WO2015162059A1 - Verfahren und vorrichtung zur aufreinigung von biologischen molekülen - Google Patents

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WO2015162059A1
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cells
pumped
vessel
buffer
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Bernd Faltin
Christian Dorrer
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Robert Bosch Gmbh
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the present invention relates to a method and an apparatus for the purification of biological molecules, in particular of nucleic acids or proteins, wherein at least one filter is used in the method.
  • Nucleic acids or proteins exist in many different ways.
  • the biological molecules are obtained from cell material, ie from prokaryotic or eukaryotic cells. Before intracellular material can be further processed, it is usually necessary to open the cells themselves. This cell disruption is commonly referred to as cell lysis. After separation of cell debris, for example
  • Nucleic acids, proteins or peptides are further purified, processed and analyzed. When referring to proteins in the following, they also mean peptides.
  • the purified nucleic acids can be amplified selectively by PCR (Polymerase Chain Reaction) so that the particular nucleic acid sequence is made detectable.
  • the digestion of the cells can take place in different ways.
  • An enzymatic digestion of the cells is widespread, for example, a treatment with the enzyme proteinase K or lysozyme is performed.
  • a thermal cell disruption by heating and / or freezing the sample or a cell disruption with chemical reagents is also possible.
  • the Cell disruption done mechanically, for example by a
  • a common method for further purification of, for example, nucleic acids provides that the so-called lysate resulting from cell disruption is mixed with a binding buffer and brought into contact with a solid matrix, for example a silica filter or a silica membrane.
  • a solid matrix for example a silica filter or a silica membrane.
  • the nucleic acids adsorb to the filter and can then be washed with a washing buffer and then eluted from the solid matrix and used further.
  • Various commercially available kits and laboratory equipment work according to this principle.
  • German laid-open specification DE 10 2005 009 479 A1 describes a method in which the cells are accumulated by means of filtration.
  • German Offenlegungsschrift DE 10 2010 030 962 A1 describes a method for the hybridization of nucleic acids in a microarray, in which the sample is first pumped through a denaturation unit and then through a separate reaction area with the microarray with the immobilized probes.
  • the pumping section can be configured as a circuit.
  • German patent application DE 10 2010 043 015 AI discloses a
  • Nucleic acid containing cells take place on the filter.
  • biological molecules in particular nucleic acids or proteins or other biological molecules
  • the purification is carried out in principle by a non-specific adsorption of the biological molecules to a matrix, in particular to a membrane.
  • a filter which hereby means the matrix, in particular in the form of a membrane or, for example, in the form of a bed.
  • the core of the invention is that at least some of the required for the process management
  • the steps of the method according to the invention initially comprise pumping a liquid with biological cells, that is to say a sample liquid, via the filter.
  • biological cells is generally understood to mean cells from which biological molecules, such as, for example, nucleic acids or proteins, are to be treated or purified, for example pathogenic microorganisms such as bacteria or fungi is also suitable for human cells or other cells and can be used in general for the purification of proteins or nucleic acids from prokaryotic or eukaryotic cells
  • sample liquid is generally understood to mean the liquid containing the corresponding cells, for example one
  • Cell suspension or a patient sample for example, blood, lavage, urine, cerebrospinal fluid, sputum or a flushed Swab or smear.
  • the volume of the sample may be different, for example, between a few ⁇ to 10 ml.
  • the cells retained on the filter are digested, whereby in principle different methods can be used for cell disruption.
  • the biological molecules contained in the cell lysate are bound to the filter by means of a binding buffer, whereby the binding buffer is pumped in circulation via the filter.
  • the biological molecules bound to the filter are cleaned in the subsequent step with wash buffer, which is pumped over the filter.
  • wash buffer which is pumped over the filter.
  • the bound biological molecules may be eluted from the filter in a conventional manner, or the filter having the reversibly immobilized biological molecules may be used directly as such.
  • the particular effectiveness of the purification process according to the invention is achieved in that the substances are rinsed several times through the filter by the circulation of the liquids, in particular during the binding process of the biological molecules to the filter.
  • the filter material is repeatedly contacted with the fluids. It turns
  • the circular fluid guide provided according to the invention achieves thorough mixing of the various reagents and buffers, which makes the method of the invention particularly suitable for implementation within a microfluidic system. Irrespective of this, the mixing efficiency, in particular in a microfluidic system, can also be increased by further measures, in particular by means of mixer structures or mixing chambers known per se, in a microfluidic system.
  • an accumulation of the biological cells takes place, wherein the cells are retained on the filter according to the size exclusion method and / or by electrostatic interactions when the sample liquid is pumped over the filter.
  • the more sample liquid is pumped through the filter the higher the number of accumulated cells.
  • the diameter of such a known filter may be different, for example between 1 and 25 mm.
  • Suitable filters are, for example, fiber filters, fabric filters and / or membrane filters, in particular of silica.
  • particle beds are also suitable.
  • Microparticle beds e.g. from silica particles.
  • the pore diameter of the materials is preferably below 100 ⁇ m.
  • the digestion of the cells can take place in various ways, for example mechanically or by heat.
  • an ultrasonic treatment which can be carried out with relatively little expenditure on equipment. In this case, no additional reagents for lysis or cell disruption are required.
  • the ultrasound can be entered directly into the filter.
  • the wall of a corresponding filter chamber be designed as a membrane into which the
  • Ultrasound is coupled by means of a horn. During the
  • the filter chamber should be filled with liquid or with a buffer or water.
  • the ultrasonic treatment may cause the filter material to be partially disassembled.
  • the cells accumulated in the filter are at least partially released and made accessible to the lysis effect by the ultrasound.
  • the resulting particles can produce an additional grinding effect and thereby further support cell disruption, with the particles being caught again by the intact areas of the filter in the further course of the processing.
  • cell disruption using enzymes or other lysing reagents for example chemical reagents.
  • lysing reagents can be provided with particular advantage also a circulation of the fluids.
  • a suitable lysis buffer is fed into the circular fluidic path and pumped in a circle over the filter. It is pumped in particular in the direction in which the sample was pumped through the filter. This avoids the loss of cells or already released nucleic acids when the lysis buffer is initially placed on the filter. Furthermore, air bubbles, which possibly reach the filter, in the course again removed from this. In the previously known methods, such air bubbles remain on the filter and locally prevent lysis. Furthermore, the leaching of the lysis reagents on the filter is thereby avoided by the continuous introduction of lysis buffer on the cells, thus achieving a particularly effective and complete lysis of the cells on the filter.
  • a lysis buffer is to be understood as meaning a buffer which is suitable for cell disruption or lysis of the target cells.
  • the buffer may contain, for example, lysis enzymes known per se, such as, for example, lysozyme and / or
  • Proteinases Alternatively or additionally, chaotropic salts, detergents and / or basic ingredients such as e.g. NaOH be included. Further, buffering agents (e.g., Tris-HCl), nuclease inhibitors (e.g., EDTA or EGTA) and / or reducing agents (e.g., ⁇ -mercaptoethanol) may be included.
  • buffering agents e.g., Tris-HCl
  • nuclease inhibitors e.g., EDTA or EGTA
  • reducing agents e.g., ⁇ -mercaptoethanol
  • the binding buffer is fed into the circular fluidic path and pumped in a circle.
  • the binding buffer mixes with the lysate and, for example, the nucleic acids bind to the filter under the conditions set in the process.
  • a buffer suitable for this purpose may in particular contain chaotropic reagents, for example GIT
  • the denaturation buffer is also preferably pumped in the circulation to further increase the effectiveness of the denaturation step.
  • an additional digestion step can be carried out, especially in the purification of nucleic acids.
  • Verdaupuffer can, for example, various enzymes, in particular
  • Proteinases that contain a digestion of the liberated in the lysis step Proteinases that contain a digestion of the liberated in the lysis step
  • the appropriate digestion buffer is fed into the path and advantageously also pumped in a circle.
  • wash buffer passed over the filter.
  • suitable wash buffers is chosen such that in this step, for example, the nucleic acids remain bound to the filter while other molecules, especially proteins, are not adsorbed and removed.
  • an alcohol-containing washing buffer e.g. 70% EtOH, are used.
  • the filter is dried after treatment with washing buffer. This can be done, for example, by passing air or nitrogen through the filter. Subsequently, elution of the adsorbed target molecules from the filter can be carried out using water or a suitable elution buffer for this purpose. It can also be provided that the filter with the target molecules adsorbed on it is used as such. For example, a PCR can be carried out with the reversibly immobilized on the filter nucleic acids, as is known per se from the prior art.
  • the filter When using certain samples, it may be advantageous to pre-treat the sample before applying it to the filter. For example, in the filtration of blood there may be a problem that the filter becomes clogged with blood cells and thus clogged, making further filtration impossible. For this purpose, it has proven to be advantageous to first lyse the blood cells selectively.
  • selectively lyse it is meant that the blood cells, also called human cells, are disrupted while other cells contained in the sample, especially pathogens, remain intact, for example, by treating the sample with chaotropic reagents or
  • a digestion can be incorporated into the method of the invention and have the advantage that the filterability of the sample is further improved and a human nucleic acid background is partially removed from the sample.
  • the sample is first mixed with a chaotropic buffer and then incubated with a DNase, e.g. for a period of 10 minutes before the sample is applied to the filter.
  • one or more of the method steps may be at least partially under
  • Heat supply done In particular for the cell disruption and / or the additional digestion step and / or for the drying of the filter, it may be advantageous to increase the temperature.
  • the enzymes used for enzymatic cell disruption may be elevated
  • the lysis of the cells can run faster and more effective.
  • the drying of the filter can be accelerated by increasing the temperature, for example by increasing the temperature to a temperature between 40 and 60 °.
  • the filter can be heated directly, for example via a per se known Peltier element or a film heater, which is brought into contact with the device containing the filter.
  • tempered liquids for example it can be provided, a Poperungsgefäß for the liquids used and / or the At least partially to heat the pipeline system.
  • a cooling or generally a temperature control may be advantageous.
  • Procedural steps are reversed once or several times. In this way, in particular clogging of the filter or clogging of the filter can be avoided or optionally reversed. Furthermore, the mixing of liquids in circulation can be improved and optionally precipitated solids can be brought back into solution.
  • a reversal of the pumping direction is particularly advantageous during the binding step and / or during the washing step and / or during the elution step.
  • microfluidic devices have the advantage that they are particularly suitable for automated processes. Automation reduces the time and cost of analysis and reduces the risk of contamination. Furthermore, an automated system does not necessarily have to be operated by qualified personnel, since the operation is generally easy to learn.
  • inventive method in conjunction with a microfluidic device has the particular advantage that a particularly good mixing of the liquids is achieved by the circulation of the fluids. Often, therefore, can be dispensed with further structures and active components such as stirrers for mixing. Nevertheless, however, additional mixer structures or mixing chambers known per se can also be used be provided in a corresponding device in order to further increase the mixing efficiency.
  • the invention further comprises an apparatus for carrying out a purification of biological molecules, in particular of nucleic acids or
  • the device has at least one pump for pumping liquids.
  • the device comprises at least one device for fixing at least one filter.
  • the purification protocols that can be carried out here are based on the fact that the biological molecules to be purified can adsorb to the filter. According to the invention, the
  • Device a conduit system for the circular pumping of liquids through the filter.
  • the described method according to the invention can advantageously be carried out with this device.
  • An essential aspect of the invention is that by the circular pumping of liquids through the filter, the efficiency of the cleaning process can be significantly improved.
  • the device for fixing the filter is in particular a filter chamber for receiving the filter material.
  • filter chamber is to be understood in particular as meaning a fluidic cavity with a filter, for example, the filter chamber may be designed as a tube or, in a particularly preferred manner, as a microfluidic element
  • Filter chamber preferably has a multilayer structure.
  • two or more structured plates in particular polymer plates, can be provided.
  • one of the plates can be a flat
  • Recess may be provided in which the filter, e.g. a membrane, or other filter material, e.g. a microparticle bed, can be inserted. It has proven to be advantageous, in particular with relatively large filter diameters (> 3 mm), to pass the filter through a support structure, e.g. a porous polymer carrier (frit), to aid in sagging or
  • one or more inlet and outlet channels are provided for the passage of liquids.
  • an additional membrane is inserted between the two plates, realized by the additional functionalities of the filter chamber can be, for example, a pneumatic actuation of
  • Diaphragm valves and / or a diaphragm pump Preferably cover films or cover membranes or other polymer layers are provided as lateral outer terminations of the system.
  • a cover film can also be used for coupling ultrasound.
  • the filter chamber has an extension for introducing the ultrasound.
  • This extension of the filter chamber can also take over the function of ventilation for the system, wherein
  • Ventilation channels may be provided, which lead to the extension.
  • the device according to the invention has at least one ventilated vessel, with which liquids can be introduced into the system.
  • an upwardly vented vessel may be incorporated into the fluidic path or conduit system for circular pumping of liquids across the filter.
  • the liquids may e.g. be introduced by hand, in particular by pipette, or by pumping with a second pump integrated in the system into the vessel.
  • a ventilated vessel also has the advantage that air bubbles which have entered the fluidic path can rise in the vessel and thus leave the system. This will avoid that
  • Such a vessel may for example be designed as a tube, chamber or other fluidic element having a volume, for example, between 100 ⁇ and 10 ml.
  • a plurality of ventilated vessels can be provided in the system, which can serve primarily as displacement chambers for reagents.
  • the pump may be, for example, a peristaltic pump or a micromembrane pump.
  • the pump is more or less directly upstream or downstream of the filter, so that the liquids can be pumped with very high positive or negative pressure through the filter.
  • the channel piece between the pump and the filter is relatively short.
  • an inlet channel for the sample liquids opens more or less directly in front of the pump or the filter. This has the advantage that other displacement vessels for buffer solutions are not contaminated by the sample liquid. It can also be provided that several
  • Inlet channels are provided for different liquids.
  • one or more elements of the device can be heated.
  • the pump and / or the line system or parts thereof and / or the filter and / or optionally a vessel which is provided for the pre-storage or for the introduction of liquids be heated.
  • individual process steps can be tempered
  • the lysis step may be performed at an elevated temperature by preheating the lysis buffer and / or heating the filter itself.
  • the device according to the invention is designed as a microfluidic system.
  • the advantages of the device according to the invention in microfluidic design reference is made to the advantages already mentioned above.
  • the method according to the invention and the device according to the invention can be implemented, for example, with particular advantage in molecular diagnostics and / or, for example, in a lab-on-a-chip system.
  • Fig. 1 is a schematic representation of the principle of the circular
  • Fig. 2 is a schematic representation of the components of an exemplary
  • Fig. 3 is a schematic representation of another exemplary embodiment
  • Fig. 4 is a schematic representation of another exemplary embodiment
  • Fig. 5 is a schematic representation of another exemplary embodiment
  • Fig. 6 is a schematic representation of a multilayer filter chamber as
  • Fig. 7 microfluidic device according to the invention in a plan view;
  • Fig. 8 side view of the multilayer structure of the microfluidic
  • FIG. 9 is an oblique view of the microfluidic device of FIG. 7; FIG.
  • microfluidic device in side view (Fig. 10) and in plan view (Fig. 11) and
  • FIG. 12 in plan view (FIG. 13).
  • FIG. 1 illustrates the principle of a circular fluidic path 11, which extends over a filter 10.
  • the fluid in the fluidic connections 11 is driven by a pump 12.
  • the fluidic connections 11 can be formed, for example, by hoses or channels.
  • the pump 12 is a
  • Liquid pump such as a peristaltic pump or a
  • Diaphragm pump Conventional integrable microfluidic pumps can be used for a microfluidic configuration of the device.
  • the filter 10 shown here is realized in the form of a filter chamber. The following description of a filter is to be understood in many cases as a synonym for a filter chamber.
  • the filter chamber can be called microfluidic
  • the type of inflow and outflow on the filter 10 can optionally be set exactly.
  • the filter chamber itself can be realized, for example, in a multilayer structure of a plurality of structured polymer layers. By this construction, a particularly cost-effective production is possible.
  • the pump 12 is connected via hoses to the inlet and outlet of the filter chamber 10, the feeding into the fluidic path can be done, for example, by opening the hose connection and pipetting.
  • Fig. 2 shows a preferred variant for the schematic structure of an apparatus for carrying out the method.
  • an upwardly ventilated vessel 24 is integrated into the fluidic path. Via this vessel 24 liquids can be introduced into the circular fluidic path. The required solutions or buffers can be pipetted into the vessel 24, for example. In this way, it is advantageously possible to feed buffer or other solutions into the fluidic path during the process.
  • this embodiment has the advantage that air bubbles that have entered the fluidic path, rise in the vessel 24 up and so can leave the system.
  • the volume of the vessel 24 can be selected accordingly, for example between 100 .mu.l and 10 ml.
  • the vessel 24 can be designed, for example, as a tube or as a microfluidic element.
  • the bottom of the vessel is the outlet channel of the system. By “bottom” is meant the part of the vessel that is at the lowest point in gravity
  • Liquids can be completely removed from the vessel.
  • the vessel 24 is designed so that it tapers downwards.
  • Fig. 3 shows a further variant of the device for carrying out the
  • This embodiment is particularly suitable as a microfluidic system.
  • a microfluidic system has the advantage that the dead volume of the structure can be kept very low and the risk of foaming is low.
  • the circular fluid guide in the fluidic connections 31 is driven by the pump 32. Upstream of the pump is the filter chamber 30. Further, a vessel 34th
  • the opening or the venting channel 35 is advantageously at the respect of the gravitation upper end of the vessel. As a result, inadvertent leakage of reagents can be avoided.
  • an inlet channel 36 is provided, wherein the inlet channel 36 can also open directly into the vessel 34. Furthermore, a plurality of inlet channels 36 may be present. Downstream of the pump is an outlet channel 37.
  • the flow of liquids is controlled by integrated valves 38 located at various locations in the system. This can be, for example, rotary or
  • the method according to the invention can be carried out as follows:
  • the sample ie the liquid with the biological cells, is introduced through the opening 35 into the vessel 34 via the inlet channel 36 or by introduction (eg pipetting).
  • the vessel 34 may be designed, for example, as a microfluidic cavity.
  • the air contained in the vessel 34 is released through the opening or the venting channel 35, so that the vessel 34 is vented.
  • the pump 32 then pumps the sample via the filter 30 in the direction of the outlet channel 37. Es it can be provided that the venting channel 35 is closed, so that the pump 32 can suck in the sample directly via the inlet channel 36.
  • the cells contained in the sample accumulate on the filter 30.
  • the cells are then disrupted by, for example, treating them with a suitable lysis buffer.
  • the lysis buffer is first introduced into the vessel 34, for example via the inlet channel 36.
  • the lysis buffer is pumped by the pump 32 via the circular fluidic path 31 in the circuit via the filter 30.
  • the cell disruption can also be done in other ways, for example with ultrasound.
  • the filter 30 is sonicated accordingly.
  • suitable binding buffer is introduced into the vessel 34 and pumped in the circuit 31.
  • the washing buffer is first introduced into the vessel 34 and pumped by the pump 32 via the filter 30 in the direction of the outlet channel 37.
  • drying of the filter 30 is provided, for example, air or nitrogen is pumped from the inlet channel 36 via the filter 30 in the direction of the outlet channel 37. It is also possible to use the pump 32 for drying.
  • an elution step can be carried out, wherein suitable elution buffer is introduced into the vessel 34 and pumped by the pump 32 via the filter 30 in the direction of the outlet channel.
  • the introduction of the sample and the buffer into the vessel 34 can take place, for example, by means of a further pump or manually by pipetting or the like.
  • a resealable opening in the vessel 34 may be provided.
  • FIG. 4 shows a further variant of the system, wherein in addition to the vessel 34 one or more further vessels 44, for example storage vessels, are provided. These vessels 44 are equipped with an opening or a vent channel 45. The contents of the vessel 44 can be introduced via a further valve 48 in the rest of the pipe system.
  • the system substantially corresponds to the device shown in FIG. 3. The corresponding elements are therefore provided with the same reference numerals.
  • another valve 49 is provided between the vessel 34 and the supply line from the other vessel 44.
  • Various buffers for example the lysis, digestion, denaturing, binding, washing or elution buffers, can be stored upstream in the vessel or vessels 44.
  • This variant has the advantage that an automatic implementation is simplified because the buffers no longer have to be individually introduced into the vessel 34.
  • the method can be carried out in such a way that, in particular, the sample is manually introduced into the vessel 34 before the filter 30 is subjected to it.
  • the various required buffers in the subsequent process steps can be automatically introduced from the vessel or vessels 44
  • FIG. 5 illustrates a further preferred example of a device for carrying out the method according to the invention, which can be realized, for example, in a microfluidic system.
  • the pump 52 is located upstream of the filter chamber 50. This has the advantage that liquids can be pumped through the filter 50 at very high pressure. For this purpose, it is particularly advantageous if the channel piece or piece of tubing between the pump 52 and the filter 50 is relatively short.
  • the inlet channel 56 opens directly in front of the pump 52. This has the advantage that the pumped from the inlet channel 56 via the filter 50
  • Liquids especially the sample with the cell material, not the
  • Pre-storage vessel 54 pass, so that contamination can be avoided.
  • the system can be heated partially or in sections, for example, the filter 50 and / or the pump 52 and / or the vessel 54 can be heated.
  • a heating may conveniently take place during the lysis step, so that the cell digestion can proceed even more efficiently.
  • an optimum temperature for the lysis enzymes used can be set, which may for example be in a temperature range between 35 and 55 ° Celsius, for example at 45 ° Celsius.
  • the process control in the Lyse intimid preferably takes place in a circular shape over the circular fluidic path 51, comparable to the other described embodiments.
  • further inlet channels may be present, via which the required reagents can be pumped into the system.
  • the vessel or vessels 54 have a volume of 2 ml and the filter has a diameter of between 2 and 10 mm, for example.
  • the fluid flow is controlled via the valves 58.
  • the fluids can leave the system via the outlet channel 57.
  • An experimental procedure for the accumulation and lysis of cells and a DNA purification in a microfluidic system according to the invention can be carried out, for example, as follows: 10 5 Staphylococci in 1 ml of physiological saline solution are introduced by pumping via the inlet channel 56 or by pipetting into the vessel 54 in the system and pumped by the pump 52 through the filter 50. For lysis 100 ⁇ lysis buffer are pipetted into the vessel 54 and with the pump 52 for 10 minutes with simultaneous
  • Nucleic acids are effectively bound to the filter 50.
  • the filter 50 is then washed by pipetting a wash buffer into the vessel and pumping it via the filter 50 into the outlet channel 57.
  • the bound DNA is eluted with water by pipetting water into the vessel 54 and pumping it via the filter 50 into the outlet channel 57.
  • the eluate is collected.
  • a reference is processed: 10 5 staphylococci in 1 ml of physiological saline are collected by centrifugation at 13,000 g and the supernatant is pipetted off. 100 ⁇ l lysis buffer are added by pipette, mixed and incubated for 10 min at 45 ° C. The resulting lysate is successively mixed with digestion buffer and binding buffer and applied to a commercially available column.
  • FIG. 6 shows a section through an exemplary microfluidic filter chamber 60 based on a multilayer construction.
  • Lid films 63 form the multi-layer structure.
  • the filter 64 is in one
  • FIGS. 7 to 9 show an exemplary embodiment of a microfluidic system 700 for carrying out the method according to the invention.
  • Fig. 7 shows a top view from the front
  • Fig. 8 is a side view
  • Fig. 9 is an oblique view from the front.
  • the microfluidic system is implemented as a multilayer structure consisting of two structured polymer plates 750 and 760 (FIG. 8) and lid films arranged on the right and left or other polymer layers (not shown) for covering the structures.
  • the system comprises a pump 702, a vessel 704 with a ventilation opening 724 and a filter device 710 and a plurality of valves 708, 718, 728.
  • the fluid is guided in the direction of the arrow (FIGS. 7, 9), whereby the direction of flow can also be reversed.
  • the fluid is guided in the direction of the arrow (FIGS. 7, 9), whereby the direction of flow can also be reversed.
  • the fluid is guided in the direction of the arrow (
  • Filter device 710 is provided by a recess 713 (filter chamber) in the
  • Polymer plate 750 a frit 711 for the mechanical support of the filter and the actual filter 712 formed (Fig. 8).
  • channels 701 which are capped by cover sheets or other polymer layers (not shown).
  • the valves 708, 718, 728 are designed as microfluidic diaphragm valves.
  • the pump 702 is as
  • microfluidic diaphragm pump having a pumping chamber and an inlet valve 708 and two outlet valves 718, 728 and located downstream of the filter device 710.
  • the outlet valves 718, 728 form a T-junction and allow switching of the fluid path between the circuit 701 (valve 728) and the outlet channel 707 (valve 718).
  • Between the polymer plates 750 and 760 is a polymer membrane, not shown, which is used for pneumatic actuation of the valves and the pump.
  • the vessel 704 is shaped so that even the smallest amounts of liquid converge at the lowest point of the vessel and from there into the channel system 701 can enter.
  • the vessel 704 has a taper towards the bottom.
  • the illustrated system 700 may be part of a larger microfluidic system that includes other functionalities, e.g. more pumps and
  • the method of the invention may be performed as follows: The sample is first introduced into the vented vessel 704, e.g. by pipetting and pumping, and
  • Lysis buffer is then introduced into the vented vessel 704 and circulated through the filter device 710 during lysis with the pump 702.
  • the lysis buffer may also be circulated only briefly to safely fill the filter chamber 713 with liquid, after which, e.g. Heat or ultrasound is applied to the filter 712.
  • a binding buffer is placed in the vented vessel 704 and circulated by the pump 702 via the filter device 710. This results in the mixing of lysate and binding buffer and nucleic acids (as an example of molecules to be purified) bind to the filter 712.
  • the mixture is then pumped into the outlet channel 707.
  • a washing buffer is introduced into the ventilated vessel 704 and pumped via the filter device 710 into the outlet channel 707.
  • an elution buffer is introduced into the vented vessel 704 and pumped via the filter device 710 into the outlet channel 707.
  • the elution buffer can also be sucked in via the outlet channel 707 and pumped in the reverse direction via the filter device 710 into the ventilated vessel 704.
  • human cells initially present in the sample can be selectively lysed.
  • a digestion of proteins can be carried out after the lysis.
  • a denaturation step can be carried out before the binding of the DNA.
  • the pumping direction can be reversed briefly, for example, for 5 to 60 seconds.
  • FIG. 10 is a side view and FIG. 11 is a plan view of an exemplary one
  • Embodiment of a filter chamber 813 for microfluidic devices In Fig. 10, the multilayer structure of two polymer plates 850 and 860 can be seen.
  • the circular recess 814 in the polymer plate 850 is provided as a blind hole for inserting a filter membrane or a filter material bed and optionally a frit.
  • a circular extension 815 is provided Immediately above the filter to be inserted.
  • a circular aperture 816 is provided in the other polymer plate 860, which is covered in the assembled state by a cover membrane (not shown). Via the channel 817, a supply or discharge of liquids can take place.
  • the circular aperture 816 may, for example, have a diameter between 5 and 50 mm and may be arranged approximately concentrically with the filter, but may also be displaced, in particular with respect to the direction of gravity upward, e.g. by the difference between the radii of the filter and the circular area.
  • ultrasound can be introduced into the interior of the filter chamber 813 by means of a sonotrode, as a result of which ultrasound lysis can be carried out.
  • This variant has the advantage that a particularly efficient ultrasonic lysis is possible.
  • the area provided for introducing ultrasound can also be oval, square or oblong with comparable dimensions.
  • this variant has the advantage that the extension 815 of the filter chamber 813 can simultaneously fulfill the function that air bubbles rise upwards in the extension and are thus eliminated from the fluid circuit and that a volume of liquid rising during processing is absorbed, and thus optionally replace other vessel of the system.
  • an additional vent channel 819 may be provided. It is useful if the
  • Extension has a volume between 500 ⁇ and 5 ml.
  • an additional extension 818 can be provided.
  • a filter here, for example, silica membranes, but also beds of microparticles can be used.
  • the filter or the bed of microparticles extends into the extension 815 and the opening 816, so that there is contact with the cover membrane on this side. This has the advantage that when coupling of Ultrasound in the lid memb ran the filter or the bed of microparticles is particularly efficiently vibrated, whereby the lysis of accumulated cells can take place with greater yield.
  • FIGS. 12 and 13 show a further embodiment of a filter chamber 913 which, comparable to the filter chamber 813, has a blind-hole-shaped recess 914 in the polymer plate 950 for receiving a filter or a filter material bed and possibly a frit.
  • a filter chamber 913 which, comparable to the filter chamber 813, has a blind-hole-shaped recess 914 in the polymer plate 950 for receiving a filter or a filter material bed and possibly a frit.
  • About the channel 919 can a
  • Polymeric plate 960 has in these areas an aperture 916 which, when assembled, makes the connection between the blind hole 914 and the extension 915 and which is covered with a cover membrane (not shown).
  • the extension 915 and the aperture 916 similarly to the embodiment 813, are also suitable for ultrasonic coupling.

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Abstract

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, wird wenigstens ein Filter (50) eingesetzt. Zumindest einige der für die Prozessführung erforderlichen Flüssigkeiten werden in einem Kreislauf (51) über den Filter (50) gepumpt. Hierbei wird zunächst eine Flüssigkeit mit biologischen Zellen über den Filter (50) gepumpt. Die an dem Filter zurückgehaltenen Zellen werden aufgeschlossen. Zur Bindung der biologischen Moleküle an den Filter wird Bindepuffer im Kreislauf (51) über den Filter (50) gepumpt. Ein Waschpuffer zur Reinigung der an den Filter gebundenen biologischen Moleküle wird über den Filter (50) gepumpt, so dass die an den Filter gebundenen biologischen Moleküle für eine weitere Verwendung zur Verfügung stehen.

Description

Beschreibung
Verfahren und Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, wobei bei dem Verfahren wenigstens ein Filter verwendet wird.
Stand der Technik
Für die Aufreinigung von biologischen Molekülen und insbesondere von
Nukleinsäuren oder Proteinen existieren viele verschiedene Methoden. In der Regel werden die biologischen Moleküle aus Zellmaterial gewonnen, also aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen. Bevor intrazelluläres Material weiter bearbeitet werden kann, ist es in der Regel erforderlich, die Zellen selbst aufzuschließen. Dieser Zellaufschluss wird allgemein auch als Zelllyse bezeichnet. Nach Abtrennung der Zelltrümmer können beispielsweise
Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide weiter aufgereinigt, bearbeitet und analysiert werden. Wenn im Folgenden von Proteinen die Rede ist, sind hiermit auch Peptide gemeint. Um beispielsweise eine bestimmte Nukleinsäure nachweisen zu können, können die aufgereinigten Nukleinsäuren mit einer PCR (Polymerase Chain Reaction) selektiv amplifiziert werden, so dass die bestimmte Nukleinsäuresequenz nachweisbar gemacht wird.
Der Aufschluss der Zellen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Verbreitet ist ein enzymatischer Aufschluss der Zellen, wobei beispielsweise eine Behandlung mit dem Enzymen Proteinase K oder Lysozym durchgeführt wird. Auch ein thermischer Zellaufschluss durch Erhitzen und/oder Einfrieren der Probe oder ein Zellaufschluss mit chemischen Reagenzien ist möglich. Weiterhin kann der Zellaufschluss mechanisch erfolgen, beispielsweise durch eine
Ultraschallbehandlung. Ein übliches Verfahren zur weiteren Aufreinigung von beispielsweise Nukleinsäuren sieht vor, dass das durch den Zellaufschluss entstehende sogenannte Lysat mit einem Bindepuffer versetzt wird und mit einer festen Matrix, beispielsweise einem Silica-Filter bzw. einer Silica- Membran, in Kontakt gebracht wird. Hierbei adsorbieren die Nukleinsäuren an den Filter und können anschließend mit einem Waschpuffer gewaschen und danach von der festen Matrix eluiert und weiter verwendet werden. Nach diesem Prinzip funktionieren verschiedene käuflich erwerbbare Kits und Laborgeräte.
Oftmals ist es erforderlich, das Zellmaterial vor der weiteren Behandlung aufzukonzentrieren bzw. die Zellen zu akkumulieren. Hierfür kann beispielsweise eine Zentrifugation der Probe mit den Zellen durchgeführt werden. Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2005 009 479 AI beschreibt ein Verfahren, bei dem die Zellen mittels einer Filtration akkumuliert werden. Mit einer solchen
Filtermembranmethode ist es beispielsweise auch möglich, die akkumulierten Zellen, beispielsweise Bakterien, zu quantifizieren, wie es in der Veröffentlichung von Dufour, Alfred P., et al. (Applied and Environmental Microbiology, May 1981, Seiten 1152-1158) beschrieben ist.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2010 030 962 AI beschreibt ein Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren in einem Microarray, bei dem die Probe zunächst durch eine Denaturierungseinheit und anschließend durch einen separaten Reaktionsbereich mit dem Microarray mit den immobilisierten Sonden gepumpt wird. Hierbei kann die Pumpstrecke als Kreislauf ausgestaltet sein.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2010 043 015 AI offenbart ein
Verfahren, mit dem Nukleinsäuren auf einem Filter amplifiziert, d.h. vervielfältigt, werden. Vorab können eine Aufkonzentrierung und eine Lyse der die
Nukleinsäuren enthaltenden Zellen auf dem Filter erfolgen.
Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können biologische Moleküle, insbesondere Nukleinsäuren oder Proteine oder andere biologische Moleküle, aufkonzentriert und aufgereinigt werden. Die Aufreinigung erfolgt im Prinzip durch eine unspezifische Adsorption der biologischen Moleküle an eine Matrix, insbesondere an eine Membran. Nachfolgend wird allgemein von einem Filter gesprochen, wobei hiermit die Matrix insbesondere in Form einer Membran oder beispielsweise in Form einer Schüttung gemeint ist. Der Kern der Erfindung ist dabei, dass zumindest einige der für die Prozessführung erforderlichen
Flüssigkeiten in einem Kreislauf über den Filter gepumpt werden. Die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen im Einzelnen zunächst das Pumpen einer Flüssigkeit mit biologischen Zellen, also einer Probenflüssigkeit, über den Filter. Unter dem Begriff„biologische Zellen" sind allgemein Zellen zu verstehen, aus denen biologische Moleküle, wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, aufbereitet bzw. aufgereinigt werden sollen. Es kann sich hierbei beispielsweise um pathogene Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilze handeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch für Humanzellen oder andere Zellen geeignet und kann allgemein für die Aufreinigung von Proteinen oder Nukleinsäuren aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen verwendet werden. Unter dem Begriff„Probenflüssigkeit" ist allgemein die Flüssigkeit zu verstehen, die die entsprechenden Zellen enthält, beispielsweise eine
Zellsuspension oder eine Patientenprobe, beispielsweise Blut, Lavage, Urin, Liquor, Sputum oder ein ausgespülter Swab oder Abstrich. Je nach Anwendung kann das Volumen der Probe unterschiedlich sein, beispielsweise zwischen einigen μΙ bis 10 ml. Nach dem Probenauftrag werden die an dem Filter zurückgehaltenen Zellen aufgeschlossen, wobei für den Zellaufschluss im Prinzip verschiedene Methoden eingesetzt werden können. Die im Zelllysat enthaltenen biologischen Moleküle werden mittels eines Bindepuffers an den Filter gebunden, wobei der Bindepuffer im Kreislauf über den Filter gepumpt wird. Die an den Filter gebundenen biologischen Moleküle werden im anschließenden Schritt mit Waschpuffer gereinigt, der über den Filter gepumpt wird. Im Ergebnis befinden sich dann die aufzureinigenden biologischen Moleküle in reversibel
immobilisierter Form am Filter. Für die weitere Verarbeitung oder Analyse können die gebundenen biologischen Moleküle in üblicher Weise von dem Filter eluiert werden oder der Filter mit den reversibel immobilisierten biologischen Molekülen wird als solcher direkt weiter verwendet.
In bisher bekannten Verfahren erfolgt die Akkumulation von Zellen aus einer Probe durch Zentrifugation. Eine Umsetzung dieses Verfahrens in einem mikrofluidischen System und damit eine kostengünstige Automatisierung ist jedoch nicht möglich. Auch sind Verfahren bekannt, bei denen die Akkumulation der Zellen aus einer Probe durch Spülen über einen Filter erfolgt, wobei die Lyse dann durch Aufgeben eines Lysepuffers auf den Filter stattfindet. Diese
Verfahren bieten jedoch für die Integration in ein mikrofluidisches System den Nachteil, dass die genaue Positionierung des Lysepuffers auf dem Filter schwierig bzw. mit großem Aufwand verbunden ist. Diese muss manuell erfolgen oder es werden z.B. Kameras oder Lichtschranken benötigt. Weiterhin besteht die Gefahr, beim Aufgeben des Lysepuffers auf den Filter Zellen und bereits freigesetzte Nukleinsäuren vom Filter zu verdrängen, die dann für die weitere Aufreinigung nicht mehr zur Verfügung stehen und somit die Effizienz der Aufreinigung herabsetzen. Weiterhin ist bei diesen Verfahren die Diffusion von Lysereagenzien, z.B. Enzymen, auf dem Filter erschwert, was die Effektivität der Lyse herabsetzt, insbesondere bei schwer zu lysierenden Zellen, z.B. Pilzen. Die Erfindung löst diese Probleme und ermöglicht dadurch die einfache Realisierung des beschriebenen Verfahrens in einem automatisierten mikrofluidischen System (Lab-on-Chip-System).
Die besondere Effektivität des erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens wird dadurch erreicht, dass durch die Kreisführung der Flüssigkeiten, insbesondere während des Bindevorgangs der biologischen Moleküle an den Filter, die Substanzen mehrfach durch den Filter gespült werden. Durch diese Führung der Flüssigkeiten in einem kreisförmigen fluidischen Pfad wird das Filtermaterial mehrfach mit den Flüssigkeiten in Kontakt gebracht. Dabei stellt sich ein
Sättigungsgleichgewicht ein, bei dem die maximale Bindekapazität der Membran ausgeschöpft wird. Bei herkömmlichen Verfahren ist es oftmals der Fall, dass nur ein Teil der interessierenden Moleküle tatsächlich adsorbiert wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die kreisförmige Fluidführung sichergestellt, dass beispielsweise sämtliche Nukleinsäuren, die während des Zellaufschlusses freigesetzt wurden, im Bindeschritt effektiv über den Filter gepumpt werden. Es gehen gewissermaßen keine Nukleinsäuren verloren, sodass die Ausbeute erhöht wird. Durch das kreislaufförmige Pumpen wird darüber hinaus gewährleistet, dass eine optimale Mischung der Reagenzien, also beispielsweise des Bindepuffers und des Zelllysats, stattfindet. Das Mischen von Reagenzien stellt insbesondere in mikrofluidischen Systemen oftmals ein Problem dar. Durch die erfindungsgemäß vorgesehene kreisförmige Fluidführung wird eine gute Durchmischung der verschiedenen Reagenzien und Puffer erreicht, wodurch sich das erfindungsgemäße Verfahren in besonders vorteilhafter Weise für eine Realisierung innerhalb eines mikrofluidischen Systems eignet. Davon unabhängig kann die Mischeffizienz insbesondere in einem mikrofluidischen System auch noch durch weitere Maßnahmen, insbesondere durch an sich bekannte Mischerstrukturen oder Mischkammern, in einem mikrofluidischen System erhöht werden.
In dem ersten Verfahrensschritt erfolgt eine Akkumulation der biologischen Zellen, wobei die Zellen am Filter nach dem Größenausschlussverfahren und/oder durch elektrostatische Interaktionen zurückgehalten werden, wenn die Probenflüssigkeit über den Filter gepumpt wird. Umso mehr Probenflüssigkeit über den Filter gepumpt wird, umso höher ist die Anzahl der akkumulierten Zellen. Je nach Dimension der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der Durchmesser eines solchen an sich bekannten Filters unterschiedlich sein, beispielsweise zwischen 1 und 25 mm. Als Filter eignen sich beispielsweise Faserfilter, Gewebefilter und/oder Membranfilter, insbesondere aus Silika.
Weiterhin eignen sich auch Partikelschüttungen, insbesondere
Mikropartikelschüttungen, z.B. aus Silikapartikeln. Der Porendurchmesser der Materialien liegt vorzugsweise unterhalb von 100 μηη. Bei dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf dem Filter kann es vorgesehen sein, dass die Probe kreisförmig mehrfach über den Filter gepumpt wird. Dies hat den Vorteil, dass auch Zellen, die beim ersten Passieren des Filters
möglicherweise nicht zurückgehalten wurden, bei einem erneuten Passieren des Filters zurückgehalten werden. Da auch elektrostatische Kräfte wirken und die Größenverteilung der Poren in einem Silikafilter im Allgemeinen nicht als homogen anzunehmen ist, kann es dazu kommen, dass Zellen bei einer ersten Passage nicht zurückgehalten werden. Darüber hinaus können sich Zellen in „Sackgassen" des Systems verfangen, sodass durch eine Kreisführung beim Probenauftrag die Effektivität erhöht werden kann.
Der Aufschluss der Zellen kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch oder durch Hitze. Mit Vorteil kann z.B. eine Ultraschallbehandlung vorgesehen sein, die mit verhältnismäßig geringem apparativem Aufwand durchgeführt werden kann. Hierbei sind keine zusätzlichen Reagenzien für die Lyse bzw. den Zellaufschluss erforderlich. Der Ultraschall kann direkt in den Filter eingetragen werden. Hierfür kann beispielsweise die Wandung einer entsprechenden Filterkammer als Membran ausgeführt sein, in die der
Ultraschall mittels eines Horns eingekoppelt wird. Während der
Ultraschallbehandlung sollte die Filterkammer mit Flüssigkeit bzw. mit einem Puffer oder Wasser befüllt sein. Die Ultraschallbehandlung kann dazu führen, dass das Filtermaterial teilweise zerlegt wird. Hierdurch werden zum einen die im Filter akkumulierten Zellen zumindest teilweise freigesetzt und der Lysewirkung durch den Ultraschall zugänglich gemacht. Zum anderen können die hierbei entstehenden Partikel eine zusätzliche mahlende Wirkung erzeugen und dadurch den Zellaufschluss weiter unterstützen, wobei die Partikel im weiteren Verlauf der Prozessierung von den intakten Bereichen des Filters wieder aufgefangen werden.
Besonders bevorzugt ist ein Zellaufschluss unter Verwendung von Enzymen oder anderen lysierenden Reagenzien, beispielsweise chemischen Reagenzien. Für diesen Zellaufschluss mit lysierenden Reagenzien kann mit besonderem Vorteil ebenfalls eine Kreislaufführung der Flüssigkeiten vorgesehen sein. Hierfür wird ein geeigneter Lysepuffer in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingespeist und im Kreis über den Filter gepumpt. Dabei wird insbesondere in der Richtung gepumpt, in der auch die Probe über den Filter gepumpt wurde. Hierdurch wird vermieden, dass es beim initialen Aufgeben des Lysepuffers auf den Filter zum Verlust von Zellen oder bereits freigesetzter Nukleinsäuren kommt. Weiterhin werden Luftblasen, die ggf. auf den Filter gelangen, im weiteren Verlauf wieder von diesem entfernt. Bei den bisher bekannten Verfahren verbleiben derartige Luftblasen auf dem Filter und unterbinden lokal die Lyse. Weiterhin wird durch die dabei kontinuierliche Heranführung von Lysepuffer auf die Zellen eine Verarmung der Lysereagenzien auf dem Filter vermieden und so eine besonders effektive und vollständige Lyse der Zellen auf dem Filter erreicht.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass bei Verwendung von Enzymen zur Lyse deren Aktivität durch das ständige Pumpen und die dabei entstehenden Scherkräfte nicht herabgesetzt wird, so dass auch eine enzymatische Lyse nach dem beschriebenen Schema mit Vorteil durchgeführt werden kann. Je nach Art der biologischen Zellen und der verwendeten Reagenzien kann die Lyse beispielsweise einen Zeitraum zwischen 2 und 30 Minuten erfordern. Unter einem Lysepuffer ist ein solcher Puffer zu verstehen, der zum Zellaufschluss bzw. zur Lyse der Zielzellen geeignet ist. Der Puffer kann beispielsweise an sich bekannte Lyseenzyme enthalten, wie beispielsweise Lysozym und/oder
Proteinasen. Alternativ oder zusätzlich können chaotrope Salze, Detergenzien und/oder basische Inhaltsstoffe wie z.B. NaOH enthalten sein. Weiterhin können Puffersubstanzen (z.B. Tris-HCI), Nukleaseinhibitoren (z.B. EDTA oder EGTA) und/oder Reduktionsmittel (z.B. ß-Mercaptoethanol) enthalten sein.
In dem nachfolgenden Bindeschritt wird der Bindepuffer in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingespeist und im Kreis gepumpt. Hierbei vermischt sich der Bindepuffer mit dem Lysat und beispielsweise die Nukleinsäuren binden unter den dabei eingestellten Bedingungen an den Filter.
Vor dem Bindeschritt kann vor allem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren ein weiterer Denaturierungsschritt durchgeführt werden. Ein hierfür geeigneter Puffer kann insbesondere chaotrope Reagenzien enthalten, beispielsweise GIT
(Guanidiniumisothiocyanat). Durch derartige Reagenzien werden die im Lysat enthaltenen Proteine gewissermaßen "eingesalzen", so dass sich die Proteine leichter auswaschen lassen. Der Denaturierungspuffer wird vorzugsweise ebenfalls im Kreislauf gepumpt, um die Effektivität des Denaturierungsschrittes weiter zu erhöhen. Vor dem Bindeschritt kann ein zusätzlicher Verdauschritt vor allem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren durchgeführt werden. Ein geeigneter
Verdaupuffer kann beispielsweise verschiedene Enzyme, insbesondere
Proteinasen, enthalten, die einen Verdau der im Lyseschritt freigesetzten
Proteine bewirken. Hierdurch kann die Effektivität einer Nukleinsäureaufreinigung und die Reinheit der gewonnenen Nukleinsäuren weiter verbessert werden. Für diesen Schritt wird der geeignete Verdaupuffer in den Pfad eingespeist und vorteilhafterweise ebenfalls im Kreis gepumpt. Auch hier hat sich
überraschenderweise gezeigt, dass die Aktivität der für den Verdau verwendeten Enzyme durch das ständige Pumpen und die dabei entstehenden Scherkräfte nicht herabgesetzt wird.
Nach der Bindung der biologischen Moleküle an den Filter erfolgen ein oder mehrere Waschschritte, wobei Waschpuffer über den Filter geleitet wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Waschpuffern ist so gewählt, dass bei diesem Schritt beispielsweise die Nukleinsäuren an dem Filter gebunden bleiben, während andere Moleküle, insbesondere Proteine, nicht adsorbieren und entfernt werden. Als Waschpuffer kann beispielsweise ein alkoholhaltiger Waschpuffer, z.B. 70% EtOH, eingesetzt werden.
Für viele Anwendungen ist es vorteilhaft, wenn der Filter nach der Behandlung mit Waschpuffer getrocknet wird. Dies kann beispielsweise mittels Durchleiten von Luft oder Stickstoff über den Filter erfolgen. Anschließend kann eine Elution der adsorbierten Zielmoleküle von dem Filter erfolgen, wobei hierfür Wasser oder ein geeigneter Elutionspuffer eingesetzt werden kann. Es kann auch vorgesehen sein, dass der Filter mit den daran adsorbierten Zielmolekülen als solcher weiterverwendet wird. Beispielsweise kann eine PCR mit den auf dem Filter reversibel immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt werden, wie es an sich aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Bei der Verwendung von bestimmten Proben kann es vorteilhaft sein, die Probe vor dem Aufgeben auf den Filter vorzubehandeln. Beispielsweise kann bei der Filtration von Blut das Problem bestehen, dass sich der Filter mit Blutzellen zusetzt und somit verstopft, wodurch eine weitere Filtration unmöglich wird. Hierfür hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Blutzellen zunächst selektiv zu lysieren. Mit„selektiv lysieren" ist hier gemeint, dass die Blutzellen, die auch als humane Zellen bezeichnet werden, aufgeschlossen werden, während andere in der Probe enthaltene Zellen, insbesondere Pathogene, intakt bleiben. Dies kann z.B. durch die Behandlung der Probe mit chaotropen Reagenzien oder
Detergenzien oder durch osmotischen Schock erfolgen und hat den Vorteil, dass ein Zusetzen des Filters vermieden wird. Ein kommerziell erhältliches Kit
(Molzym MolYsis Completeö) führt bei einer derartigen selektiven Lyse zusätzlich einen Verdau der freigesetzten humanen Nukleinsäuren mittels einer DNase durch. Ein solcher Verdau kann in das erfindungsgemäße Verfahren integriert werden und den Vorteil haben, dass die Filtrierbarkeit der Probe weiter verbessert und ein humaner Nukleinsäure-Hintergrund teilweise aus der Probe entfernt wird. Beispielsweise wird die Probe zunächst mit einem chaotropen Puffer vermischt und anschließend mit einer DNase inkubiert, z.B. für einen Zeitraum von 10 Min, bevor die Probe auf den Filter aufgetragen wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine oder mehrere der Verfahrensschritte zumindest teilweise unter
Wärmezufuhr erfolgen. Insbesondere für den Zellaufschluss und/oder den zusätzlichen Verdauschritt und/oder für das Trocknen des Filters kann es vorteilhaft sein, die Temperatur zu erhöhen. Beispielsweise können die für einen enzymatischen Zellaufschluss eingesetzten Enzyme ein erhöhtes
Temperaturoptimum aufweisen, so dass bei einer Erhöhung der Temperatur, beispielsweise auf Temperaturen zwischen 35 und 60° Celsius, insbesondere zwischen 35 und 45° Celsius, die Lyse der Zellen schneller und effektiver ablaufen kann. Entsprechendes gilt für einen Verdau- oder Denaturierungsschritt. Auch das Trocknen des Filters kann durch eine Erhöhung der Temperatur beschleunigt werden, beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung auf eine Temperatur zwischen 40 und 60°. Allgemein kann für die Wärmezufuhr insbesondere der Filter direkt beheizt werden, beispielsweise über ein an sich bekanntes Peltierelement oder einen Folienheizer, der mit der Einrichtung, die den Filter enthält, in Kontakt gebracht wird. Darüber hinaus ist es auch möglich, mit temperierten Flüssigkeiten zu arbeiten, beispielsweise kann es vorgesehen sein, ein Vorlagerungsgefäß für die eingesetzten Flüssigkeiten und/oder das Leitungssystem zumindest teilweise zu beheizen. Je nach Anwendung kann auch eine Kühlung oder allgemein eine Temperierung vorteilhaft sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Pumprichtung bei einem oder mehreren der
Verfahrensschritte ein- oder mehrfach umgekehrt werden. Hierdurch kann insbesondere ein Verstopfens des Filters bzw. ein Zusetzen des Filters vermieden oder gegebenenfalls rückgängig gemacht werden. Weiterhin kann die Durchmischung von im Kreislauf befindlichen Flüssigkeiten verbessert werden und gegebenenfalls können ausgefallene Feststoffe wieder in Lösung gebracht werden. Durch die Umkehr der Pumprichtung nach erfolgter Bindung der Zielmoleküle an den Filter kommt es im Allgemeinen nicht zu einer Ablösung der Zielmoleküle vom Filter, da die Adsorption der Moleküle an den Filter von der Pumprichtung unabhängig ist. Eine Umkehr der Pumprichtung ist insbesondere während des Bindeschrittes und/oder während des Waschschrittes und/oder während des Elutionsschrittes vorteilhaft. Auch während des Probenauftrags bzw. während der Akkumulation der Zellen am Filter kann es vorteilhaft sein, die Pumprichtung wiederholt kurz umzukehren, um ein Zusetzen des Filters mit Zellen und damit ein Verstopfen zu vermeiden oder gegebenenfalls rückgängig zu machen.
Mit besonderem Vorteil wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt. Im Allgemeinen haben mikrofluidische Vorrichtungen den Vorteil, dass sie sich in besonderer Weise für automatisierte Prozesse eignen. Durch eine Automatisierung werden Zeitdauer und Kosten der Analyse und die Gefahr von Kontaminationen verringert. Weiterhin muss ein automatisiertes System nicht notwendigerweise durch Fachpersonal bedient werden, da die Bedienung im Allgemeinen einfach erlernbar ist. Das
erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenspiel mit einer mikrofluidischen Vorrichtung bietet den besonderen Vorteil, dass durch die Kreisführung der Flüssigkeiten eine besonders gute Durchmischung der Flüssigkeiten erreicht wird. Oftmals kann daher auf weitere Strukturen und aktive Komponenten wie Rührer für eine Durchmischung verzichtet werden. Dessen ungeachtet können jedoch auch zusätzliche an sich bekannte Mischerstrukturen oder Mischkammern in einer entsprechenden Vorrichtung vorgesehen sein, um die Mischeffizienz weiter zu erhöhen.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung einer Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder
Proteinen. Die Vorrichtung weist wenigstens eine Pumpe zum Pumpen von Flüssigkeiten auf. Darüber hinaus umfasst die Vorrichtung wenigstens eine Einrichtung zur Fixierung wenigstens eines Filters. Die hiermit durchführbaren Reinigungsprotokolle basieren darauf, dass die zur reinigenden biologischen Moleküle an dem Filter adsorbieren können. Erfindungsgemäß weist die
Vorrichtung ein Leitungssystem zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter auf. Mit dieser Vorrichtung kann vor allem das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren mit Vorteil durchgeführt werden. Wesentlicher Aspekt der Erfindung ist dabei, dass durch das kreisförmige Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter die Effizienz des Reinigungsverfahrens wesentlich verbessert werden kann.
Bei der Einrichtung zur Fixierung des Filters handelt es sich insbesondere um eine Filterkammer zur Aufnahme des Filtermaterials. Unter dem Ausdruck „Filterkammer" ist insbesondere ein fluidischer Hohlraum mit einem Filter zu verstehen. Die Filterkammer kann beispielsweise als Röhrchen ausgestaltet sein oder in besonders bevorzugter Weise als mikrofluidisches Element. Die
Filterkammer weist vorzugsweise einen mehrschichtigen Aufbau auf. Hierbei können beispielsweise zwei oder mehr strukturierte Platten, insbesondere Polymerplatten, vorgesehen sein. In einer der Platten kann eine flächige
Aussparung vorgesehen sein, in die der Filter, z.B. eine Membran, oder ein anderes Filtermaterial, z.B. eine Mikropartikelschüttung, eingelegt werden kann. Es hat sich hierbei insbesondere bei verhältnismäßig großen Filterdurchmessern (> 3 mm) als vorteilhaft erwiesen, den Filter durch eine Stützstruktur, z.B. einen porösen Polymerträger (Fritte), zu unterstützen, um ein Durchbiegen oder
Durchsacken des Filters zu vermeiden. Zum Hindurchführen von Flüssigkeiten sind ein oder mehrere Ein- und Auslasskanäle vorgesehen. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass zwischen den beiden Platten eine zusätzliche Membran eingelegt ist, über die zusätzliche Funktionalitäten der Filterkammer realisiert werden können, beispielsweise eine pneumatische Betätigung von
Membranventilen und/oder eine Membranpumpe. Vorzugsweise sind Deckfolien oder Deckelmembranen oder andere Polymerschichten als seitliche äußere Abschlüsse des Systems vorgesehen. Eine Deckfolie kann darüber hinaus zur Einkopplung von Ultraschall genutzt werden. Insbesondere in Ausgestaltungen der Vorrichtung, die für eine Ultraschallbehandlung bei der Zelllyse eingerichtet sind, kann es vorgesehen sein, dass die Filterkammer eine Erweiterung zum Einbringen des Ultraschalls aufweist. Hierbei ist die Erweiterung, die
beispielsweise kreisförmig oder teilkreisförmig sein kann, zweckmäßigerweise als Durchbruch nach außen realisiert, der insbesondere mit einer Deckelmembran verschlossen sein kann. Diese Erweiterung der Filterkammer kann darüber hinaus die Funktion einer Belüftung für das System übernehmen, wobei
Belüftungskanäle vorgesehen sein können, die in die Erweiterung münden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung weist die erfindungsgemäße Vorrichtung wenigstens ein belüftetes Gefäß auf, mit dem Flüssigkeiten in das System eingebracht werden können. Insbesondere kann ein nach oben belüftetes Gefäß in den fluidischen Pfad bzw. in das Leitungssystem zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter eingebaut sein. Der Einbau eines belüfteten Gefäßes hat den Vorteil, dass hierdurch das
zunehmende Volumen der im Kreislauf befindlichen Flüssigkeiten aufgenommen und der Druck im Kreislauf konstant gehalten werden kann, wodurch eine mikrofluidische Realisierung in besonders vorteilhafter Weise möglich wird. Die Flüssigkeiten können z.B. per Hand, insbesondere per Pipette, oder durch Pumpen mit einer zweiten in das System integrierten Pumpe in das Gefäß eingebracht werden. Ein belüftetes Gefäß hat weiterhin den Vorteil, dass Luftblasen, die in den fluidischen Pfad gelangt sind, in dem Gefäß nach oben steigen und so das System verlassen können. So wird vermieden, dass
Luftblasen im Kreislauf verbleiben und zur Schaumbildung führen. Ein solches Gefäß kann beispielsweise als Röhrchen, Kammer oder als anderes fluidisches Element ausgeführt sein, das ein Volumen beispielsweise zwischen 100 μΙ und 10 ml aufweist. Mit besonderem Vorteil können darüber hinaus mehrere belüftete Gefäße in dem System vorgesehen sein, die vor allem als Verlagerungskammern für Reagenzien dienen können. Bei der Pumpe kann es sich beispielsweise um eine peristaltische Pumpe oder um eine Mikromembranpumpe handeln. Mit besonderem Vorteil ist die Pumpe mehr oder weniger unmittelbar dem Filter vor- oder nachgeschaltet, so dass die Flüssigkeiten mit sehr hohem Über- oder Unterdruck über den Filter gepumpt werden können. Zweckmäßigerweise ist das Kanalstück zwischen der Pumpe und dem Filter dabei verhältnismäßig kurz. Weiterhin kann es mit Vorteil vorgesehen sein, dass ein Einlasskanal für die Probenflüssigkeiten mehr oder weniger direkt vor der Pumpe oder dem Filter mündet. Dies hat den Vorteil, dass andere Verlagerungsgefäße für Pufferlösungen nicht durch die Probenflüssigkeit verunreinigt werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass mehrere
Einlasskanäle für verschiedene Flüssigkeiten vorgesehen sind.
Mit besonderem Vorteil können ein oder mehrere Elemente der Vorrichtung beheizbar sein. Beispielsweise können die Pumpe und/oder das Leitungssystem oder Teile davon und/oder der Filter und/oder gegebenenfalls ein Gefäß, das zur Vorlagerung oder zum Einbringen von Flüssigkeiten vorgesehen ist, beheizbar sein. Auf diese Weise können einzelne Verfahrensschritte temperiert
durchgeführt werden. Beispielsweise kann der Lyseschritt bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden, indem der Lysepuffer vorgewärmt wird und/oder der Filter selbst beheizt wird.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung als mikrofluidisches System ausgestaltet. Bezüglich der Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung in mikrofluidischer Ausgestaltung wird auf die oben bereits erwähnten Vorteile verwiesen. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können beispielsweise mit besonderem Vorteil in der molekularen Diagnostik und/oder beispielsweise in einem Lab-on-a-Chip-System umgesetzt werden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der
nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 schematische Darstellung des Prinzips der kreisförmigen
Fluidführung;
Fig. 2 schematische Darstellung der Komponenten einer beispielhaften
Ausführungsform einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 3 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften
Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 4 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften
Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 5 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften
Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 6 schematische Darstellung einer mehrschichtigen Filterkammer als
Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 7 mikrofluidische Vorrichtung gemäß der Erfindung in Aufsicht; Fig. 8 seitliche Ansicht des mehrschichtigen Aufbaus der mikrofluidischen
Vorrichtung aus Fig. 7;
Fig. 9 Schrägansicht der mikrofluidischen Vorrichtung aus Fig. 7;
Fig. 10/11 Detailansichten einer beispielhaften Filterkammer einer
erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in Seitenansicht (Fig. 10) und in Aufsicht (Fig. 11) und
Fig. 12/13 Detailansicht einer weiteren beispielhaften Filterkammer einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in Seitenansicht
(Fig. 12) und in Aufsicht (Fig. 13).
Beschreibung von Ausführungsbeispielen Die schematische Darstellung in Fig. 1 illustriert das Prinzip eines kreisförmigen fluidischen Pfades 11, der über einen Filter 10 verläuft. Die Flüssigkeit in den fluidischen Verbindungen 11 wird über eine Pumpe 12 angetrieben. Die fluidischen Verbindungen 11 können beispielsweise durch Schläuche oder Kanäle gebildet werden. Bei der Pumpe 12 handelt es sich um eine
Flüssigkeitspumpe, beispielsweise eine peristaltische Pumpe oder eine
Membranpumpe. Für eine mikrofluidische Ausgestaltung der Vorrichtung können übliche integrierbare mikrofluidische Pumpen eingesetzt werden. Der hier dargestellte Filter 10 ist in Form einer Filterkammer realisiert. Die im Folgenden beschriebene Darstellung eines Filters ist in vielen Fällen als Synonym für eine Filterkammer zu verstehen. Die Filterkammer kann als mikrofluidische
Komponente ausgestaltet sein. Die Art der An- und Abströmung am Filter 10 kann gegebenenfalls genau eingestellt werden. Die Filterkammer selbst kann beispielweise in einem mehrschichtigen Aufbau aus mehreren strukturierten Polymerschichten realisiert sein. Durch diese Bauweise ist eine besonders kostengünstige Fertigung möglich. Wenn die Pumpe 12 über Schläuche mit dem Ein- und Auslass der Filterkammer 10 verbunden ist, kann das Einspeisen in den fluidischen Pfad beispielsweise durch Öffnen der Schlauchverbindung und Pipettieren geschehen.
Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Variante für den schematischen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Neben dem Filter bzw. der Filterkammer 20 und der Pumpe 22 und den fluidischen Verbindungen 21 ist ein nach oben belüftetes Gefäß 24 in den fluidischen Pfad integriert. Über dieses Gefäß 24 können Flüssigkeiten in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingebracht werden. Die erforderlichen Lösungen oder Puffer können beispielsweise in das Gefäß 24 pipettiert werden. Hierdurch ist es in vorteilhafter Weise möglich, während des Prozesses Puffer oder andere Lösungen in den fluidischen Pfad einzuspeisen. Darüber hinaus bietet diese Ausgestaltung den Vorteil, dass Luftblasen, die in den fluidischen Pfad gelangt sind, in dem Gefäß 24 nach oben steigen und so das System verlassen können. Je nach Ausgestaltung der Anordnung kann das Volumen des Gefäßes 24 entsprechend gewählt werden, beispielsweise zwischen 100 μΙ und 10 ml. Das Gefäß 24 kann beispielsweise als Röhrchen oder als mikrofluidisches Element ausgeführt sein. Vorteilhafterweise befindet sich der Auslasskanal des Systems an der Unterseite des Gefäßes 24. Mit„Unterseite" ist hierbei der Teil des Gefäßes gemeint, der sich bzgl. der Gravitation an der tiefsten Stelle befindet. Dies hat den Vorteil, dass
Flüssigkeiten vollständig aus dem Gefäß entnommen werden können.
Vorteilhafterhafterweise ist das Gefäß 24 dabei so ausgestaltet, dass es sich nach unten hin verjüngt.
Fig. 3 zeigt eine weitere Variante der Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens. Diese Ausgestaltung ist insbesondere als mikrofluidisches System geeignet. Allgemein hat ein mikrofluidisches System den Vorteil, dass das Totvolumen des Aufbaus sehr gering gehalten werden kann und die Gefahr der Schaumbildung gering ist. Die kreisförmige Fluidführung in den fluidischen Verbindungen 31 wird durch die Pumpe 32 angetrieben. Stromaufwärts der Pumpe befindet sich die Filterkammer 30. Weiterhin ist ein Gefäß 34
vorgesehen, das über eine Öffnung bzw. einen Entlüftungskanal 35 entlüftet werden kann. Die Öffnung bzw. der Entlüftungskanal 35 befindet sich vorteilhafterweise am bzgl. der Gravitation oberen Ende des Gefäßes. Hierdurch kann ein unbeabsichtigtes Auslaufen von Reagenzien vermieden werden.
Stromaufwärts des Gefäßes 34 ist ein Einlasskanal 36 vorgesehen, wobei der Einlasskanal 36 auch direkt in das Gefäß 34 münden kann. Weiterhin können auch mehrere Einlasskanäle 36 vorhanden sein. Stromabwärts der Pumpe befindet sich ein Auslasskanal 37. Der Fluss der Flüssigkeiten wird über die integrierten Ventile 38 gesteuert, die an verschiedenen Stellen im System angeordnet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dreh- oder
Membranventile handeln.
Bei Verwendung einer solchen Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt werden: Die Probe, also die Flüssigkeit mit den biologischen Zellen, wird über den Einlasskanal 36 oder durch Einleiten (z. B. Pipettieren) durch die Öffnung 35 in das Gefäß 34 eingebracht. Das Gefäß 34 kann beispielsweise als mikrofluidische Kavität ausgeführt sein. Die im Gefäß 34 enthaltene Luft wird dabei über die Öffnung oder den Entlüftungskanal 35 freigesetzt, so dass das Gefäß 34 entlüftet wird. Die Pumpe 32 pumpt anschließend die Probe über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37. Es kann vorgesehen sein, dass der Entlüftungskanal 35 verschlossen wird, sodass die Pumpe 32 die Probe direkt über den Einlasskanal 36 ansaugen kann. Die in der Probe enthaltenen Zellen sammeln bzw. akkumulieren sich an dem Filter 30. Anschließend werden die Zellen aufgeschlossen, indem sie beispielsweise mit einem geeigneten Lysepuffer behandelt werden. Der Lysepuffer wird zunächst in das Gefäß 34 eingebracht, beispielsweise über den Einlasskanal 36.
Anschließend wird der Lysepuffer von der Pumpe 32 über den kreisförmigen fluidischen Pfad 31 im Kreislauf über den Filter 30 gepumpt. Alternativ hierzu kann der Zellaufschluss auch auf andere Weise, beispielsweise mit Ultraschall, erfolgen. In diesem Fall wird der Filter 30 entsprechend beschallt. Anschließend erfolgt ein Bindeschritt, in dem die Zielmoleküle am Filter 30 adsorbieren. Hierfür wird geeigneter Bindepuffer in das Gefäß 34 eingebracht und im Kreis 31 gepumpt. Für den nachfolgenden Waschschritt wird zunächst der Waschpuffer in das Gefäß 34 eingebracht und mit der Pumpe 32 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37 gepumpt. Wenn eine Trocknung des Filters 30 vorgesehen ist, wird beispielsweise Luft oder Stickstoff vom Einlasskanal 36 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37 gepumpt. Es ist auch möglich, die Pumpe 32 für die Trocknung zu verwenden. Abschließend kann ein Elutionsschritt erfolgen, wobei geeigneter Elutionspuffer in das Gefäß 34 eingebracht und von der Pumpe 32 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals gepumpt wird.
Allgemein kann das Einbringen der Probe und der Puffer in das Gefäß 34 beispielsweise mittels einer weiteren Pumpe oder manuell durch Pipettieren oder Ähnliches erfolgen. Hierfür kann eine wiederverschließbare Öffnung im Gefäß 34 vorgesehen sein.
Fig. 4 zeigt eine weitere Variante des Systems, wobei zusätzlich zum Gefäß 34 ein oder mehrere weitere Gefäße 44, beispielsweise Vorlagerungsgefäße, vorgesehen sind. Auch diese Gefäße 44 sind mit einer Öffnung oder einem Entlüftungskanal 45 ausgestattet. Der Inhalt des Gefäßes 44 kann über ein weiteres Ventil 48 in das übrige Leitungssystem eingebracht werden. Im Übrigen entspricht das System im Wesentlichen der in Fig. 3 dargestellten Vorrichtung. Die entsprechenden Elemente sind daher mit den gleichen Bezugszeichen versehen. Zwischen dem Gefäß 34 und der Zuleitung aus dem weiteren Gefäß 44 ist ein weiteres Ventil 49 vorgesehen. In dem oder den Gefäßen 44 können verschiedene Puffer, z.B. der Lyse-, Verdau-, Denaturierungs-, Binde-, Waschoder Elutionspuffer, vorgelagert werden. Diese Variante hat den Vorteil, dass eine automatische Durchführung vereinfacht wird, da die Puffer nicht mehr einzeln in das Gefäß 34 eingebracht werden müssen. Das Verfahren kann so durchgeführt werden, dass insbesondere die Probe manuell in das Gefäß 34 eingebracht wird, bevor der Filter 30 damit beaufschlagt wird. Die verschiedenen benötigten Puffer in den darauffolgenden Prozessschritten können automatisiert aus dem oder den Gefäßen 44 eingeleitet werden.
Fig. 5 illustriert ein weiteres bevorzugtes Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die beispielsweise in einem mikrofluidischen System realisiert werden kann. Bei diesem System ist die Pumpe 52 stromaufwärts der Filterkammer 50 angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass Flüssigkeiten mit sehr hohem Druck über den Filter 50 gepumpt werden können. Hierfür ist es besonders vorteilhaft, wenn das Kanalstück oder das Schlauchstück zwischen der Pumpe 52 und dem Filter 50 verhältnismäßig kurz ist. Der Einlasskanal 56 mündet unmittelbar vor der Pumpe 52. Dies hat den Vorteil, dass die aus dem Einlasskanal 56 über den Filter 50 gepumpten
Flüssigkeiten, insbesondere die Probe mit dem Zellmaterial, nicht das
Vorlagerungsgefäß 54 passieren, sodass Kontaminationen vermieden werden. Vorteilhafterweise kann das System teilweise oder abschnittsweise beheizt werden, beispielsweise kann der Filter 50 und/oder die Pumpe 52 und/oder das Gefäß 54 beheizt werden. Ein Beheizen kann zweckmäßigerweise während des Lyseschrittes erfolgen, sodass der Zellaufschluss noch effizienter ablaufen kann. Zweckmäßigerweise kann eine optimale Temperatur für die eingesetzten Lyseenzyme eingestellt werden, die beispielsweise in einem Temperaturbereich zwischen 35 und 55° Celsius liegen kann, beispielsweise bei 45° Celsius. Die Prozessführung bei dem Lyseschritt erfolgt vorzugsweise in Kreisform über den kreisförmigen fluidischen Pfad 51, vergleichbar mit den anderen beschriebenen Ausführungsbeispielen. Als Variante können weitere Einlasskanäle vorhanden sein, über die die benötigten Reagenzien in das System gepumpt werden können. Das oder die Gefäße 54 haben beispielsweise ein Volumen von 2 ml und der Filter hat beispielsweise einen Durchmesser zwischen 2 und 10 mm. Eine Steuerung des Fluidflusses erfolgt über die Ventile 58. Die Flüssigkeiten können das System über den Auslasskanal 57 verlassen.
Eine Versuchsdurchführung zur Akkumulation und Lyse von Zellen und einer DNA- Reinigung in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System kann beispielsweise folgendermaßen durchgeführt werden: 105 Staphylokokken in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung werden durch Pumpen über den Einlasskanal 56 oder durch Pipettieren in das Gefäß 54 in das System eingebracht und mit der Pumpe 52 über den Filter 50 gepumpt. Zur Lyse werden 100 μΙ Lysepuffer in das Gefäß 54 pipettiert und mit der Pumpe 52 für 10 Minuten bei gleichzeitiger
Temperierung auf 45° Celsius über den Filter 50 und das Kanalsystem 51 im Kreis gepumpt. Im Anschluss werden sukzessive ein Verdaupuffer und ein Bindepuffer in das Gefäß 54 pipettiert und ebenfalls zirkuliert. Dies hat den Vorteil, dass eine sehr gute Durchmischung der Reagenzien erfolgt und
Nukleinsäuren effektiv an den Filter 50 gebunden werden. Der Filter 50 wird anschließend gewaschen, indem ein Waschpuffer in das Gefäß pipettiert und über den Filter 50 in den Auslasskanal 57 gepumpt wird. Die gebundene DNA wird mit Wasser eluiert, indem Wasser in das Gefäß 54 pipettiert und über den Filter 50 in den Auslasskanal 57 gepumpt wird. Das Eluat wird aufgefangen. Parallel dazu wird eine Referenz prozessiert: 105 Staphylokokken in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung werden durch Zentrifugation bei 13 000 g akkumuliert und der Überstand wird abpipettiert. 100 μΙ Lysepuffer werden hinzupipettiert, durchmischt und für 10 Min. bei 45 °C inkubiert. Das entstandene Lysat wird sukzessive mit Verdaupuffer und Bindepuffer gemischt und auf eine handelsübliche Säule aufgebracht. Im Anschluss wird die Säule mit Waschpuffer gewaschen und die DNA mit 100 μΙ Wasser eluiert. Eine Analyse der Proben erfolgt mittels einer quantitativen PCR. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vergleichbare Ergebnisse wie bei der Referenz erzielt werden können, wobei bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine erhebliche Arbeitsersparnis durch die Möglichkeiten der einfachen
Automatisierung erreicht werden kann.
Fig. 6 zeigt einen Schnitt durch eine beispielhafte mikrofluidische Filterkammer 60 auf der Basis eines Mehrschichtaufbaus. Zwei strukturierte Polymerplatten 61, eine dazwischen liegende Polymermembran 62 und außen aufliegende
Deckelfolien 63 bilden den Mehrschichtaufbau. Der Filter 64 ist in einer
Vertiefung einer der Polymerplatten 61 eingelegt. Die Flüssigkeitszufuhr und die Flüssigkeitsabfuhr erfolgen über den Einlasskanal 65 und den Auslasskanal 66. Die dem Filter 64 vorgeschaltete Membran 62 kann zusätzliche Funktionalitäten, beispielsweise eine Ventilfunktion, ausüben. Dieser Aufbau ist insbesondere für mikrofluidische Ausgestaltungen geeignet.
Die Fig. 7 bis 9 zeigen eine beispielhafte Ausführung eines mikrofluidischen Systems 700 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 7 zeigt eine Aufsicht von vorne, Fig. 8 eine Seitenansicht und Fig. 9 eine Schrägansicht von vorne. Das mikrofluidische System ist als Mehrschichtaufbau aus zwei strukturierten Polymerplatten 750 und 760 (Fig. 8) und rechts und links angeordneten Deckelfolien oder anderen Polymerschichten (nicht dargestellt) zur Abdeckung der Strukturen realisiert. Das System umfasst eine Pumpe 702, ein Gefäß 704 mit einer Belüftungsöffnung 724 und eine Filtereinrichtung 710 sowie mehrere Ventile 708, 718, 728. Die Fluidführung erfolgt in Pfeilrichtung (Fig. 7, Fig. 9), wobei die Fließrichtung auch umgekehrt werden kann. Die
Filtereinrichtung 710 wird von einer Vertiefung 713 (Filterkammer) in der
Polymerplatte 750, einer Fritte 711 zur mechanischen Stützung des Filters und dem eigentlichen Filter 712 gebildet (Fig. 8). An den Außenseiten des Systems verlaufen Kanäle 701, die durch Deckelfolien oder weitere Polymerschichten (nicht dargestellt) gedeckelt werden. Die Ventile 708, 718, 728 sind als mikrofluidische Membranventile ausgeführt. Die Pumpe 702 ist als
mikrofluidische Membranpumpe mit einer Pumpkammer und einem Einlassventil 708 und zwei Auslassventilen 718, 728 ausgeführt und liegt stromabwärts der Filtereinrichtung 710. Die Auslassventile 718, 728 bilden eine T- Kreuzung und erlauben eine Umschaltung des Fluidpfads zwischen dem Kreislauf 701 (Ventil 728) und dem Auslasskanal 707 (Ventil 718). Zwischen den Polymerplatten 750 und 760 befindet sich eine nicht dargestellte Polymermembran, die für eine pneumatische Betätigung der Ventile und der Pumpe genutzt wird. Das Gefäß 704 ist so geformt, dass auch kleinste Flüssigkeitsmengen an der untersten Stelle des Gefäßes zusammenlaufen und von dort in das Kanalsystem 701 eintreten können. Das Gefäß 704 weist dazu eine Verjüngung nach unten hin auf.
Das dargestellte System 700 kann Teil eines größeren mikrofluidischen Systems sein, das weitere Funktionalitäten beinhaltet, z.B. weitere Pumpen und
Mischkammern, Kammern zur Vorlagerung von Reagenzien, Kammern zur weiteren Prozessierung der biologischen Molekülen, z.B. zur Amplifikation der gewonnenen Nukleinsäuren, beispielsweise mittels PCR, und Komponenten zur Detektion von biologischen Molekülen, z.B. von Nukleinsäuren.
Bei Verwendung der mikrofluidischen Vorrichtung 700 kann das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt werden: Die Probe wird zunächst in das belüftete Gefäß 704 eingebracht, z.B. durch Pipettieren und Pumpen, und
anschließend von unten über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Dann wird Lysepuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und während der Lyse mit der Pumpe 702 über die Filtereinrichtung 710 zirkuliert. Alternativ kann der Lysepuffer auch nur kurz zirkuliert werden, um die Filterkammer 713 sicher mit Flüssigkeit zu befüllen, woraufhin dann z.B. Hitze oder Ultraschall an den Filter 712 appliziert wird. Im Anschluss wird ein Bindepuffer in das belüftete Gefäß 704 gegeben und mit der Pumpe 702 über die Filtereinrichtung 710 zirkuliert. Dabei kommt es zur Vermischung von Lysat und Bindepuffer und Nukleinsäuren (als Beispiel für aufzureinigende Moleküle) binden an den Filter 712. Das Gemisch wird anschließend in den Auslasskanal 707 gepumpt. Anschließend wird ein Waschpuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Schließlich wird ein Elutionspuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Alternativ kann der Elutionspuffer auch über den Auslasskanal 707 angesaugt und in umgekehrter Richtung über die Filtereinrichtung 710 in das belüftete Gefäß 704 gepumpt werden.
In einer Variante dieses Verfahrens können zunächst in der Probe vorhandene humane Zellen selektiv lysiert werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann nach der Lyse ein Verdau von Proteinen durchgeführt werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann vor dem Binden der DNA ein Denaturierungsschritt durchgeführt werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann der Filter vor der Elution getrocknet werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann die Pumprichtung zwischendurch kurz, z.B. für 5 bis 60 s, umgekehrt werden.
Fig. 10 zeigt eine Seitenansicht und Fig. 11 eine Aufsicht einer beispielhaften
Ausführungsform einer Filterkammer 813 für mikrofluidische Vorrichtungen. In Fig. 10 ist der mehrschichtige Aufbau aus zwei Polymerplatten 850 und 860 erkennbar. Die kreisrunde Vertiefung 814 in der Polymerplatte 850 ist als Sackloch zum Einsetzen einer Filtermembran oder einer Filtermaterialschüttung und gegebenenfalls einer Fritte vorgesehen. Unmittelbar oberhalb des einzusetzenden Filters ist eine kreisförmige Erweiterung 815 vorgesehen. In der anderen Polymerplatte 860 ist ein kreisförmiger Durchbruch 816 vorgesehen, der im montierten Zustand durch eine Deckelmembran (nicht dargestellt) abgedeckt ist. Über den Kanal 817 kann eine Zufuhr oder Abfuhr von Flüssigkeiten erfolgen. Der kreisförmige Durchbruch 816 kann beispielsweise einen Durchmesser zwischen 5 und 50 mm aufweisen und kann in etwa konzentrisch zum Filter angeordnet sein, aber auch - insbesondere bzgl. der Gravitationsrichtung nach oben - verschoben sein, z.B. um die Differenz der Radien von Filter und kreisförmigem Bereich. Durch den Durchbruch 816 und die Erweiterung 815 kann mittels einer Sonotrode Ultraschall in das Innere der Filterkammer 813 eingetragen werden, wodurch eine Ultraschall-Lyse durchgeführt werden kann. Diese Variante weist den Vorteil auf, dass eine besonders effiziente Ultraschall-Lyse möglich ist. Alternativ kann der zum Einbringen von Ultraschall vorgesehene Bereich auch oval, quadratisch oder länglich sein mit vergleichbaren Abmessungen. Weiterhin hat diese Variante den Vorteil, dass die Erweiterung 815 der Filterkammer 813 gleichzeitig die Funktion erfüllen kann, dass Luftblasen in der Erweiterung nach oben aufsteigen und somit aus dem Flüssigkeitskreislauf eliminiert werden und dass ein während der Prozessierung ansteigendes Flüssigkeitsvolumen aufgenommen wird, und damit gegebenenfalls ein anderes Gefäß des Systems ersetzen kann. Zu diesem Zweck kann ein zusätzlicher Entlüftungskanal 819 vorgesehen sein. Hierbei ist es zweckmäßig, wenn die
Erweiterung beispielsweise ein Volumen zwischen 500 μΙ und 5 ml aufweist. Hierfür kann eine zusätzliche Erweiterung 818 vorgesehen sein. Als Filter können hier z.B. Silicamembranen, aber auch Schüttungen von Mikropartikeln zum Einsatz kommen. In einer Variante erstreckt sich der Filter bzw. die Schüttung von Mikropartikeln in die Erweiterung 815 und den Durchbruch 816 hinein, so dass auf dieser Seite Kontakt mit der Deckelmembran besteht. Dies hat den Vorteil, dass beim Einkoppeln von Ultraschall in die Deckel memb ran der Filter bzw. die Schüttung von Mikropartikeln besonders effizient in Schwingung versetzt wird, wodurch die Lyse von akkumulierten Zellen mit größerer Ausbeute stattfinden kann.
Fig. 12 und Fig. 13 zeigen eine weitere Ausführungsform für eine Filterkammer 913, die vergleichbar mit der Filterkammer 813 eine sacklochförmige Vertiefung 914 in der Polymerplatte 950 für die Aufnahme eines Filters oder einer Filtermaterialschüttung und gegebenenfalls einer Fritte aufweist. Über den Kanal 919 kann eine
Flüssigkeitszufuhr oder -abfuhr erfolgen. In der Polymerplatte 950 ist eine teilkreisförmige Erweiterung 915 des Sacklochs 914 vorgesehen. Die andere
Polymerplatte 960 weist in diesen Bereichen einen Durchbruch 916 auf, der im montierten Zustand die Verbindung zwischen dem Sackloch 914 und der Erweiterung 915 herstellt und der mit einer Deckelmembran (nicht dargestellt) abgedeckt ist. Die Erweiterung 915 und der Durchbruch 916 sind vergleichbar mit der Ausführungsform 813 ebenfalls für eine Einkopplung von Ultraschall geeignet.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von
Nukleinsäuren oder Proteinen, unter Verwendung wenigstens eines Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einige der für eine Prozessführung erforderlichen Flüssigkeiten in einem Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt werden, wobei zumindest die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt werden:
- Flüssigkeit mit biologischen Zellen wird über einen Filter (10; 20; 30; 50; 64;
710) gepumpt,
- die an dem Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) zurückgehaltenen Zellen werden aufgeschlossen,
- Bindepuffer zur Bindung der biologischen Moleküle an den Filter wird im Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt,
- Waschpuffer zur Reinigung der an den Filter gebundenen biologischen Moleküle wird über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufschluss der Zellen Lysepuffer im Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt wird oder dass die Zellen mechanisch aufgeschlossen werden, insbesondere durch eine Ultraschallbehandlung.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Behandlung mit Bindepuffer ein Denaturierungsschritt durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Behandlung mit Bindepuffer ein zusätzlicher Verdauschritt
durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Behandlung mit Waschpuffer der Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) getrocknet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Pumpen der Flüssigkeit mit den biologischen Zellen über den Filter eine Vorbehandlung der Flüssigkeit erfolgt, wobei vorzugsweise in der Flüssigkeit vorhandene humane Zellen selektiv lysiert werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einige der Verfahrensschritte unter Wärmezufuhr erfolgen, insbesondere der Zellaufschluss und/oder der gegebenenfalls durchgeführte Verdauschritt und/oder das gegebenenfalls vorgesehene Trocknen des Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710).
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumprichtung bei einem oder mehreren der Verfahrensschritte ein- oder mehrfach umgekehrt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einer mikrofluidischen Vorrichtung (700) durchgeführt wird.
10. Vorrichtung zur Durchführung einer Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, mit wenigstens einer Pumpe (12; 22; 32; 52; 702) zum Pumpen von Flüssigkeiten und wenigstens einer Einrichtung zur Fixierung wenigstens eines Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710), dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Leitungssystem (11; 21; 31; 51; 701) zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter umfasst.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Fixierung des Filters (64; 712) eine Filterkammer (60; 713; 813; 913) ist, die vorzugsweise einen mehrschichtigen Aufbau aufweist, wobei die Filterkammer (60; 713; 813; 913) zum Einsetzen insbesondere einer Filtermembran (64) oder eines anderen Filtermaterials, insbesondere einer Partikelschüttung, eingerichtet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterkammer (813; 913) eine Erweiterung (815; 915) zur Einkopplung von Ultraschall aufweist, wobei vorzugsweise die Erweiterung einen mit einer Deckelmembran
verschlossener Durchbruch (816; 916) umfasst.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche Anspruch 10 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, dass die Vorrichtung wenigstens ein belüftetes Gefäß (24; 34; 44; 704) zum Einbringen von Flüssigkeiten in das System umfasst.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) und/oder die Pumpe (12; 22; 32; 52; 702) und/oder das gegebenenfalls vorgesehene Gefäß (24; 34; 44; 704) und/oder das Leitungssystem (11; 21; 31; 51; 701) beheizbar sind.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung als mikrofluidisches System (700) ausgestaltet ist.
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