CN107405431B

CN107405431B - 抗血栓性金属材料

Info

Publication number: CN107405431B
Application number: CN201680019476.7A
Authority: CN
Inventors: 门胁功治; 藤田雅规; 阪口有佳; 棚桥一裕
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2036-03-31
Also published as: EP3278819A4; BR112017017572A2; US10709822B2; RU2017134610A3; EP3278819B1; RU2711652C2; RU2017134610A; KR20170133321A; JPWO2016159243A1; EP3278819A1; CA2979779A1; CN107405431A; US20180344906A1; CA2979779C; BR112017017572B1; WO2016159243A1; JP6788796B2

Abstract

本发明的目的在于提供可提高相对于低溶血毒性的安全性、持续地发挥高的抗血栓性的抗血栓性金属材料。本发明提供抗血栓性金属材料，所述金属材料的表面用被覆材料被覆，所述被覆材料含有：膦酸衍生物或儿茶酚衍生物，包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白及二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物，和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，上述聚合物与上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物共价键合，上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于上述金属材料，表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率为4.0～13.0原子数%。

Description

抗血栓性金属材料

技术领域

本发明涉及抗血栓性金属材料。

背景技术

对于与血液接触的医疗器材（医疗仪器及医疗器具）（更具体而言，人工肾脏、人工肺、人工血管、人工瓣膜、支架、覆膜支架（stent graft）、导管、游离血栓捕获器具、血管内窥镜、缝合线、血液回路、管（tube）类、套管（cannula）、血袋及注射器等），为了防止因血液的凝固而导致的功能下降，要求高抗血栓性。

尤其是，关于支架这样的由金属材料制作的医疗器材，容易被血液识别为异物，容易形成血栓。

为了向金属材料赋予抗血栓性，报道了将作为抗凝剂的肝素或肝素衍生物涂覆或化学键合于金属材料的表面的方法。作为将肝素或肝素衍生物涂覆或化学键合于金属材料的表面的方法，主要已知下述方法：1）使肝素或肝素衍生物与导入至金属材料表面的官能团共价键合从而进行固定化的方法；2）在有机阳离子混合物与肝素或肝素衍生物之间形成离子复合体，将其溶解于有机溶剂而涂覆于金属材料的表面的方法；3）使肝素或肝素衍生物与导入至金属材料表面的带有正电荷的阳离子性化合物离子键合从而进行固定化的方法。

作为1）的方法，报道了下述方法：通过偶联剂和交联剂、使氨基化肝素共价键合于经臭氧处理的金属材料的表面的方法（专利文献1）；使用包含肝素、多巴胺、交联活化剂、交联活性辅助剂的涂覆液，将肝素固定于金属材料的表面的方法（专利文献2）。

作为2）的方法，报道了在季铵盐等有机阳离子混合物与肝素或肝素衍生物之间形成离子复合体，将其溶解于有机溶剂而涂覆于金属材料的表面的方法（专利文献3）。

作为3）的方法，报道了通过等离子体处理向金属材料的表面导入包含二氨基环己烷的胺群，然后以离子键将肝素固定于导入的胺群的方法（专利文献4）。

另一方面，报道了通过将肝素等带有负电荷的蛋白质非吸附性物质键合于基材的表面、从而抑制细胞吸附于表面的方法（专利文献5）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3938418号公报

专利文献2：日本专利第5576441号公报

专利文献3：日本专利第4273965号公报

专利文献4：韩国专利申请公开第2000-0059680号

专利文献5：日本专利第4982752号公报。

发明内容

发明所要解决的课题

然而，在专利文献1或2中公开的方法中，由于肝素或肝素衍生物共价键合于聚合物或低分子化合物、从而被固定于金属材料的表面，因此其自由度下降，难以得到所需要的抗凝活性。

另外，专利文献3中公开的方法中，在季铵盐等有机阳离子混合物与肝素或肝素衍生物之间形成离子复合体，将其溶解于有机溶剂而涂覆于金属材料表面，然而现状是，在涂覆后的干燥工序中，离子复合体中的亲水性高的部分被有机溶剂排斥而发生凝集，引起相分离，因此，无法均匀地涂覆于金属材料表面。此外，季铵盐等有机阳离子混合物容易通过与血液等体液的接触而溶出，无法控制肝素或肝素衍生物的溶出速度。

此外，专利文献4中记载了向金属材料的表面导入具有氨基的阳离子性化合物，使作为阴离子性的具有抗凝活性的化合物的肝素离子键合于该阳离子性化合物而将其固定的方法，但未记载导入的肝素或肝素衍生物的合适的量。此外，关于被导入至金属材料的表面的阳离子性化合物的合适的量并未进行考察。被覆的阳离子性化合物的量过少时，无法得到高的抗血栓性，过多时，可能导致出现溶血毒性。

另一方面，如专利文献5中记载那样，以往，已知通过将肝素等附着于基材，从而使得细胞相对于基材表面的粘接性下降，因此，在将使用了肝素等的抗血栓性材料用于人工血管、支架、覆膜支架等时，能防止血栓，另一方面，有时抑制由内皮细胞等的粘接・增殖带来的生物体化。

因此，本发明的目的在于提供可提高相对于低溶血毒性的安全性、长期持续地发挥高的抗血栓性的抗血栓性金属材料。

此外，本发明的目的在于提供不仅具有抗血栓性、而且不会使细胞相对于表面的粘接性下降的抗血栓性金属材料。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果，发现以下的（1）～（9）的发明。

（1）抗血栓性金属材料，其中，金属材料的表面被被覆材料被覆，所述被覆材料含有：膦酸衍生物或儿茶酚衍生物、包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物、和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，上述聚合物与上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物共价键合，上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于上述金属材料，表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率为4.0～13.0原子数%。

（2）根据（1）所述的抗血栓性金属材料，其中，表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的相对于全部原子的存在量的硫原子的存在比率为3.0～6.0原子数%。

（3）根据（1）或（2）所述的抗血栓性金属材料，其中，上述聚合物具有季铵基。

（4）根据（3）所述的抗血栓性金属材料，其中，上述季铵基的键合于氮原子的碳链由烷基构成，每1个该烷基的碳数为1～12个。

（5）根据（1）～（4）中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，上述被覆材料含有：包含选自由丙烯酸、甲基丙烯酸、α-谷氨酸、γ-谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的化合物作为构成单体的阴离子性聚合物、或选自由草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组中的阴离子性化合物。

（6）根据（1）～（5）中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，上述包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物为肝素或肝素衍生物。

（7）根据（1）～（6）中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，上述聚合物的重均分子量为600～2000000。

（8）根据（1）～（7）中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，上述金属材料选自由铁、钛、铝、锡、金、银、铜、铂、铬、钴、镍、锌、钨及它们的合金以及这些金属的氧化物及氢氧化物组成的组。

（9）体内留置用的医疗器材，其由（1）～（8）中任一项所述的抗血栓性金属材料制造。

发明的效果

对于本发明的抗血栓性金属材料而言，膦酸衍生物或儿茶酚衍生物通过自身所具有的膦酸基或儿茶酚基键合于金属表面，聚合物共价键合于膦酸衍生物或儿茶酚衍生物，聚合物通过利用离子键以可游离的状态将包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物保持于金属材料的表面，从而可抑制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物以外的成分溶出，可在保持低溶血毒性的同时、长期发挥抗凝活性，因此，可合适地应用于需要抗血栓性的金属材料制的医疗器材（例如，支架及覆膜支架等）。

具体实施方式

本发明的抗血栓性金属材料的特征在于，金属材料的表面被被覆材料被覆，所述被覆材料含有：膦酸衍生物或儿茶酚衍生物、包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物、和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，上述聚合物与上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物共价键合，上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于上述金属材料，表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子的存在量相对于全部原子的存在量的存在比率为4.0～13.0原子数%。

本说明书中，只要没有特别说明，使用的术语使用如下所示的定义。

此处所谓抗血栓性，是在与血液接触的表面血液不发生凝固的性质，例如是指抑制血小板的凝集、基于以凝血酶为代表的凝血因子的活化等而发生的凝血的性质。

此处所谓抗血栓性金属材料，是指被赋予了抗血栓性的金属材料，没有特别限制，可作为构成医疗器材（医疗仪器及医疗器具）（更具体而言，支架、覆膜支架等）的材料使用。由于这些医疗器材与血液接触，因而容易在医疗器材的表面发生凝血，需要使用抗血栓性金属材料。

本发明中的金属材料没有特别限制，优选生物相容性高的金属，例如优选选自由铁、钛、铝、锡、金、银、铜、铂、铬、钴、镍、锌、钨和它们的合金、以及这些金属的氧化物及氢氧化物组成的组。其中，优选选自由SUS304、SUS316L、SUS420J2、SUS630等不锈钢、钴-铬合金、镍-钛合金及锌-钨合金组成的组中的合金及合金的金属氧化物，更优选SUS304、SUS316L、SUS420J2、SUS630等不锈钢系，进一步优选SUS304。另外，上述金属材料特别优选在表面具有氧化物或氢氧化物。

所谓被覆材料，是指被覆金属材料的表面的至少一部分的材料，本发明中，被覆材料包含：膦酸衍生物或儿茶酚衍生物，包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物（以下称为“构成被覆材料的聚合物”），和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物。

本发明中，构成被覆材料的膦酸衍生物是膦酸基（-PO₃H₂）键合于化合物中的碳原子的有机化合物。

上述膦酸衍生物只要是膦酸基（-PO₃H₂）键合于化合物中的碳原子的化合物，就没有特别限制，特别优选通过与构成本发明的被覆材料的聚合物进行共价键合从而使被覆稳定化，发挥高抗血栓性，可抑制聚合物的溶出，因此，优选具有能与聚合物反应的反应性的官能团。例如，优选羧基烷基膦酸或氨基烷基膦酸，更优选羧基烷基膦酸。

上述羧基烷基膦酸衍生物的碳原子的数目没有特别限制，可举出例如化合物A（以下的通式（I））、化合物B（以下的通式（II））。

[化学式1]

[化学式2]

本发明中，构成被覆材料的儿茶酚衍生物是以下的通式（III）表示的儿茶酚基键合于化合物中的碳原子的有机化合物。

[化学式3]

［式中，n表示1～5的整数］。

儿茶酚衍生物只要是通式（III）表示的儿茶酚基键合于化合物中的碳原子的化合物，就没有特别限制，特别优选通过与构成本发明的被覆材料的聚合物进行共价键合从而使被覆稳定化，发挥高抗血栓性，可抑制聚合物的溶出，因此，优选具有能与聚合物反应的反应性的官能团。例如，优选在末端具有羧基、氨基，更优选具有羧基。

[化学式4]

［式中，n表示1～5的整数］。

儿茶酚衍生物的碳原子的数目没有特别限制，可举出例如化合物C（以下的通式（IV））、化合物D（以下的通式（V）、化合物E（以下的通式（VI）、化合物F（以下的通式（VII））。

[化学式5]

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

具体而言，构成抗血栓性金属材料的表面的被覆材料的组合物的存在可通过飞行时间型二次离子质谱法（以下记为“GCIB-TOF-SIMS”）而求出。

［测定条件］

装置：TOF.SIMS5（ION-TOF公司制）

1次离子种类：Bi₃ ⁺⁺

2次离子极性：正或负

蚀刻离子：Ar气团簇离子束（Ar-GCIB）

质量范围（m/z）：0～1500

光栅尺寸：300μm见方

像素数（1边）：128像素

后段加速：10kV

测定真空度（试样导入前）：4×10^-7Pa以下

1次离子加速电压：30kV

脉冲宽度：5.1ns

聚束：有（高质量分辨率测定）

静电中和：无。

向位于超高真空中的抗血栓性金属材料的表面照射经脉冲化的1次离子，从抗血栓性金属材料的表面释放的2次离子得到一定的动能，被导入至飞行时间型的质谱计。对应于2次离子的质量而得到质谱，因此，由存在于抗血栓性金属材料的表面的有机物、无机物的鉴定、其峰强度，可得到与存在量有关的信息。另外，通过并用Ar气团簇离子束，从而也能进行深度方向分析。

抗血栓性金属材料的表面的膦酸衍生物的存在可通过检测到选自由通过GCIB-TOF-SIMS观测到的负2次离子的³¹P^-峰、⁴⁷PO^-峰、⁶³PO₂ ^-峰、⁷⁹PO₃ ^-峰、⁹⁴CH₃PO₃ ^-峰、¹⁰⁷C₂H₄PO₃ ^-峰、²⁶⁵C₁₁H₂₂PO₅ ^-峰、正2次离子的⁶⁵PH₂O₂ ⁺峰、⁸²PH₃O₃ ⁺峰、⁹⁶CH₅PO₃ ⁺峰、²⁴⁹C₁₁H₂₂PO₄ ⁺峰、²⁷⁷C₁₂H₂₂PO₅ ⁺峰组成的组中的至少一种峰而确认。

抗血栓性金属材料的表面的儿茶酚衍生物的存在可通过检测到选自由通过GCIB-TOF-SIMS观测到的负2次离子的⁹⁸C₄H₄NO₂ ^-峰、¹¹⁶C₄H₆NO₃ ^-峰、¹²²C₇H₆O₂ ^-峰、¹³⁵C₈H₇O₂ ^-峰、²⁵²C₁₂H₁₄NO₅ ^-峰、正2次离子的¹³⁷C₈H₉O₂ ⁺峰、¹⁵⁴C₈H₁₂NO₂ ⁺峰、²⁰⁸C₁₂H₁₈NO₂ ⁺峰及²⁵⁴C₁₂H₁₆NO₅ ⁺峰组成的组中的至少一种峰而确认。

例如，包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物为肝素时，抗血栓性金属材料的表面的肝素的存在可通过检测到选自由负2次离子的⁸⁰SO₃ ^-峰、⁹⁷SO₄H^-峰、⁷¹C₃H₃O₂ ^-峰和⁸⁷C₃H₃O₃ ^-峰组成的组中的至少一种峰而确认。

例如，构成被覆材料的聚合物中包含聚乙烯亚胺（以下PEI）时，抗血栓性金属材料的表面的PEI的存在可通过检测到选自由通过GCIB-TOF-SIMS观测到的正2次离子的¹⁸NH₄ ⁺峰、²⁸CH₂N⁺峰、⁴³CH₃N₂ ⁺峰、⁷⁰C₄H₈N⁺峰、负2次离子的²⁶CN^-峰及⁴²CNO^-峰组成的组中的至少一种峰而确认。

例如，构成被覆材料的聚合物中包含聚丙烯酸（以下记为“PAA”）时，抗血栓性金属材料的表面的PAA的存在可通过检测到通过GCIB-TOF-SIMS观测到的负2次离子的⁷¹C₃H₃O₂ ^-峰而确认。

本发明中，构成被覆材料的聚合物是包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物。由于这些构成单体具有阳离子性的氮原子，因而聚合物成为阳离子性，另一方面，由于包含硫原子的具有抗凝活性的化合物为阴离子性，因而可进行离子键合。关于包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，可举出肝素或肝素衍生物、硫酸葡聚糖、聚乙烯基磺酸和聚苯乙烯磺酸等，更优选肝素或肝素衍生物。另外，对于肝素或肝素衍生物而言，只要能抑制凝血反应，就没有特别限制，除了临床上通常广泛使用的肝素、未纯化肝素、低分子量肝素之外，抗凝血酶III也包含高亲和性的肝素等。

构成被覆材料的聚合物具有阳离子性，可能呈现细胞毒性等，因此，在血液等体液中溶出是不理想的。因此，对于构成被覆材料的聚合物而言，通过经与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合，而且膦酸衍生物或儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于金属材料的表面，从而被稳定地固定于金属材料的表面。另外，在金属材料的表面，对于金属与膦酸基而言，优选金属原子与磷原子通过氧原子共价键合（金属-O-P），对于金属与儿茶酚基而言，优选金属原子与苯环中的碳原子通过氧原子共价键合（金属-O-Ph）。金属材料与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物的共价键合的确认可通过即使用溶解聚合物的溶剂进行洗涤也不溶出来判断。

此处，共价键是指原子彼此通过共有相互的电子而产生的化学键，可以是单键，也可以是多重键。膦酸衍生物或儿茶酚衍生物与构成被覆材料的聚合物的共价键的种类没有限制，可举出例如胺键、叠氮键、酰胺键、亚胺键等。其中，尤其是从共价键的形成容易性、键合后的稳定性等观点考虑，更优选酰胺键。

构成被覆材料的聚合物可以是均聚物，也可以是共聚物。聚合物为共聚物时，可以是无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物或交替共聚物中的任何一种，在嵌段共聚物的情况下，包含氮原子的重复单元连续的嵌段的部分与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物相互作用时，牢固地形成离子键，因而更优选嵌段共聚物。

此处，均聚物是指将1种构成单体聚合而得到的高分子化合物，共聚物是指将2种以上的单体共聚而得到的高分子化合物。其中，嵌段共聚物是指重复单元不同的至少2种以上的聚合物通过共价键连接而形成长链那样的分子结构的共聚物，嵌段是指构成嵌段共聚物的“重复单元不同的至少2种以上的聚合物”中的各种。

本发明中，聚合物的结构可以为直链状，也可以为支链状。本发明中，为了能在多点与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物形成更稳定的离子键，更优选支链状聚合物。

本发明中，聚合物具有伯至叔氨基和季铵基中的至少1种官能团，其中，季铵基与伯至叔氨基相比，与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用牢固，容易控制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的溶出速度，因而优选。

本发明中，构成季铵基的3个烷基的碳数没有特别限制，若过多，则疏水性高，而且空间位阻变大，因而，包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物变得无法有效地离子键合于季铵基。另外，若过多，则也变得容易产生细胞毒性，因此，每1个键合于构成季铵基的氮原子的烷基的碳数优选为1～12，进一步优选为2～6。键合于构成季铵基的氮原子的3个烷基可以是完全相同的碳数，也可以不同。

本发明中，从基于离子相互作用与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的吸附量多方面考虑，优选使用聚烯化亚胺作为聚合物。作为聚烯化亚胺，可举出PEI、聚丙烯亚胺和聚丁烯亚胺、以及经烷氧基化的聚烯化亚胺等，其中，更优选PEI。

作为PEI的具体例，可举出“LUPASOL”（注册商标）（BASF公司制）、“EPOMIN”（注册商标）（株式会社日本触媒公司制）等，在不妨碍本发明的效果的范围内，可以是与其他单体的共聚物，也可以是改性物。此处所谓改性物，是指构成聚合物的单体的重复单元相同、通过例如放射线的照射而导致其一部分发生自由基分解、再键合等而得到的产物。

本发明中，除了烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵以外而可使用的、形成共聚物的构成单体没有特别限制，可例举例如乙二醇、丙二醇、乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇、乙烯基己内酰胺、乙酸乙烯酯、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟基乙酯和硅氧烷等。若除了烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵以外而可使用的、形成共聚物的构成单体过多，则与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子键变弱，因此，优选为10重量%以下。

本发明中，若构成被覆材料的聚合物的重均分子量过小，则由于分子量变得小于包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，因而无法在金属材料的表面形成稳定的离子键，变得无法得到目标抗血栓性。另一方面，若聚合物的重均分子量过大，则包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物被聚合物包裹，变得不在被覆材料的最表面露出。因此，构成被覆材料的聚合物的重均分子量优选为600～2000000，更优选为1000～1500000，进一步更优选为10000～1000000。聚合物的重均分子量例如可利用凝胶渗透色谱法（GPC）法、光散射法等测定。

本发明中，作为构成被覆材料的包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的例子，只要是能抑制凝血反应的化合物即可，除了包括在临床上通常广泛使用的肝素、未纯化肝素、低分子量肝素之外，还包括对抗凝血酶III高亲和性的肝素、硫酸葡聚糖等。作为肝素的具体例，可举出“肝素钠”（Organon API公司制）等。肝素或肝素衍生物可被纯化，也可未被纯化。

本发明中，为了保持抑制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物以外的成分溶出的状态地、长期持续地以高活性呈现包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的抗凝活性，本申请发明人等进行了深入研究，结果发现，抗血栓性金属材料的表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率有最合适的值。原子的存在比率以“原子数%”表示，原子数%是指换算为原子数而表示的将全部原子的存在量设为100时的特定原子的比例。

即，本发明中，抗血栓性金属材料的表面的利用XPS测得的硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率优选为3.0～6.0原子数%，更优选为3.2～5.5原子数%，进一步更优选为5.0～5.5原子数%。硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率不足3.0原子数%时，包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的被覆量变少，因此，无法得到目标抗血栓性。另一方面，硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率超过6.0原子数%时，包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的被覆量足量地存在，虽然能得到目标抗血栓性，但需要大量的用于进行离子键合的聚合物的量，因此可知，随着发生溶出而露出的大量的聚合物由于具有阳离子性因而显示溶血毒性。

具体而言，抗血栓性金属材料的表面的硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率可利用XPS求出。

［测定条件］

装置：ESCALAB220iXL（VG Scientific公司制）

激发X射线：monochromaticAlKα1,2线（1486.6eV）

X射线径：1mm

X电子逸出角度：90°（检测器相对于抗血栓性金属材料的表面的倾斜度）

此处所谓抗血栓性金属材料的表面，是指在使XPS的测定条件下的X电子逸出角度、即检测器相对于抗血栓性金属材料的表面的倾斜度为90°而进行测定时检测的从测定表面至10nm深度。另外，本发明中，金属材料中可以包含硫原子，也可以不包含硫原子。另外，本发明中，金属材料可以包含氮原子，也可以不包含氮原子。

由通过测定向抗血栓性金属材料的表面照射X射线而产生的光电子的能量而得到的物质中的束缚电子的键能值，可得到抗血栓性金属材料的表面的原子信息，另外，由各键能值的峰的能量转移，可得到与价数、键合状态有关的信息。此外，可使用各峰的面积比进行定量，即，可计算各原子、价数、键合状态的存在比率。

具体而言，在键能值为161eV～170eV附近可观察到表明硫原子的存在的S2p峰，本发明中发现，S2p峰相对于全部峰的面积比优选为3.0～6.0原子数%。对于硫原子相对于全部原子的存在量的存在比率而言，将小数点后第2位四舍五入而算出。

另外发现，同样地利用XPS测定而得到的抗血栓性金属材料的表面的利用XPS测得的氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率也有最合适的值。即，对于抗血栓性金属材料的表面的利用XPS测得的氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率而言，为了提高抗血栓性，优选为4.0～13.0原子数%，更优选为9.0～10.0原子数%。氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率为4.0原子数%以上时，存在于金属材料表面的聚合物的量成为充分的量，因此，通过聚合物离子键合的肝素或肝素衍生物这样的包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的被覆量也成为对于得到优选的抗血栓性而言最合适的离子键合量。另一方面，氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率为13.0原子数%以下时，可防止：存在于金属材料表面的聚合物的量变得过多，导致随着包含硫原子的具有抗凝活性的化合物溶出而露出大量的聚合物，由于所述聚合物具有阳离子性，因而显示溶血毒性。

具体而言，在键能值为396eV～403eV附近可观察到表明氮原子的存在的N1s峰，本发明中，N1s峰相对于全部峰的面积比优选为4.0～13.0原子数%。此外，N1s峰主要可分割为归属于碳-氮（以下记为“C-N”）键的n1成分（399eV附近）、和归属于铵盐或C-N（与n1不同的结构）或氮氧化物（以下记为“NO”）的n2成分（401～402eV附近）。各分割峰成分的存在比率可利用以下的式1算出。氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率及各分割峰成分的存在比率将小数点后第2位四舍五入而算出。

分割_ratio= N1s_ratio × （分割_percent /100） ……式1

分割_ratio：各分割峰成分的存在比率（%）

N1s_ratio：氮原子相对于全部原子的存在量的存在比率（%）

分割_percent： N1s峰中的各分割峰成分的比例（%）。

通过N1s峰的分割而得到的归属于NO的n2成分在本发明中表明季铵基的存在，发现n2成分相对于N1s峰的全部成分的比例、即分割_percent（n2）优选为20～70原子数%，更优选为25～65原子数%，进一步优选为30～60原子数%。分割_percent（n2）为20原子数%以上时，季铵基的存在量成为充分的量，因此，与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用成为优选范围，可得到对于得到优选的抗血栓性而言最合适的溶出速度。另一方面，分割_percent（n2）为70原子数%以下时，与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用不会变得过强，可防止因离子复合体的形成而导致的自由度的下降，因此，溶出速度不会变得过慢，可得到用于得到更优选的抗凝活性的最合适的溶出速度。另外，对于n2成分的存在比率、即分割_ratio（n2）而言，由于通过式1而算出，因而，基于上述理由，优选为1.4～8.4原子数%，更优选为1.8～7.2原子数%，进一步更优选为2.4～6.0原子数%。

另外，在键能值为282～292eV附近可观察到表明碳原子的存在的C1s峰，C1s峰主要可分割为：归属于暗示饱和烃等的存在的碳-氢（以下记为“CHx”）键、碳-碳（以下记为“C-C”）键、碳=碳（以下记为“C=C”）键的c1成分（285eV附近）、归属于暗示醚、羟基的存在的碳-氧（以下记为“C-O”）键、碳-氮（以下记为“C-N”）键的c2成分（286eV附近）、归属于暗示羰基的存在的碳=氧（以下记为“C=O”）键的c3成分（287～288eV附近）、归属于暗示酯基、羧基的存在的氧=碳-氧（以下记为“O=C-O”）键的c4成分（288～289eV附近）、和归属于暗示苯环等共轭系的存在的π-π^*卫星峰（以下记为“π-π”）键的c5成分（290～292eV附近）。各分割峰成分的存在比率可利用以下的式2算出。碳原子相对于全部原子的存在量的存在比率及各分割峰成分的存在比率将小数点后第2位四舍五入而算出。

分割_ratio= C1s_ratio × （分割_percent /100） ……式2

分割_ratio：各分割峰成分的存在比率（%）

C1s_ratio：碳原子相对于全部原子的存在量的存在比率（%）

分割_percent： C1s峰中的各分割峰成分的比例（%）。

通过C1s峰的分割而得到的归属于C=O键的c3成分在本发明中表明酰胺基的存在，发现本发明中c3成分相对于C1s峰的全部成分的比例、即本发明中抗血栓性金属材料的表面的利用XPS测得的酰胺基的存在比率优选为3.0原子数%以上，更优选为8.0原子数%以上，进一步更优选为10.0原子数%以上。酰胺基的存在比率为3.0原子数%以上时，在构成被覆材料的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物之间，充分产生基于酰胺键的共价键，因此，可防止由于聚合物在金属材料表面的立体构型的影响而导致与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子键状态变差，可得到更优选的抗血栓性。

本发明的抗血栓性金属材料可合适地用于医疗器材、例如医疗仪器及医疗器具，特别优选作为支架及覆膜支架的材料使用。

本发明的抗血栓性金属材料的制造方法如下所示。例如，可以向包含选自由膦酸衍生物或儿茶酚衍生物组成的组中的化合物、包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物、和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的溶液中添加目标金属材料，进行基于被覆材料的被覆，也可利用在上述膦酸衍生物或上述儿茶酚衍生物、上述聚合物、和包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物之间、预先使其全部或任意一部分进行反应后的被覆材料被覆金属材料的表面。

其中，为了在金属材料的表面高效地呈现抗血栓性，更优选下述方法：作为第1被覆工序，将膦酸衍生物或儿茶酚衍生物通过自身所具有的膦酸基或儿茶酚基键合于金属材料的表面；然后，作为第2被覆工序，使包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合；然后，作为第3被覆工序，将包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物离子键合于上述聚合物。

另外，聚合物包含伯至叔氨基时，为了使得与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用牢固，容易控制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的溶出速度，可在第2被覆工序后，追加将聚合物季铵化的工序。

利用下述方法时的制造方法如下文所示，所述方法中，作为第1被覆工序，使膦酸衍生物或儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于金属材料的表面；然后，作为第2被覆工序，使包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合；然后，作为第3被覆工序，将包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物离子键合于上述聚合物。

作为第1被覆工序，使膦酸衍生物通过自身的膦酸基键合于金属材料的表面的方法没有特别限制，可举出以下的方法。依次用水、丙酮、甲醇对金属材料进行超声波洗涤，然后进行真空干燥。在室温下浸渍于膦酸衍生物的四氢呋喃（以下THF）溶液中，然后，用蒸发器浓缩后，进行真空干燥。于120℃进行加热后，放置冷却，然后用甲醇进行超声波洗涤，然后用水洗涤，然后进行真空干燥。或者，将洗涤了的金属材料在膦酸衍生物的乙醇溶液中于37℃浸渍一夜，然后用乙醇和水洗涤，然后进行真空干燥。

作为第1被覆工序，使儿茶酚衍生物键合于金属材料的表面的方法没有特别限制，例如可使用以下的方法。依次用水、丙酮、甲醇对金属材料进行超声波洗涤，然后进行真空干燥。在室温下浸渍于儿茶酚衍生物的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中，然后，用蒸发器进行浓缩，然后进行真空干燥。于120℃进行加热，然后放置冷却，然后用水进行超声波洗涤，然后进行真空干燥。或者，将洗涤了的金属材料在儿茶酚衍生物的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中于37℃浸渍一夜，然后用水洗涤，然后进行真空干燥。

使构成被覆材料的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合的方法没有特别限制，膦酸衍生物或儿茶酚衍生物具有官能团（羟基、硫醇基、氨基、羧基、醛基、乙烯基、卤代烷基、异氰酸酯基及异硫氰酸酯等）时，有通过化学反应与聚合物共价键合的方法。例如，在膦酸衍生物或儿茶酚衍生物具有羧基等时，只要使具有羟基、硫醇基和氨基等的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合即可，可举出下述方法：在将具有羟基、硫醇基和氨基等的化合物与聚合物共价键合后，共价键合于具有羧基等的膦酸衍生物或儿茶酚衍生物的方法等。作为其他方法，还可使用下述方法：作为第1工序，使膦酸衍生物或儿茶酚衍生物、与包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物共价键合，然后，作为第2工序，通过膦酸衍生物或儿茶酚衍生物所具有的膦酸基或儿茶酚基键合于金属材料的表面，然后作为第3被覆工序，使包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物离子键合于上述聚合物。

本发明中，为了较长期地持续地呈现高的抗血栓性，优选在第2被覆工序之后进行第1追加工序，所述第1追加工序中，将包含选自由丙烯酸、甲基丙烯酸、α-谷氨酸、γ-谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的化合物作为构成单体的阴离子性聚合物、或选自由草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组中的至少一种阴离子性化合物中的至少一方与包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物、或膦酸衍生物、或儿茶酚衍生物共价键合。另外，更优选的是，进行将阴离子性聚合物或阴离子性化合物与包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物进行共价键合的第2追加工序，然后，进行将肝素或肝素衍生物这样的包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物与上述聚合物离子键合的第3被覆工序。另外，上述聚合物包含伯至叔氨基时，为了使得与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用牢固，容易控制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的溶出速度，可在第2追加工序后，追加将聚合物季铵化的工序。此外，根据需要，可使用阴离子性聚合物或阴离子性化合物及聚合物进行第3和第4追加工序。

阴离子性聚合物没有特别限制，阴离子性官能团的重量比率高时，基于与金属材料、膦酸衍生物或儿茶酚衍生物或上述聚合物的共价键的被覆量变多，因此，优选使用PAA、聚甲基丙烯酸、聚α-谷氨酸、聚γ-谷氨酸、聚天冬氨酸，更优选PAA。

作为PAA的具体例，可举出“聚丙烯酸”（和光纯药工业株式会社制）等，在不妨碍本发明的效果的范围，可以是与其他单体的共聚物，也可以是改性物。

阴离子性聚合物没有特别限制，可与上述以外的构成单体形成共聚物，例如，可例举乙二醇、丙二醇、乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇、乙烯基己内酰胺、乙酸乙烯酯、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、硅氧烷等。与阴离子性聚合物形成共聚物的构成单体过多时，基于与金属材料、膦酸衍生物或儿茶酚衍生物或上述聚合物的共价键的被覆量变少，因而优选为10重量%以下。

阴离子性聚合物的重均分子量为600以上时，基于与金属材料、上述聚合物的共价键的被覆量成为更优选的值，因而可得到高抗血栓性。另一方面，阴离子性聚合物的重均分子量为2000000以下时，使由于阴离子性聚合物的尺寸过大而导致的包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物被掩埋的可能性下降，因而优选。因此，阴离子性聚合物的重均分子量优选为600～2000000，更优选为10000～1000000。

阴离子性化合物没有特别限制，阴离子性官能团的重量比率高时，基于与金属材料、膦酸衍生物或儿茶酚衍生物或上述聚合物的共价键的被覆量变多，因此优选使用草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸，更优选琥珀酸。

第2被覆工序中，作为使聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合的方法，例如有使用脱水缩合剂等进行缩合反应的方法。

使用的脱水缩合剂的种类没有特别限制，可举出例如N,N’-二环己基碳二亚胺、N,N’-二异丙基碳二亚胺、1-醚-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、1-醚-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（以下记为“EDC”）、1,3-双（2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基甲基）碳二亚胺、N-｛3-（二甲基氨基）丙基-｝-N’-乙基碳二亚胺、N-｛3-（二甲基氨基）丙基-｝-N’-乙基碳二亚胺甲碘化物、N-叔丁基-N’-乙基碳二亚胺、N-环己基-N’-（2-吗啉代乙基）碳二亚胺内消旋对甲苯磺酸酯、N,N’-二叔丁基碳二亚胺或N,N’-二对甲苯基碳二亚胺等碳二亚胺系化合物、4（-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉鎓氯化物n水合物（以下记为“DMT-MM”）等三嗪系化合物。

脱水缩合剂可与脱水缩合促进剂一起使用。使用的脱水缩合促进剂没有特别限制，可举出例如吡啶、4-二甲基氨基吡啶（以下记为“DMAP”）、三乙基胺、异丙基胺、1-羟基苯并三唑或N-羟基琥珀酰亚胺。

对于构成被覆材料的聚合物、脱水缩合剂及脱水缩合促进剂而言，可制成混合水溶液而使其进行反应，也可依次添加而进行反应。

另外，构成被覆材料的聚合物包含伯至叔氨基时，使与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用牢固，变得容易控制包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的溶出速度时，可追加将聚合物季铵化的工序。

作为将构成被覆材料的聚合物季铵化的方法，可在将聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合之前，将所述聚合物进行季铵化，也可在将聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合之后，将所述聚合物季铵化。然而，为了使构成被覆材料的聚合物与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子相互作用牢固，优选使聚合物所具有的季铵基存在于被覆材料的表面侧，使得与包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物的离子键容易形成，因此，优选在将构成被覆材料的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合后，将所述构成被覆材料的聚合物进行季铵化。具体而言，在将构成被覆材料的聚合物与膦酸衍生物或儿茶酚衍生物共价键合后，可与氯化乙醚、溴乙烷等卤代烷化合物或含有缩水甘油基的季铵盐直接接触，也可溶解于水溶液或有机溶剂中而进行接触。

作为使包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物离子键合于构成被覆材料的聚合物的第3被覆工序，没有特别限制，优选以水溶液的状态进行接触的方法。

本发明中，测定了抗血栓性金属材料的表面的抗Xa因子活性。此处所谓抗Xa因子活性，是表示抑制促进从凝血酶原向凝血酶的转化的第Xa因子的活性的程度的指标，例如，抗血栓性金属材料中的包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物为肝素或肝素衍生物时，可知其以活性单位计的表面量。测定中使用了“テストチーム（注册商标）肝素S”（积水メディカル株式会社制）。抗Xa因子活性过低时，抗血栓性金属材料中的肝素或肝素衍生物的表面量少，变得难以得到目标抗血栓性。即，抗Xa因子活性优选为15mIU/cm²以上，更优选为30mIU/cm²以上，进一步更优选为100mIU/cm²。此处所谓基于抗Xa因子活性的表面量，是指于37℃在生理盐水中浸渍30分钟后测得的数值。

本发明的抗血栓性金属材料的特征在于，即使在金属材料的表面上被覆的肝素或肝素衍生物的基于抗Xa因子活性的总被覆量少，在生理盐水中浸渍30分钟后的初始表面量也高。所谓总被覆量，是通过抗Xa因子活性测得的全部的溶出量和在抗血栓性金属材料的表面上残留的表面量的总量，若过多，则被覆材料变厚，对作为支架的功能造成影响，另一方面，若过低，则变得难以得到目标抗血栓性。即，对于抗血栓性金属材料的表面的基于抗Xa因子活性的总被覆量而言，优选的是，为10000mIU/cm²以下，并且在生理盐水中浸渍30分钟后的初始表面量为15mIU/cm²以上；更优选的是，为10000mIU/cm²以下，并且在生理盐水中浸渍30分钟后的初始表面量为30mIU/cm²以上；更优选的是，总被覆量为5000mIU/cm²以下，并且在生理盐水中浸渍30分钟后的初始表面量为100mIU/cm²以上。此处所谓溶出量，是指于37℃在人血浆中浸渍24小时而溶出至人血浆中的量。测定中使用了“テストチーム（注册商标）肝素S”（积水メディカル株式会社制）。

本发明中，由于持续使用抗血栓性金属材料，导致包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物溶出，此时，由于露出的聚合物具有阳离子性，因而可能存在溶血毒性。作为表示溶血毒性的指标，使用了利用以下的式3算出的溶血率。对于溶血毒性而言，按照日本厚生劳动省发行的指南“医療機器の製造販売承認申請等に必要な生物学的安全性評価の基本的考え方について（关于医疗仪器的制造销售批准申请等所需要的生物学的安全性评价的基本的意见）”的溶血毒性试验，如表1那样，按照溶血率的值进行分级。作为本发明中的溶血毒性，优选被分级为非溶血性和有轻度的溶血性，更优选被分级为非溶血性。

溶血率（%） = ［（At-An）/（Ap-An）］×100 ……式3

At：样品的吸光度

An：阴性对照的吸光度

Ap：阳性对照的吸光度。

[表1]

溶血率（%）	等级
		溶血率≤2	非溶血性
2＜溶血率≤10	有轻度的溶血性
		10＜溶血率≤20	有中度的溶血性
20＜溶血率≤40	有强溶血性
		40＜溶血率	有非常强的溶血性

实施例

以下，举出实施例和比较例详细地说明本发明，但本发明不受它们的限制。

（实施例1）

作为金属材料，使用SUS304的板材（长：1cm，宽0.5cm）。依次用水、丙酮、甲醇对SUS304进行超声波洗涤，然后进行真空干燥。将洗涤了的SUS304在1mM的化合物A（以下的通式（I））乙醇溶液中于37℃浸渍一夜，然后用乙醇和水洗涤，然后进行真空干燥，将化合物A共价键合于SUS304的表面（第1被覆工序）。

[化学式9]

接下来，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM（和光纯药工业株式会社制）、作为被覆材料的一部分的5.0重量%PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）的水溶液中，于30℃进行2小时反应，通过缩合反应将PEI共价键合于化合物A（第2被覆工序）。将反应后的水溶液除去，用蒸馏水洗涤。

进而将SUS304浸渍于溴乙烷（和光纯药工业株式会社制）或溴戊烷（和光纯药工业株式会社制）的1重量%甲醇水溶液中，于35℃进行1小时反应，然后加热至50℃，进行4小时反应，将PEI进行季铵化（季铵化工序）。将反应后的水溶液除去，用甲醇、蒸馏水洗涤。

最后，浸渍于0.75重量%肝素钠（Organon API公司制）、0.1mol/L氯化钠的水溶液（pH=4）中，于70℃进行6小时反应，与PEI离子键合（第3被覆工序）。将反应后的水溶液除去，用蒸馏水洗涤。

此处，将不实施季铵化工序而实施了第3被覆工序的SUS304作为样品1，将使用溴乙烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品2，将使用溴戊烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品3。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品1的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（+），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（+），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。另外，样品2和3的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（++），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。

（实施例2）

将化合物A变更为化合物B（以下的通式（II）），除此之外，进行与实施例1同样的操作，实施第1被覆工序和第2被覆工序。另外，进行与实施例1同样的操作，使用溴乙烷实施季铵化工序后，实施第3被覆工序。

[化学式10]

此处，将用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第2被覆工序的SUS304作为样品4，将用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第2被覆工序的SUS304作为样品5。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品4和5的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（++），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。

（实施例3）

进行与实施例1同样的操作，实施第1被覆工序和第2被覆工序后，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、0.5重量%PAA（和光纯药工业株式会社制）的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第1追加工序）。将反应后的水溶液除去，用碳酸钠水溶液、蒸馏水洗涤。

进而，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、5.0重量%PEI的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第2追加工序）。将反应后的水溶液除去，用蒸馏水洗涤。进行与实施例1同样的操作，使用溴乙烷实施季铵化工序后，实施第3被覆工序。

此处，将用化合物A实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约600；和光纯药工业株式会社制）实施了第2追加工序的SUS304作为样品6，将用化合物A实施了第1被覆工序、用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第2追加工序的SUS304作为样品7，将用化合物B实施了第1被覆工序、用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第2追加工序的SUS304作为样品8。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品4和5的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（+++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（+++），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。

（比较例1）

依次用水、丙酮、甲醇对SUS304进行超声波洗涤，然后进行真空干燥。对洗涤了的SUS304实施第3被覆工序，将使肝素离子键合于SUS304的表面而成的SUS304作为样品9。

针对样品9，实施在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。另外，未实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）进行的测定。将结果示于表2。如表2所示，样品9的溶血毒性评价为非溶血性（-），但基于抗Xa因子活性的表面量少，为（-），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（-）。

（比较例2）

进行与实施例1同样的操作，实施第1被覆工序、第2被覆工序、季铵化工序后，实施第3被覆工序。

此处，将用化合物B实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约600；和光纯药工业株式会社制）实施了第2追加工序、用溴乙烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品10，将用化合物A实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约600；和光纯药工业株式会社制）实施了第2追加工序、用溴乙烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品11。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品10和11的溶血毒性评价为非溶血性（-），但基于抗Xa因子活性的表面量少，为（-），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（-）。

（比较例3）

进行与实施例1同样的操作，在实施了第1被覆工序和第2被覆工序后，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、0.5重量%PAA（和光纯药工业株式会社制）的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第1追加工序）。将反应后的水溶液除去，用碳酸钠水溶液、蒸馏水洗涤。

进而，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、5.0重量%PEI的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第2追加工序）。将反应后的水溶液除去，用蒸馏水洗涤。

进而，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、0.5重量%PAA（和光纯药工业株式会社制）的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第3追加工序）。将反应后的水溶液除去，用碳酸钠水溶液、蒸馏水洗涤。

进而，将SUS304浸渍于0.5重量%DMT-MM、5.0重量%PEI的水溶液中，于30℃进行2小时反应（第4追加工序）。将反应后的水溶液除去，用蒸馏水洗涤。进行与实施例1同样的操作，使用溴代十二烷的甲醇溶液实施了季铵化工序后，实施第3被覆工序。

此处，将使用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第4追加工序的SUS304作为样品12，将使用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第4追加工序的SUS304作为样品13。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品11和12的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（+++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（+++），但溶血毒性评价是有轻度的溶血性，为（+）。

（比较例4）

将使用日本专利第5576441号公报中公开的方法、固定了肝素的SUS304作为样品14。

针对样品14，实施在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。另外，不实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）进行的测定。将结果示于表2。如表2所示，样品9的溶血毒性评价为非溶血性（-），但基于抗Xa因子活性的表面量少，为（-），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（-）。

（实施例4）

第1被覆工序中，将化合物A变更为化合物C（以下通式IV）、化合物D（以下的通式（V）、化合物E（以下的通式（VI）、化合物F（以下的通式（VII））中的任一种，将洗涤后的SUS304分别在1mM的化合物C、化合物D、化合物E或化合物F的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中于37℃浸渍一夜，然后用水洗涤，然后进行真空干燥（第1被覆工序）。除了第1被覆工序以外，进行与实施例1同样的操作，实施第2被覆工序。另外，使用溴乙烷或溴戊烷实施了季铵化工序后，实施第3被覆工序。

此处，将用化合物C（以下通式IV）实施了第1被覆工序、用PEI（LUPASOL（注册商标）P；BASF公司制）实施了第2被覆工序、用溴乙烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品15，将用化合物D（以下通式V）实施了第1被覆工序、用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第2被覆工序、用溴乙烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品16，将用化合物E（以下通式VI）实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约10000；和光纯药工业株式会社制）实施了第2被覆工序、用溴戊烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品17，将用化合物F（以下通式VII）实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第2被覆工序、用溴戊烷实施了季铵化工序的SUS304作为样品18。

[化学式11]

[化学式12]

[化学式13]

[化学式14]

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品15、16、17和18的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（++），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。

（实施例5）

第1被覆工序中，将化合物A或化合物B变更为化合物C或化合物E中的任一种，将洗涤了的SUS304分别在1mM的化合物C或化合物E的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中于37℃浸渍一夜，然后用水洗涤，然后进行真空干燥（第1被覆工序）。除了第1被覆工序以外，进行与实施例3同样的操作，实施第2被覆工序、第1追加工序、第2追加工序。另外，使用溴乙烷实施季铵化工序后，实施第3被覆工序。

此处，将用化合物C实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第2追加工序的SUS304作为样品19，将用化合物E实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第2追加工序的SUS304作为样品20。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品19和20的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（+++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（+++），溶血毒性评价也为非溶血性（-）。

（比较例5）

第1被覆工序中，将化合物A或化合物B变更为化合物C或化合物E中的任一种，将洗涤了的SUS304分别在1mM的化合物C或化合物E的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中于37℃浸渍一夜，然后用水洗涤，然后进行真空干燥（第1被覆工序）。除了第1被覆工序以外，进行与比较例2同样的操作，实施第2被覆工序、季铵化工序、第3被覆工序。

此处，将用化合物C实施了第1被覆工序的SUS304作为样品21，将用化合物E实施了第1被覆工序的SUS304作为样品22。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品21和22的溶血毒性评价为非溶血性（-），但基于抗Xa因子活性的表面量少，为（-），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（-）。

（比较例6）

第1被覆工序中，将化合物A变更为化合物C或化合物E，将洗涤了的SUS304分别在1mM的化合物C或化合物E的Tris-盐酸缓冲液（pH8.5）溶液中于37℃浸渍一夜，然后用水洗涤，然后进行真空干燥（第1被覆工序）。除了第1被覆工序以外，进行与比较例3同样的操作，实施第2被覆工序、第1追加工序、第2追加工序、第3追加工序、第4追加工序、季铵化工序、第3被覆工序。

此处，将用化合物C实施了第1被覆工序、用PEI（LUPASOL（注册商标） P；BASF公司制）实施了第4追加工序的SUS304作为样品23，将用化合物E实施了第1被覆工序、用PEI（平均分子量约70000；和光纯药工业株式会社制）实施了第4追加工序的SUS304作为样品24。

针对各样品，实施表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测得的氮原子和硫原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率、在生理盐水中浸渍30分钟后的基于抗Xa因子活性的表面量的测定、基于人全血试验的评价及溶血毒性评价。将结果示于表2。如表2所示，样品23和24的基于抗Xa因子活性的表面量多，为（+++），利用基于人全血试验的评价得到的抑制血栓形成的能力为（+++），但溶血毒性评价是有轻度的溶血性，为（+）。

针对实施例1～5中记载的样品，实施基于细胞粘接性试验的评价。将结果示于表3。如表3所示，样品1～5和15～18的细胞粘接性评价为（++），样品6～8、19和20的细胞粘接性评价为（+）。

同样地，针对比较例1～6中记载的样品，实施基于细胞粘接性试验的评价。样品9～11、21和22的细胞粘接性评价为（++），样品12～14、23和24的细胞粘接性评价为（-）。

关于本发明的金属材料所具有的抗血栓性和安全性，基于抗Xa因子活性的表面量、基于人全血试验的评价及溶血毒性的评价方法如下所述。

另外，关于本发明的金属材料所具有的细胞粘接性，使用吸光度测定培养后的细胞粘接量的基于细胞粘接性试验的评价方法如下所述。

（评价1：基于抗Xa因子活性的表面量）

将抗血栓性金属材料的各样品切割成0.5×0.5cm的尺寸，使用生理盐水于37℃进行30分钟洗涤。使洗涤后的样品按照“テストチーム（注册商标）肝素S”（积水メディカル株式会社制）的操作步骤进行反应，用酶标仪（microplate reader）（MTP-300；电晕电气株式会社制）测定405nm的吸光度。按照“テストチーム（注册商标）肝素S”（积水メディカル株式会社制）的操作步骤制成标准曲线，计算基于抗Xa因子活性的表面量。表面量越高越好，优选为15mIU/cm²以上，更优选为30mIU/cm²以上，进一步更优选为100mIU/cm²以上。若表面量不足15mIU/cm²，则判断为表面量少，记为（-），若为15mIU/cm²以上，则判断为表面量多，为（+），若为30mIU/cm²以上，则判断为表面量更多，记为（++），若为100mIU/cm²以上，则判断为表面量进一步更多，记为（+++）。

（评价2：人全血试验）

将抗血栓性金属材料的各样品切割成1.0×0.5cm的尺寸，将未被被覆材料被覆的同种金属材料（阳性对照）切割成1.0×0.5cm的尺寸，用生理盐水于37℃进行30分钟洗涤，然后放入到2mL的微管（micro tube）中。向人新鲜血液中添加肝素钠注射液（味の素制药株式会社制），使其成为0.4U/mL，然后添加2mL所述的人血液，于37℃孵育2小时。孵育后取出SUS304，测定血液中的凝血酶-抗凝血酶复合体（以下TAT）的浓度。如以下的式4所示那样，计算血栓形成抑制能力。

血栓形成抑制能力 = Ct/Cpre ……式4

Ct：孵育样品后的测定浓度（ng/mL）

Cpre：孵育样品前的测定浓度（ng/mL）。

若由式4算出的血栓形成抑制能力为300以上，则判断为血栓形成抑制能力弱，记为（-），若为100以上且不足300，则判断为血栓形成抑制能力强，记为（+），若为50以上且不足100，则判断为血栓形成抑制能力更强，记为（++），若不足50，则判断为血栓形成抑制能力进一步更强，记为（+++）。

（评价3：溶血毒性试验）

将人新鲜血液沿着壁面装入到装有玻璃珠的锥形瓶中。在手掌上，以水平画圆的方式，以大致1秒2次的间隔振荡约5分钟，制备脱纤维蛋白血。将抗血栓性金属材料的各样品切割成1.0×0.5cm的尺寸，用生理盐水于37℃洗涤30分钟，然后装入到2mL的微管中。向装有金属材料的微管中添加用生理盐水进行了50倍稀释的脱纤维蛋白血1mL，于37℃进行4小时孵育。孵育后，以750G进行5分钟离心分离。采集上清液，测定576nm处的UV吸收。若由式3算出的值为大于2的值、即有溶血性，则判断为（+），若为2以下的值、即为非溶血性，则判断为（-）。优选无溶血毒性，优选为非溶血性。

（评价4：细胞粘接性试验）

所谓细胞粘接性，是表示细胞相对于材料的粘接容易性的性质，可利用以下的评价方法测定。将抗血栓性金属材料的各样品切割成1.0×0.5cm的尺寸，在细胞培养用的24孔微孔板（住友ベークライト公司制）的孔上放入1个，使内壁面朝上，从上方放置厚度为1mm的金属管状的砝码。以每1孔成为4×10⁴个的方式，添加在2%FBS内皮细胞培养基试剂盒-2（タカラバイオ公司制）中悬浮的正常人脐带静脉内皮细胞（タカラバイオ公司）。在1mL的培养基中，在37℃、5%CO₂的环境下进行24小时培养。然后，用PBS（-）（ニッスイ公司制）冲洗后，添加Cell Counting Kit-8（同仁化学公司制）100μL，在37℃、5%CO₂的环境下进行4小时培养。然后，用酶标仪（MTP-300；电晕电气株式会社制）测定450nm的吸光度，如以下的式5所示那样，算出吸光度。

As = At-Ab ……式5

At：测定值的吸光度

Ab：空白溶液的吸光度（仅有培养基和Cell Counting Kit-8的溶液而无细胞。）

As：算出的吸光度。

此处，如以下的式6所示那样，算出细胞粘接性。

细胞粘接性（%） = As（样品）×100/As（对照） ……式6

As（样品）：孵育样品后算出的吸光度

As（对照）：孵育未被被覆材料被覆的同种金属材料（阳性对照）后算出的吸光度。

基于细胞粘接性（%）确定细胞粘接性的评分。具体而言，若细胞粘接性（%）不足50%，则判断为细胞粘接性弱，记为（-），若细胞粘接性（%）为50%以上且不足90%，则判断为细胞粘接性强，记为（+），若细胞粘接性（%）为90%以上，则判断为细胞粘接性更强，记为（++）。

[表2]

[表3]

产业上的可利用性

本发明的抗血栓性金属材料可用于医疗领域中长期持续地需要高的抗血栓性的医疗器材（医疗仪器及医疗器具）。

Claims

1.抗血栓性金属材料，其中，金属材料的表面用被覆材料被覆，所述被覆材料含有：

膦酸衍生物或儿茶酚衍生物、

包含选自由烯化亚胺、乙烯胺、烯丙胺、赖氨酸、鱼精蛋白和二烯丙基二甲基氯化铵组成的组中的化合物作为构成单体的聚合物、和

包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物，

前述聚合物与前述膦酸衍生物或前述儿茶酚衍生物共价键合，

前述膦酸衍生物或前述儿茶酚衍生物通过自身的膦酸基或儿茶酚基键合于前述金属材料，

表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测定的氮原子的存在量相对于全部原子的存在量的比率为4.0～13.0原子数%，

表面的利用X射线光电子能谱法（XPS）测定的相对于全部原子的存在量的硫原子的存在比率为3.0～6.0原子数%，

前述膦酸衍生物是羧基烷基膦酸或氨基烷基膦酸，

前述儿茶酚衍生物是下述通式(IV)的化合物、通式(V)的化合物、通式(VI)的化合物或通式(VII)的化合物，

（ＩＶ）

（Ｖ）

（ＶＩ）

（ＶＩＩ）。

2.根据权利要求1所述的抗血栓性金属材料，其中，前述聚合物具有季铵基。

3.根据权利要求2所述的抗血栓性金属材料，其中，前述季铵基的键合于氮原子的碳链由烷基构成，每1个该烷基的碳数为1～12个。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，前述被覆材料含有：包含选自由丙烯酸、甲基丙烯酸、α-谷氨酸、γ-谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的化合物作为构成单体的阴离子性聚合物、或选自由草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组中的阴离子性化合物。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，前述包含硫原子的阴离子性的具有抗凝活性的化合物为肝素或肝素衍生物。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，前述聚合物的重均分子量为600～2000000。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的抗血栓性金属材料，其中，前述金属材料选自由铁、钛、铝、锡、金、银、铜、铂、铬、钴、镍、锌、钨和它们的合金以及这些金属的氧化物和氢氧化物组成的组。

8.体内留置用的医疗器材，其由权利要求1～7中任一项所述的抗血栓性金属材料制造。