WO2016121292A1 - 細胞培養方法、及び細胞培養装置 - Google Patents

細胞培養方法、及び細胞培養装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2016121292A1
WO2016121292A1 PCT/JP2016/000002 JP2016000002W WO2016121292A1 WO 2016121292 A1 WO2016121292 A1 WO 2016121292A1 JP 2016000002 W JP2016000002 W JP 2016000002W WO 2016121292 A1 WO2016121292 A1 WO 2016121292A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
container
cell culture
base
culture
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/000002
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
幡多　徳彦
正広 村井
Original Assignee
東洋製罐グループホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2015017827A external-priority patent/JP2016140299A/ja
Priority claimed from JP2015017824A external-priority patent/JP2016140296A/ja
Priority claimed from JP2015017823A external-priority patent/JP6609931B2/ja
Application filed by 東洋製罐グループホールディングス株式会社 filed Critical 東洋製罐グループホールディングス株式会社
Priority to EP16742901.8A priority Critical patent/EP3252140B1/en
Priority to KR1020177019751A priority patent/KR101984074B1/ko
Priority to US15/542,978 priority patent/US10731122B2/en
Priority to CN201680006996.4A priority patent/CN107208030B/zh
Publication of WO2016121292A1 publication Critical patent/WO2016121292A1/ja
Priority to US16/904,690 priority patent/US11390842B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method and a cell culture device for culturing cells in an artificial environment.
  • cells in an artificial environment
  • cells in an artificial environment
  • the cell density in the culture solution hereinafter, including cells and medium
  • the depletion of medium components necessary for growth and the accumulation of metabolites of the cell itself occur. Occurs, the growth rate decreases and the cell density reaches saturation. For this reason, when cells are cultured on a certain scale, they are usually cultured with repeated passages so that the cell density is maintained appropriately.
  • the well plate is transferred to a flask.
  • a cell culture well plate start the culture by adding cells to the individual wells together with the medium so that the cell density is moderate, and after the cells have grown sufficiently in the wells, transfer them to the cell culture flask. Incubate with additional culture medium in line with cell growth, and subculture, and when it grows to a certain volume, transfer it to a flask or bag with a larger volume.
  • the cells were repeatedly cultured in large quantities (see, for example, paragraph [0027] of Patent Document 1).
  • the cells when using cryopreserved cells, the cells are thawed and cultured in a high density state for several days using a well plate in order to restore the original function of the cells (hereinafter referred to as “curative culture”).
  • curative culture There is also a method in which cell function is restored to its original state, transferred to a flask and cultured (hereinafter referred to as “expanded culture”), and then activated culture in which antibody stimulation is performed (for example, Patent Document 2 [0057] paragraph).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, maintains the cell density at the time of culturing appropriately, further eliminates the work of transferring the culture container when growing the cells in large quantities, and reduces damage to the cells.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture method and a cell culture apparatus that can reduce the risk of contamination.
  • the cell culture method according to the present invention is a cell culture method for performing cell culture by supplying a medium together with cells to a container made of a flexible material, wherein the bottom surface of the container is partially raised to form a plurality of compartments.
  • the cells are cultured for each of the compartments, and then the compartments are eliminated, thereby expanding the culture area in the container.
  • the cell culture device is a cell culture device that performs cell culture by supplying a medium together with cells to a container made of a flexible material, and has a planar mounting surface that holds the container.
  • a partition piece that can be projected at a predetermined height from the mounting surface is embedded in the base, and when the partition piece is accommodated in the base, the upper end surface of the partition piece is The configuration is the same as the mounting surface described above.
  • the culture area in the container is expanded when the density of the proliferated cells increases beyond a certain level and exceeds the range suitable for culture.
  • the transfer operation movement of a culture container is unnecessary and it becomes possible to reduce the damage to a cell and the risk of contamination because a culture solution stays in the same culture container.
  • cell culture method is performed by supplying a container 1 made of a flexible material together with a cell (cultured cell) C to be cultured together with a medium M for culturing the cell C.
  • This is a cell culture method to be performed, and in particular, a cell culture method suitable for culturing damaged cells such as cells collected from patients or frozen cells, while restoring the original function of the cells. is there.
  • the container 1 is formed into a bag shape (bag shape) using a flexible material, and the shape is usually a rectangular shape.
  • the four sides are formed by heat sealing. It can be sealed or can be made into an integrally formed bag by blow molding.
  • the shape of the container 1 may be a square shape, an elliptical shape, a circular shape, or the like, and may be various shapes as necessary.
  • the container 1 is preferably capable of performing cell culture in a closed system (closed system) and has gas permeability to oxygen and carbon dioxide necessary for use in a CO 2 incubator, In particular, it is preferable to be suitable for use in a culture environment of 37 ° C. and 5% carbon dioxide concentration.
  • the container 1 is preferably partially or entirely transparent so that the progress of cell culture and the state of the cells can be confirmed, so that the cells can be propagated more efficiently. In addition, it preferably has low cytotoxicity, low dissolution and suitability for radiation sterilization.
  • Polyethylene resins such as ionomers using coalescence and metal ions can be mentioned, but other polyolefins, styrene elastomers, polyester thermoplastic elastomers, silicone thermoplastic elastomers, silicone resins, and the like can also be used.
  • the tube 12 is connected to one side of the short side of the rectangular container 1.
  • the cells and the culture medium are supplied from the outside to the container 1 through the tube 12, and the cells and the culture medium are collected from the container 1 after the process in the container 1 is finished.
  • Two tubes may be connected for recovery.
  • a tube for taking out the sample may be connected.
  • the tube 12 may be connected to a tubular port attached to the container 1, and the container 1 can reduce the residual liquid when cells and culture medium are collected from the container 1. It is also possible to form the housing portion so that the shape gradually decreases toward the port.
  • silicone rubber soft vinyl chloride resin, polybutadiene resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, chlorinated polyethylene resin, polyurethane-based thermoplastic elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, styrene A system elastomer or the like can be used.
  • styrene elastomer examples include SBS (styrene / butadiene / styrene), SIS (styrene / isoprene / styrene), SEBS (styrene / ethylene / butylene / styrene), SEPS (styrene / ethylene / propylene / styrene), and the like. Can be used.
  • the cell culturing method uses such a container 1 for culturing cells that have been damaged from function such as cells collected from patients and cells thawed after cryopreservation.
  • a curing culture process for culturing the cell while curing the cell in the initial stage of cell culture, and expanding the culture area in the container after the cell curing has progressed to some extent, And an expansion culture step of continuing the cell culture until the cell density is reached.
  • the container 1 supplied with the medium M together with the cells C is held on the base 2 having the planar placement surface 20, and the placement surface 20.
  • the bottom surface of the container 1 is partially raised to partition it into a plurality of compartments 10, and the cells C are cultured in each partitioned compartment 10.
  • the bottom portion of the container 1 is raised so that the bent portion pushed up by the partition piece 3 is lifted from the placement surface 20, and the remaining flat portion in contact with the placement surface 20 becomes the culture surface. .
  • the cells C are supplied to the container 1 in a state of being suspended in the medium M, the cells C are then placed on the bottom surface of the container 1 regardless of whether they are floating cells or anchorage-dependent cells. Sedimentation is performed, but the sedimented cells C gather on the culture surface of each compartment 10 so that the cells C can be cultured in a state where the cell density is increased.
  • cells C are collected on the culture surface of each compartment 10 and cell culture is performed.
  • the number, interval, size, etc. of the compartments 10 formed on the bottom surface of the container 1 are as follows.
  • the density of the cells C collected on the culture surface of each compartment 10 can be adjusted to an appropriate range.
  • the area of the culture surface in each compartment 10 depends on the type of cell C to be cultured, the inoculation concentration, etc., of each well of a well plate (for example, a 24-well plate) that has been used for subcultures. It is preferable to make it the same as the bottom area.
  • the partition piece 3 that partitions the bottom of the container 1 is formed in a short shape with a predetermined thickness, so that the cells C in culture do not move between the compartments.
  • the thickness and the protruding height from the placement surface 20 are set as appropriate.
  • the thickness of the partition piece 3 is preferably 0.5 to 2.0 mm, and the protruding height from the placement surface 20 is preferably 0.5 to 1.5 mm.
  • the cells C are cultured in a state where the cell density is increased for each of the compartments 10 formed on the bottom surface of the container 1, and the density of the cells C thus proliferated (unit area on the culture surface of each compartment 10). After the number of cells per cell) increases above a certain level, the process proceeds to the expansion culture process.
  • the partition piece 3 is accommodated in the base 2, and the upper end surface of the partition piece 3 is flush with the placement surface 20, thereby eliminating the partition 10 and the container.
  • the culture area is expanded using 1 inside as one section. That is, in the curing culture process, the bottom surface of the container 1 is raised by the partition piece 3 so that the bent portion is raised from the placement surface 20 and is partitioned into a plurality of compartments 10 as described above.
  • the partition piece 3 is accommodated in the base 2, the upper end surface thereof is flush with the mounting surface 20, and the section 10 is eliminated, the portion is flattened by the weight of the content liquid. As a result, it can be used as a culture surface, and the culture area in the container is expanded accordingly.
  • the cells C are cultured while being cured in a state where the cell density is increased. Then, when the density of the proliferated cells C exceeds a certain level and exceeds the range suitable for culture, the process proceeds to an expansion culture step, the culture area in the container is expanded, and the cells until the predetermined cell density is reached. Continue culturing C. In expanding the culture area in the container and continuing the cell culture, the medium 1 is additionally supplied to the container 1 as necessary.
  • the container 1 when shifting to an expansion culture process, it is preferable to stir the contents liquid of the container 1. For example, after moving the container 1 upward from the initial position, the container 1 is returned to the initial position, and the operation of applying vibration to the container 1 that has returned to the initial position is repeated to stir the content liquid in the container 1. be able to.
  • the cell C diffuses so as to rise in the content liquid by vibration applied to the container 1.
  • the content liquid in the container 1 is efficiently stirred in the vertical direction, the distribution of the cells C in the content liquid in the container 1 and the component concentration of the medium M are made uniform, and a good culture environment is maintained.
  • the present embodiment when the present embodiment is applied and, for example, floating cells such as lymphocytes are cultured, the cells C are generated by collecting the cells C for each of the compartments 10 formed on the bottom surface of the container 1.
  • the concentration of an activator such as a cytokine is locally increased, and an interaction between cells is generated, so that the cells can be cultured with an increased cell activity.
  • the cell C can be efficiently cultured while maintaining an appropriate cell density in the same container by expanding the culture area in the container after the proliferation of the cell C proceeds to some extent.
  • the present embodiment restores the original function of the cell by curing cells that have been damaged such as cells just collected from patients or cells that have been thawed after cryopreservation. It can be particularly suitably used for efficient culture.
  • the culture surface of each compartment 10 formed on the bottom surface of the container 1 is used.
  • the cell C adheres and proliferates, and then the culture area in which the cells C can proliferate can be expanded with an appropriate arrangement by eliminating the section 10 and expanding the culture area in the container. For this reason, as in subculture, it is necessary to perform a complicated operation that may cause a reduction in proliferation efficiency, such as detaching and collecting cells from the culture surface and seeding the cells in a new culture vessel.
  • cell culture can be efficiently performed in the same culture environment as that of subculture in the same container.
  • the container 1 used by this embodiment consists of a flexible material, it is easy to bend and a shape is not stable. For this reason, in general, if the container 1 is deformed due to vibrations or the like during a culture period that takes several days, the content liquid flows excessively and damages the cells, reducing the culture efficiency. It can be considered. In view of such circumstances, in this embodiment, when the culture medium M is supplied to the container 1 made of a flexible material together with the cells C to perform cell culture, vibration is applied during a long culture period. However, the container 1 is not easily deformed so that the flow of the content liquid that damages the growing cells C can be suppressed and the cells C can be efficiently proliferated. Cell culture is preferably performed in a state where the inside is pressurized, but this will be described later.
  • FIG. 3 is a perspective view showing an outline of the cell culture device according to the present embodiment.
  • the culture apparatus 100 includes the base 2 having the planar mounting surface 20 that holds the container 1 as described above.
  • the base 2 has one end on the short side supported by the support frame 4 and is rotatable about the axis.
  • the base 2 includes a holding member 21 that forms the placement surface 20 and a partition plate 30 disposed below the holding member 21.
  • the partition plate 30 includes a plurality of short partitions.
  • the pieces 3 are erected in parallel at regular intervals.
  • a plurality of slits 22 are arranged in parallel along the longitudinal direction on the mounting surface 20 of the holding member 21, and the partition pieces 3 erected on the partition plate 30 protrude from the slits 22, respectively. It can be made to. In this way, the partition piece 3 that can protrude from the placement surface 20 at a predetermined height is embedded in the base 2.
  • FIG. 4 shows an exploded perspective view of the base 2 included in the culture apparatus 100 shown in FIG. 3.
  • the side surfaces Two pairs of notches 31 are formed by notching opposing portions with a certain width. Then, with the two guide members 32 fitted into the notches 31 in a loosely fitting manner, the guide members 32 are attached to the holding member 21, so that the partition plate 30 is placed below the holding member 21. It is arranged. At this time, when the partition plate 30 is lifted from the guide member 32 and pressed against the holding member 21, the partition piece 3 protrudes from the placement surface 20 at a predetermined height, and the partition plate 30 is guided by the guide member 32. The shape, size, etc. of each member are adjusted as appropriate so that the upper end surface of the partition piece 3 is flush with the placement surface 20 (see FIGS. 6 and 9).
  • two support members 40 having an L-shaped cross section are rotatably mounted with the long-side base end side pivotally supported. Yes.
  • the support member 40 When the long side is parallel to the vertical direction, the support member 40 has a long side that comes into contact with the lower surface of the partition plate 30, thereby lifting the partition plate 30 and pressing it against the holding member 21. 30 is supported (see FIG. 6).
  • the support member 40 rotates so that the long side is inclined with respect to the vertical direction by the weight of the short side (see FIG. 7).
  • the partition plate 30 that has lost its support is lowered to a position where it is supported by the guide member 32. Thereby, the partition piece 3 is accommodated in the base 2, and the upper end surface of the partition piece 3 is flush with the placement surface 20.
  • the base 2 is provided with a pressing plate 23 for pressing the upper surface side of the container 1 held on the mounting surface 20 to pressurize the inside of the container.
  • the pressing plate 23 can be moved up and down in accordance with the internal volume of the container 1 (see FIGS. 11 and 12).
  • elongated guide holes 24 are formed at the four corners of the base 2.
  • the annular rising piece 25 is erected, and the guide hole 24 can be attached by inserting pins 26 protruding horizontally at the four corners of the pressing plate 23.
  • a groove shape is formed on the upper end side of two annular rising pieces 25 located at both ends of one long side of the base 2 among the four annular rising pieces 25 provided on the base 2.
  • a cut-out thin portion 27 is formed. Accordingly, when the pin 26 inserted into the guide hole 24 of the annular rising piece 25 applies a force in a state where the pin 26 is in contact with the upper edge of the guide hole 24 when the pressing plate 23 is lifted, the thin portion 27 is removed. It passes through the guide hole 24 through it.
  • the pressing plate 23 is lifted diagonally so that the mounting surface 20 can be opened.
  • the holes 11 drilled at the four corners of the container 1 are locked to the fixtures 28 provided at the four corners of the base 2, and the tube 12 connected to the container 1 is fixed to the tube fixing member 29.
  • the container 1 can be attached to the culture apparatus 100.
  • the medium 1 is supplied to the container 1 together with the cells C, and a predetermined amount of content liquid is stored in the container.
  • the hooks 41 and 42 are locked to the two sides on the short side of the press plate 23,
  • the pressing plate 23 can be fixed at a lower position, whereby the upper surface side of the container 1 held on the mounting surface 20 is pressed by the pressing plate 23 and the inside of the container is pressurized. I am doing so.
  • the hooks 41 and 42 that are locked to the pressing plate 23 are pivotally supported by the support frame 4, respectively.
  • the hooks 41 and 42 are rotated and locked and released from the pressing plate 23. It has become so.
  • the pressing plate 23 from which the hooks 41 and 42 are unlocked can be moved up to an upper position where the pin 26 contacts the upper edge of the guide hole 24.
  • 6 to 9 are explanatory diagrams for explaining the operation of the cell culture device according to the present embodiment, and the cross sections shown in these drawings correspond to the AA cross section of FIG.
  • FIG. 6 shows an initial state of the culture apparatus 100.
  • the bottom surface of the container 1 is partitioned into a plurality of compartments 10 by the partition piece 3 protruding at a predetermined height from the placement surface 20 (see FIG. 1).
  • the preparation which performs the curing culture process of the cell culture method mentioned above is completed.
  • the container 1 is not shown in FIGS. 6 to 9, in the curing culture step, as shown in FIG. 11, the upper surface side of the container 1 is pressed by the pressing plate 23 fixed at the lower position.
  • the amount of the medium M to be supplied to the container 1 is adjusted so that the inner volume is such that the inside is pressurized.
  • the pressing plate 23 is returned from the state shown in FIG. 5 and pressed against the container 1, and at the two short sides of the pressing plate 23.
  • the inside of the container can be pressurized by pressing the upper surface side of the container 1 held on the placement surface 20 with the pressing plate 23.
  • the container By placing the container in a pressurized state, it is possible to suppress excessive flow of the content liquid in the container and prevent damage to the cells C during culture. Furthermore, if the gas dissolved in the medium M is vaporized and bubbles remain in the container, the fine bubbles refract the illumination optical path when observing the inside of the container, and the container cannot be clearly observed.
  • gas such as oxygen diffuses from outside into the culture solution in the container, the gas and film, the film gas movement of the film and the culture solution in two places, the bubbles stay in the container, There is a risk that the film gas moves in three places, gas and film, film and bubble, bubble and culture solution, and there is a risk that the gas diffusion to the culture solution in the container is reduced.
  • pressurizing the inside of the container vaporization of the gas dissolved in the culture medium M can also be suppressed, so that the above-described problems can be prevented.
  • the curing culture process is performed in this way, and after the curing culture process has progressed and the density of the proliferated cells C has increased beyond a certain range and exceeds the range suitable for the culture, the expansion culture process is performed. Transition.
  • the push-up member 5 when moving to the expansion culture step, the push-up member 5 is moved upward, and the base 2 pivotally supported by the support frame 4 is rotated upward around the axis.
  • the support member 40 having an L-shaped cross section that supports the partition plate 30 is released from contact with the partition plate 30, and the long side is vertical in the vertical direction due to the weight of the short side. It rotates so as to be inclined with respect to.
  • the partition plate 30 that has lost support by the support member 40 is lowered to a position where it is supported by the guide member 32, and accordingly, the partition piece 3 is accommodated in the base 2, and the upper end surface of the partition piece 3 Is flush with the mounting surface 20.
  • the section 10 partitioned by the partition piece 3 is eliminated, and the inside of the container becomes one section and the culture area is expanded (see FIG. 2).
  • the hooks 41 and 42 are locked to the two sides on the short side of the pressing plate 23, but the hooks 41 and 42 are locked by rotating the base 2 upward. Canceled. That is, in the present embodiment, the push-up member 5 that has moved upward is brought into contact with the contact member 50 provided on the short side opposite to the side on which the rotation shaft of the base 2 is provided. When the base 2 is rotated upward, a beam-shaped contact piece 51 is installed on the contact member 50. When the push-up member 5 comes into contact with the contact member 50 and rotates the base 2 upward, the contact piece 51 contacts the lower tongue piece 41a of one hook 41 as shown in FIG. The hook 41 rotates in contact with it, and thereby the lock is released. Then, when the base 2 is further rotated upward, as shown in FIG. 8, the other hook 42 is rotated so as to be pushed by the base 2, and the hook 42 is unlocked. It is.
  • the push-up member 5 is moved downward. Thereby, as shown in FIG. 9, the base 2 rotates downward and returns to the initial position. At this time, the vibration is transmitted to the container 1 held on the mounting surface 20 of the base 2 by the impact of the support frame 4 receiving the base 2. In this way, by moving the push-up member 5 up and down and repeating the pivoting operation of the base 2, the container 1 is moved upward from the initial position, and then the container 1 is returned to the initial position. The operation
  • movement which applies a vibration to the container 1 which returned to the position will be repeated, and, thereby, the content liquid of the container 1 can be stirred.
  • the drive mechanism for moving the push-up member 5 up and down includes a plate cam 5b having a first cam surface 5c having an arcuate outline and a second cam surface 5d having a rectilinear outline.
  • a plate cam 5b having a first cam surface 5c having an arcuate outline and a second cam surface 5d having a rectilinear outline.
  • it can be configured as a cam mechanism using a receiving plate 5a provided horizontally at the base end of the push-up member 5 as a follower, it is not limited to this.
  • the curvature of the cam surfaces 5c and 5d, the position of the drive shaft 5e for rotating the plate cam 5b, and the rotational speed of the drive shaft 5e are set as appropriate, and the first cam surface 5c pushes up the receiving plate 5a.
  • the push-up member 5 moves upward (see FIGS. 10A to 10E), and when switching to the second cam surface 5d, the plate cam 5b is separated from the receiving plate 5a so that the push-up member 5 falls.
  • FIGS. 10 (f) to 10 (h) the vertical movement of the push-up member 5 is repeated as the plate cam 5b rotates in a certain direction. If the drive mechanism is configured in this manner, when the base 2 is rotated downward to return to the initial position, the base 2 is rotated so as to drop, and the support frame 4 is thus supported by the base 2. A shock will be generated when receiving.
  • the culture medium M is additionally supplied to the container 1.
  • the pressing plate 23 is pushed up by the container 1 whose internal capacity is increased and the thickness is increased, but the pin 26 protruding from the pressing plate 23 is provided.
  • the pressing plate 23 cannot move above it and is fixed at the upper position (see FIG. 12).
  • the transition to the expansion culture process is completed, and thereafter, the culture of the cells C is continued until a predetermined cell density is reached.
  • the culture apparatus 100 can move from the curing culture process to the expansion culture process by the rotation operation of the base 2.
  • the bottom surface of the flattened container 1 is flattened by the weight of the content liquid and is used as the culture surface.
  • the bottom surface of the container 1 is not sufficiently flattened and the culture surface is If wrinkles or slack occur in the cells, cells accumulate in the portions, resulting in an excessive density, and cell migration is restricted, and there is a concern that the proliferation efficiency of the cells may be reduced.
  • such a place where the cells accumulate may cause the cells to remain in the container when the cultured cells are collected.
  • FIG. 17 shows an example in which the hole 11 provided in the container 1 is locked to the fixture 28 and the container 1 is pulled. It is not enough to prevent wrinkles and slack.
  • the holes 11 formed at the four corners of the container 1 are locked to the fixtures 28 provided at the four corners of the base 2.
  • a recess 28a is provided in the fixture 28, the hole 11 provided in the container 1 is engaged with the recess 28a, and the end of the container 1 is moved at the height of the recess 28a. It is preferable to hold.
  • the arrangement and the number of the fixtures 28 are not particularly limited, and it is sufficient that two or more fixtures 28 are arranged to face each other at the peripheral edge of the base 2.
  • the fixtures 28 are preferably erected at the four corners of the base 2, and when a relatively large container 1 is used, more fixtures 28 are erected. Is also preferable.
  • one fixing tool 28 can be arranged at the center of the end on the short side of the base 2, one at the center of the end on one of the short sides, and two or more at the opposite end. You can also.
  • the holes 11 drilled in the container 1 are provided corresponding to the arrangement and number of the fixtures 28 provided on the base 2, and the fixtures 28 are inserted into the holes 11 so that the peripheral edge of the holes 11 is recessed. It can be provided in a heat sealed end region or the like so that it can engage with 28a. That is, it is only necessary that two or more holes 11 are provided at the end of the container 1 corresponding to two or more fixtures 28 provided at the peripheral edge of the base 2. At this time, it goes without saying that the hole 11 is provided in the container 1 so that the sealing performance of the container 1 is not impaired.
  • the shape of the fixture 28 is not particularly limited.
  • it can be made into a substantially cylindrical shape, other shapes such as a substantially rectangular parallelepiped may be used.
  • the upper part of the recessed part 28a can be made into a dome shape, and the lower part can be made into a columnar shape or a prism shape.
  • the recess 28a is preferably formed in a circumferential shape with respect to the horizontal plane in the fixture 28, but is not limited thereto, and the semi-circular shape, arc shape, or the like with respect to the horizontal plane in the outer direction of the base 2. You may form in. Further, the horizontal cross section of the recess 28a is not limited to a circle, and may be a polygon or a star.
  • the position where the recess 28a is formed in the fixture 28 is determined based on the thickness of the container 1 when the container 1 is full, assuming the thickness of the container 1 that is filled with the culture solution to the full capacity of the container 1. be able to.
  • FIG. 15 shows that in the fixture 28, a concave portion 28a is formed at a position 1/2 of the thickness of the container 1 when full (approximately 1/2 of the liquid depth d) upward from the position of the surface of the base 2.
  • the example which engaged the peripheral part of the hole 11 of the container 1 with this recessed part 28a is shown.
  • the edge part of the container 1 is hold
  • FIG. 16 shows that in the fixture 28, a concave portion 28a is formed at a position 3/4 of the thickness of the container 1 when full (approximately 3/4 of the liquid depth d) upward from the position of the surface of the base 2. And the example which engaged the peripheral part of the hole 11 of the container 1 with this recessed part 28a is shown. By doing in this way, the bottom face of container 1 can be made into a flat state by pulling up the edge part which counters in container 1 to the height of crevice 28a. Such an effect can be similarly obtained even when the position of the recess 28a is above the position of the surface of the base 2 and slightly above the thickness of the full container 1.
  • the position where the recess 28a is formed in the fixture 28 may be set to a range of 1/2 to 3/2 of the thickness of the container 1 when the container 1 is full, from the surface position of the base 2 upward. Preferably, it is in the range of 1/2 to 1, more preferably in the range of 1/2 to 3/4.
  • the bottom surface of the container 1 after shifting to the expansion culture process can be more reliably maintained in a flat state. It can be in a state without slack. For this reason, it becomes possible to maximize the culture area of the container 1.
  • the bottom surface of the container 1 more flat, the cells can be uniformly distributed (dispersed) in the container 1. For this reason, it is possible to optimize the culture conditions in the cell culture, and to further improve the proliferation efficiency of the cells.
  • the container 1 is held in a state in which the partition piece 3 protrudes from the base 2 in which the partition piece 3 that can protrude from the placement surface 20 at a predetermined height is embedded.
  • the bottom surface of the container 1 is partially raised and partitioned into a plurality of compartments 10, the cell culture method according to the present invention can be implemented without being limited thereto.
  • the deformation of the container 1 made of a flexible material can be used to partially bulge the bottom surface of the container 1 and partition it into a plurality of compartments 10, for example, a plurality of rod-shaped members can be placed on the mounting surface 20. You may make it arrange
  • the pressing plate 23 is provided with annular rising pieces 25 that form elongated hole-shaped guide holes 24 at the four corners of the base 2, and the four corners of the pressing plate 23 are formed in the guide holes 24.
  • the pressing plate 23 may be attached as shown in FIGS. 13 and 14 as long as it can be moved up and down in accordance with the content of the container 1.
  • two pairs of rising pieces 25 a each having a long hole-shaped guide hole 24 a are erected so as to be paired at positions where the long sides of the base 2 are opposed to each other.
  • a pressing plate 23 is attached so as to be movable up and down via a support bar 26a installed on each of the two.
  • the hook F is locked to the support rod 26a inserted into the guide hole 24a to prevent the pressing plate 23 from moving upward, so that the pressing plate 23 fixed at the lower position has a predetermined content.
  • the inside of the container 1 can be pressed by pressing the upper surface side of the container 1 (see FIG. 13). Further, in the expansion culture process, the pressing plate 23 can be moved upward by releasing the hook F.
  • the pressing plate 23 cannot move above it and is fixed at the upper position.
  • the medium M is additionally supplied, and the inside of the container can be pressurized by pressing the upper surface side of the container 1 whose inner volume is increased and the thickness is increased with the pressing plate 23 (see FIG. 14).
  • the hook F is rotated by its weight due to the inclination of the base 2. You just have to do it.
  • the present invention can be suitably used for gene therapy, immunotherapy, regenerative medicine, antibody drug production, etc. in which cells are cultured in a closed system aseptically and simply using a cell culture container.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

　可撓性材料からなる容器１の底面を部分的に隆起させて複数の区画１０に仕切り、仕切られた区画１０ごとに細胞Ｃを培養し、しかる後に、区画１０を解消することによって容器内の培養面積を拡大する。これにより、培養時の細胞密度を適性に維持し、さらに細胞を大量に増殖させる際に培養容器の移し替え作業をなくし、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減を可能とする。

Description

細胞培養方法、及び細胞培養装置
　本発明は、人工的な環境下で細胞を培養する細胞培養方法、及び細胞培養装置に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物、ウィルス等（これらを包括して「細胞」と称する）を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。このような細胞培養にあっては、培養液（以下、細胞及び培地を含むものをいう）内の細胞密度が高くなるにつれて、増殖に必要な培地成分の枯渇、細胞自身の代謝産物の蓄積が起こり、増殖速度が低下し細胞密度は飽和に達してしまう。このため、細胞をある程度の規模で培養する場合には、通常、細胞密度が適性に維持されるよう継代を繰り返しながら培養を行っている。
　この継代の際、ウェルプレートからフラスコなどに移し替える場合がある。例えば、細胞培養ウェルプレートを用いて適度の細胞密度となるように、培地とともに細胞を個々のウェルに加えて培養を開始し、ウェル内で細胞を十分に増殖させてから細胞培養フラスコに移し替え、細胞増殖に合わせて培地を追加して培養するとともに継代を行い、一定量に増殖した時点で、より容量の大きいフラスコやバッグなどに移し替えて、さらに培養と培地の補給、継代を繰り返し、細胞の大量培養が行われていた（例えば、特許文献１［００２７］段落等参照）。
　また、凍結保存された細胞を使用する際には、融解した後に、細胞本来の機能を回復するためにウェルプレートを用いて高密度状態で数日間の培養（以下、「養生培養」と称する）が行われ、細胞の機能を本来の状態に回復させた後にフラスコに移し替えて培養し（以下、「拡大培養」と称する）、その後、抗体刺激を行う活性化培養を行なう方法もある（例えば、特許文献２［００５７］段落等参照）。
　なお、このような細胞培養にあっては、従来、ウェルプレートやフラスコなどの器具が用いられてきたが、近年では、これらの器具の代わりに、樹脂フィルムのような可撓性材料を製袋してなる培養バッグが用いられるようになってきている（特許文献３、４参照）。ウェルプレートやフラスコなどの器具は、大量の細胞を培養するには不向きであり、これに対して、培養バッグは、大容量化が容易であることから大量培養が可能なだけでなく、細胞培養を閉鎖系で行うことができ、培養期間中における菌やウィルスのコンタミネーションリスクを低減できるというメリットもある。このため、実験室レベルを超えて、ある程度の規模で細胞を大量に培養する場合には、培養バッグが好んで用いられている。
特開２０１１－２４１１５９号公報 特開２０１３－２１５１４１号公報 国際公開２０１２／０３２７６１号パンフレット 国際公開２００８／１３６３７１号パンフレット
　しかしながら、このような細胞培養においては、ウェルプレートからフラスコに移し替える際にピペッティング作業を何回も繰り返す必要があり、また、継代のたびに新たなフラスコやバッグなどの培養容器に細胞を移さなければならず、作業が煩雑になるだけでなく、細胞にダメージを与える可能性がある。さらに、コンタミネーション（contamination：汚染）のリスクが高いという問題もあった。
　本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、培養時の細胞密度を適性に維持し、さらに細胞を大量に増殖させる際に培養容器の移し替え作業をなくし、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減を可能とする細胞培養方法、及び細胞培養装置の提供を目的とする。
　本発明に係る細胞培養方法は、可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養方法であって、前記容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切り、前記区画ごとに前記細胞を培養し、しかる後に、前記区画を解消することによって、前記容器内の培養面積を拡大する方法としてある。
　また、本発明に係る細胞培養装置は、可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、前記容器を保持する平面状の載置面を有する基台を備え、前記載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が前記基台に埋設され、前記仕切片を前記基台内に収容したときに、前記仕切片の上端面が前記載置面と面一になる構成としてある。
　本発明によれば、細胞密度を高めた状態で細胞を培養しつつ、増殖した細胞の密度が一定以上に増大して培養に適した範囲を超えたときに、容器内の培養面積を拡大することによって、継代を行うことなく培養時の細胞密度を適正に維持して、細胞を効率的に増殖することが可能になる。
　また、培養容器の移し替え作業が不要であり、培養液が同一の培養容器に留まることで、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減が可能となる。
本発明の実施形態に係る細胞培養方法における養生培養工程の概略を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養方法における拡大培養工程の概略を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す斜視図である。 図３に示す細胞培養装置が備える基台の分解斜視図である。 図３に示す細胞培養装置の載置面を開放した状態を示す斜視図である。 図３に示す細胞培養装置の動作を説明するための説明図である。 図３に示す細胞培養装置の動作を説明するための説明図である。 図３に示す細胞培養装置の動作を説明するための説明図である。 図３に示す細胞培養装置の動作を説明するための説明図である。 図３に示す細胞培養装置が備える基台を回動させる突き上げ部材を上下動する駆動機構の一例を示す説明図である。 図３に示す細胞培養装置を用いて養生培養工程を行う状態を示す説明図である。 図３に示す細胞培養装置を用いて拡大培養工程を行う状態を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の変形例の概略を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の変形例の概略を示す斜視図である。 容器に設けた孔を固定具に形成した凹部に係合させた一例を示す説明図である。 容器に設けた孔を固定具に形成した凹部に係合させた他の一例を示す説明図である。 容器に設けた孔を固定具に係止した一例を示す説明図である。
　以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
［細胞培養方法］
　まず、本実施形態に係る細胞培養方法について説明する。
　本実施形態に係る細胞培養方法は、可撓性材料からなる容器１に、培養の対象となる細胞（培養細胞）Ｃとともに、この細胞Ｃを培養するための培地Ｍを供給して細胞培養を行う細胞培養方法であり、特に、患者から採取した細胞や凍結された細胞などのダメージを受けた細胞を養生して、細胞本来の機能を回復しつつ、培養するのに好適な細胞培養方法である。
　本実施形態において、容器１は、可撓性材料を用いて袋状（バッグ型）に形成してなり、その形状は、通常、長方形状とされることが多く、例えば、四辺がヒートシールにより密封されたものとしたり、ブロー成形による一体成型バッグとしたりすることができる。
　なお、容器１の形状は、正方形状、楕円形状、円形状などとする場合もあり、必要に応じて種々の形状とすることができる。
　また、容器１は、細胞培養を閉鎖系（密閉系）で行うことができるとともに、ＣＯ２インキュベータ内で使用する場合に必要な酸素及び二酸化炭素に対するガス透過性を有しているのが好ましく、特に、３７℃，５％二酸化炭素濃度の培養環境下での使用に適したものとするのが好ましい。
　さらに、容器１は、細胞培養の進行状況や細胞の状態などを確認できるように、一部又は全部が透明性を有しているのが好ましく、細胞をより効率的に増殖することができるように、低細胞毒性、低溶出性及び放射線滅菌適性を有しているのが好ましい。
　このような容器１としての条件を満たす可撓性材料の具体例としては、ポリエチレン，エチレンとα－オレフィンの共重合体，エチレンと酢酸ビニルの共重合体，エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等のポリエチレン系樹脂が挙げられるが、他のポリオレフィン，スチレン系エラストマー，ポリエステル系熱可塑性エラストマー，シリコーン系熱可塑性エラストマー，シリコーン樹脂等を用いることもできる。
　図５に示す例では、長方形状とされた容器１の短辺側の一辺にチューブ１２が接続されている。このチューブ１２を介して、細胞や培地を外部から容器１に供給し、また、当該容器１での工程を終えた後は、細胞や培地を容器１から回収するようにしてあるが、供給用と回収用として２本のチューブを接続してもよい。この他にもサンプル取り出し用のチューブなどを接続するようにしてもよい。
　なお、特に図示しないが、チューブ１２は、容器１に取り付けられた管状のポートに接続するようにしてもよく、細胞や培地を容器１から回収する際の残液を低減できるように、容器１の収容部の形状をポートに向かって次第に狭くなるように形成することもできる。
　容器１に接続されるチューブ１２の材質としては、使用環境に合わせて適宜選択すればよい。ＣＯ２インキュベータ内で使用する場合は、酸素及び二酸化炭素に対するガス透過性に優れるものが望ましいが、ＣＯ２インキュベータ外で使用する場合は、ガスバリア性に優れるものが望ましい。
　具体的には、例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。
　本実施形態に係る細胞培養方法は、このような容器１を用いて、患者から採取した細胞や、凍結保存後に解凍された細胞のようなダメージを受けて機能が衰えた細胞を培養するにあたり、細胞本来の機能が回復するように、細胞培養の初期の段階において当該細胞を養生しつつ培養する養生培養工程と、細胞の養生がある程度進んでから容器内の培養面積を拡大して、所定の細胞密度となるまで細胞の培養を継続する拡大培養工程とを含んでいる。
　本実施形態において、養生培養工程では、図１に示すように、細胞Ｃとともに培地Ｍが供給された容器１を、平面状の載置面２０を有する基台２に保持し、載置面２０から所定の高さで突出する仕切片３によって、容器１の底面を部分的に隆起させて複数の区画１０に仕切り、仕切られた区画１０ごとに細胞Ｃを培養する。このとき、容器１の底面は、仕切片３によって押し上げられて撓んだ部分が、載置面２０から浮き上がるように隆起し、載置面２０に当接する残りの平らな部分が培養面となる。
　これにより、細胞Ｃが培地Ｍに懸濁された状態で容器１に供給されると、その後、浮遊系細胞であるか足場依存性細胞であるかにかかわらず、細胞Ｃは容器１の底面に沈降するが、沈降した細胞Ｃが各区画１０の培養面に集まることで、細胞密度が高められた状態で細胞Ｃを培養することができる。
　このように、養生培養工程にあっては、各区画１０の培養面に細胞Ｃが集められて細胞培養が行われるが、容器１の底面に形成される区画１０の数、間隔、大きさなどを調整することで、各区画１０の培養面に集められた細胞Ｃの密度を適正な範囲に調整することができる。
　なお、各区画１０における培養面の面積は、培養する細胞Ｃの種類や接種濃度などに応じて、従前より継代培養に用いられてきたウェルプレート（例えば、２４ウェルプレートなど）の各ウェルの底面積と同程度となるようにするのが好ましい。
　このようにして養生培養工程を行うにあたり、容器１の底部を仕切る仕切片３は、所定の厚みを以て短尺状に形成され、培養中の細胞Ｃが区画間を移動してしまわないように、その厚みや、載置面２０からの突出高さを適宜設定する。例えば、仕切片３の厚みは、０．５～２．０ｍｍとするのが好ましく、載置面２０からの突出高さは、０．５～１．５ｍｍとするのが好ましい。
　次いで、養生培養工程において、容器１の底面に形成された区画１０ごとに細胞密度を高めた状態で細胞Ｃを培養し、これによって増殖した細胞Ｃの密度（各区画１０の培養面における単位面積あたりの細胞数）が一定以上に増大した後に、拡大培養工程に移行する。
　拡大培養工程では、図２に示すように、仕切片３を基台２内に収容し、仕切片３の上端面を載置面２０と面一とすることによって、区画１０を解消して容器１内を一区画として用いて培養面積を拡大する。
　すなわち、養生培養工程では、容器１の底面が、仕切片３によって押し上げられて撓んだ部分が載置面２０から浮き上がるように隆起して、複数の区画１０に仕切られているのは前述した通りであるが、仕切片３を基台２内に収容し、その上端面を載置面２０と面一にして区画１０を解消すると、当該部分が、内容液の重さによって平らにならされて培養面として利用できるようになり、その分だけ容器内の培養面積が拡大する。
　このように、本実施形態にあっては、養生培養工程において、細胞密度を高めた状態で細胞Ｃを養生しつつ培養する。そして、増殖した細胞Ｃの密度が一定以上に増大して培養に適した範囲を超えたときに拡大培養工程に移行して、容器内の培養面積を拡大し、所定の細胞密度となるまで細胞Ｃの培養を継続する。容器内の培養面積を拡大して細胞培養を継続するにあたり、容器１には必要に応じて培地Ｍを追加供給する。
　また、拡大培養工程に移行する際には、容器１の内容液を撹拌するのが好ましい。例えば、容器１を初期位置よりも上方に移動させた後に、容器１を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った容器１に振動を加える動作を繰り返すことによって、容器１の内容液を撹拌することができる。
　このようにすることで、容器１の上下動による内容液の撹拌に加えて、容器１に加わる振動によって細胞Ｃが内容液中を舞い上がるように拡散する。これにより、容器1の内容液が上下方向にも効率よく攪拌され、容器１の内容液中の細胞Ｃの分布や培地Ｍの成分濃度を均一にして良好な培養環境を維持するとともに、細胞Ｃが容器内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞Ｃの増殖を促進することができる。さらに、培養する細胞Ｃが接着性細胞である場合には、容器１に加わる振動により、容器１の培養面からの細胞Ｃの剥離を促すことも可能である。
　このような本実施形態に係る細胞培養方法によれば、継代を行うことなく培養時の細胞密度を適正に維持して、細胞Ｃを効率的に増殖することが可能になるだけでなく、培養容器の移し替え作業が不要であり、培養液が同一の培養容器に留まることで、細胞Ｃへのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減が可能となる。
　したがって、本実施形態を適用して、例えば、リンパ球などの浮遊系細胞を培養する場合には、容器１の底面に形成された区画１０ごとに細胞Ｃが集まることにより、細胞Ｃが生成するサイトカインなどの活性化物質の濃度が局所的に高まり、また、細胞間の相互作用が生じることにより、細胞活性を高めた状態で培養することができる。そして、細胞Ｃの増殖がある程度進んでから容器内の培養面積を拡大させることで、同一容器内で適正な細胞密度を維持しながら、効率的に細胞Ｃを培養することができる。このため、本実施形態は、患者から採取したばかりの細胞や、凍結保存後に解凍されたばかりの細胞のようなダメージを受けて機能が衰えた細胞を養生して、細胞本来の機能を回復しつつ、効率よく培養するのに特に好適に利用することができる。
　また、本実施形態を適用して、例えば、皮膚細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などの足場依存性細胞を培養する場合には、容器１の底面に形成された各区画１０の培養面に細胞Ｃが接着して増殖し、しかる後に、当該区画１０を解消して容器内の培養面積を拡大することで、細胞Ｃが増殖できる培養面を適度な配置をもって拡大することができる。このため、継代培養のように、培養面から細胞を剥離して回収し、新たな培養容器への細胞播種を行うというような、煩雑で増殖効率の低下を招く虞もある作業を必要とせずに、同一容器内で継代培養と同様の培養環境で細胞培養を効率よく行うことができる。
　なお、本実施形態で用いる容器１は、可撓性材料からなるため撓みやすく、形状が安定しない。このため、一般には数日を要する培養期間中に、振動が加わるなどして容器１が変形してしまうと、内容液が過度に流動して細胞にダメージを与えてしまい、培養効率を低下させてしまうことが考えられる。かかる事情に鑑みて、本実施形態にあっては、可撓性材料からなる容器１に、細胞Ｃとともに培地Ｍを供給して細胞培養を行うにあたり、長期にわたる培養期間中に振動が加わるなどしても当該容器１が容易には変形せず、増殖中の細胞Ｃにダメージを与えてしまうような内容液の流動を抑止して、細胞Ｃを効率的に増殖することができるように、容器内を加圧した状態で細胞培養が行われるようにするのが好ましいが、これについては後述する。
［細胞培養装置］
　次に、前述した細胞培養方法に用いるのに好適な本実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
　なお、図３は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す斜視図である。
　本実施形態において、培養装置１００は、前述したような容器１を保持する平面状の載置面２０を有する基台２を備えている。かかる基台２は、短辺側の一端が支持フレーム４に軸支されて、その軸周りに回動可能とされている。
　また、基台２は、載置面２０を形成する保持部材２１と、保持部材２１の下方に配設される仕切板３０とを備えており、仕切板３０には、複数の短尺状の仕切片３が一定の間隔で平行に立設されている。これとともに、保持部材２１の載置面２０には、長手方向に沿って複数のスリット２２が平行に列設されており、仕切板３０に立設された仕切片３を当該スリット２２からそれぞれ突出させることができるようになっている。このようにすることで、載置面２０から所定の高さで突出可能な仕切片３が、基台２に埋設されるようにしてある。
　ここで、図４に、図３に示す培養装置１００が備える基台２の分解斜視図を示すが、本実施形態にあっては、仕切板３０の長辺側の両側面に、当該側面の相対する部位を一定の幅で切り欠いてなる二対の切欠き部３１を形成している。そして、これらの切欠き部３１に二つのガイド部材３２をそれぞれ遊嵌状に嵌合させた状態で、当該ガイド部材３２を保持部材２１に取り付けることによって、保持部材２１の下方に仕切板３０を配設している。この際、仕切板３０をガイド部材３２から浮き上がらせて、保持部材２１に押し付けた状態にあるときに、仕切片３が所定の高さで載置面２０から突出し、仕切板３０がガイド部材３２に支持された状態にあるときに、仕切片３の上端面が載置面２０と面一となるように、各部材の形状、寸法などを適宜調整する（図６及び図９参照）。
　一方、このような基台２を軸支する支持フレーム４には、断面Ｌ字状とされた二つの支持部材４０が、長辺側の基端側が軸支されて回動可能に取り付けられている。かかる支持部材４０は、長辺側が鉛直方向と平行なときに、長辺側の先端が仕切板３０の下面に当接し、これによって仕切板３０を持ち上げて、保持部材２１に押し付けるように仕切板３０を支持する（図６参照）。そして、支持部材４０は、仕切板３０との当接が解除されると、短辺側の重さによって長辺側が鉛直方向に対して傾くように回動し（図７参照）、支持部材４０による支えを失った仕切板３０は、ガイド部材３２に支持される位置まで下がる。これによって、仕切片３が基台２内に収容されて、仕切片３の上端面が載置面２０と面一になる。
　また、基台２には、載置面２０上に保持された容器１の上面側を押圧して、容器内を加圧するための押圧板２３が取り付けられている。押圧板２３は、容器１の内容量に応じて上下動できるように（図１１及び図１２参照）、例えば、図示するように、基台２の四隅に、長穴状のガイド孔２４を形成する環状立ち上り片２５を立設し、このガイド孔２４に、押圧板２３の四隅に水平に突設されたピン２６を挿通することによって取り付けることができる。
　さらに、図示する例では、基台２に設けられた四つの環状立ち上り片２５のうち、基台２の一方の長辺の両端に位置する二つの環状立ち上り片２５の上端側に、溝状に切り欠かれた薄肉部２７を形成してある。これによって、当該環状立ち上り片２５のガイド孔２４に挿通されたピン２６が、押圧板２３を持ち上げたときにガイド孔２４の上縁に当接した状態で力を加えると、この薄肉部２７を通ってガイド孔２４から外れるようにしてある。
　このようにすることで、図５に示すように、押圧板２３を斜めに持ち上げて、載置面２０を開放できるようにしてある。この状態で、基台２の四隅に設けられた固定具２８に、容器１の四隅に穿設された孔１１を係止するとともに、容器１に接続されたチューブ１２をチューブ固定部材２９に固定することによって、容器１を培養装置１００に取り付けることができる。
　また、容器１を培養装置１００に取り付けるにあたり、容器１には、細胞Ｃとともに培地Ｍを供給して、容器内に所定量の内容液を貯留させておく。そして、容器１を培養装置１００に取り付けた後は、押圧板２３を元に戻して容器１に押し当てるとともに、フック４１，４２を押圧板２３の短辺側の二辺に係止して、押圧板２３を下方位置に固定できるようになっており、これによって、載置面２０上に保持された容器１の上面側が押圧板２３で押圧されて、容器内が加圧された状態となるようにしている。
　押圧板２３に係止されるフック４１，４２は、それぞれ支持フレーム４に回動可能に軸支されており、フック４１，４２を回動させることによって押圧板２３への係止と解除がなされるようになっている。フック４１，４２の係止が解除された押圧板２３は、ピン２６がガイド孔２４の上縁に当接する上方位置まで上動可能となる。
　次に、このような培養装置１００の動作について説明する。
　なお、図６～図９は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を説明するための説明図であり、これらの図に示す断面は、図３のＡ－Ａ断面に相当する。
　図６は、培養装置１００の初期状態を示している。この状態で、細胞Ｃとともに培地Ｍが供給された容器１を取り付けると、載置面２０から所定の高さで突出する仕切片３によって、容器１の底面が複数の区画１０に仕切られる（図１参照）。
　これにより、前述した細胞培養方法の養生培養工程を行う準備が整う。
　図６～図９では容器１の図示を省略するが、養生培養工程にあっては、図１１に示すように、下方位置に固定された押圧板２３によって容器１の上面側が押圧されて、容器内が加圧される程度の内容量となるように、容器１に供給する培地Ｍの量を調整する。
　このようにすることで、容器１を培養装置１００に取り付けた後に、押圧板２３を図５に示す状態から元に戻して容器１に押し当てるとともに、押圧板２３の短辺側の二辺にフック４１，４２を係止することで、載置面２０上に保持された容器１の上面側を押圧板２３で押圧して、容器内を加圧することができる。
　容器内を加圧した状態とすることで、容器内での内容液の過度の流動を抑制して、培養中の細胞Ｃにダメージを与えないようにすることができる。さらに、培地Ｍに溶存するガスが気化して容器内に気泡が滞留してしまうと、容器内を観察する際に微細な気泡が照明の光路を屈折させ鮮明な観察ができないという不具合や、容器外から容器内の培養液に酸素などのガスが拡散する際に、ガスとフィルム、フィルムと培養液の二ヵ所の境膜ガス移動であったものが、容器内に気泡が滞留することで、ガスとフィルム、フィルムと気泡、気泡と培養液の三ヵ所の境膜ガス移動となり、容器内の培養液へのガス拡散の低下という不具合が生じてしまう虞がある。容器内を加圧することによって、培地Ｍに溶存するガスの気化を抑制することもでき、これによって、上記したような不具合が生じないようにすることができる。
　前述した細胞培養方法では、このようにして養生培養工程を行い、養生培養工程が進んで増殖した細胞Ｃの密度が一定以上に増大して培養に適した範囲を超えた後に、拡大培養工程に移行する。
　本実施形態にあっては、拡大培養工程に移行するに際し、突き上げ部材５を上動させて、支持フレーム４に軸支された基台２を、その軸周りに上方に回動させる。これにより、図７に示すように、仕切板３０を支持する断面Ｌ字状の支持部材４０は、仕切板３０との当接が解除されて、短辺側の重さによって長辺側が鉛直方向に対して傾くように回動する。そして、支持部材４０による支えを失った仕切板３０は、ガイド部材３２に支持される位置まで下がり、これに伴って、仕切片３が基台２内に収容されて、仕切片３の上端面が載置面２０と面一になる。その結果、仕切片３によって仕切られていた区画１０が解消されて、容器内が一区画となって培養面積が拡大する（図２参照）。
　また、初期状態では、押圧板２３の短辺側の二辺にフック４１，４２を係止させているが、基台２を上方に回動させることによって、当該フック４１，４２の係止が解除される。
　すなわち、本実施形態では、基台２の回動軸が設けられた側とは反対側の短辺側に設けられた当接部材５０に、上動してきた突き上げ部材５を当接させることによって、基台２を上方に回動させているところ、当接部材５０には、梁状の当接片５１が架設されている。そして、突き上げ部材５が当接部材５０に当接して基台２を上方に回動させると、図７に示すように、かかる当接片５１が一方のフック４１の下側舌片４１ａに当接して当該フック４１が回動し、これによって係止が解除されるようにしてある。そして、基台２をさらに上方に回動させると、図８に示すように、他方のフック４２が基台２に押されるように回動して、かかるフック４２の係止も解除されるようにしてある。
　基台２を所定の角度まで回動させた後は、突き上げ部材５を下動させる。これにより、図９に示すように、基台２は、下方に回動して初期状態の位置に戻る。この際、支持フレーム４が基台２を受けた衝撃によって、基台２の載置面２０上に保持された容器１に振動が伝わるようにする。このようにすれば、突き上げ部材５を上下動させて基台２の回動動作を繰り返すことによって、容器１を初期位置よりも上方に移動させた後に、容器１を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った容器１に振動を加える動作が繰り返されることになり、これによって、容器１の内容液を撹拌することができる。
　突き上げ部材５を上下動させる駆動機構は、例えば、図１０に示すように、輪郭が円弧状の第一カム面５ｃと、輪郭が直線状の第二カム面５ｄとを有する板カム５ｂを備え、突き上げ部材５の基端に水平に設けられた受け板５ａをフォロアとするカム機構として構成することができるが、これに限定されない。
　図１０に示す例では、カム面５ｃ，５ｄの曲率、板カム５ｂを回転させる駆動軸５ｅの位置及び駆動軸５ｅの回転速度を適宜設定し、第一カム面５ｃが受け板５ａを押し上げることによって突き上げ部材５が上動し（図１０（ａ）～（ｅ）参照）、第二カム面５ｄに切り替わる際に板カム５ｂが受け板５ａから離れて、突き上げ部材５が落下するようにして（図１０（ｆ）～（ｈ）参照）、板カム５ｂが一定方向に回転することによって突き上げ部材５の上下動が繰り返されるようにしている。当該駆動機構をこのように構成すれば、基台２が下方に回動して初期状態の位置に戻る際に、基台２が落下するように回動して、支持フレーム４が基台２を受けたときに衝撃が生じるようになる。
　基台２の回動動作を数回繰り返して、容器１の内容液の撹拌が十分になされたら、容器１には、培地Ｍを追加供給する。このとき、押圧板２３は、フック４１，４２の係止が解除されているので、内容量が増加して厚みが増した容器１によって押し上げられるが、押圧板２３に突設されたピン２６がガイド孔２４の上縁に達すると、押圧板２３は、それよりも上には動くことができなくなって上方位置で固定される（図１２参照）。これにより、培地Ｍを追加供給して内容量が増加した容器１の容器内の圧力を高めることができ、拡大培養工程にあっても、容器内を加圧した状態とすることで、容器内での内容液の過度の流動を抑制して、細胞Ｃにダメージを与えないようにすることができるとともに、培地Ｍに溶存するガスが気泡となって容器内に滞留するのを有効に避けることができる。
　培養装置１００を上記のように動作させることによって、拡大培養工程への移行が完了し、その後は、所定の細胞密度となるまで細胞Ｃの培養を継続する。
　このように、培養装置１００は、基台２の回動動作によって、養生培養工程から拡大培養工程へ移行できるようになっている。そして、拡大培養工程では、内容液の重さによって平らにならされて、平坦になった容器１の底面が培養面として利用されるが、容器１の底面が十分に平坦にならずに培養面にシワや弛みが生じると、その部分に細胞が溜って過度な密度を生じ、また細胞の移動が制限されるため、細胞の増殖効率が低下することが懸念される。
　また、このような細胞の溜まった場所は、培養細胞の回収にあたって、容器内に細胞が残存する原因にもなりかねない。
　特許文献４では、培養容器の四隅に孔を設けるとともに、容器載置台の四隅に固定具を立設し、培養容器の孔を容器載置台の固定具に係止して培養容器を引っ張ることによって、培養面を平坦にする方法が採られている。
　しかしながら、この方法によっても、培養容器に培養液が入った状態では、培養容器の培養面にシワや弛みが生じ、その部分に細胞の溜まった場所が生じることによって、細胞の増殖効率が低下するという不具合を解消するには不十分である。
　具体的には、図１７に、容器１に設けられた孔１１を固定具２８に係止して、容器１を引っ張るようにした例を示すが、このようにしてもなお、容器１の底面にはシワや弛みが生じないようにするには不十分である。
　本実施形態にあっては、容器１を培養装置１００に取り付けるにあたり、基台２の四隅に設けられた固定具２８に、容器１の四隅に穿設された孔１１を係止しているのは前述した通りであるが、この際に、固定具２８に凹部２８ａを設けて、この凹部２８ａに容器１に設けた孔１１を係合させ、凹部２８ａの高さで容器１の端部を保持するようにするのが好ましい。このようにすることで、拡大培養工程に移行する際に、容器１の底面が内容液の重さによって平らにならされ易くして、容器１の底面を十分に平坦にすることができる。
　このような態様において、固定具２８の配置及び個数は、特に限定されず、基台２の周縁部に二個以上の固定具２８が対向して配置されていればよい。一般的な容器１を用いる場合、固定具２８は基台２の四隅に立設することが好ましく、比較的サイズの大きな容器１を用いる場合には、より多くの固定具２８を立設することも好ましい。また、固定具２８を基台２の短辺における端部中央にそれぞれ一個ずつ配置することもでき、一方の短辺における端部中央に一個配置し、対向する端部に二個以上配置することもできる。
　一方、容器１に穿設する孔１１は、基台２に設けられた固定具２８の配置及び数に対応して設けられ、固定具２８を孔１１に挿入して孔１１の周縁部を凹部２８ａに係合できるように、ヒートシールされた端部領域などに設けることができる。すなわち、基台２の周縁部に設けられた二個以上の固定具２８に対応して、容器１の端部に二個以上の孔１１が設けられていればよい。このとき、容器１に孔１１を設けることによって、容器1の密封性が損なわれないようにするのは言うまでもない。
　固定具２８の形状は、特に限定されない。例えば、略円柱状とすることができるが、略直方体などその他の形状にしてもよい。また、凹部２８ａの上方をドーム状にし、同下方を円柱状や角柱状にすることもできる。
　また、凹部２８ａは、固定具２８に水平面に対して円周状に形成することが好ましいが、これに限定されず、基台２の外側方向に、水平面に対して半円周状や弧状等に形成してもよい。また、凹部２８ａの水平断面は円形に限定されず、多角形や星形などであってもよい。
　また、固定具２８に凹部２８ａを形成する位置は、容器１の容量いっぱいに培養液が充填され、満杯となった容器１の厚みを想定し、満杯時の容器１の厚みを基準に決定することができる。
　図１５は、固定具２８において、基台２の表面の位置から上方に、満杯時の容器１の厚みの１／２（ほぼ液深ｄの１／２）の位置に凹部２８ａを形成し、かかる凹部２８ａに容器1の孔１１の周縁部を係合した例を示している。
　このようにすることで、容器１の端部は、凹部２８ａの高さに保持されて、容器１の底面を平坦な状態にして容器１を基台２に固定することができる。
　また、図１６は、固定具２８において、基台２の表面の位置から上方に、満杯時の容器１の厚みの３／４（ほぼ液深ｄの３／４）の位置に凹部２８ａを形成し、かかる凹部２８ａに容器１の孔１１の周縁部を係合した例を示している。
　このようにすることで、容器1における対向する端部を、凹部２８ａの高さに引っ張り上げることで、容器1の底面を平坦な状態にすることができる。このような効果は、凹部２８ａの位置が、基台２の表面の位置から上方に、満杯の容器１の厚みよりもやや上方の位置にあっても同様に得ることができる。
　このような観点から、固定具２８に凹部２８ａを形成する位置を、基台２の表面の位置から上方に、満杯時の容器１の厚みの１／２～３／２の範囲とすることが好ましく、１／２～１の範囲とすることがより好ましく、１／２～３／４の範囲とすることがさらに好ましい。
　固定具２８に凹部２８ａを形成する位置を上記範囲とすることで、拡大培養工程に移行した後の容器１の底面を、より確実に平坦な状態に維持することができ、培養面をシワや弛みのない状態にすることができる。このため、容器１の培養面積を最大にすることが可能になる。
　また、容器１の底面をより確実に平坦な状態にすることにより、容器１内において細胞を均一に分布（分散）させることができる。このため、細胞の培養における培養条件の最適化を図ることができ、細胞の増殖効率をより一層向上させることが可能となる。
　以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、前述した実施形態では、載置面２０から所定の高さで突出可能な仕切片３が埋設された基台２に、当該仕切片３を突出させた状態で容器１を保持することで、容器１の底面を部分的に隆起させて複数の区画１０に仕切っているが、本発明に係る細胞培養方法は、これに限定されることなく実施することができる。
　可撓性材料からなる容器１の撓み変形を利用して、容器１の底面を部分的に隆起させて複数の区画１０に仕切ることができれば、例えば、複数の棒状の部材を載置面２０に並べて配置し、その上に容器１を保持するようにしてもよい。
　このようにしても、容器１の底面は、棒状の部材によって押し上げられて部分的に隆起し、これによって、複数の区画１０に仕切られる。そして、かかる棒状の部材を引き抜けば、内容液の重さによって容器１の底面が平らにならされて、容器内の培養面積が拡大する。
　また、前述した実施形態において、押圧板２３は、基台２の四隅に、長穴状のガイド孔２４を形成する環状立ち上り片２５を立設し、このガイド孔２４に、押圧板２３の四隅に水平に突設されたピン２６を挿通することによって取り付けているが、これに限定されない。押圧板２３は、容器１の内容量に応じて上下動可能に取り付けられていればよく、例えば、図１３及び図１４に示すように取り付けてもよい。
　図１３及び図１４では、長穴状のガイド孔２４ａを形成した二対の立ち上り片２５ａを基台２の長辺の相対する位置に対となるように立設し、対となる立ち上り片２５ａのそれぞれに架設された支持棒２６ａを介して押圧板２３を上下動可能に取り付けている。そして、養生培養工程では、ガイド孔２４ａに挿通された支持棒２６ａにフックＦを係止して押圧板２３の上動を抑止することにより、下方位置に固定された押圧板２３で所定の内容量とされた容器１の上面側を押圧して、容器内を加圧できるようにしてある（図１３参照）
　また、拡大培養工程では、フックＦの係止を解除することで、押圧板２３が上動できるようにする。そして、支持棒２６ａがガイド孔２４ａの上縁に達すると、押圧板２３は、それよりも上には動くことができなくなって上方位置に固定される。これによって、培地Ｍが追加供給され、内容量が増加して厚みが増した容器１の上面側を押圧板２３で押圧して、容器内を加圧できるようにしてある（図１４参照）。
　なお、フックＦの係止を解除するには、前述した実施形態と同様にして基台２の回動動作を行ったときに、基台２の傾きによって、フックＦがその重さで回動するようにすればよい。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先権の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　本発明は、細胞培養容器を用いて、無菌的かつ簡便に閉鎖系で細胞を培養する遺伝子治療、免疫療法、再生医療、抗体医薬生産などに好適に利用することが可能である。
　１　　　　　容器
　１０　　　　　区画
　１１　　　　　孔
　２　　　　　基台
　２０　　　　　載置面
　２３　　　　　押圧板
　２４　　　　　ガイド孔
　２５　　　　　環状立ち上り片
　２６　　　　　ピン
　２８　　　　　固定具
　２８ａ　　　　　凹部
　３　　　　　仕切片
　４　　　　　支持フレーム
　４１，４２　　　　　フック
　Ｃ　　　　　細胞
　Ｍ　　　　　培地
 
 
 

Claims (16)

  1. 　可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養方法であって、
    　前記容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切り、前記区画ごとに前記細胞を培養し、しかる後に、前記区画を解消することによって、前記容器内の培養面積を拡大することを特徴とする細胞培養方法。
  2. 　平面状の載置面を有し、前記載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が埋設された基台に前記容器を保持し、
    　前記載置面から突出する前記仕切片によって、前記容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切る請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　前記仕切片を前記基台内に収容し、前記仕切片の上端面を前記載置面と面一とすることによって、前記区画を解消する請求項２に記載の細胞培養方法。
  4. 　前記区画を解消することによって、前記容器内の培養面積を拡大して細胞培養を継続するにあたり、
    　前記容器を初期位置よりも上方に移動させた後に、前記容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記容器に振動を加えることによって、前記容器の内容液を撹拌する請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  5. 　上下動可能に取り付けられた押圧板を下方位置に固定して、当該押圧板により、所定の内容量に調整された前記容器を押圧して容器内を加圧した状態で細胞培養を行い、
    　しかる後に、前記容器に培地を追加供給するとともに、前記押圧板を上方位置で固定して、当該押圧板により、内容量が増加した前記容器を押圧して容器内を加圧した状態で細胞培養を継続する請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  6. 　可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、
    　前記容器を保持する平面状の載置面を有する基台を備え、
    　前記載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が前記基台に埋設され、
    　前記仕切片を前記基台内に収容したときに、前記仕切片の上端面が前記載置面と面一になることを特徴とする細胞培養装置。
  7. 　前記基台が、前記載置面を形成する保持部材と、前記仕切片が一定の間隔で平行に複数立設されている仕切板とを備える請求項６に記載の細胞培養装置。
  8. 　前記基台が、支持フレームに回動可能に軸支されており、
    　前記基台の回動動作により、前記容器を初期位置よりも上方に移動させた後に、前記容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記容器に振動を加えて前記容器の内容液を撹拌する請求項６又は７に記載の細胞培養装置。
  9. 　前記基台に、前記載置面上に保持された前記容器を押圧して容器内を加圧するための押圧板が、前記容器の内容量に応じて上下動可能に取り付けられた請求項６～８のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  10. 　前記基台の四隅に、長穴状のガイド孔を形成する環状立ち上り片を立設し、前記ガイド孔に、前記押圧板の四隅に突設されたピンを挿通することによって、前記押圧板を上下動可能に取り付けるとともに、
    　前記押圧板に係止され、前記押圧板を所定位置に固定するフックが設けられた請求項９に記載の細胞培養装置。
  11. 　前記基台が、支持フレームに回動可能に軸支されており、
    　前記基台の回動動作により前記フックの係止が解除される請求項１０に記載の細胞培養装置。
  12. 　前記基台の周縁部に、前記容器を固定する二個以上の固定具が対向して立設され、前記固定具に凹部が形成された請求項６～１１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  13. 　前記凹部が、前記固定具において、前記基台の表面の位置から上方に、満杯時の前記容器の厚みの１／２～３／２の位置に形成された請求項１２に記載の細胞培養装置。
  14. 　前記凹部が前記固定具に水平面に対して円周状に形成されたことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の細胞培養装置。
  15. 　前記基台の四隅に前記固定具が立設されたことを特徴とする請求項１２～１４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  16. 　前記容器の端部に二個以上の孔が前記固定具に対応して設けられ、前記固定具を前記孔に挿入して前記孔の周縁部を前記凹部に係合したことを特徴とする請求項１２～１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
     
     
     
PCT/JP2016/000002 2015-01-30 2016-01-04 細胞培養方法、及び細胞培養装置 WO2016121292A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16742901.8A EP3252140B1 (en) 2015-01-30 2016-01-04 Cell culturing method and cell culturing device
KR1020177019751A KR101984074B1 (ko) 2015-01-30 2016-01-04 세포 배양 방법 및 세포 배양 장치
US15/542,978 US10731122B2 (en) 2015-01-30 2016-01-04 Cell culture method and cell culture apparatus
CN201680006996.4A CN107208030B (zh) 2015-01-30 2016-01-04 细胞培养方法及细胞培养装置
US16/904,690 US11390842B2 (en) 2015-01-30 2020-06-18 Cell culture method and cell culture apparatus

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015017827A JP2016140299A (ja) 2015-01-30 2015-01-30 培養バッグ固定台、及び培養バッグ固定台の使用方法
JP2015-017827 2015-01-30
JP2015017824A JP2016140296A (ja) 2015-01-30 2015-01-30 細胞培養装置、及び細胞培養方法
JP2015017823A JP6609931B2 (ja) 2015-01-30 2015-01-30 細胞培養方法、及び細胞培養装置
JP2015-017823 2015-01-30
JP2015-017824 2015-01-30

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/542,978 A-371-Of-International US10731122B2 (en) 2015-01-30 2016-01-04 Cell culture method and cell culture apparatus
US16/904,690 Division US11390842B2 (en) 2015-01-30 2020-06-18 Cell culture method and cell culture apparatus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016121292A1 true WO2016121292A1 (ja) 2016-08-04

Family

ID=56542921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/000002 WO2016121292A1 (ja) 2015-01-30 2016-01-04 細胞培養方法、及び細胞培養装置

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10731122B2 (ja)
EP (1) EP3252140B1 (ja)
KR (1) KR101984074B1 (ja)
CN (1) CN107208030B (ja)
TW (1) TWI691594B (ja)
WO (1) WO2016121292A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018105554A1 (ja) * 2016-12-08 2018-06-14 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養装置
WO2018230544A1 (ja) * 2017-06-15 2018-12-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
WO2019138956A1 (ja) * 2018-01-09 2019-07-18 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP2019532658A (ja) * 2016-10-28 2019-11-14 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ バイオリアクタトレイ
WO2020149246A1 (ja) * 2019-01-18 2020-07-23 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置

Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6418433A (en) * 1987-07-11 1989-01-23 Kawasumi Lab Inc Shaking method for container containing liquid and/or solid
JPH03505164A (ja) * 1989-03-10 1991-11-14 バクスター　インターナショナル　インコーポレーテッド 生体外増殖のための方法及び装置並びに培養培地中での細胞の成長
JP2000125848A (ja) * 1998-10-19 2000-05-09 Agriculture Forestry & Fisheries Technical Information Society 細胞培養用具及び前記細胞培養用具を用いる簡易細胞培養方法
JP2004089136A (ja) * 2002-09-03 2004-03-25 Olympus Corp 培養容器
JP2006325437A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 National Cancer Center-Japan 培養用トレイ
WO2007122814A1 (ja) * 2006-04-13 2007-11-01 Research Organization Of Information And Systems マルチウェルインキュベーション装置及びこれを用いた分析方法
WO2008136371A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Toyo Seikan Kaisha, Ltd. 細胞培養装置、細胞培養システム及び細胞培養方法
WO2009123173A1 (ja) * 2008-04-01 2009-10-08 東洋製罐株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置
JP2011109933A (ja) * 2009-11-24 2011-06-09 Nikon Corp 培養容器アダプタ
JP2011239734A (ja) * 2010-05-19 2011-12-01 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法
JP2012510298A (ja) * 2008-11-28 2012-05-10 テルモ株式会社 血液バッグシステム及びカセット
JP2012510299A (ja) * 2008-11-28 2012-05-10 テルモ株式会社 血液バッグシステム及びカセット
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2013088537A1 (ja) * 2011-12-14 2013-06-20 株式会社日立製作所 細胞培養容器、それを用いた細胞自動継代培養装置および細胞継代培養方法
US20130244322A1 (en) * 2012-03-15 2013-09-19 Cellprothera Automated apparatus and method of cell culture
WO2015133116A1 (ja) * 2014-03-07 2015-09-11 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養装置
WO2015145954A1 (ja) * 2014-03-28 2015-10-01 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
JP2015188391A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
JP2015188390A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0353679Y2 (ja) 1987-03-31 1991-11-25
DE3788026T2 (de) 1986-08-27 1994-04-21 Kawasumi Lab Inc Verfahren und Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen.
US20040214313A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 Weihua Zhang Cell interaction culture system and uses thereof
JP5265687B2 (ja) * 2007-09-26 2013-08-14 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・バイオプロセス・コーポレイション 三次元の使い捨てバイオリアクター
CN103276046B (zh) 2009-03-09 2015-07-29 东洋制罐株式会社 容器内的计数对象物的计数方法及计数用装置
JP2011241159A (ja) 2010-05-17 2011-12-01 Toyo Shinyaku Co Ltd 美白剤
EP2615161B1 (en) 2010-09-06 2019-12-25 Toyo Seikan Kaisha, Ltd. Cell culture container formed by a multilayer film
JP6142142B2 (ja) 2012-04-10 2017-06-07 株式会社リンフォテック メモリーｔ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法

Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6418433A (en) * 1987-07-11 1989-01-23 Kawasumi Lab Inc Shaking method for container containing liquid and/or solid
JPH03505164A (ja) * 1989-03-10 1991-11-14 バクスター　インターナショナル　インコーポレーテッド 生体外増殖のための方法及び装置並びに培養培地中での細胞の成長
JP2000125848A (ja) * 1998-10-19 2000-05-09 Agriculture Forestry & Fisheries Technical Information Society 細胞培養用具及び前記細胞培養用具を用いる簡易細胞培養方法
JP2004089136A (ja) * 2002-09-03 2004-03-25 Olympus Corp 培養容器
JP2006325437A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 National Cancer Center-Japan 培養用トレイ
WO2007122814A1 (ja) * 2006-04-13 2007-11-01 Research Organization Of Information And Systems マルチウェルインキュベーション装置及びこれを用いた分析方法
WO2008136371A1 (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Toyo Seikan Kaisha, Ltd. 細胞培養装置、細胞培養システム及び細胞培養方法
WO2009123173A1 (ja) * 2008-04-01 2009-10-08 東洋製罐株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置
JP2012510298A (ja) * 2008-11-28 2012-05-10 テルモ株式会社 血液バッグシステム及びカセット
JP2012510299A (ja) * 2008-11-28 2012-05-10 テルモ株式会社 血液バッグシステム及びカセット
JP2011109933A (ja) * 2009-11-24 2011-06-09 Nikon Corp 培養容器アダプタ
JP2011239734A (ja) * 2010-05-19 2011-12-01 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2013088537A1 (ja) * 2011-12-14 2013-06-20 株式会社日立製作所 細胞培養容器、それを用いた細胞自動継代培養装置および細胞継代培養方法
US20130244322A1 (en) * 2012-03-15 2013-09-19 Cellprothera Automated apparatus and method of cell culture
WO2015133116A1 (ja) * 2014-03-07 2015-09-11 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養装置
WO2015145954A1 (ja) * 2014-03-28 2015-10-01 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
JP2015188391A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム
JP2015188390A (ja) * 2014-03-28 2015-11-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法、及び細胞培養システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3252140A4 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7015616B2 (ja) 2016-10-28 2022-02-03 グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー バイオリアクタトレイ
JP2019532658A (ja) * 2016-10-28 2019-11-14 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ バイオリアクタトレイ
JP2018093752A (ja) * 2016-12-08 2018-06-21 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養装置
WO2018105554A1 (ja) * 2016-12-08 2018-06-14 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養装置
WO2018230544A1 (ja) * 2017-06-15 2018-12-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP2019000045A (ja) * 2017-06-15 2019-01-10 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP7035343B2 (ja) 2017-06-15 2022-03-15 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
WO2019138956A1 (ja) * 2018-01-09 2019-07-18 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP2019118319A (ja) * 2018-01-09 2019-07-22 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
JP7102734B2 (ja) 2018-01-09 2022-07-20 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養方法及び装置
WO2020149246A1 (ja) * 2019-01-18 2020-07-23 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置
JP2020114191A (ja) * 2019-01-18 2020-07-30 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置
JP7348586B2 (ja) 2019-01-18 2023-09-21 東洋製罐グループホールディングス株式会社 培養容器、培養方法、及び培養装置

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170093245A (ko) 2017-08-14
US11390842B2 (en) 2022-07-19
EP3252140B1 (en) 2022-03-02
TW201639952A (zh) 2016-11-16
TWI691594B (zh) 2020-04-21
US10731122B2 (en) 2020-08-04
US20170362559A1 (en) 2017-12-21
KR101984074B1 (ko) 2019-05-30
CN107208030B (zh) 2020-12-18
US20200318057A1 (en) 2020-10-08
EP3252140A4 (en) 2018-09-26
CN107208030A (zh) 2017-09-26
EP3252140A1 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016121292A1 (ja) 細胞培養方法、及び細胞培養装置
US20240093134A1 (en) Culture chamber and culture method
JP6427872B2 (ja) 細胞培養方法、及び細胞培養装置
EP3124589A1 (en) Cell culture method and cell culture system
EP3124591B1 (en) Culture vessel
JP2011239734A (ja) 細胞培養方法、細胞培養装置、及び細胞培養装置の制御方法
JP2021118749A (ja) 細胞培養容器、細胞培養容器の支持治具、及び細胞培養方法
EP2440649A2 (en) Devices for the production of cell clusters of defined cell numbers and cluster sizes
JP2016140296A (ja) 細胞培養装置、及び細胞培養方法
JP2014128247A (ja) 細胞培養容器、細胞培養用具、及び細胞培養方法
JP6609931B2 (ja) 細胞培養方法、及び細胞培養装置
JP2017085960A (ja) 貫通孔を備える細胞培養用プレートを備える積層プレート式細胞培養器具
JP2017085959A (ja) 凸部を備える細胞培養用プレート及び細胞培養器具
JP2015188390A (ja) 細胞培養方法、及び細胞培養システム
KR20140107672A (ko) 세포 회수 방법
JP2016140299A (ja) 培養バッグ固定台、及び培養バッグ固定台の使用方法
JP2015116151A (ja) 細胞培養装置、及び細胞培養方法
WO2020160678A1 (en) Multi-well device and method for tissue or organoid generation
JP6341263B1 (ja) 細胞培養装置
CN107974408A (zh) 细胞培养玻璃瓶
JP2015050963A (ja) 樹状細胞の調製方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16742901

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2016742901

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15542978

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177019751

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE