JP6609931B2 - 細胞培養方法、及び細胞培養装置 - Google Patents
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Description
また、培養容器の移し替え作業が不要であり、培養液が同一の培養容器に留まることで、細胞へのダメージの低減、コンタミネーションのリスクの低減が可能となる。
まず、本実施形態に係る細胞培養方法について説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、可撓性材料からなる容器1に、培養の対象となる細胞(培養細胞)Cとともに、この細胞Cを培養するための培地Mを供給して細胞培養を行う細胞培養方法であり、特に、患者から採取した細胞や凍結された細胞などのダメージを受けた細胞を養生して、細胞本来の機能を回復しつつ、培養するのに好適な細胞培養方法である。
なお、容器1の形状は、正方形状、楕円形状、円形状などとする場合もあり、必要に応じて種々の形状とすることができる。
具体的には、例えば、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー等を用いることができる。また、スチレン系エラストマーとしては、例えば、SBS(スチレン・ブタジエン・スチレン)、SIS(スチレン・イソプレン・スチレン)、SEBS(スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン)、SEPS(スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン)等を用いることができる。
これにより、細胞Cが培地Mに懸濁された状態で容器1に供給されると、その後、浮遊系細胞であるか足場依存性細胞であるかにかかわらず、細胞Cは容器1の底面に沈降するが、沈降した細胞Cが各区画10の培養面に集まることで、細胞密度が高められた状態で細胞Cを培養することができる。
なお、各区画10における培養面の面積は、培養する細胞Cの種類や接種濃度などに応じて、従前より継代培養に用いられてきたウェルプレート(例えば、24ウェルプレートなど)の各ウェルの底面積と同程度となるようにするのが好ましい。
すなわち、養生培養工程では、容器1の底面が、仕切片3によって押し上げられて撓んだ部分が載置面20から浮き上がるように隆起して、複数の区画10に仕切られているのは前述した通りであるが、仕切片3を基台2内に収容し、その上端面を載置面20と面一にして区画10を解消すると、当該部分が、内容液の重さによって平らにならされて培養面として利用できるようになり、その分だけ容器内の培養面積が拡大する。
このようにすることで、容器1の上下動による内容液の撹拌に加えて、容器1に加わる振動によって細胞Cが内容液中を舞い上がるように拡散する。これにより、容器1の内容液が上下方向にも効率よく攪拌され、容器1の内容液中の細胞Cの分布や培地Mの成分濃度を均一にして良好な培養環境を維持するとともに、細胞Cが容器内壁に付着したり、過度に凝集したりするのを抑制して、細胞Cの増殖を促進することができる。さらに、培養する細胞Cが接着性細胞である場合には、容器1に加わる振動により、容器1の培養面からの細胞Cの剥離を促すことも可能である。
したがって、本実施形態を適用して、例えば、リンパ球などの浮遊系細胞を培養する場合には、容器1の底面に形成された区画10ごとに細胞Cが集まることにより、細胞Cが生成するサイトカインなどの活性化物質の濃度が局所的に高まり、また、細胞間の相互作用が生じることにより、細胞活性を高めた状態で培養することができる。そして、細胞Cの増殖がある程度進んでから容器内の培養面積を拡大させることで、同一容器内で適正な細胞密度を維持しながら、効率的に細胞Cを培養することができる。このため、本実施形態は、患者から採取したばかりの細胞や、凍結保存後に解凍されたばかりの細胞のようなダメージを受けて機能が衰えた細胞を養生して、細胞本来の機能を回復しつつ、効率よく培養するのに特に好適に利用することができる。
次に、前述した細胞培養方法に用いるのに好適な本実施形態に係る細胞培養装置について説明する。
なお、図3は、本実施形態に係る細胞培養装置の概略を示す斜視図である。
そのようにしたときに、容器1を培養装置100に取り付けた後に、押圧板23を元に戻して容器1に押し当てるとともに、押圧板23の短辺側の二辺にフック41,42を係止することで、載置面20上に保持された容器1の上面側を押圧して、容器内を加圧できるようにしてある(図11参照)。容器内を加圧した状態とすることで、容器内での内容液の過度の流動を抑制して、培養中の細胞Cにダメージを与えないようにすることができる。さらに、培地Mに溶存するガスが気化して容器内に気泡が滞留してしまうと、容器内を観察する際に微細な気泡が照明の光路を屈折させ鮮明な観察ができないという不具合や、容器外から容器内の培養液に酸素などのガスが拡散する際に、ガスとフィルム、フィルムと培養液の二ヵ所の境膜ガス移動であったものが、容器内に気泡が滞留することで、ガスとフィルム、フィルムと気泡、気泡と培養液の三ヵ所の境膜ガス移動となり、容器内の培養液へのガス拡散の低下という不具合が生じてしまう虞がある。容器内を加圧することによって、培地Mに溶存するガスの気化を抑制することもでき、これによって、上記したような不具合が生じないようにすることができる。
なお、押圧板23に係止されるフック41,42は、それぞれ支持フレーム4に回動可能に軸支されており、フック41,42を回動させることによって押圧板23への係止と解除がなされるようになっている。フック41,42の係止が解除された押圧板23は、ピン26がガイド孔24の上縁に当接する上方位置まで上動可能となる。
なお、図6〜図9は、本実施形態に係る細胞培養装置の動作を説明するための説明図であり、これらの図に示す断面は、図3のA−A断面に相当する。
本実施形態にあっては、拡大培養工程に移行するに際し、突き上げ部材5を上動させて、支持フレーム4に軸支された基台2を、その軸周りに上方に回動させる。これにより、図7に示すように、仕切板30を支持する断面L字状の支持部材40は、仕切板30との当接が解除されて、短辺側の重さによって長辺側が鉛直方向に対して傾くように回動する。そして、支持部材40による支えを失った仕切板30は、ガイド部材32に支持される位置まで下がり、これに伴って、仕切片3が基台2内に収容されて、仕切片3の上端面が載置面20と面一になる。その結果、仕切片3によって仕切られていた区画10が解消されて、容器内の培養面積が拡大する(図2参照)。
すなわち、本実施形態では、基台2の回動軸が設けられた側とは反対側の短辺側に設けられた当接部材50に、上動してきた突き上げ部材5を当接させることによって、基台2を上方に回動させているところ、当接部材50には、梁状の当接片51が架設されている。そして、突き上げ部材5が当接部材50に当接して基台2を上方に回動させると、図7に示すように、かかる当接片51が一方のフック41の下側舌片41aに当接して当該フック41が回動し、これによって係止が解除されるようにしてある。そして、基台2をさらに上方に回動させると、図8に示すように、他方のフック42が基台2に押されるように回動して、かかるフック42の係止も解除されるようにしてある。
図10に示す例では、カム面5c,5dの曲率、板カム5bを回転させる駆動軸5eの位置及び駆動軸5eの回転速度を適宜設定し、第一カム面5cが受け板5aを押し上げることによって突き上げ部材5が上動し(図10(a)〜(e)参照)、第二カム面5dに切り替わる際に板カム5bが受け板5aから離れて、突き上げ部材5が落下するようにして(図10(f)〜(h)参照)、板カム5bが一定方向に回転することによって突き上げ部材5の上下動が繰り返されるようにしている。当該駆動機構をこのように構成すれば、基台2が下方に回動して初期状態の位置に戻る際に、基台2が落下するように回動して、支持フレーム4が基台2を受けたときに衝撃が生じるようになる。
可撓性材料からなる容器1の撓み変形を利用して、容器1の底面を部分的に隆起させて複数の区画10に仕切ることができれば、例えば、複数の棒状の部材を載置面20に並べて配置し、その上に容器1を保持するようにしてもよい。このようにしても、容器1の底面は、棒状の部材によって押し上げられて部分的に隆起し、これによって、複数の区画10に仕切られる。そして、かかる棒状の部材を引き抜けば、内容液の重さによって容器1の底面が平らにならされて、容器内の培養面積が拡大する。
また、拡大培養工程では、フックFの係止を解除することで、押圧板23が上動できるようにする。そして、支持棒26aがガイド孔24aの上縁に達すると、押圧板23は、それよりも上には動くことができなくなって上方位置に固定される。これによって、培地Mが追加供給され、内容量が増加して厚みが増した容器1の上面側を押圧板23で押圧して、容器内を加圧できるようにしてある(図14参照)。
なお、フックFの係止を解除するには、前述した実施形態と同様にして基台2の回動動作を行ったときに、基台2の傾きによって、フックFがその重さで回動するようにすればよい。
10 区画
2 基台
20 載置面
23 押圧板
3 仕切片
4 支持フレーム
C 細胞
M 培地
Claims (7)
- 可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養方法であって、
平面状の載置面を有し、前記載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が埋設された基台に前記容器を保持し、
前記載置面から突出する前記仕切片によって、前記容器の撓み変形を利用して、前記容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切り、前記区画ごとに前記細胞を培養し、しかる後に、前記区画を解消して隆起していた部分が平らにならされることによって、前記容器内の培養面積を拡大することを特徴とする細胞培養方法。 - 前記仕切片を前記基台内に収容し、前記仕切片の上端面を前記載置面と面一とすることによって、前記区画を解消する請求項1に記載の細胞培養方法。
- 前記区画を解消することによって、前記容器内の培養面積を拡大して細胞培養を継続するにあたり、
前記容器を初期位置よりも上方に移動させた後に、前記容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記容器に振動を加えることによって、前記容器の内容液を撹拌する請求項1又は2に記載の細胞培養方法。 - 可撓性材料からなる容器に、細胞とともに培地を供給して細胞培養を行う細胞培養装置であって、
前記容器を保持する平面状の載置面を有する基台を備え、
前記載置面から所定の高さで突出可能な仕切片が前記基台に埋設されて、前記仕切片によって、前記容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切ることが可能となるように構成され、
前記仕切片を前記基台内に収容したときに、前記仕切片の上端面が前記載置面と面一になることを特徴とする細胞培養装置。 - 前記基台が、前記載置面を形成する保持部材と、前記仕切片が一定の間隔で平行に複数立設されている仕切板とを備える請求項4に記載の細胞培養装置。
- 前記基台が、支持フレームに回動可能に軸支されており、
前記基台の回動動作により、前記容器を初期位置よりも上方に移動させた後に、前記容器を初期位置まで戻すとともに、初期位置に戻った前記容器に振動を加えて前記容器の内容液を撹拌する請求項4又は5に記載の細胞培養装置。 - 前記基台に、前記載置面上に保持された前記容器を押圧して容器内を加圧するための押圧板が、前記容器の内容量に応じて上下動可能に取り付けられた請求項4〜6のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
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