JP4982752B2 - タンパク質および細胞が内壁に固定された中空構造体 - Google Patents
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Description
本発明では、先端を針状に加工した電極を刺入するという簡便な方法で、レディーメードの中空構造体の内壁表面にタンパク質および細胞の接着領域を形成でき、内壁の局所にタンパク質および細胞が固定された中空構造体を提供できる。さらに、電極を針状にすることで、柔軟性のある中空構造体への電極の刺入を容易にし、また、電極を中空構造体から引き抜いた後に、刺入部位からの溶液の漏れを抑制できる。3次元構造体への細胞配置技術は、微小組織モデルの構築技術として重要であり、細胞を用いるバイオアッセイやバイオリアクターの実践に貢献するであろう。例えば、チューブ状構造体の内壁に敷き詰められた血管内皮細胞の一部を変性細胞に置換することで、薬剤や治療法開発のための組織疾患モデルを提供できる。また、肝臓などの代謝系組織を模倣した細胞ベースのリアクターにおいては、異種細胞の反復構造をチューブ内に作製することでリアクター効率の向上が期待できる。
本発明は、タンパク質および細胞非吸着性の内壁表面を有する中空構造体の局所を改質してタンパク質吸着領域を形成させることで作成されるタンパク質および細胞が局所的に固定された中空構造体であることを特徴としている。具体的には、このタンパク質および細胞の固定方法は、正電荷を帯びた中空構造体内壁表面に負電荷を帯びたタンパク質非吸着性物質を積層して形成したタンパク質非吸着性表面を形成する工程と、タンパク質非吸着性表面を局所的にタンパク質吸着性表面に改質する工程と、局所的に改質した領域にタンパク質および細胞を接着させる工程を含むことを特徴としている。
図2aに示すように、0.5mm径の白金線の先端を機械研磨することで針状に加工した。シリコンゴム製のチューブには、内径2mm、外径3mmのものを用いた。このチューブをアセトン、エタノール、純水の順で洗浄後、図2bに示すように、インレットおよびアウトレットを備え付けた。チューブ内の溶液の駆動は、チューブに接続したシリンジポンプに陽圧もしくは陰圧を印加することで行った。まず、チューブ内に5 mg mL-1 ポリエチレンイミン(PEI)水溶液、2 mg mL-1 ヘパリン水溶液を順に導入し、内壁にブロッキング処理を施した。続いて、25 mM KBrを含むリン酸バッファー(0.1 M、pH 7.4)をチューブに充填し、図2cに示すように、針状電極の先端を1mm程度チューブに刺入した。この針状電極(WE)およびアウトレット部のステンレス製注射針(CE)を、1.5Vの単3アルカリ乾電池のカソードおよびアノードに15秒間接続し、針状電極において電気化学的に次亜臭素酸を生成した。針状電極をチューブから引き抜いた後に、チューブ内に30μg mL-1 フィブロネクチン溶液を導入し、20分後にリン酸バッファーで洗浄した。その後、ウシ血清を含有するダルベッコ改変イーグル培養液(DMEM)中に懸濁させたNIH-3T3細胞をチューブ内に導入し、30分間のインキュベーション後、未接着の細胞を洗い流した。
図4は、ヘパリン処理およびポリ-L-リジン(PLL)処理を施したシリコンゴムチューブ内壁表面へのフィブロネクチンの相対吸着量である。ヘパリンは、上記実施例1と同様の手順でチューブ内壁に吸着させた。カチオン性のポリペプチドであるPLLは、ヘパリンを内壁に吸着させたチューブ内に40μg mL-1 PLL溶液を導入することでヘパリン表面上に静電的に固定した。次に、内壁をコートしていないチューブ、ヘパリン処理を施したチューブ、およびPLL処理を施したチューブに、それぞれ蛍光標識したフィブロネクチン溶液(30μg mL-1)を導入し、リン酸バッファーで洗浄後、蛍光観察を行った。フィブロネクチンの相対吸着量は、内壁をコートしていないチューブから観察された蛍光強度を基準に算出した。図4より、ヘパリンで内壁をコートしたチューブにはフィブロネクチンがほとんど吸着しないが、PLLを積層した後には未処理のシリコンゴムチューブと同程度のフィブロネクチンが吸着することがわかる。これは、ヘパリン処理を施した表面にPLL処理を施すことで、細胞非接着性の表面が細胞接着性へと改質されることを意味している。
Claims (6)
- 正電荷を帯びた中空構造体内壁表面に負電荷を帯びたタンパク質非吸着性物質を積層し
て形成したタンパク質非吸着性の内壁表面を有する中空構造体の外部からその内部に刺入
した電極に酸化電位もしくは酸化電流を印加して生成される活性化学種により、タンパク
質非吸着性表面を局所的にタンパク質吸着性表面に改質し、局所的に改質した領域にタン
パク質が固定されていることを特徴とする中空構造体。 - 正電荷を帯びた中空構造体内壁表面に負電荷を帯びたタンパク質非吸着性物質を積層し
て形成したタンパク質非吸着性の内壁表面を有する中空構造体の外部からその内部に刺入
した電極に酸化電位もしくは酸化電流を印加して生成される活性化学種により、タンパク
質非吸着性表面を局所的にタンパク質吸着性表面に改質し、局所的に改質した領域に細胞
接着性タンパク質を吸着させ、該細胞接着性表面に細胞が固定されていることを特徴とす
る中空構造体。 - 正電荷を帯びた中空構造体内壁表面がカチオン性ポリマーで形成されていることを特徴
とする請求項1または2に記載の中空構造体。 - 活性化学種は、ハロゲン化物イオンを酸化させて生成された活性ハロゲン種であること
を特徴とする請求項1に記載の中空構造体。 - 活性ハロゲン種は、次亜臭素酸(HBrO)または次亜塩素酸(HClO)であることを特徴と
する請求項4に記載の中空構造体。 - 細胞接着性タンパク質は、フィブロネクチン、コラーゲンおよびラミニンからなる群か
ら少なくとも1つが選択されることを特徴とする請求項2に記載の中空構造体。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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