with distilled water.
  • DMT-MM manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • PEI LPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF
  • sample 1 is SUS304 that has been subjected to the third coating process without performing the quaternary ammoniumation process
  • sample 2 is SUS304 that has been subjected to the quaternary ammoniumation process using ethyl bromide, and pentyl bromide
  • Sample 3 was SUS304 which had been subjected to the quaternary ammonium conversion step.
  • Example 2 Except for changing Compound A to Compound B (the following general formula (II)), the same operation as in Example 1 was performed, and the first coating step and the second coating step were performed. Further, the same operation as in Example 1 was performed, and after performing a quaternary ammonium conversion step using ethyl bromide, a third coating step was performed.
  • SUS304 which was subjected to the second coating step with PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF), was subjected to the second coating with Sample 4, PEI (average molecular weight of about 70,000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). SUS304 which performed the process was made into the sample 5.
  • PEI LPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF
  • Example 3 After performing the same operation as in Example 1 and carrying out the first coating step and the second coating step, SUS304 was mixed with 0.5 wt% DMT-MM, 0.5 wt% PAA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Product) and reacted at 30 ° C. for 2 hours (first additional step). The aqueous solution after the reaction was removed and washed with an aqueous sodium carbonate solution or distilled water.
  • SUS304 was immersed in an aqueous solution of 0.5 wt% DMT-MM and 5.0 wt% PEI and reacted at 30 ° C. for 2 hours (second additional step).
  • the aqueous solution after the reaction was removed and washed with distilled water.
  • the same operation as in Example 1 was performed, and after performing a quaternary ammonium conversion step using ethyl bromide, a third coating step was performed.
  • SUS304 which performed the 1st coating process with compound A, and performed the 2nd additional process with PEI average molecular weight of about 600; made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • PEI average molecular weight of about 600; made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • (Trademark) P: manufactured by BASF) SUS304 subjected to the second additional step was designated as sample 8.
  • Sample 9 was measured for the surface amount by anti-factor Xa activity after being immersed in physiological saline for 30 minutes, evaluated by human whole blood test, and hemolytic toxicity evaluation. Moreover, the measurement by the X ray electron spectroscopy (XPS) in the surface is not implemented. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the hemolytic toxicity evaluation of sample 9 was non-hemolytic ( ⁇ ), but the surface amount due to anti-factor Xa activity was small, ( ⁇ ), and thrombus formation as evaluated by human whole blood test The suppressive ability of ( ⁇ ) was ( ⁇ ).
  • Example 2 The same operation as in Example 1 was performed, and after performing the first coating step, the second coating step, and the quaternary ammonium conversion step, the third coating step was performed.
  • the first coating step is carried out with Compound B
  • the second additional step is carried out with PEI (average molecular weight of about 600; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and quaternary ammonium using ethyl bromide.
  • the first coating step was performed on sample SUS304 with Compound 10 and Compound A
  • the second additional step was performed with PEI (average molecular weight of about 600; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Sample 11 was SUS304 which had been subjected to the quaternary ammonium conversion step.
  • SUS304 was immersed in an aqueous solution of 0.5 wt% DMT-MM and 5.0 wt% PEI and reacted at 30 ° C. for 2 hours (second additional step). The aqueous solution after the reaction was removed and washed with distilled water.
  • SUS304 was immersed in an aqueous solution of 0.5 wt% DMT-MM and 0.5 wt% PAA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and reacted at 30 ° C. for 2 hours (third additional step).
  • the aqueous solution after the reaction was removed and washed with an aqueous sodium carbonate solution or distilled water.
  • SUS304 was immersed in an aqueous solution of 0.5 wt% DMT-MM and 5.0 wt% PEI and reacted at 30 ° C. for 2 hours (fourth additional step).
  • the aqueous solution after the reaction was removed and washed with distilled water.
  • the same operation as in Example 1 was performed, and after performing a quaternary ammonium conversion step using a methanol solution of dodecane bromide, a third coating step was performed.
  • SUS304 subjected to the fourth additional step with PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF) was added as a sample 12 with PEI (average molecular weight of about 70,000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as the fourth additional step.
  • Sample 13 was SUS304 which was subjected to the process.
  • Sample 14 was subjected to measurement of the surface amount by anti-factor Xa activity after immersion in physiological saline for 30 minutes, evaluation by human whole blood test, and hemolysis toxicity evaluation. Moreover, the measurement by the X ray electron spectroscopy (XPS) in the surface is not implemented. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the hemolytic toxicity evaluation of sample 9 was non-hemolytic ( ⁇ ), but the surface amount due to anti-factor Xa activity was small, ( ⁇ ), and thrombus formation as evaluated by human whole blood test The suppressive ability of ( ⁇ ) was ( ⁇ ).
  • Example 4 In the first coating step, compound A is converted into compound C (hereinafter, general formula IV), compound D (the following general formula (V), compound E (the following general formula (VI), compound F (the following general formula (VII) )), Immersing the washed SUS304 in 1 mM compound C, compound D, compound E or compound F in a tris-HCl buffer (pH 8.5) overnight at 37 ° C., After washing with water and vacuum drying (first coating step), the second coating step was carried out in the same manner as in Example 1 except for the first coating step. After performing the quaternary ammonium conversion step using pentyl chloride, the third coating step was performed.
  • the first coating step is performed with Compound C (hereinafter, general formula IV)
  • the second coating step is performed with PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF)
  • the quaternary ammoniumation step is performed with ethyl bromide.
  • SUS304 was sampled with sample 15, compound D (hereinafter, general formula V) in the first coating step, PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF Corp.) in the second coating step, and quaternary ammoniumation with ethyl bromide.
  • SUS304 subjected to the process was sample 16, sample E (hereinafter, general formula VI) as the first coating process, PEI (average molecular weight of about 10,000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as the second coating process, as pentyl bromide.
  • SUS304 subjected to the quaternary ammonium conversion step is sample 17, sample F (hereinafter referred to as general formula VII) in the first coating step, PEI (average molecular weight of about 70,000; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the second coating step, the SUS304 was carried quaternary ammonium step with pentyl bromide was used as a sample 18, Ltd.).
  • Example 5 In the first coating step, Compound A or Compound B is changed to either Compound C or Compound E, and washed SUS304 is 1 mM of Compound C or Compound E in Tris-HCl buffer (pH 8.5). The film was soaked overnight at 37 ° C., washed with water, and then vacuum-dried (first coating step). Except for the first coating step, the same operation as in Example 3 was performed, and the second coating step, the first additional step, and the second additional step were performed. Moreover, after implementing the quaternary ammonium formation process using ethyl bromide, the 3rd coating process was implemented.
  • the first coating step with Compound C SUS304 subjected to the second additional step with PEI (average molecular weight of about 70,000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as Sample 19
  • Compound E with the first coating step, Sample 20 was SUS304 which was subjected to the second additional step with PEI (average molecular weight of about 70000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • SUS304 which performed the 1st coating process with the compound C was set as the sample 21
  • SUS304 which performed the 1st coating process with the compound E was set as the sample 22.
  • the first coating step with Compound C, SUS304 which was subjected to the fourth additional step with PEI (LUPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF)), Sample 23, Compound E with the first coating step, PEI ( Sample 24 was SUS304, which had an average molecular weight of about 70,000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • PEI LPASOL (registered trademark) P; manufactured by BASF
  • Example 1 to 5 The samples described in Examples 1 to 5 were evaluated by a cell adhesion test. The results are shown in Table 3. As shown in Table 3, the cell adhesion evaluation of samples 1 to 5 and 15 to 18 was (++), and the cell adhesion evaluation of samples 6 to 8, 19 and 20 was (+).
  • Comparative Examples 1 to 6 were evaluated by a cell adhesion test.
  • the cell adhesion evaluation of samples 9 to 11, 21 and 22 was (++), and the cell adhesion evaluation of samples 12 to 14, 23 and 24 was ( ⁇ ).
  • the surface amount based on the anti-factor Xa activity, the evaluation by the human whole blood test, and the evaluation method for the hemolysis toxicity are shown below.
  • a calibration curve was prepared according to the operation procedure of “Test Team (registered trademark) Heparin S” (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.), and the surface amount due to anti-factor Xa activity was calculated.
  • Surface weight high moderately is preferably 15 mIU / cm 2 or more, more preferably 30mIU / cm 2 or more, still more preferably not less 100 mIU / cm 2 or more. If the surface amount is less than 15 mIU / cm 2 , the surface amount is small ( ⁇ ), if the surface amount is 15 mIU / cm 2 or more, the surface amount is large (+), and if it is 30 mIU / cm 2 or more, the surface amount is further increased. If it is large (++), if it is 100 mIU / cm 2 or more, it is determined that the surface amount is still larger (++).
  • TAT thrombin-antithrombin complex
  • the thrombus formation inhibitory ability calculated by Formula 4 is 300 or more, the thrombus formation inhibitory ability is weak ( ⁇ ), and if it is 100 or more and less than 300, the thrombus formation inhibitory ability is strong (+). If present, the ability to inhibit thrombus formation was considered to be stronger (++), and if less than 50, the ability to inhibit thrombus formation was judged to be even stronger (+++).
  • Cell adhesion is a property indicating the ease of cell adhesion to a material, and is measured by the following evaluation method. Cut each sample of antithrombotic metal material to a size of 1.0 x 0.5 cm, put one in a well of a 24-well microplate for cell culture (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), A metal pipe-shaped weight having a thickness of 1 mm was placed from above. Normal human umbilical vein endothelial cells (Takara Bio Inc.) suspended in 2% FBS endothelial cell culture medium kit-2 (Takara Bio Inc.) were added at 4 ⁇ 10 4 cells per well.
  • Ab Absorbance of the blank solution (without the cells only with the medium and the solution of Cell Counting Kit-8) As: Calculated absorbance
  • Cell adhesion (%) As (sample) X 100 / As (control) Formula 6 As (sample): Absorbance calculated after incubating the sample As (control): Absorbance calculated after incubating the same metal material (positive control) not coated with the coating material
  • the cell adhesion score was determined based on the cell adhesion (%). Specifically, if the cell adhesion (%) is less than 50%, the cell adhesion is weak ( ⁇ ), and if the cell adhesion (%) is 50% or more and less than 90%, the cell adhesion is strong. (+) If the cell adhesiveness (%) was 90% or more, it was determined that the cell adhesiveness was stronger (++).
  • the antithrombotic metal material of the present invention can be used for medical devices (medical devices and medical instruments) that require high antithrombogenic properties for a long period of time in the medical field.

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Abstract

　本発明は低溶血毒性に対する安全性が高められ、持続的に高い抗血栓性を発揮する抗血栓性金属材料を提供することを目的としている。本発明は、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物と、を含む被覆材料によって金属材料の表面が被覆され、上記ポリマーは、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体と共有結合され、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体は、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して上記金属材料に結合され、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在量の比率が４．０～１３．０原子数％である、抗血栓性金属材料を提供する。

Description

抗血栓性金属材料
　本発明は、抗血栓性金属材料に関する。
　血液と接触する医療器材（医療機器及び医療器具）（より具体的には、人工腎臓、人工肺、人工血管、人工弁、ステント、ステントグラフト、カテーテル、遊離血栓捕獲器具、血管内視鏡、縫合糸、血液回路、チューブ類、カニューレ、血液バッグ及び注射器等）は、血液の凝固による機能低下を防ぐために、高い抗血栓性が求められている。
　特に、ステントのような金属材料で作製された医療器材は、血液に対しては異物認識され易く、血栓を形成し易い。
　金属材料に抗血栓性を付与するために、抗凝固剤であるヘパリン又はヘパリン誘導体を金属材料の表面にコーティング又は化学結合させる手法が報告されている。ヘパリン又はヘパリン誘導体を金属材料の表面にコーティング又は化学結合させる手法としては、主に、１）金属材料の表面に導入された官能基と、ヘパリン又はヘパリン誘導体を共有結合させることにより固定化する方法と、２）有機カチオン混合物とヘパリン若しくはヘパリン誘導体との間でイオン複合体を形成させ、有機溶媒に溶かして金属材料の表面にコーティングする方法、３）金属材料の表面に導入された正電荷を帯びたカチオン性化合物と、ヘパリン又はヘパリン誘導体をイオン結合させることにより固定化する方法が知られている。
　１）の方法としては、アミノ化ヘパリンをカップリング剤と架橋剤を介してオゾン処理した金属材料の表面に共有結合させる方法（特許文献１）、ヘパリン、ドパミン、架橋活性化剤、架橋活性補助剤を含むコーティング液を用いて、ヘパリンを金属材料の表面に固定化する方法（特許文献２）が報告されている。
　２）の方法としては、第４級アンモニウム塩等の有機カチオン混合物とヘパリン又はヘパリン誘導体との間でイオン複合体を形成させ、有機溶媒に溶かして金属材料の表面にコーティングする方法が報告されている（特許文献３）。
　３）の方法としては、プラズマ処理によって金属材料の表面にジアミノシクロヘキサンからなるアミン群を導入した後、導入したアミン群にヘパリンをイオン結合で固定化する方法が報告されている（特許文献４）。
　一方、ヘパリン等の負電荷を帯びたタンパク質非吸着性物質を基材の表面に結合させることで、細胞の表面への吸着を阻害する方法が報告されている（特許文献５）。
特許第３９３８４１８号公報 特許第５５７６４４１号公報 特許第４２７３９６５号公報 韓国特許出願公開第２０００－００５９６８０号 特許第４９８２７５２号公報
　しかしながら、特許文献１又は２で開示された方法では、ヘパリン又はヘパリン誘導体がポリマー若しくは低分子化合物に共有結合されることによって金属材料の表面に固定化されているために、その自由度が低下してしまい、必要とされる抗凝固活性を得ることが困難である。
　また、特許文献３で開示された方法では、第４級アンモニウム塩等の有機カチオン混合物とヘパリン又はヘパリン誘導体との間でイオン複合体を形成させ、有機溶媒に溶かして金属材料表面にコーティングしているが、コーティング後の乾燥工程において、イオン複合体中の親水性の高い部分が有機溶媒を避けて凝集して相分離を引き起こすため、金属材料表面に均一にコーティングできないのが現状である。さらに、第４級アンモニウム塩等の有機カチオン混合物は、血液等の体液との接触により溶出し易く、ヘパリン又はヘパリン誘導体の溶出速度を制御できない。
　さらに、特許文献４には、金属材料の表面にアミノ基を有するカチオン性化合物を導入し、そのカチオン性化合物に対して、アニオン性の抗凝固活性を有する化合物であるヘパリンをイオン結合させて固定化する方法が記載されているが、導入する適切なヘパリン又はヘパリン誘導体の量については記載されていない。さらに、金属材料の表面に導入されるカチオン性化合物の適切な量について検討はされていなかった。被覆するカチオン性化合物の量が少なすぎる場合、高い抗血栓性は得られず、多すぎる場合は、溶血毒性を示してしまう可能性がある。
　一方、特許文献５に記載されているように、従来は、ヘパリン等を基材に付着させることで、基材表面に対する細胞接着性が低下してしまうことが知られているため、ヘパリン等を用いた抗血栓性材料を人工血管やステント、ステントグラフト等に用いた場合、血栓を防ぐことはできる一方で、内皮細胞などの接着・増殖による生体化を阻害してしまう場合がある。
　そこで本発明は、低溶血毒性に対する安全性が高められ、長期間持続的に高い抗血栓性を発揮する抗血栓性金属材料を提供することを目的としている。
　さらに、本発明は、抗血栓性を持たせつつ、表面に対する細胞接着性を低下させることのない抗血栓性金属材料を提供することを目的としている。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、以下の（１）～（９）の発明を見出すに至った。
（１）　ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物と、を含む被覆材料によって金属材料の表面が被覆され、上記ポリマーは、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体と共有結合され、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体は、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して上記金属材料に結合され、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在量の比率が４．０～１３．０原子数％である、抗血栓性金属材料。
（２）　表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率が３．０～６．０原子数％である、（１）記載の抗血栓性金属材料。
（３）　上記ポリマーは、第４級アンモニウム基を有する、（１）又は（２）記載の抗血栓性金属材料。
（４）　上記第４級アンモニウム基は、窒素原子に結合する炭素鎖がアルキル基で構成され、該アルキル基１つ当たりの炭素数が１～１２個である、（３）記載の抗血栓性金属材料。
（５）　上記被覆材料は、アクリル酸、メタクリル酸、α－グルタミン酸、γ－グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むアニオン性ポリマー、又は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸からなる群から選択されるアニオン性化合物を含む、（１）～（４）のいずれか記載の抗血栓性金属材料。
（６）　上記硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物は、ヘパリン又はヘパリン誘導体である、（１）～（５）のいずれか記載の抗血栓性金属材料。
（７）　上記ポリマーの重量平均分子量は、６００～２００００００である、（１）～（６）のいずれか記載の抗血栓性金属材料。
（８）　上記金属材料は、鉄、チタン、アルミニウム、スズ、金、銀、銅、白金、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、タングステン及びこれらの合金並びにこれらの金属の酸化物及び水酸化物からなる群から選択される、（１）～（７）のいずれか記載の抗血栓性金属材料。
（９）　（１）～（８）のいずれか記載の抗血栓性金属材料から製造された、体内留置用の医療器材。
　本発明の抗血栓性金属材料は、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体が、自身が有するホスホン酸基又はカテコール基を介して金属表面に結合され、ポリマーがホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体に共有結合され、ポリマーがイオン結合によって硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を遊離可能な状態で金属材料の表面に保持することによって、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物以外の成分の溶出を抑えることができ、低溶血毒性を保ちながら、長期にわたって抗凝固活性を発揮することができるため、抗血栓性を必要とする金属材料製の医療器材（例えば、ステント及びステントグラフト等）に好適に利用できる。
　本発明の抗血栓性金属材料は、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物と、を含む被覆材料によって金属材料の表面が被覆され、上記ポリマーは、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体と共有結合され、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体は、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して、上記金属材料に結合され、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率が、４．０～１３．０原子数％であることを特徴としている。
　本明細書において使用する用語は、特に断りがない限り、下記に示す定義を用いる。
　ここで、抗血栓性とは、血液と接触する表面で血液が凝固しない性質であり、例えば、血小板の凝集や、トロンビンに代表される血液凝固因子の活性化等で進行する血液凝固、を阻害する性質を指す。
　ここで、抗血栓性金属材料とは、抗血栓性が付与された金属材料のことであり、特に限定されるものではないが、医療器材（医療機器及び医療器具）（より具体的には、ステント、ステントグラフト等）を構成する材料として用いることができる。これらの医療器材は血液と接触するため、医療器材の表面では血液凝固が進行しやすく、抗血栓性金属材料を用いることが必要とされている。
　本発明における金属材料は、特に限定されるものではないが、生体適合性の高い金属であることが好ましく、例えば、鉄、チタン、アルミニウム、スズ、金、銀、銅、白金、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、タングステン及びこれらの合金、並びにこれらの金属酸化物及び水酸化物からなる群から選択されることが好ましい。この中でも、ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６Ｌ、ＳＵＳ４２０Ｊ２、ＳＵＳ６３０等のステンレス、コバルト－クロム合金、ニッケル－チタン合金及び亜鉛－タングステン合金からなる群から選択される合金及び合金の金属酸化物であることが好ましく、ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６Ｌ、ＳＵＳ４２０Ｊ２、ＳＵＳ６３０等のステンレス系がより好ましく、ＳＵＳ３０４がさらに好ましい。また、上記金属材料は、特に表面に酸化物または水酸化物を有していることが好ましい。
　被覆材料とは、金属材料の表面の少なくとも一部を被覆する材料のことであり、本発明において被覆材料は、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマー（以下「被覆材料を構成するポリマー」という）と、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を含んでいる。
　本発明において、被覆材料を構成するホスホン酸誘導体は、化合物中の炭素原子にホスホン酸基（－ＰＯ３Ｈ２）が結合した有機化合物である。
　上記ホスホン酸誘導体は、化合物中の炭素原子にホスホン酸基（－ＰＯ３Ｈ２）が結合した化合物であれば、特に限定されないが、本発明の被覆材料を構成するポリマーと共有結合することによって被覆を安定化して高い抗血栓性を発揮し、ポリマーの溶出を抑制することができることが特に好ましいので、ポリマーと反応できる反応性の官能基を有していることが好ましい。例えば、カルボキシアルキルホスホン酸又はアミノアルキルホスホン酸が好ましく、カルボキシアルキルホスホン酸がより好ましい。
　上記カルボキシアルキルホスホン酸誘導体の炭素原子の数は特に限定されないが、例えば、化合物Ａ（以下の一般式（Ｉ））や化合物Ｂ（以下の一般式（ＩＩ））があげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明において、被覆材料を構成するカテコール誘導体は、化合物中の炭素原子に以下の一般式（ＩＩＩ）で示されるカテコール基が結合した有機化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、ｎは１～５の整数を表す。］
　カテコール誘導体は、化合物中の炭素原子に一般式（ＩＩＩ）で示されるカテコール基が結合した化合物であれば、特に限定されないが、本発明の被覆材料を構成するポリマーと共有結合することによって被覆を安定化して高い抗血栓性を発揮し、ポリマーの溶出を抑制することができることが特に好ましいので、ポリマーと反応できる反応性の官能基を有していることが好ましい。例えば、末端にカルボキシル基やアミノ基を有していることが好ましく、カルボキシル基を有していることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、ｎは１～５の整数を表す。］
　カテコール誘導体の炭素原子の数は特に限定されないが、例えば、化合物Ｃ（以下の一般式（ＩＶ））や化合物Ｄ（以下の一般式（Ｖ）、化合物Ｅ（以下の一般式（ＶＩ）、化合物Ｆ（以下の一般式（ＶＩＩ））があげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　具体的に、抗血栓性金属材料の表面における被覆材料を構成する組成物の存在は、飛行時間型２次イオン質量分析法（以下、「ＧＣＩＢ－ＴＯＦ－ＳＩＭＳ」）によって求めることができる。
［測定条件］
　装置　　　　　　　　　　　：ＴＯＦ．ＳＩＭＳ５（ＩＯＮ－ＴＯＦ社製）
　１次イオン種　　　　　　　：Ｂｉ３ ＋＋
　２次イオン極性　　　　　　：正又は負
　エッチングイオン　　　　　：Ａｒガスクラスターイオン（Ａｒ－ＧＣＩＢ）
　質量範囲（ｍ／ｚ）　　　　：０～１５００
　ラスターサイズ　　　　　　：３００μｍ四方
　ピクセル数（１辺）　　　　：１２８ピクセル
　後段加速　　　　　　　　　：１０ｋＶ
　測定真空度（試料導入前）　：４×１０－７Ｐａ以下
　１次イオン加速電圧　　　　：３０ｋＶ
　パルス幅　　　　　　　　　：５．１ｎｓ
　バンチング　　　　　　　　：あり（高質量分解能測定）
　帯電中和　　　　　　　　　：なし
　超高真空中においた抗血栓性金属材料の表面にパルス化された１次イオンが照射され、抗血栓性金属材料の表面から放出された２次イオンが一定の運動エネルギーを得て飛行時間型の質量分析計へ導かれる。２次イオンの質量に応じて質量スペクトルが得られるため、抗血栓性金属材料の表面に存在する有機物や無機物の同定、そのピーク強度から存在量に関する情報が得られる。また、Ａｒガスクラスターイオンビームを併用することで、深さ方向分析も可能である。
　抗血栓性金属材料の表面におけるホスホン酸誘導体の存在は、ＧＣＩＢ－ＴＯＦ－ＳＩＭＳにより観測される負２次イオンの３１Ｐ－ピーク、４７ＰＯ－ピーク、６３ＰＯ２ －ピーク、７９ＰＯ３ －ピーク、９４ＣＨ３ＰＯ３ －ピーク、１０７Ｃ２Ｈ４ＰＯ３ －ピーク、２６５Ｃ１１Ｈ２２ＰＯ５ －ピーク、正２次イオンの６５ＰＨ２Ｏ２ ＋ピーク、８２ＰＨ３Ｏ３ ＋ピーク、９６ＣＨ５ＰＯ３ ＋ピーク、２４９Ｃ１１Ｈ２２ＰＯ４ ＋ピーク、２７７Ｃ１２Ｈ２２ＰＯ５ ＋ピークからなる群から選択される少なくとも一種類のピークの検出から確認できる。
　抗血栓性金属材料の表面におけるカテコール誘導体の存在は、ＧＣＩＢ－ＴＯＦ－ＳＩＭＳにより観測される負２次イオンの９８Ｃ４Ｈ４ＮＯ２ －ピーク、１１６Ｃ４Ｈ６ＮＯ３ －ピーク、１２２Ｃ７Ｈ６Ｏ２ －ピーク、１３５Ｃ８Ｈ７Ｏ２ －ピーク、２５２Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ５ －ピーク、正２次イオンの１３７Ｃ８Ｈ９Ｏ２ ＋ピーク、１５４Ｃ８Ｈ１２ＮＯ２ ＋ピーク、２０８Ｃ１２Ｈ１８ＮＯ２ ＋ピーク及び２５４Ｃ１２Ｈ１６ＮＯ５ ＋ピークからなる群から選択される少なくとも一種類のピークの検出から確認できる。
　例えば、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物がヘパリンである場合には、抗血栓性金属材料の表面におけるヘパリンの存在は、負２次イオンの８０ＳＯ３ －ピーク、９７ＳＯ４Ｈ－ピーク、７１Ｃ３Ｈ３Ｏ２ －ピーク及び８７Ｃ３Ｈ３Ｏ３ －ピークからなる群から選択される少なくとも一種類のピークの検出から確認できる。
　例えば、被覆材料を構成するポリマーにポリエチレンイミン（以下ＰＥＩ）が含まれる場合には、抗血栓性金属材料の表面におけるＰＥＩの存在は、ＧＣＩＢ－ＴＯＦ－ＳＩＭＳにより観測される正２次イオンの１８ＮＨ４ ＋ピーク、２８ＣＨ２Ｎ＋ピーク、４３ＣＨ３Ｎ２ ＋ピーク、７０Ｃ４Ｈ８Ｎ＋ピーク、負２次イオンの２６ＣＮ－ピーク及び４２ＣＮＯ－ピークからなる群から選択される少なくとも一種類のピークの検出から確認できる。
　例えば、被覆材料を構成するポリマーにポリアクリル酸（以下、「ＰＡＡ」）が含まれる場合には、抗血栓性金属材料の表面におけるＰＡＡの存在は、ＧＣＩＢ－ＴＯＦ－ＳＩＭＳにより観測される負２次イオンの７１Ｃ３Ｈ３Ｏ２ －ピークの検出から確認できる。
　本発明において、被覆材料を構成するポリマーは、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーである。これらの構成モノマーは、カチオン性の窒素原子を有しているため、ポリマーはカチオン性となり、一方、硫黄原子を含む抗凝固活性を有する化合物はアニオン性であるため、イオン結合することができる。硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物は、ヘパリン又はヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、ポリビニルスルホン酸及びポリスチレンスルホン酸等が挙げられ、ヘパリン又はヘパリン誘導体がより好ましい。また、ヘパリン又はヘパリン誘導体は、血液凝固反応を阻害できるものであれば特に限定されず、臨床で一般的に広く使われているヘパリン、未分画ヘパリンや低分子量ヘパリンのほか、アンチトロンビンＩＩＩに高親和性のヘパリン等も含まれる。
　被覆材料を構成するポリマーは、カチオン性を有しており細胞毒性等を発現する可能性があるため、血液等の体液中に溶出することは好ましくない。そのため、被覆材料を構成するポリマーは、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合しており、さらにホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体が、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して金属材料の表面に結合することで、金属材料の表面に安定して固定化されている。また、金属材料の表面において、金属とホスホン酸基においては、酸素原子を介して金属原子とリン原子が共有結合（金属－Ｏ－Ｐ）していることが好ましく、金属とカテコール基においては、酸素原子を介して金属原子とベンゼン環中の炭素原子が共有結合（金属－Ｏ－Ｐｈ）していることが好ましい。金属材料とホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体の共有結合の確認は、ポリマーを溶解する溶剤で洗浄しても溶出しないことから判定することができる。
　ここで、共有結合とは、原子同士で互いの電子を共有することによって生じる化学結合を指し、単結合であっても多重結合であっても構わない。ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と被覆材料を構成するポリマーの共有結合の種類は、限定されるものではないが、例えば、アミン結合、アジド結合、アミド結合、イミン結合等が挙げられる。その中でも特に共有結合の形成しやすさや結合後の安定性等の観点からアミド結合がより好ましい。
　被覆材料を構成するポリマーは、単独重合体であってもよく、共重合体であってもよい。ポリマーが共重合体である場合には、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体又は交互共重合体のいずれであってもよいが、ブロック共重合体の場合、窒素原子を含んだ繰り返し単位が連続するブロックの部分と硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とで相互作用する方が、強固にイオン結合するため、ブロック共重合体がより好ましい。
　ここで、単独重合体とは、１種類の構成モノマーを重合して得られる高分子化合物をいい、共重合体とは、２種類以上のモノマーを共重合して得られる高分子化合物をいう。中でもブロック共重合体とは、繰り返し単位の異なる少なくとも２種類以上のポリマーが共有結合でつながり、長い連鎖になったような分子構造の共重合体をいい、ブロックとは、ブロック共重合体を構成する「繰り返し単位の異なる少なくとも２種類以上のポリマー」のそれぞれを指す。
　本発明において、ポリマーの構造は直鎖状でもよいし、分岐状でもよい。本発明においては、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物、と多点でより安定なイオン結合を形成することができるため、分岐状ポリマーの方がより好ましい。
　本発明において、ポリマーは、第１級から第３級のアミノ基及び第４級アンモニウム基のうち少なくとも１つの官能基を有しているが、その中でも、第４級アンモニウム基は、第１級から第３級のアミノ基よりも硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用が強固であり、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の溶出速度が制御しやすいため、好ましい。
　本発明において、第４級アンモニウム基を構成する３つのアルキル基の炭素数は特に限定されるものではないが、多すぎると疎水性が高く、また立体障害が大きくなるため、第４級アンモニウム基に効果的に硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物がイオン結合できなくなる。また、多すぎると細胞毒性も生じやすくなることから、第４級アンモニウム基を構成する窒素原子に結合しているアルキル基１つあたりの炭素数は１～１２が好ましく、さらには、２～６が好ましい。第４級アンモニウム基を構成する窒素原子に結合している３つのアルキル基は全て同じ炭素数であってもよいし、異なっていてもよい。
　本発明において、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とイオン相互作用に基づく吸着量が多いことから、ポリマーとしてポリアルキレンイミンを用いることが好ましい。ポリアルキレンイミンとしては、ＰＥＩ、ポリプロピレンイミン及びポリブチレンイミン、さらにはアルコキシル化されたポリアルキレンイミン等が挙げられ、なかでもＰＥＩがより好ましい。
　ＰＥＩの具体例としては、“ＬＵＰＡＳＯＬ”（登録商標）（ＢＡＳＦ社製）や“ＥＰＯＭＩＮ”（登録商標）（株式会社日本触媒社製）等が挙げられるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーとの共重合体であってもよく変性体であってもよい。ここでいう変性体とは、ポリマーを構成するモノマーの繰り返し単位は同じであるが、例えば、放射線の照射により、その一部がラジカル分解や再結合等を起こしているものを指す。
　本発明において、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライド以外に用いられる、共重合体を形成する構成モノマーは、特に限定されるものではないが、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、ビニルカプロラクタム、酢酸ビニル、スチレン、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート及びシロキサン等が例示できる。アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライド以外に用いられる、共重合体を形成する構成モノマーは、多すぎると硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物、とのイオン結合が弱くなるので１０重量％以下であることが好ましい。
　本発明において、被覆材料を構成するポリマーの重量平均分子量が小さすぎると、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物よりも分子量が小さくなるため、金属材料の表面で安定したイオン結合が形成されず、目的の抗血栓性が得られにくくなる。一方で、ポリマーの重量平均分子量が大きすぎると、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物がポリマーによって内包されてしまい、被覆材料の最表面に露出しなくなってしまう。このため、被覆材料を構成するポリマーの重量平均分子量は、６００～２００００００が好ましく、１０００～１５０００００がより好ましく、１００００～１００００００がさらにより好ましい。ポリマーの重量平均分子量は、例えば、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法や、光散乱法等により測定することができる。
　本発明において、被覆材料を構成する硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の例としては、血液凝固反応を阻害できるものであれば良く、臨床で一般的に広く使われているヘパリン、未分画ヘパリンや低分子量ヘパリンのほか、アンチトロンビンＩＩＩに高親和性のヘパリン、デキストラン硫酸等も含まれる。ヘパリンの具体例としては、“ヘパリンナトリウム”（Ｏｒｇａｎｏｎ　ＡＰＩ社製）等が挙げられる。ヘパリン又はヘパリン誘導体は、精製されていてもよいし、されていなくてもよい。
　本発明において、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物以外の成分の溶出を抑えたまま、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の抗凝固活性を長期間持続的に高い活性で発現するために、本願発明者らが鋭意検討した結果、抗血栓性金属材料の表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）による全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率に最適な値が存在することを見出した。原子の存在比率は、「原子数％」で表され、原子数％とは、全原子の存在量を１００とした時の、特定原子の割合を原子数換算で示したものである。
　すなわち、本発明において、抗血栓性金属材料の表面におけるＸＰＳによる全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率は、３．０～６．０原子数％が好ましく、３．２～５．５原子数％がより好ましく、５．０～５．５原子数％がさらにより好ましい。全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率が３．０原子数％未満の場合、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の被覆量が少なくなるため、目的の抗血栓性は得られない。一方、全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率が６．０原子数％を超える場合は、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の被覆量が十分量存在し、目的の抗血栓性は得られるものの、イオン結合させるためのポリマーの量を多く必要とするため、溶出するにつれて露出した多量のポリマーが、カチオン性を有するために、溶血毒性を示すことが分かった。
　具体的に、抗血栓性金属材料の表面における全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率は、ＸＰＳによって求めることができる。
［測定条件］
　装置　　　　　　：ＥＳＣＡＬＡＢ２２０ｉＸＬ（ＶＧ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
　励起Ｘ線　　　　：ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃＡｌＫα１，２線（１４８６．６ｅＶ）
　Ｘ線径　　　　　：１ｍｍ
　Ｘ電子脱出角度　：９０°（抗血栓性金属材料の表面に対する検出器の傾き）
　ここでいう抗血栓性金属材料の表面とは、ＸＰＳの測定条件におけるＸ電子脱出角度、すなわち抗血栓性金属材料の表面に対する検出器の傾きを９０°として測定した場合に検出される、測定表面からの深さ１０ｎｍまでのことを指す。また、本発明において、金属材料には硫黄原子を含んでいても硫黄原子を含んでいなくてもよい。また、本発明において、金属材料には窒素原子を含んでいても窒素原子を含んでいなくてもよい。
　抗血栓性金属材料の表面にＸ線を照射し、生じる光電子のエネルギーを測定することで得られる物質中の束縛電子の結合エネルギー値から、抗血栓性金属材料の表面の原子情報が得られ、また各結合エネルギー値のピークのエネルギーシフトから価数や結合状態に関する情報が得られる。さらに、各ピークの面積比を用いて定量、すなわち各原子や価数、結合状態の存在比率を算出することができる。
　具体的には、硫黄原子の存在を示すＳ２ｐピークは結合エネルギー値が１６１ｅＶ～１７０ｅＶ付近に見られ、本発明においては、全ピークに対するＳ２ｐピークの面積比が３．０～６．０原子数％であることが好ましいことを見出した。全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率は、小数点第２位を四捨五入して、算出することとする。
　また、同様にしてＸＰＳ測定から、抗血栓性金属材料の表面におけるＸＰＳで測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率にも最適な値が存在することを見出した。すなわち、抗血栓性金属材料の表面におけるＸＰＳで測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率は、抗血栓性を高めるためには、４．０～１３．０原子数％が好ましく、９．０～１０．０原子数％がより好ましい。全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率が４．０原子数％以上の場合、金属材料表面に存在しているポリマーの量が十分な量となることで、ポリマーを介してイオン結合する、ヘパリン又はヘパリン誘導体のような硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の被覆量も好ましい抗血栓性を得るのに最適なイオン結合量となる。一方、全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率が１３．０原子数％以下の場合、金属材料表面に存在しているポリマーの量が多くなりすぎることによる硫黄原子を含む抗凝固活性を有する化合物が溶出するにつれて露出した多量のポリマーが、カチオン性を有するために、溶血毒性を示すことを防ぐことが出来る。
　具体的には、窒素原子の存在を示すＮ１ｓピークは結合エネルギー値が３９６ｅＶ～４０３ｅＶ付近に見られ、本発明においては、全ピークに対するＮ１ｓピークの面積比が４．０～１３．０原子数％であることが好ましいことを見出した。さらに、Ｎ１ｓピークは、主に炭素－窒素（以下、「Ｃ－Ｎ」）結合に帰属されるｎ１成分（３９９ｅＶ付近）と、アンモニウム塩又はＣ－Ｎ（ｎ１とは異なる構造）又は窒素酸化物（以下、「ＮＯ」）に帰属されるｎ２成分（４０１～４０２ｅＶ付近）にピーク分割することができる。各分割ピーク成分の存在比率は、以下の式１によって算出される。全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率及び各分割ピーク成分の存在比率は、小数点第２位を四捨五入して、算出することとする。
　分割ｒａｔｉｏ　　＝　Ｎ１ｓｒａｔｉｏ　×　（分割ｐｅｒｃｅｎｔ　／１００）　・・・式１
　　分割ｒａｔｉｏ　　：　各分割ピーク成分の存在比率（％）
　　Ｎ１ｓｒａｔｉｏ　：　全原子の存在量に対する窒素原子の存在比率（％）
　　分割ｐｅｒｃｅｎｔ　：　Ｎ１ｓピークにおける各分割ピーク成分の割合（％）
　Ｎ１ｓピークの分割によって得られるＮＯに帰属するｎ２成分は、本発明においては第４級アンモニウム基の存在を示すものであり、Ｎ１ｓピークの全成分に対するｎ２成分の割合、すなわち、分割ｐｅｒｃｅｎｔ（ｎ２）は、２０～７０原子数％が好ましく、２５～６５原子数％がより好ましく、３０～６０原子数％がさらに好ましいことを見出した。分割ｐｅｒｃｅｎｔ（ｎ２）が２０原子数％以上の場合、第４級アンモニウム基の存在量が十分な量となるため、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用が好ましい範囲になり、好ましい抗血栓性を得るのに最適な溶出速度が得られる。一方、分割ｐｅｒｃｅｎｔ（ｎ２）が７０原子数％以下の場合は、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用が強くなりすぎず、イオン複合体の形成による自由度の低下を防ぐことが出来るため、溶出速度が遅くなりすぎず、より好ましい抗凝固活性を得るための最適な溶出速度が得られる。また、ｎ２成分の存在比率、すなわち、分割ｒａｔｉｏ（ｎ２）は、式１によって算出されるため、上記理由により、１．４～８．４原子数％が好ましく、１．８～７．２原子数％がより好ましく、２．４～６．０原子数％がさらにより好ましい。
　また、炭素原子の存在を示すＣ１ｓピークは結合エネルギー値が２８２～２９２ｅＶ付近に見られ、Ｃ１ｓピークは、主に飽和炭化水素等の存在を示唆する炭素－水素（以下、「ＣＨｘ」）結合や、炭素－炭素（以下、「Ｃ－Ｃ」）結合、炭素＝炭素（以下、「Ｃ＝Ｃ」）結合に帰属されるｃ１成分（２８５ｅＶ付近）と、エーテルや水酸基の存在を示唆する炭素－酸素（以下、「Ｃ－Ｏ」）結合や、炭素－窒素（以下、「Ｃ－Ｎ」）結合に帰属されるｃ２成分（２８６ｅＶ付近）と、カルボニル基の存在を示唆する炭素＝酸素（以下、「Ｃ＝Ｏ」）結合に帰属されるｃ３成分（２８７～２８８ｅＶ付近）と、エステル基やカルボキシル基の存在を示唆する酸素＝炭素－酸素（以下、「Ｏ＝Ｃ－Ｏ」）結合に帰属されるｃ４成分（２８８～２８９ｅＶ付近）と、ベンゼン環等の共役系の存在を示唆するπ－π＊サテライトピーク（以下、「π－π」）結合に帰属されるｃ５成分（２９０～２９２ｅＶ付近）にピーク分割することができる。各分割ピーク成分の存在比率は、以下の式２によって算出される。全原子の存在量に対する炭素原子の存在比率及び各分割ピーク成分の存在比率は、小数点第２位を四捨五入して、算出することとする。
　分割ｒａｔｉｏ　　＝　Ｃ１ｓｒａｔｉｏ　×　（分割ｐｅｒｃｅｎｔ　／１００）　・・・式２
　　分割ｒａｔｉｏ　　：　各分割ピーク成分の存在比率（％）
　　Ｃ１ｓｒａｔｉｏ　：　全原子の存在量に対する炭素原子の存在比率（％）
　　分割ｐｅｒｃｅｎｔ　：　Ｃ１ｓピークにおける各分割ピーク成分の割合（％）
　Ｃ１ｓピークの分割によって得られるＣ＝Ｏ結合に帰属されるｃ３成分は、本発明においてはアミド基の存在を示すものであり、本発明においてＣ１ｓピークの全成分に対するｃ３成分の割合、すなわち、本発明において、抗血栓性金属材料の表面におけるＸＰＳで測定したアミド基の存在比率は、３．０原子数％以上が好ましく、８．０原子数％以上がより好ましく、１０．０原子数％以上がさらにより好ましいことを見出した。アミド基の存在比率が３．０原子数％以上の場合、被覆材料を構成するポリマーとホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体との間で、アミド結合による共有結合が十分に発生しているため、ポリマーの金属材料表面における立体配置の影響により硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン結合状態が悪くなるのを防ぐことができ、より好ましい抗血栓性を得ることができる。
　本発明の抗血栓性金属材料は、医療器材、例えば医療機器及び医療器具に好適に用いることができるが、特にステント及びステントグラフトの材料として用いることが好ましい。
　本発明の抗血栓性金属材料の製造方法を以下に示す。例えば、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体からなる群から選択される化合物と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を含んだ溶液の中に目的の金属材料を添加して被覆材料による被覆を行なってもよいが、上記ホスホン酸誘導体又は上記カテコール誘導体と、上記ポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の間で、その全てもしくはいずれか一部を予め反応させた後の被覆材料により、金属材料の表面を被覆してもよい。
　その中でも、金属材料の表面で抗血栓性を効率良く発現させるためには、第１の被覆工程として、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体を、自身の有するホスホン酸基又はカテコール基を介して金属材料の表面に結合させた後に、第２の被覆工程として、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合させてから、第３の被覆工程として硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を上記ポリマーにイオン結合させる方法がより好ましい。
　また、ポリマーが第１級から第３級のアミノ基を含んでいる場合、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用を強固にし、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の溶出速度を制御しやすくするため、第２の被覆工程後に、ポリマーを第４級アンモニウム化する工程を追加してもよい。
　第１の被覆工程として、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体を、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して金属材料の表面に結合させた後に、第２の被覆工程として、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合させてから、第３の被覆工程として硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を上記ポリマーにイオン結合させる方法を用いた場合の製造方法を以下に示す。
　第１の被覆工程として、ホスホン酸誘導体を、自身のホスホン酸基を介して金属材料の表面に結合させる方法は、特に限定されるものではないが、以下の方法が例示される。金属材料を、水、アセトン、メタノールの順で超音波洗浄後、真空乾燥する。ホスホン酸誘導体のテトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）溶液に室温で浸漬後、エバポレータで濃縮した後に真空乾燥する。１２０℃で加熱した後に、放冷後メタノールで超音波洗浄後、水で洗浄してから真空乾燥する。または、洗浄した金属材料をホスホン酸誘導体のエタノール溶液に３７℃で一晩浸漬してから、エタノールと水で洗浄後、真空乾燥する。
　第１の被覆工程として、カテコール誘導体を金属材料の表面に結合させる方法は、特に限定されるものではないが、例えば以下の方法が用いられる。金属材料を、水、アセトン、メタノールの順で超音波洗浄後、真空乾燥する。カテコール誘導体のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に室温で浸漬後、エバポレータで濃縮した後に真空乾燥する。１２０℃で加熱した後に、放冷後水で超音波洗浄してから、真空乾燥する。または、洗浄した金属材料をカテコール誘導体のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に３７℃で一晩浸漬してから、水で洗浄後、真空乾燥する。
　被覆材料を構成するポリマーとホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体を共有結合させる方法は、特に限定されるものではないが、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体が官能基（水酸基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビニル基、ハロゲン化アルキル基、イソシアネート基及びチオイソシアネート等）を有する場合、ポリマーと化学反応により共有結合させる方法がある。例えば、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体がカルボキシル基等を有する場合、水酸基、チオール基及びアミノ基等を有するポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合させればよいし、水酸基、チオール基及びアミノ基等を有する化合物をポリマーと共有結合させた後、カルボキシル基等を有するホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体に共有結合させる方法等が挙げられる。その他の方法として、第１の工程として、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーとを共有結合させてから、第２の工程として、ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体が有するホスホン酸基又はカテコール基を介して金属材料の表面に結合させた後に、第３の被覆工程として硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を上記ポリマーにイオン結合させる方法を用いることもできる。
　本発明において、より長期間持続的に高い抗血栓性を発現するために、アクリル酸、メタクリル酸、α－グルタミン酸、γ－グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むアニオン性ポリマー、又は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸からなる群から選択される少なくとも一種のアニオン性化合物のうち少なくとも一方をアルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマー、又はホスホン酸誘導体、又はカテコール誘導体と共有結合させる第１の追加工程を第２の被覆工程の後に行うことが好ましい。また、アニオン性ポリマー又はアニオン性化合物を、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと共有結合させる第２の追加工程を行い、その後、ヘパリン又はヘパリン誘導体のような硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を上記ポリマーとイオン結合させる第３の被覆工程を行うことがより好ましい。また、上記ポリマーが第１級から第３級のアミノ基を含んでいる場合、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用を強固にし、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の溶出速度を制御しやすくするため、第２の追加工程後に、ポリマーを第４級アンモニウム化する工程を追加してもよい。さらに、必要に応じて、アニオン性ポリマー又はアニオン性化合物及びポリマーを用いて、第３及び第４の追加工程を行ってもよい。
　アニオン性ポリマーは、特に限定されるものではないが、アニオン性官能基の重量比率が高い方が金属材料やホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体又は上記ポリマーとの共有結合による被覆量が多くなるため、ＰＡＡや、ポリメタクリル酸、ポリα－グルタミン酸、ポリγ－グルタミン酸、ポリアスパラギン酸を用いることが好ましく、ＰＡＡがより好ましい。
　ＰＡＡの具体例としては、“ポリアクリル酸”（和光純薬工業株式会社製）等が挙げられるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーとの共重合体であってもよく変性体であってもよい。
　アニオン性ポリマーは、特に限定されるものではないが、上記以外の構成モノマーと共重合体を形成していてもよく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ビニルピロリドン、ビニルアルコール、ビニルカプロラクタム、酢酸ビニル、スチレン、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、シロキサン等が例示できる。アニオン性ポリマーと共重合体を形成する構成モノマーは、多すぎると金属材料やホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体又は上記ポリマーとの共有結合による被覆量が少なくなるため、１０重量％以下であることが好ましい。
　アニオン性ポリマーの重量平均分子量が６００以上の場合、金属材料や上記ポリマーとの共有結合による被覆量がより好ましい値になるため、高い抗血栓性が得られる。一方で、アニオン性ポリマーの重量平均分子量が２００００００以下の場合、アニオン性ポリマーのサイズが大きすぎることにより、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物が埋もれる可能性を低減させるため好ましい。このため、アニオン性ポリマーの重量平均分子量は、６００～２００００００が好ましく、１００００～１００００００がより好ましい。
　アニオン性化合物は、特に限定されるものではないが、アニオン性官能基の重量比率が高い方が金属材料やホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体又は上記ポリマーとの共有結合による被覆量が多くなるため、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸を用いることが好ましく、コハク酸がより好ましい。
　第２の被覆工程において、ポリマーとホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体を共有結合させる方法としては、例えば脱水縮合剤等を用いて縮合反応させる方法がある。
　用いられる脱水縮合剤の種類は、特に限定されるものではないが、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、１－エーテル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１－エーテル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」）、１，３－ビス（２，２－ジメチルー１，３－ジオキソランー４－イルメチル）カルボジイミド、Ｎ－｛３－（ジメチルアミノ）プロピル－｝－Ｎ’－エチルカルボジイミド、Ｎ－｛３－（ジメチルアミノ）プロピル－｝－Ｎ’－エチルカルボジイミドメチオダイド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ’－エチルカルボジイミド、Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ’－（２－モルフォィノエチル）カルボジイミド　メソ－ｐ－トルエンスルフォネート、Ｎ，Ｎ’－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド又はＮ，Ｎ’－ジ－ｐ－トリカルボジイミド等のカルボジイミド系化合物や、４（－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルフォリニウムクロリドｎ水和物（以下、「ＤＭＴ－ＭＭ」）等のトリアジン系化合物が挙げられる。
　脱水縮合剤は、脱水縮合促進剤と共に用いてもよい。用いられる脱水縮合促進剤は、特に限定されるものではないが、例えば、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」）、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ－ヒドロキシコハク酸イミドが挙げられる。
　被覆材料を構成するポリマー、脱水縮合剤及び脱水縮合促進剤は、混合水溶液にして反応させてよいし、順番に添加して反応を行なってもよい。
　また、被覆材料を構成するポリマーが第１級から第３級のアミノ基を含んでいる場合、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用を強固にし、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物の溶出速度を制御しやすくさせる場合に、ポリマーを第４級アンモニウム化する工程を追加しても良い。
　被覆材料を構成するポリマーを第４級アンモニウム化する方法としては、ポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合する前に第４級アンモニウム化してもよいし、ポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体に共有結合した後に第４級アンモニウム化してもよい。しかしながら、被覆材料を構成するポリマーと硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン相互作用を強固にするためには、ポリマーが有する第４級アンモニウム基が被覆材料の表面側に存在させて、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物とのイオン結合をさせやすくすることが好ましいため、被覆材料を構成するポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合した後に第４級アンモニウム化するのが好ましい。具体的には、被覆材料を構成するポリマーをホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と共有結合した後に、塩化エーテル、臭化エチル等のハロゲン化アルキル化合物又はグリシジル基含有４級アンモニウム塩を直接接触させてもよいし、水溶液もしくは有機溶剤に溶解させて接触させてもよい。
　硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物を被覆材料を構成するポリマーにイオン結合させる第３の被覆工程としては、特に限定されるものではないが、水溶液の状態で接触させる方法が好ましい。
　本発明では抗血栓性金属材料の表面の抗ファクターＸａ活性を測定した。ここで、抗ファクターＸａ活性とは、プロトロンビンからトロンビンへの変換を促進する第Ｘａ因子の活性を阻害する程度を表す指標であり、例えば、抗血栓性金属材料における硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物がヘパリン又はヘパリン誘導体の場合には、その活性単位での表面量を知ることができる。測定には、“テストチーム（登録商標）　ヘパリンＳ”（積水メディカル株式会社製）を用いた。抗ファクターＸａ活性が低すぎると、抗血栓性金属材料におけるヘパリン又はヘパリン誘導体の表面量が少なく、目的の抗血栓性は得られにくくなる。すなわち、抗ファクターＸａ活性は、１５ｍＩＵ／ｃｍ２以上あることが好ましく、３０ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、１００ｍＩＵ／ｃｍ２であることがさらにより好ましい。ここでいう抗ファクターＸａ活性による表面量は、３７℃で生理食塩水に３０分浸漬した後に測定した数値を指す。
　本発明の抗血栓性金属材料は、金属材料の表面に被覆したヘパリン又はヘパリン誘導体の抗ファクターＸａ活性による総被覆量が少ないにも関わらず、生理食塩水に３０分浸漬した後の初期表面量が高いことが特徴である。総被覆量とは、抗ファクターＸａ活性により測定した全ての溶出量と抗血栓性金属材料の表面に残存する表面量を合計した量であり、多すぎると、被覆材料が厚くなってしまい、ステントとしての機能に影響が出てしまう一方で、低すぎると、目的の抗血栓性が得られにくくなる。すなわち、抗血栓性金属材料の表面の抗ファクターＸａ活性による総被覆量が１００００ｍＩＵ／ｃｍ２以下であり、かつ、生理食塩水に３０分浸漬した後の初期表面量が１５ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることが好ましく、１００００ｍＩＵ／ｃｍ２以下であり、かつ、生理食塩水に３０分浸漬した後の初期表面量が３０ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、総被覆量が５０００ｍＩＵ／ｃｍ２以下であり、かつ、生理食塩水に３０分浸漬した後の初期表面量が１００ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることがより好ましい。ここでいう溶出量とは、３７℃でヒト血漿に２４時間浸漬させて、ヒト血漿中に溶出してきた量を指す。測定には、“テストチーム（登録商標）　ヘパリンＳ”（積水メディカル株式会社製）を用いた。
　本発明において、抗血栓性金属材料が使用され続けることで、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物が溶出していくが、その際、露出したポリマーが、カチオン性を有するために、溶血毒性の懸念がある。溶血毒性を示す指標として、以下の式３で算出される、溶血率を用いた。溶血毒性は、厚生労働省が発行するガイドライン「医療機器の製造販売承認申請等に必要な生物学的安全性評価の基本的考え方について」の溶血毒性試験に沿って、表１のように溶血率の値でグレード分けされている。本発明における溶血毒性としては、非溶血性と軽度の溶血性あり、にグレード分けされることが好ましく、非溶血性、にグレード分けされることがより好ましい。
　溶血率（％）　＝　［（Ａｔ－Ａｎ）／（Ａｐ－Ａｎ）］×１００　・・・式３
　　Ａｔ　：　検体の吸光度
　　Ａｎ　：　陰性対照の吸光度
　　Ａｐ　：　陽性対照の吸光度
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
　金属材料としてＳＵＳ３０４の板材（縦：１ｃｍ、横０．５ｃｍ）を用いた。ＳＵＳ３０４を水、アセトン、メタノールの順で超音波洗浄後、真空乾燥した。洗浄したＳＵＳ３０４を１ｍＭの化合物Ａ（以下の一般式（Ｉ））エタノール溶液に３７℃で一晩浸漬してから、エタノールと水で洗浄後、真空乾燥して、ＳＵＳ３０４の表面に化合物Ａを共有結合させた（第１の被覆工程）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　次いでＳＵＳ３０４を、０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ（和光純薬工業株式会社製）、被覆材料の一部である５．０重量％ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）の水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させて化合物ＡにＰＥＩを縮合反応により共有結合させた（第２の被覆工程）。反応後の水溶液を除去し、蒸留水で洗浄した。
　さらにＳＵＳ３０４を、臭化エチル（和光純薬工業株式会社製）、若しくは臭化ペンチル（和光純薬工業株式会社製）の１重量％メタノール水溶液に浸漬し、３５℃で１時間反応させた後、５０℃に加温して４時間反応させ、ＰＥＩを第４級アンモニウム化した（第４級アンモニウム化工程）。反応後の水溶液を除去し、メタノールや蒸留水で洗浄した。
　最後に、０．７５重量％ヘパリンナトリウム（Ｏｒｇａｎｏｎ　ＡＰＩ社製）、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムの水溶液（ｐＨ＝４）に浸漬し、７０℃で６時間反応させて、ＰＥＩとイオン結合させた（第３の被覆工程）。反応後の水溶液を除去し、蒸留水で洗浄した。
　ここで、第４級アンモニウム化工程を実施せずに第３の被覆工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２、臭化ペンチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル３とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル１の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。また、サンプル２及び３の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。
（実施例２）
　化合物Ａを化合物Ｂ（以下の一般式（ＩＩ））に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、第１の被覆工程及び第２の被覆工程を実施した。また、実施例１と同様の操作を行い、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ここで、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第２の被覆工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル４、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第２の被覆工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル５とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル４及び５の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。
（実施例３）
　実施例１と同様の操作を行い、第１の被覆工程と第２の被覆工程を実施した後、ＳＵＳ３０４を０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、０．５重量％ＰＡＡ（和光純薬工業株式会社製）の水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第１の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、炭酸ナトリウム水溶液や蒸留水で洗浄した。
　さらにＳＵＳ３０４を、０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、５．０重量％ＰＥＩの水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第２の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、蒸留水で洗浄した。実施例１と同様の操作を行い、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ａで第１の被覆工程を実施し、ＰＥＩ（平均分子量約６００；和光純薬工業株式会社製）で第２の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル６、化合物Ａで第１の被覆工程を実施し、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第２の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル７、化合物Ｂで第１の被覆工程を実施し、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第２の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル８とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル４及び５の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。
（比較例１）
　ＳＵＳ３０４を水、アセトン、メタノールの順で超音波洗浄後、真空乾燥した。洗浄したＳＵＳ３０４に第３の被覆工程を実施し、ヘパリンをＳＵＳ３０４の表面にイオン結合させたＳＵＳ３０４をサンプル９とした。
　サンプル９について、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。また表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）による測定は実施していない。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル９の溶血毒性評価は非溶血性（－）であったが、抗ファクターＸａ活性による表面量は少なく、（－）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（－）であった。
（比較例２）
　実施例１と同様の操作を行い、第１の被覆工程、第２の被覆工程、第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ｂで第１の被覆工程を実施し、ＰＥＩ（平均分子量約６００；和光純薬工業株式会社製）で第２の追加工程を実施し、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１０、化合物Ａで第１の被覆工程を実施し、ＰＥＩ（平均分子量約６００；和光純薬工業株式会社製）で第２の追加工程を実施し、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１１とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル１０及び１１の溶血毒性評価は非溶血性（－）であったが、抗ファクターＸａ活性による表面量は少なく、（－）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（－）であった。
（比較例３）
　実施例１と同様の操作を行い、第１の被覆工程及び第２の被覆工程を実施した後、ＳＵＳ３０４を０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、０．５重量％ＰＡＡ（和光純薬工業株式会社製）の水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第１の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、炭酸ナトリウム水溶液や蒸留水で洗浄した。
　さらにＳＵＳ３０４を、０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、５．０重量％ＰＥＩの水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第２の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、蒸留水で洗浄した。
　さらにＳＵＳ３０４を、０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、０．５重量％ＰＡＡ（和光純薬工業株式会社製）の水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第３の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、炭酸ナトリウム水溶液や蒸留水で洗浄した。
　さらにＳＵＳ３０４を、０．５重量％ＤＭＴ－ＭＭ、５．０重量％ＰＥＩの水溶液に浸漬し、３０℃で２時間反応させた（第４の追加工程）。反応後の水溶液を除去し、蒸留水で洗浄した。実施例１と同様の操作を行い、臭化ドデカンのメタノール溶液を用いて第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第４の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１２、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第４の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１３とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル１１及び１２の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋＋）であったが、溶血毒性評価は軽度の溶血性あり（＋）であった。
（比較例４）
　特許第５５７６４４１号公報に開示された方法を用いて、ヘパリンを固定化したＳＵＳ３０４をサンプル１４とした。
　サンプル１４について、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。また表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）による測定は実施していない。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル９の溶血毒性評価は非溶血性（－）であったが、抗ファクターＸａ活性による表面量は少なく、（－）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（－）であった。
（実施例４）
　第１の被覆工程において、化合物Ａを化合物Ｃ（以下一般式ＩＶ）、化合物Ｄ（以下の一般式（Ｖ）、化合物Ｅ（以下の一般式（ＶＩ）、化合物Ｆ（以下の一般式（ＶＩＩ））のいずれかに変更して、洗浄したＳＵＳ３０４をそれぞれ１ｍＭの化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｅ又は化合物Ｆのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に３７℃で一晩浸漬してから、水で洗浄後、真空乾燥した（第１の被覆工程）。第１の被覆工程以外は、実施例１と同様の操作を行い、第２の被覆工程を実施した。また、臭化エチル又は臭化ペンチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ｃ（以下一般式ＩＶ）で第１の被覆工程、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第２の被覆工程、臭化エチルで第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１５、化合物Ｄ（以下一般式Ｖ）で第１の被覆工程、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第２の被覆工程、臭化エチルで第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１６、化合物Ｅ（以下一般式ＶＩ）で第１の被覆工程、ＰＥＩ（平均分子量約１００００；和光純薬工業株式会社製）で第２の被覆工程、臭化ペンチルで第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１７、化合物Ｆ（以下一般式ＶＩＩ）で第１の被覆工程、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第２の被覆工程、臭化ペンチルで第４級アンモニウム化工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１８とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル１５、１６、１７及び１８の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。
（実施例５）
　第１の被覆工程において、化合物Ａ又は化合物Ｂを、化合物Ｃ又は化合物Ｅのいずれかに変更して、洗浄したＳＵＳ３０４をそれぞれ１ｍＭの化合物Ｃ又は化合物Ｅのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に３７℃で一晩浸漬してから、水で洗浄後、真空乾燥した（第１の被覆工程）。第１の被覆工程以外は、実施例３と同様の操作を行い、第２の被覆工程、第１の追加工程、第２の追加工程を実施した。また、臭化エチルを用いて第４級アンモニウム化工程を実施した後、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ｃで第１の被覆工程、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第２の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル１９、化合物Ｅで第１の被覆工程、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第２の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２０とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル１９及び２０の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋＋）であり、溶血毒性評価も非溶血性（－）であった。
（比較例５）
　第１の被覆工程において、化合物Ａ又は化合物Ｂを、化合物Ｃ又は化合物Ｅのいずれかに変更して、洗浄したＳＵＳ３０４をそれぞれ１ｍＭの化合物Ｃ又は化合物Ｅのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に３７℃で一晩浸漬してから、水で洗浄後、真空乾燥した（第１の被覆工程）。第１の被覆工程以外は、比較例２と同様の操作を行い、第２の被覆工程、第４級アンモニウム化工程、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ｃで第１の被覆工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２１、化合物Ｅで第１の被覆工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２２とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル２１及び２２の溶血毒性評価は非溶血性（－）であったが、抗ファクターＸａ活性による表面量は少なく、（－）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（－）であった。
（比較例６）
　第１の被覆工程において、化合物Ａを、化合物Ｃ又は化合物Ｅに変更して、洗浄したＳＵＳ３０４をそれぞれ１ｍＭの化合物Ｃ又は化合物Ｅのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に３７℃で一晩浸漬してから、水で洗浄後、真空乾燥した（第１の被覆工程）。第１の被覆工程以外は、比較例３と同様の操作を行い、第２の被覆工程、第１の追加工程、第２の追加工程、第３の追加工程、第４の追加工程、第４級アンモニウム化工程、第３の被覆工程を実施した。
　ここで、化合物Ｃで第１の被覆工程、ＰＥＩ（ＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）　Ｐ；ＢＡＳＦ社製）で第４の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２３、化合物Ｅで第１の被覆工程、ＰＥＩ（平均分子量約７００００；和光純薬工業株式会社製）で第４の追加工程を実施したＳＵＳ３０４をサンプル２４とした。
　それぞれのサンプルについて、表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子及び硫黄原子の存在量の比率、生理食塩水に３０分浸漬した後の抗ファクターＸａ活性による表面量の測定、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性評価を実施した。結果を表２に示す。表２に示すとおり、サンプル２３及び２４の抗ファクターＸａ活性による表面量は多く、（＋＋＋）であり、ヒト全血液試験による評価での血栓形成の抑制能は、（＋＋＋）であったが、溶血毒性評価は軽度の溶血性あり（＋）であった。
　実施例１～５に記載のサンプルについて、細胞接着性試験による評価を実施した。結果を表３に示す。表３に示すとおり、サンプル１～５及び１５～１８の細胞接着性評価は（＋＋）であり、サンプル６～８、１９及び２０の細胞接着性評価は（＋）であった。
　同様に、比較例１～６に記載のサンプルについて、細胞接着性試験による評価を実施した。サンプル９～１１、２１及び２２の細胞接着性評価は（＋＋）であり、サンプル１２～１４、２３及び２４の細胞接着性評価は（－）であった。
　本発明の金属材料が有する抗血栓性と安全性について、抗ファクターＸａ活性による表面量、ヒト全血液試験による評価及び溶血毒性の評価方法を下記に示す。
　また、本発明の金属材料が有する細胞接着性について、吸光度を用いて培養後の細胞接着量を測定する細胞接着性試験による評価方法を下記に示す。
（評価１：抗ファクターＸａ活性による表面量）
　抗血栓性金属材料の各サンプルを０．５×０．５ｃｍのサイズにカットし、生理食塩水を用いて３７℃で３０分間洗浄した。洗浄後のサンプルを“テストチーム（登録商標）　ヘパリンＳ”（積水メディカル株式会社製）の操作手順に従って反応させ、４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダ（ＭＴＰ－３００；コロナ電気株式会社製）で測定した。“テストチーム（登録商標）　ヘパリンＳ”（積水メディカル株式会社製）の操作手順に従って検量線を作成して抗ファクターＸａ活性による表面量を算出した。表面量は高い程よく、１５ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることが好ましく、３０ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、１００ｍＩＵ／ｃｍ２以上であることがさらにより好ましい。表面量が１５ｍＩＵ／ｃｍ２未満であれば、表面量が少ないとして（－）、１５ｍＩＵ／ｃｍ２以上であれば表面量が多いとして（＋）、３０ｍＩＵ／ｃｍ２以上であれば表面量がさらに多いとして（＋＋）、１００ｍＩＵ／ｃｍ２以上であれば表面量がさらにより多いとして（＋＋＋）と判定した。
（評価２：ヒト全血液試験）
　抗血栓性金属材料の各サンプルを１．０×０．５ｃｍのサイズにカットし、被覆材料で被覆されていない同種の金属材料（陽性対照）を１．０×０．５ｃｍのサイズにカットし、生理食塩水で３７℃、３０分間洗浄してから２ｍＬのマイクロチューブに入れた。ヒト新鮮血に０．４Ｕ／ｍＬとなるようにヘパリンナトリウム注（味の素製薬株式会社製）を添加した後、このヒト血液を２ｍＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後にＳＵＳ３０４を取り出し、血液中のトロンビン－アンチトロンビン複合体（以下ＴＡＴ）の濃度を測定した。以下の式４に示すように、血栓形成抑制能を算出した。
　血栓形成抑制能　＝　Ｃｔ／Ｃｐｒｅ　・・・式４
　　Ｃｔ　：　サンプルをインキュベートした後の測定濃度（ｎｇ／ｍＬ）
　　Ｃｐｒｅ　：　サンプルをインキュベートする前の測定濃度（ｎｇ／ｍＬ）
　式４で算出した血栓形成抑制能が、３００以上であれば血栓形成抑制能は弱いとして（－）、１００以上３００未満であれば血栓形成抑制能は強いとして（＋）、５０以上１００未満であれば血栓形成抑制能はより強いとして（＋＋）、５０未満であれば血栓形成抑制能はさらにより強いとして（＋＋＋）と判定した。
（評価３：溶血毒性試験）
　ヒト新鮮血をガラスビーズ入り三角フラスコの壁面を伝うように入れた。手のひらの上で、水平に円を描くように、およそ１秒間に２回の間隔で約５分間振とうし、脱線維血を調製した。抗血栓性金属材料の各サンプルを１．０×０．５ｃｍのサイズにカットし、生理食塩水で３７℃、３０分間洗浄してから２ｍＬのマイクロチューブに入れた。金属材料が入ったマイクロチューブに生理食塩水で５０倍希釈した脱線維血を１ｍＬ添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、７５０Ｇで５分間遠心分離した。上清を採取し、５７６ｎｍでのＵＶ吸収を測定した。式３より算出した値が２より大きい値、すなわち溶血性有りであれば（＋）、２以下の値、すなわち非溶血性であれば（－）と判定した。溶血毒性は無い方がよく、非溶血性であることが好ましい。
（評価４：細胞接着性試験）
　細胞接着性とは、材料に対する細胞の接着のしやすさを示す性質であり、以下の評価法で測定される。抗血栓性金属材料の各サンプルを１．０×０．５ｃｍのサイズにカットし、細胞培養用の２４ウェル・マイクロプレート（住友ベークライト社製）のウェルに内壁面を上にして１枚入れ、上から肉厚１ｍｍの金属パイプ状の錘を乗せた。２％ＦＢＳ内皮細胞培地キット－２（タカラバイオ社製）に懸濁した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（タカラバイオ社）を１ウェル当たり４×１０４個になるように添加した。１ｍＬの培地中で３７℃、５％ＣＯ２の環境下で２４時間培養した。その後、ＰＢＳ（－）（ニッスイ社製）でリンスした後に、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学社製）を１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４時間培養した。その後、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダ（ＭＴＰ－３００；コロナ電気株式会社製）で測定して、以下の式５に示すように、吸光度を算出した。
　Ａｓ　＝　Ａｔ－Ａｂ　・・・式５
　　Ａｔ　：　測定値の吸光度
　　Ａｂ　：　ブランク溶液の吸光度（培地及びＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８の溶液のみで細胞なし。）
　　Ａｓ　：　算出された吸光度
　ここで、以下の式６に示すように、細胞接着性を算出した。
　細胞接着性（％）　＝　Ａｓ（sample）Ｘ　１００／Ａｓ（control）　・・・式６
　　Ａｓ（sample） ：　サンプルをインキュベートした後に算出された吸光度
　　Ａｓ（control） ：　被覆材料で被覆されていない同種の金属材料（陽性対照）をインキュベートした後に算出された吸光度
　細胞接着性（％）を元に細胞接着性のスコアを決定した。具体的には、細胞接着性（％）が５０％未満であれば細胞接着性は弱いとして（－）、細胞接着性（％）が５０％以上９０％未満であれば細胞接着性は強いとして（＋）、細胞接着性（％）が９０％以上であれば細胞接着性はより強いとして（＋＋）と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　本発明の抗血栓性金属材料は、医療分野において、長期間持続的に高い抗血栓性を必要とする医療器材（医療機器及び医療器具）に用いることができる。
 

Claims (9)

  1. 　ホスホン酸誘導体又はカテコール誘導体と、アルキレンイミン、ビニルアミン、アリルアミン、リジン、プロタミン及びジアリルジメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むポリマーと、硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物と、を含む被覆材料によって金属材料の表面が被覆され、
    　前記ポリマーは、前記ホスホン酸誘導体又は前記カテコール誘導体と共有結合され、
    　前記ホスホン酸誘導体又は前記カテコール誘導体は、自身のホスホン酸基又はカテコール基を介して前記金属材料に結合され、
    　表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する窒素原子の存在量の比率が４．０～１３．０原子数％である、抗血栓性金属材料。
  2. 　表面におけるＸ線電子分光法（ＸＰＳ）で測定した全原子の存在量に対する硫黄原子の存在比率が３．０～６．０原子数％である、請求項１記載の抗血栓性金属材料。
  3. 　前記ポリマーは、第４級アンモニウム基を有する、請求項１又は２記載の抗血栓性金属材料。
  4. 　前記第４級アンモニウム基は、窒素原子に結合する炭素鎖がアルキル基で構成され、該アルキル基１つ当たりの炭素数が１～１２個である、請求項３記載の抗血栓性金属材料。
  5. 　前記被覆材料は、アクリル酸、メタクリル酸、α－グルタミン酸、γ－グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される化合物を構成モノマーとして含むアニオン性ポリマー、又は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、リンゴ酸、酒石酸及びクエン酸からなる群から選択されるアニオン性化合物を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の抗血栓性金属材料。
  6. 　前記硫黄原子を含むアニオン性の抗凝固活性を有する化合物は、ヘパリン又はヘパリン誘導体である、請求項１～５のいずれか一項記載の抗血栓性金属材料。
  7. 　前記ポリマーの重量平均分子量は、６００～２００００００である、請求項１～６のいずれか一項記載の抗血栓性金属材料。
  8. 　前記金属材料は、鉄、チタン、アルミニウム、スズ、金、銀、銅、白金、クロム、コバルト、ニッケル、亜鉛、タングステン及びこれらの合金並びにこれらの金属の酸化物及び水酸化物からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項記載の抗血栓性金属材料。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項記載の抗血栓性金属材料から製造された、体内留置用の医療器材。
     
     
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