JP2015116151A - 細胞培養装置、及び細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡易かつ簡便に、培養時の細胞密度を適性に維持し、さらに細胞を大量に増殖させる際に培養容器の移し替え作業をなくし、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減を可能とする。
【解決手段】側板２１が鉛直に立ち上った状態として、容器１内に細胞とともに培地を供給し、容器１の底板２０に保持された部位にだけに内容物が存在するようにして所定の細胞密度となるように培養環境を整えて細胞培養を開始し、しかる後に、側板２１を底板２０と水平に倒した状態として、容器１内の培養面積を拡大する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で培養するための細胞培養装置、及び細胞培養方法に関する。

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。このような細胞培養にあっては、培地内の細胞密度が高くなるにつれて、増殖に必要な成分の枯渇、細胞自身の代謝産物の蓄積が起こり、増殖速度が低下し細胞密度は飽和に達してしまう。このため、細胞をある程度の規模で培養する場合には、通常、細胞密度が適性に維持されるよう継代を繰り返しながら培養を行っている。

従来の細胞培養では、この継代は、順次容積の大きな培養容器、或いは複数の培養容器に移し替えられている。例えば、細胞培養ウェルプレートやフラスコなどの容器を用いて適度の細胞密度となるように、培養液とともに細胞を容器に加えて培養を開始し、細胞を十分に増殖させてから容積の大きな培養容器、又は複数の培養容器に移し替え、細胞増殖に合わせて培養液を追加して培養するとともに継代を行い、一定量に増殖した時点で、より容量の大きいバックなどに移し替えて、さらに培養と培養液の補給、継代を繰り返し、細胞の大量培養が行われていた。

しかしながら、このような細胞培養においては、別の容器に移し替える際にピペッティング作業を何回も繰り返す必要があり、また、継代のたびに新たなフラスコやバックなどの培養容器に細胞の一部を移さなければならず、作業が煩雑になるだけでなく、細胞にダメージを与える可能性がある。さらに、コンタミネーション（contamination：汚染）のリスクが高いという問題もあった。

この問題を回避するため、単一の容器を用いて継代する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、細胞培養バッグ中の培養液の流通を阻止するための阻止部材を用いて、かかる阻止部材で細胞培養バッグを狭持して仕切ることで、培養バック内で実際に培養を行う領域を段階的に拡張できるようにした装置が提案されている。また、特許文献２には、培養容器を載置台に載置し、載置台の一部を昇降させて培養面積を変化させるようにした装置が提案されている。

特開２０００−１２５８４８号公報 国際公開２００８／０５２７１６パンフレット

しかしながら、特許文献１の装置にあっては、阻止部材で細胞培養バッグを狭持する際に、細胞培養バッグを損傷するなどの不具合が生じないように注意して作業する必要があった。さらに、阻止部材で狭持しただけでは細胞培養バックを十分に仕切ることができないこともあり、培養液が所定の領域から漏れ出さないように阻止部材を着脱しなければならず、煩雑な作業が必要であった。
また、特許文献２の装置では、載置台の一部を昇降させるために、載置台の分割されたそれぞれの部位に対応させて昇降機構を設置しなければならず、装置が大掛かりなものとなってしまうという問題があった。

本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、簡易かつ簡便に、培養時の細胞密度を適性に維持し、さらに細胞を大量に増殖させる際に培養容器の移し替え作業をなくし、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減を可能とする細胞培養装置、及び細胞培養方法の提供を目的とする。

本発明に係る細胞培養装置は、軟包材からなる容器と、前記容器を保持する保持具とを備え、前記保持具が、前記容器の一部を保持する底板と、前記底板の少なくとも一方の側端縁に沿って設けられて前記容器の残部を保持する側板とを有し、前記側板が、鉛直に立ち上った状態と、前記底板と水平に倒れた状態とに可変とされた構成としてある。

また、本発明に係る細胞培養方法は、前記細胞培養装置を用いて、前記側板が鉛直に立ち上った状態として、前記容器内に細胞とともに培地を供給し、前記容器の前記底板に保持された部位にだけに内容物が存在するようにして所定の培養面積となるように培養環境を整えて細胞培養を開始し、しかる後に、前記側板を前記底板と水平に倒した状態として、前記容器内の培養面積を拡大する方法としてある。

本発明によれば、保持具の側板が鉛直に立ち上った状態で細胞培養を開始し、細胞が増殖して細胞密度が培養に適した範囲を超えたときに、保持具の側板を底板と水平に倒すという簡易かつ簡便な操作によって容器内の培養面積を拡大することができ、継代を行うことなく適正な培養環境を維持して、同一の容器内で効率的に細胞を増殖することが可能になる。また、培養容器の移し替え作業が不要なため、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減が可能となる。

本発明の実施形態に係る細胞培養方法の概略を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養方法の概略を示す説明図であり、（ａ）は図１（ａ）のＡ−Ａ断面図、（ｂ）は図１（ｂ）のＢ−Ｂ断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置が備える保持具の概略を示す平面図であり、（ａ）は側板を立てた状態を示し、（ｂ）は側板を倒した状態を示している。 図４（ｂ）のＥ−Ｅ断面図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置が備える保持具の側板を立てた状態から倒した状態とする過程を示す説明図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の変形例が備える保持具の概略を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置の変形例が備える保持具の側板を構成する側板分割片を順次倒した状態とする過程を示す説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
なお、図１及び図２は、本実施形態に係る細胞培養方法の概略を示す説明図であり、図３は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す斜視図である。

［細胞培養装置］
まず、本実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
本実施形態に係る細胞培養装置１００は、軟包材を材料として袋状（バッグ型）に形成された容器１と、かかる容器１を保持する保持具２とを備えている。容器１を形成する軟包材とは、可撓性及び柔軟性を包装体に与える包装材料をいう。軟包材については、例えば、特開２００４−３２３０７７号公報などに記載されており、周知技術である。

細胞培養装置１００が備える容器１には、培養の対象となる細胞（培養細胞）とともに、この細胞を培養するための培地（培養液や培養基を含む）が供給されて、所定の培養面積とされた培養環境下で細胞培養が開始される。容器１は、細胞培養を閉鎖系（密閉系）で行うことができるように、細胞培養に必要なガス透過性（酸素透過性）を有している。さらに、容器１は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。
このような容器１としての条件を満たす包装材料の具体例としては、ポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴムなどが挙げられる。

また、容器１の形状は、通常、長方形状とされ、短辺側の対抗する二辺にチューブ１２が接続されている。そして、容器１の四辺はヒートシールにより密封されるとともに、容器１内の収容部がチューブ１２の取り付け部分に向かって次第に狭くなるようにするのが好ましい。
なお、容器１は、ブロー成形による一体成型バッグでもよい。

容器１に接続されるチューブ１２のうち、１本は細胞や培地を外部から容器１に供給するための供給用、他の１本は細胞や培地を容器１から回収するための回収用である。このチューブ１２の材質としては、適宜使用環境に合わせて選択すれば良いが、特にガス透過性に優れるものが望ましい。例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）等を用いることができる。

また、細胞培養装置１００が備える保持具２は、容器１の幅方向中央部を保持する底板２０と、底板２０の両側端縁に沿って設けられて容器１の幅方向側縁部を保持する側板２１とを有している。そして、底板２０の両側端縁に沿って設けられた側板２１は、鉛直に立ち上った状態と、底板２０と水平に倒れた状態とに可変となるように、その下端側を軸に回動可能としてある。

また、保持具２の側板２１には、容器１を保持具２に取り付けて保持するための止め部材２１１が立設されている。これとともに、容器１の四隅には、止め部材２１１に係止される孔１１が穿設されている。これにより、止め部材２１１のそれぞれに容器１の各孔１１を係止することで、容器１が保持具２に取り付けられて、図３に示すように、側板２１が底板２０と水平に倒れた状態の保持具２のほぼ全面で容器１が保持されるようになっている。

このようにすることで、側板２１が鉛直に立ち上った状態にあるときには、容器１の幅方向端縁部と幅方向中央部との間が長手方向に沿って折れ曲がり、容器１の幅方向端縁部が、止め部材２１１にぶら下がるようにして側板２１と一緒に立ち上った状態になる（図２（ａ）参照）。そして、側板２１が底板２０と水平に倒れた状態にあるときには、容器１の幅方向端縁部も側板２１と一緒に倒れて、底板２０上に保持される容器１の幅方向中央部と水平になるようになっている（図２（ｂ）参照）。

また、保持具２の底板２０の一端には、その長手方向に沿ってスライド可能な可動片２０２が設けられており、かかる可動片２０２の幅方向両端には、係止部２０３が突出して形成されている。係止部２０３は、側板２１が底板２０と水平に倒れた状態にあるときには、側板２１の長手方向の端縁と係合可能とされ（図５参照）、また、側板２１が鉛直に立ち上った状態にあるときには、側板２１の長手方向の端縁側を挟み込める間隔で形成される。
なお、図４は、保持具２の概略を示す平面図であり、図４（ａ）は側板２１を立てた状態を示し、図４（ｂ）は側板２１を倒した状態を示している。また、図５は、図４（ｂ）のＥ−Ｅ断面図である。

このような可動片２０２を底板２の一端に設けることで、側板２１が鉛直に立ち上った状態にあるときには、可動片２０２の幅方向両端に形成された係止部２０３が、側板２１の長手方向の端縁側を挟み込み、側板２１が鉛直に立ち上った状態に保たれるようにしてある（図６（ａ）参照）。そして、底板２０の長手方向に沿って可動片２０２を引き出すようにスライドさせて、係止部２０３を側板２１から離間させることで（図６（ｂ）参照）、側板２１を回動可能な状態とし、側板２１を底板２０と水平に倒した状態とする（図６（ｃ）参照）。次いで、可動片２０２を押し戻すようにスライドさせて、係止部２０３を側板２１の長手方向の端縁と係合させることで（図５及び図６（ｄ）参照）、側板２１を底板２０と水平に倒した状態が保たれるようにしてある。

［細胞培養方法］
次に、前述した細胞培養装置を利用して好適に実施される本実施形態に係る細胞培養方法について説明する。

本実施形態に係る細胞培養方法にあっては、容器１を保持具２に保持するとともに、側板２１が鉛直に立ち上った状態として、容器１内に、細胞とともに培地を供給する。このとき、容器１内に供給する培地の量を調整して、底板２０上に保持された容器１の幅方向中央部だけに内容物が存在するようにして、容器１内の培養面積が、その範囲に限られるようにしつつ、所定の培養面積となるように培養環境を整えて細胞培養を開始する。

この状態で細胞培養を行って、増殖した細胞の底面積密度（単位底面積あたりの細胞の密度）が一定以上に増大して、細胞の細胞密度が培養に適した範囲を超えたときに、容器１内の培養面積を拡大する。

具体的な操作としては、まず、底板２０の長手方向に沿って可動片２０２を引き出すようにスライドさせて、係止部２０３を側板２１から離間させる。そして、その下端側を軸に側板２１を回動させて、側板２１を鉛直に立ち上った状態から、底板２０と水平に倒した状態とする。すると、容器１の幅方向端縁部も側板２１と一緒に倒れて、容器１の幅方向中央部と水平となり、内容物が容器１の幅方向端縁部にも行き渡るようになり、その結果、容器１内の培養面積が拡大される（図２（ｂ）参照）。

次いで、可動片２０２を押し戻すようにスライドさせて、係止部２０３を側板２１の長手方向の端縁と係合させることで（図５及び図６（ｄ）参照）、側板２１を底板２０と水平に倒した状態が保たれるようにする。このとき、必要に応じて容器１に培地を追加供給してもよい。

このように、本実施形態によれば、保持具２の側板２１が鉛直に立ち上った状態で細胞培養を開始し、しかる後に、側板２１を底板２０と水平に倒した状態とするだけで容器１内の培養面積を拡大することができる。したがって、簡易かつ簡便に、培養時の細胞密度を適正に維持し、さらに細胞を大量に増殖させる際に培養容器の移し替え作業をなくし、細胞へのダメージの低減を図ることができるとともに、細胞培養を閉鎖系（密閉系）で行うことによって、コンタミネーションのリスクを低減することができる。

より具体的には、例えば、リンパ球などの浮遊系細胞を培養する場合には、側板２１を鉛直に立ち上った状態としておき、所定の培養面積で細胞培養を開始し、細胞の増殖がある程度進んでから、側板２１を底板２０と水平に倒した状態として容器１内の培養面積を拡大させることで、同一容器内で適正な細胞密度を維持しながら、効率的に細胞を培養することができる。

また、浮遊系細胞の培養において、容器１の幅方向端縁部の内面に抗体を固相化させておき、この容器１の幅方向端縁部を側板２１とともに鉛直に立ち上った状態として、底板２０上に保持された容器１の幅方向中央部で初代培養などを行った後に、側板２１を底板２０と水平に倒した状態とすることで、細胞の活性化を図り、さらなる細胞培養に細胞が耐えられるようにする活性化培養を容器１の幅方向端縁部において行うこともできる。

この場合、特に図示しないが、底板２０の一方の幅方向端縁だけに側板２１を設けておき、容器１の底板２０に保持される部位と、容器１の側板２１に保持される部位とを同形状、同寸法とし、容器１の側板２１に保持される部位の内面に抗体を固相化して当該内面を抗体固相面とし、容器１の底板２０に保持される部位の内面と、容器１の側板２１に保持される部位の内面とを異なる培養面として細胞培養装置を構成してもよい。

このようにすることで、側板２１を鉛直に立ち上った状態として、容器１の底板２０に保持される部位で初代培養を行い、しかる後に、側板２１を底板２０と水平に倒した状態として、容器１の側板２１に保持される部位で活性化培養を行うことができる。この際に、底板２０を鉛直に立ち上げて、容器１の側板２１に保持される部位に内容物を移動させることにより、同一の培養面積を維持して、培養環境の変化を極力避けながら初代培養と活性化培養とを同一容器内で行うこともできる。その後、底板２０を水平に戻せば、培養面積が拡大された培養環境下で細胞をさらに培養することができる。
このように、本実施形態によれば、異なる培養面への移行培養が同一容器内で可能となる。培養面としては、プレーンの培養面、コラーゲン塗布面、抗体固相面、レトロネクチン塗布面などがある。

さらに、皮膚細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞などの足場依存性細胞を培養する場合には、側板２１を底板２０と水平に倒した状態とするだけで、細胞が増殖できる培養面を適度な配置をもって拡大することができる。このため、継代培養のように、培養面から細胞を剥離して回収し、新たな培養容器への細胞播種を行うというような、煩雑で増殖効率の低下を招く虞もある作業を必要とせずに、同一容器内で継代培養と同様の培養環境で細胞培養を効率よく行うことができる。

また、図７に示すように、保持具２が有する側板２１を長手方向に沿って回動可能に連結された複数の側板分割片２１ａから構成し、かかる側板分割片２１ａが順次底板２０と水平に倒れた状態となるようにしてもよい。このようにすることで、例えば、図８（ａ）〜図８（ｅ）に示すように、所望の培養面積に応じて容器１内の培養面積を段階的に拡大することができる。

以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。

本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。

１ 容器
２ 保持具
２０ 底板
２０２ 可動片
２０３ 係止部
２１ 側板
２１ａ 側板分割片

Claims (6)

1. 軟包材からなる容器と、前記容器を保持する保持具とを備え、
   前記保持具が、前記容器の一部を保持する底板と、前記底板の少なくとも一方の側端縁に沿って設けられて前記容器の残部を保持する側板とを有し、
   前記側板が、鉛直に立ち上った状態と、前記底板と水平に倒れた状態とに可変とされたことを特徴とする細胞培養装置。
2. 前記保持具が、前記容器の幅方向中央部を保持する底板と、前記底板の両側端縁に沿って設けられて前記容器の幅方向側縁部を保持する側板とを有する請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記底板の一端に、前記底板の長手方向に沿ってスライド可能な可動片が設けられており、前記可動片の幅方向両端に、前記側板が前記底板と水平に倒れた状態にあるときに前記側板の長手方向の端縁と係合可能とされた係止部を、前記側板が鉛直に立ち上った状態にあるときに前記側板の長手方向の端縁側を挟み込める間隔で形成した請求項２に記載の細胞培養装置。
4. 前記側板が長手方向に沿って回動可能に連結された複数の側板分割片からなり、前記側板分割片が順次前記底板と水平に倒れた状態となる請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
5. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、
   前記側板が鉛直に立ち上った状態として、前記容器内に細胞とともに培地を供給し、前記容器の前記底板に保持された部位にだけに内容物が存在するようにして所定の培養面積となるように培養環境を整えて細胞培養を開始し、
   しかる後に、前記側板を前記底板と水平に倒した状態として、前記容器内の培養面積を拡大することを特徴とする細胞培養方法。
6. 請求項４に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、
   前記側板が鉛直に立ち上った状態として、前記容器内に細胞とともに培地を供給し、前記容器の前記底板に保持された部位にだけに内容物が存在するようにして所定の培養面積となるように培養環境を整えて細胞培養を開始し、
   しかる後に、前記側板を構成する前記分割片を順次前記底板と水平に倒した状態としていき、前記容器内の培養面積を段階的に拡大することを特徴とする細胞培養方法。

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