DE102014207774A1

DE102014207774A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen

Info

Publication number: DE102014207774A1
Application number: DE102014207774.5A
Authority: DE
Inventors: Bernd Faltin; Christian Dorrer
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2015-10-29
Anticipated expiration: 2034-04-26
Also published as: US20170044483A1; EP3134505A1; KR20160145610A; WO2015162059A1; JP2017515500A; DE102014207774B4; CN106232799A

Abstract

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, wird wenigstens ein Filter (50) eingesetzt. Zumindest einige der für die Prozessführung erforderlichen Flüssigkeiten werden in einem Kreislauf (51) über den Filter (50) gepumpt. Hierbei wird zunächst eine Flüssigkeit mit biologischen Zellen über den Filter (50) gepumpt. Die an dem Filter zurückgehaltenen Zellen werden aufgeschlossen. Zur Bindung der biologischen Moleküle an den Filter wird Bindepuffer im Kreislauf (51) über den Filter (50) gepumpt. Ein Waschpuffer zur Reinigung der an den Filter gebundenen biologischen Moleküle wird über den Filter (50) gepumpt, so dass die an den Filter gebundenen biologischen Moleküle für eine weitere Verwendung zur Verfügung stehen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, wobei bei dem Verfahren wenigstens ein Filter verwendet wird.
Stand der Technik
Für die Aufreinigung von biologischen Molekülen und insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen existieren viele verschiedene Methoden. In der Regel werden die biologischen Moleküle aus Zellmaterial gewonnen, also aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen. Bevor intrazelluläres Material weiter bearbeitet werden kann, ist es in der Regel erforderlich, die Zellen selbst aufzuschließen. Dieser Zellaufschluss wird allgemein auch als Zelllyse bezeichnet. Nach Abtrennung der Zelltrümmer können beispielsweise Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide weiter aufgereinigt, bearbeitet und analysiert werden. Wenn im Folgenden von Proteinen die Rede ist, sind hiermit auch Peptide gemeint. Um beispielsweise eine bestimmte Nukleinsäure nachweisen zu können, können die aufgereinigten Nukleinsäuren mit einer PCR (Polymerase Chain Reaction) selektiv amplifiziert werden, so dass die bestimmte Nukleinsäuresequenz nachweisbar gemacht wird.
Der Aufschluss der Zellen kann auf verschiedene Weise erfolgen. Verbreitet ist ein enzymatischer Aufschluss der Zellen, wobei beispielsweise eine Behandlung mit dem Enzymen Proteinase K oder Lysozym durchgeführt wird. Auch ein thermischer Zellaufschluss durch Erhitzen und/oder Einfrieren der Probe oder ein Zellaufschluss mit chemischen Reagenzien ist möglich. Weiterhin kann der Zellaufschluss mechanisch erfolgen, beispielsweise durch eine Ultraschallbehandlung. Ein übliches Verfahren zur weiteren Aufreinigung von beispielsweise Nukleinsäuren sieht vor, dass das durch den Zellaufschluss entstehende sogenannte Lysat mit einem Bindepuffer versetzt wird und mit einer festen Matrix, beispielsweise einem Silica-Filter bzw. einer Silica-Membran, in Kontakt gebracht wird. Hierbei adsorbieren die Nukleinsäuren an den Filter und können anschließend mit einem Waschpuffer gewaschen und danach von der festen Matrix eluiert und weiter verwendet werden. Nach diesem Prinzip funktionieren verschiedene käuflich erwerbbare Kits und Laborgeräte.
Oftmals ist es erforderlich, das Zellmaterial vor der weiteren Behandlung aufzukonzentrieren bzw. die Zellen zu akkumulieren. Hierfür kann beispielsweise eine Zentrifugation der Probe mit den Zellen durchgeführt werden. Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2005 009 479 A1 beschreibt ein Verfahren, bei dem die Zellen mittels einer Filtration akkumuliert werden. Mit einer solchen Filtermembranmethode ist es beispielsweise auch möglich, die akkumulierten Zellen, beispielsweise Bakterien, zu quantifizieren, wie es in der Veröffentlichung von Dufour, Alfred P., et al. (Applied and Environmental Microbiology, May 1981, Seiten 1152–1158) beschrieben ist.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2010 030 962 A1 beschreibt ein Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren in einem Microarray, bei dem die Probe zunächst durch eine Denaturierungseinheit und anschließend durch einen separaten Reaktionsbereich mit dem Microarray mit den immobilisierten Sonden gepumpt wird. Hierbei kann die Pumpstrecke als Kreislauf ausgestaltet sein.
Die deutsche Offenlegungsschrift DE 10 2010 043 015 A1 offenbart ein Verfahren, mit dem Nukleinsäuren auf einem Filter amplifiziert, d.h. vervielfältigt, werden. Vorab können eine Aufkonzentrierung und eine Lyse der die Nukleinsäuren enthaltenden Zellen auf dem Filter erfolgen.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können biologische Moleküle, insbesondere Nukleinsäuren oder Proteine oder andere biologische Moleküle, aufkonzentriert und aufgereinigt werden. Die Aufreinigung erfolgt im Prinzip durch eine unspezifische Adsorption der biologischen Moleküle an eine Matrix, insbesondere an eine Membran. Nachfolgend wird allgemein von einem Filter gesprochen, wobei hiermit die Matrix insbesondere in Form einer Membran oder beispielsweise in Form einer Schüttung gemeint ist. Der Kern der Erfindung ist dabei, dass zumindest einige der für die Prozessführung erforderlichen Flüssigkeiten in einem Kreislauf über den Filter gepumpt werden. Die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen im Einzelnen zunächst das Pumpen einer Flüssigkeit mit biologischen Zellen, also einer Probenflüssigkeit, über den Filter. Unter dem Begriff „biologische Zellen“ sind allgemein Zellen zu verstehen, aus denen biologische Moleküle, wie beispielsweise Nukleinsäuren oder Proteine, aufbereitet bzw. aufgereinigt werden sollen. Es kann sich hierbei beispielsweise um pathogene Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilze handeln. Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber auch für Humanzellen oder andere Zellen geeignet und kann allgemein für die Aufreinigung von Proteinen oder Nukleinsäuren aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen verwendet werden. Unter dem Begriff „Probenflüssigkeit“ ist allgemein die Flüssigkeit zu verstehen, die die entsprechenden Zellen enthält, beispielsweise eine Zellsuspension oder eine Patientenprobe, beispielsweise Blut, Lavage, Urin, Liquor, Sputum oder ein ausgespülter Swab oder Abstrich. Je nach Anwendung kann das Volumen der Probe unterschiedlich sein, beispielsweise zwischen einigen µl bis 10 ml. Nach dem Probenauftrag werden die an dem Filter zurückgehaltenen Zellen aufgeschlossen, wobei für den Zellaufschluss im Prinzip verschiedene Methoden eingesetzt werden können. Die im Zelllysat enthaltenen biologischen Moleküle werden mittels eines Bindepuffers an den Filter gebunden, wobei der Bindepuffer im Kreislauf über den Filter gepumpt wird. Die an den Filter gebundenen biologischen Moleküle werden im anschließenden Schritt mit Waschpuffer gereinigt, der über den Filter gepumpt wird. Im Ergebnis befinden sich dann die aufzureinigenden biologischen Moleküle in reversibel immobilisierter Form am Filter. Für die weitere Verarbeitung oder Analyse können die gebundenen biologischen Moleküle in üblicher Weise von dem Filter eluiert werden oder der Filter mit den reversibel immobilisierten biologischen Molekülen wird als solcher direkt weiter verwendet.
In bisher bekannten Verfahren erfolgt die Akkumulation von Zellen aus einer Probe durch Zentrifugation. Eine Umsetzung dieses Verfahrens in einem mikrofluidischen System und damit eine kostengünstige Automatisierung ist jedoch nicht möglich. Auch sind Verfahren bekannt, bei denen die Akkumulation der Zellen aus einer Probe durch Spülen über einen Filter erfolgt, wobei die Lyse dann durch Aufgeben eines Lysepuffers auf den Filter stattfindet. Diese Verfahren bieten jedoch für die Integration in ein mikrofluidisches System den Nachteil, dass die genaue Positionierung des Lysepuffers auf dem Filter schwierig bzw. mit großem Aufwand verbunden ist. Diese muss manuell erfolgen oder es werden z.B. Kameras oder Lichtschranken benötigt. Weiterhin besteht die Gefahr, beim Aufgeben des Lysepuffers auf den Filter Zellen und bereits freigesetzte Nukleinsäuren vom Filter zu verdrängen, die dann für die weitere Aufreinigung nicht mehr zur Verfügung stehen und somit die Effizienz der Aufreinigung herabsetzen. Weiterhin ist bei diesen Verfahren die Diffusion von Lysereagenzien, z.B. Enzymen, auf dem Filter erschwert, was die Effektivität der Lyse herabsetzt, insbesondere bei schwer zu lysierenden Zellen, z.B. Pilzen. Die Erfindung löst diese Probleme und ermöglicht dadurch die einfache Realisierung des beschriebenen Verfahrens in einem automatisierten mikrofluidischen System (Lab-on-Chip-System).
Die besondere Effektivität des erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahrens wird dadurch erreicht, dass durch die Kreisführung der Flüssigkeiten, insbesondere während des Bindevorgangs der biologischen Moleküle an den Filter, die Substanzen mehrfach durch den Filter gespült werden. Durch diese Führung der Flüssigkeiten in einem kreisförmigen fluidischen Pfad wird das Filtermaterial mehrfach mit den Flüssigkeiten in Kontakt gebracht. Dabei stellt sich ein Sättigungsgleichgewicht ein, bei dem die maximale Bindekapazität der Membran ausgeschöpft wird. Bei herkömmlichen Verfahren ist es oftmals der Fall, dass nur ein Teil der interessierenden Moleküle tatsächlich adsorbiert wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die kreisförmige Fluidführung sichergestellt, dass beispielsweise sämtliche Nukleinsäuren, die während des Zellaufschlusses freigesetzt wurden, im Bindeschritt effektiv über den Filter gepumpt werden. Es gehen gewissermaßen keine Nukleinsäuren verloren, sodass die Ausbeute erhöht wird. Durch das kreislaufförmige Pumpen wird darüber hinaus gewährleistet, dass eine optimale Mischung der Reagenzien, also beispielsweise des Bindepuffers und des Zelllysats, stattfindet. Das Mischen von Reagenzien stellt insbesondere in mikrofluidischen Systemen oftmals ein Problem dar. Durch die erfindungsgemäß vorgesehene kreisförmige Fluidführung wird eine gute Durchmischung der verschiedenen Reagenzien und Puffer erreicht, wodurch sich das erfindungsgemäße Verfahren in besonders vorteilhafter Weise für eine Realisierung innerhalb eines mikrofluidischen Systems eignet. Davon unabhängig kann die Mischeffizienz insbesondere in einem mikrofluidischen System auch noch durch weitere Maßnahmen, insbesondere durch an sich bekannte Mischerstrukturen oder Mischkammern, in einem mikrofluidischen System erhöht werden.
In dem ersten Verfahrensschritt erfolgt eine Akkumulation der biologischen Zellen, wobei die Zellen am Filter nach dem Größenausschlussverfahren und/oder durch elektrostatische Interaktionen zurückgehalten werden, wenn die Probenflüssigkeit über den Filter gepumpt wird. Umso mehr Probenflüssigkeit über den Filter gepumpt wird, umso höher ist die Anzahl der akkumulierten Zellen. Je nach Dimension der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der Durchmesser eines solchen an sich bekannten Filters unterschiedlich sein, beispielsweise zwischen 1 und 25 mm. Als Filter eignen sich beispielsweise Faserfilter, Gewebefilter und/oder Membranfilter, insbesondere aus Silika. Weiterhin eignen sich auch Partikelschüttungen, insbesondere Mikropartikelschüttungen, z.B. aus Silikapartikeln. Der Porendurchmesser der Materialien liegt vorzugsweise unterhalb von 100 µm.
Bei dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf dem Filter kann es vorgesehen sein, dass die Probe kreisförmig mehrfach über den Filter gepumpt wird. Dies hat den Vorteil, dass auch Zellen, die beim ersten Passieren des Filters möglicherweise nicht zurückgehalten wurden, bei einem erneuten Passieren des Filters zurückgehalten werden. Da auch elektrostatische Kräfte wirken und die Größenverteilung der Poren in einem Silikafilter im Allgemeinen nicht als homogen anzunehmen ist, kann es dazu kommen, dass Zellen bei einer ersten Passage nicht zurückgehalten werden. Darüber hinaus können sich Zellen in „Sackgassen“ des Systems verfangen, sodass durch eine Kreisführung beim Probenauftrag die Effektivität erhöht werden kann.
Der Aufschluss der Zellen kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise mechanisch oder durch Hitze. Mit Vorteil kann z.B. eine Ultraschallbehandlung vorgesehen sein, die mit verhältnismäßig geringem apparativem Aufwand durchgeführt werden kann. Hierbei sind keine zusätzlichen Reagenzien für die Lyse bzw. den Zellaufschluss erforderlich. Der Ultraschall kann direkt in den Filter eingetragen werden. Hierfür kann beispielsweise die Wandung einer entsprechenden Filterkammer als Membran ausgeführt sein, in die der Ultraschall mittels eines Horns eingekoppelt wird. Während der Ultraschallbehandlung sollte die Filterkammer mit Flüssigkeit bzw. mit einem Puffer oder Wasser befüllt sein. Die Ultraschallbehandlung kann dazu führen, dass das Filtermaterial teilweise zerlegt wird. Hierdurch werden zum einen die im Filter akkumulierten Zellen zumindest teilweise freigesetzt und der Lysewirkung durch den Ultraschall zugänglich gemacht. Zum anderen können die hierbei entstehenden Partikel eine zusätzliche mahlende Wirkung erzeugen und dadurch den Zellaufschluss weiter unterstützen, wobei die Partikel im weiteren Verlauf der Prozessierung von den intakten Bereichen des Filters wieder aufgefangen werden.
Besonders bevorzugt ist ein Zellaufschluss unter Verwendung von Enzymen oder anderen lysierenden Reagenzien, beispielsweise chemischen Reagenzien. Für diesen Zellaufschluss mit lysierenden Reagenzien kann mit besonderem Vorteil ebenfalls eine Kreislaufführung der Flüssigkeiten vorgesehen sein. Hierfür wird ein geeigneter Lysepuffer in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingespeist und im Kreis über den Filter gepumpt. Dabei wird insbesondere in der Richtung gepumpt, in der auch die Probe über den Filter gepumpt wurde. Hierdurch wird vermieden, dass es beim initialen Aufgeben des Lysepuffers auf den Filter zum Verlust von Zellen oder bereits freigesetzter Nukleinsäuren kommt. Weiterhin werden Luftblasen, die ggf. auf den Filter gelangen, im weiteren Verlauf wieder von diesem entfernt. Bei den bisher bekannten Verfahren verbleiben derartige Luftblasen auf dem Filter und unterbinden lokal die Lyse. Weiterhin wird durch die dabei kontinuierliche Heranführung von Lysepuffer auf die Zellen eine Verarmung der Lysereagenzien auf dem Filter vermieden und so eine besonders effektive und vollständige Lyse der Zellen auf dem Filter erreicht. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass bei Verwendung von Enzymen zur Lyse deren Aktivität durch das ständige Pumpen und die dabei entstehenden Scherkräfte nicht herabgesetzt wird, so dass auch eine enzymatische Lyse nach dem beschriebenen Schema mit Vorteil durchgeführt werden kann. Je nach Art der biologischen Zellen und der verwendeten Reagenzien kann die Lyse beispielsweise einen Zeitraum zwischen 2 und 30 Minuten erfordern. Unter einem Lysepuffer ist ein solcher Puffer zu verstehen, der zum Zellaufschluss bzw. zur Lyse der Zielzellen geeignet ist. Der Puffer kann beispielsweise an sich bekannte Lyseenzyme enthalten, wie beispielsweise Lysozym und/oder Proteinasen. Alternativ oder zusätzlich können chaotrope Salze, Detergenzien und/oder basische Inhaltsstoffe wie z.B. NaOH enthalten sein. Weiterhin können Puffersubstanzen (z.B. Tris-HCl), Nukleaseinhibitoren (z.B. EDTA oder EGTA) und/oder Reduktionsmittel (z.B. β-Mercaptoethanol) enthalten sein.
In dem nachfolgenden Bindeschritt wird der Bindepuffer in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingespeist und im Kreis gepumpt. Hierbei vermischt sich der Bindepuffer mit dem Lysat und beispielsweise die Nukleinsäuren binden unter den dabei eingestellten Bedingungen an den Filter.
Vor dem Bindeschritt kann vor allem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren ein weiterer Denaturierungsschritt durchgeführt werden. Ein hierfür geeigneter Puffer kann insbesondere chaotrope Reagenzien enthalten, beispielsweise GIT (Guanidiniumisothiocyanat). Durch derartige Reagenzien werden die im Lysat enthaltenen Proteine gewissermaßen "eingesalzen", so dass sich die Proteine leichter auswaschen lassen. Der Denaturierungspuffer wird vorzugsweise ebenfalls im Kreislauf gepumpt, um die Effektivität des Denaturierungsschrittes weiter zu erhöhen.
Vor dem Bindeschritt kann ein zusätzlicher Verdauschritt vor allem bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren durchgeführt werden. Ein geeigneter Verdaupuffer kann beispielsweise verschiedene Enzyme, insbesondere Proteinasen, enthalten, die einen Verdau der im Lyseschritt freigesetzten Proteine bewirken. Hierdurch kann die Effektivität einer Nukleinsäureaufreinigung und die Reinheit der gewonnenen Nukleinsäuren weiter verbessert werden. Für diesen Schritt wird der geeignete Verdaupuffer in den Pfad eingespeist und vorteilhafterweise ebenfalls im Kreis gepumpt. Auch hier hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Aktivität der für den Verdau verwendeten Enzyme durch das ständige Pumpen und die dabei entstehenden Scherkräfte nicht herabgesetzt wird.
Nach der Bindung der biologischen Moleküle an den Filter erfolgen ein oder mehrere Waschschritte, wobei Waschpuffer über den Filter geleitet wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Waschpuffern ist so gewählt, dass bei diesem Schritt beispielsweise die Nukleinsäuren an dem Filter gebunden bleiben, während andere Moleküle, insbesondere Proteine, nicht adsorbieren und entfernt werden. Als Waschpuffer kann beispielsweise ein alkoholhaltiger Waschpuffer, z.B. 70% EtOH, eingesetzt werden.
Für viele Anwendungen ist es vorteilhaft, wenn der Filter nach der Behandlung mit Waschpuffer getrocknet wird. Dies kann beispielsweise mittels Durchleiten von Luft oder Stickstoff über den Filter erfolgen. Anschließend kann eine Elution der adsorbierten Zielmoleküle von dem Filter erfolgen, wobei hierfür Wasser oder ein geeigneter Elutionspuffer eingesetzt werden kann. Es kann auch vorgesehen sein, dass der Filter mit den daran adsorbierten Zielmolekülen als solcher weiterverwendet wird. Beispielsweise kann eine PCR mit den auf dem Filter reversibel immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt werden, wie es an sich aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Bei der Verwendung von bestimmten Proben kann es vorteilhaft sein, die Probe vor dem Aufgeben auf den Filter vorzubehandeln. Beispielsweise kann bei der Filtration von Blut das Problem bestehen, dass sich der Filter mit Blutzellen zusetzt und somit verstopft, wodurch eine weitere Filtration unmöglich wird.
Hierfür hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Blutzellen zunächst selektiv zu lysieren. Mit „selektiv lysieren“ ist hier gemeint, dass die Blutzellen, die auch als humane Zellen bezeichnet werden, aufgeschlossen werden, während andere in der Probe enthaltene Zellen, insbesondere Pathogene, intakt bleiben. Dies kann z.B. durch die Behandlung der Probe mit chaotropen Reagenzien oder Detergenzien oder durch osmotischen Schock erfolgen und hat den Vorteil, dass ein Zusetzen des Filters vermieden wird. Ein kommerziell erhältliches Kit (Molzym MolYsis Complete 5) führt bei einer derartigen selektiven Lyse zusätzlich einen Verdau der freigesetzten humanen Nukleinsäuren mittels einer DNase durch. Ein solcher Verdau kann in das erfindungsgemäße Verfahren integriert werden und den Vorteil haben, dass die Filtrierbarkeit der Probe weiter verbessert und ein humaner Nukleinsäure-Hintergrund teilweise aus der Probe entfernt wird. Beispielsweise wird die Probe zunächst mit einem chaotropen Puffer vermischt und anschließend mit einer DNase inkubiert, z.B. für einen Zeitraum von 10 Min, bevor die Probe auf den Filter aufgetragen wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine oder mehrere der Verfahrensschritte zumindest teilweise unter Wärmezufuhr erfolgen. Insbesondere für den Zellaufschluss und/oder den zusätzlichen Verdauschritt und/oder für das Trocknen des Filters kann es vorteilhaft sein, die Temperatur zu erhöhen. Beispielsweise können die für einen enzymatischen Zellaufschluss eingesetzten Enzyme ein erhöhtes Temperaturoptimum aufweisen, so dass bei einer Erhöhung der Temperatur, beispielsweise auf Temperaturen zwischen 35 und 60° Celsius, insbesondere zwischen 35 und 45° Celsius, die Lyse der Zellen schneller und effektiver ablaufen kann. Entsprechendes gilt für einen Verdau- oder Denaturierungsschritt. Auch das Trocknen des Filters kann durch eine Erhöhung der Temperatur beschleunigt werden, beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung auf eine Temperatur zwischen 40 und 60°. Allgemein kann für die Wärmezufuhr insbesondere der Filter direkt beheizt werden, beispielsweise über ein an sich bekanntes Peltierelement oder einen Folienheizer, der mit der Einrichtung, die den Filter enthält, in Kontakt gebracht wird. Darüber hinaus ist es auch möglich, mit temperierten Flüssigkeiten zu arbeiten, beispielsweise kann es vorgesehen sein, ein Vorlagerungsgefäß für die eingesetzten Flüssigkeiten und/oder das Leitungssystem zumindest teilweise zu beheizen. Je nach Anwendung kann auch eine Kühlung oder allgemein eine Temperierung vorteilhaft sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Pumprichtung bei einem oder mehreren der Verfahrensschritte ein- oder mehrfach umgekehrt werden. Hierdurch kann insbesondere ein Verstopfens des Filters bzw. ein Zusetzen des Filters vermieden oder gegebenenfalls rückgängig gemacht werden. Weiterhin kann die Durchmischung von im Kreislauf befindlichen Flüssigkeiten verbessert werden und gegebenenfalls können ausgefallene Feststoffe wieder in Lösung gebracht werden. Durch die Umkehr der Pumprichtung nach erfolgter Bindung der Zielmoleküle an den Filter kommt es im Allgemeinen nicht zu einer Ablösung der Zielmoleküle vom Filter, da die Adsorption der Moleküle an den Filter von der Pumprichtung unabhängig ist. Eine Umkehr der Pumprichtung ist insbesondere während des Bindeschrittes und/oder während des Waschschrittes und/oder während des Elutionsschrittes vorteilhaft. Auch während des Probenauftrags bzw. während der Akkumulation der Zellen am Filter kann es vorteilhaft sein, die Pumprichtung wiederholt kurz umzukehren, um ein Zusetzen des Filters mit Zellen und damit ein Verstopfen zu vermeiden oder gegebenenfalls rückgängig zu machen.
Mit besonderem Vorteil wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer mikrofluidischen Vorrichtung durchgeführt. Im Allgemeinen haben mikrofluidische Vorrichtungen den Vorteil, dass sie sich in besonderer Weise für automatisierte Prozesse eignen. Durch eine Automatisierung werden Zeitdauer und Kosten der Analyse und die Gefahr von Kontaminationen verringert. Weiterhin muss ein automatisiertes System nicht notwendigerweise durch Fachpersonal bedient werden, da die Bedienung im Allgemeinen einfach erlernbar ist. Das erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenspiel mit einer mikrofluidischen Vorrichtung bietet den besonderen Vorteil, dass durch die Kreisführung der Flüssigkeiten eine besonders gute Durchmischung der Flüssigkeiten erreicht wird. Oftmals kann daher auf weitere Strukturen und aktive Komponenten wie Rührer für eine Durchmischung verzichtet werden. Dessen ungeachtet können jedoch auch zusätzliche an sich bekannte Mischerstrukturen oder Mischkammern in einer entsprechenden Vorrichtung vorgesehen sein, um die Mischeffizienz weiter zu erhöhen.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung einer Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen. Die Vorrichtung weist wenigstens eine Pumpe zum Pumpen von Flüssigkeiten auf. Darüber hinaus umfasst die Vorrichtung wenigstens eine Einrichtung zur Fixierung wenigstens eines Filters. Die hiermit durchführbaren Reinigungsprotokolle basieren darauf, dass die zur reinigenden biologischen Moleküle an dem Filter adsorbieren können. Erfindungsgemäß weist die Vorrichtung ein Leitungssystem zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter auf. Mit dieser Vorrichtung kann vor allem das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren mit Vorteil durchgeführt werden. Wesentlicher Aspekt der Erfindung ist dabei, dass durch das kreisförmige Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter die Effizienz des Reinigungsverfahrens wesentlich verbessert werden kann.
Bei der Einrichtung zur Fixierung des Filters handelt es sich insbesondere um eine Filterkammer zur Aufnahme des Filtermaterials. Unter dem Ausdruck „Filterkammer“ ist insbesondere ein fluidischer Hohlraum mit einem Filter zu verstehen. Die Filterkammer kann beispielsweise als Röhrchen ausgestaltet sein oder in besonders bevorzugter Weise als mikrofluidisches Element. Die Filterkammer weist vorzugsweise einen mehrschichtigen Aufbau auf. Hierbei können beispielsweise zwei oder mehr strukturierte Platten, insbesondere Polymerplatten, vorgesehen sein. In einer der Platten kann eine flächige Aussparung vorgesehen sein, in die der Filter, z.B. eine Membran, oder ein anderes Filtermaterial, z.B. eine Mikropartikelschüttung, eingelegt werden kann. Es hat sich hierbei insbesondere bei verhältnismäßig großen Filterdurchmessern (> 3 mm) als vorteilhaft erwiesen, den Filter durch eine Stützstruktur, z.B. einen porösen Polymerträger (Fritte), zu unterstützen, um ein Durchbiegen oder Durchsacken des Filters zu vermeiden. Zum Hindurchführen von Flüssigkeiten sind ein oder mehrere Ein- und Auslasskanäle vorgesehen. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass zwischen den beiden Platten eine zusätzliche Membran eingelegt ist, über die zusätzliche Funktionalitäten der Filterkammer realisiert werden können, beispielsweise eine pneumatische Betätigung von Membranventilen und/oder eine Membranpumpe. Vorzugsweise sind Deckfolien oder Deckelmembranen oder andere Polymerschichten als seitliche äußere Abschlüsse des Systems vorgesehen. Eine Deckfolie kann darüber hinaus zur Einkopplung von Ultraschall genutzt werden. Insbesondere in Ausgestaltungen der Vorrichtung, die für eine Ultraschallbehandlung bei der Zelllyse eingerichtet sind, kann es vorgesehen sein, dass die Filterkammer eine Erweiterung zum Einbringen des Ultraschalls aufweist. Hierbei ist die Erweiterung, die beispielsweise kreisförmig oder teilkreisförmig sein kann, zweckmäßigerweise als Durchbruch nach außen realisiert, der insbesondere mit einer Deckelmembran verschlossen sein kann. Diese Erweiterung der Filterkammer kann darüber hinaus die Funktion einer Belüftung für das System übernehmen, wobei Belüftungskanäle vorgesehen sein können, die in die Erweiterung münden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung weist die erfindungsgemäße Vorrichtung wenigstens ein belüftetes Gefäß auf, mit dem Flüssigkeiten in das System eingebracht werden können. Insbesondere kann ein nach oben belüftetes Gefäß in den fluidischen Pfad bzw. in das Leitungssystem zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter eingebaut sein. Der Einbau eines belüfteten Gefäßes hat den Vorteil, dass hierdurch das zunehmende Volumen der im Kreislauf befindlichen Flüssigkeiten aufgenommen und der Druck im Kreislauf konstant gehalten werden kann, wodurch eine mikrofluidische Realisierung in besonders vorteilhafter Weise möglich wird. Die Flüssigkeiten können z.B. per Hand, insbesondere per Pipette, oder durch Pumpen mit einer zweiten in das System integrierten Pumpe in das Gefäß eingebracht werden. Ein belüftetes Gefäß hat weiterhin den Vorteil, dass Luftblasen, die in den fluidischen Pfad gelangt sind, in dem Gefäß nach oben steigen und so das System verlassen können. So wird vermieden, dass Luftblasen im Kreislauf verbleiben und zur Schaumbildung führen. Ein solches Gefäß kann beispielsweise als Röhrchen, Kammer oder als anderes fluidisches Element ausgeführt sein, das ein Volumen beispielsweise zwischen 100 µl und 10 ml aufweist. Mit besonderem Vorteil können darüber hinaus mehrere belüftete Gefäße in dem System vorgesehen sein, die vor allem als Verlagerungskammern für Reagenzien dienen können.
Bei der Pumpe kann es sich beispielsweise um eine peristaltische Pumpe oder um eine Mikromembranpumpe handeln. Mit besonderem Vorteil ist die Pumpe mehr oder weniger unmittelbar dem Filter vor- oder nachgeschaltet, so dass die Flüssigkeiten mit sehr hohem Über- oder Unterdruck über den Filter gepumpt werden können. Zweckmäßigerweise ist das Kanalstück zwischen der Pumpe und dem Filter dabei verhältnismäßig kurz. Weiterhin kann es mit Vorteil vorgesehen sein, dass ein Einlasskanal für die Probenflüssigkeiten mehr oder weniger direkt vor der Pumpe oder dem Filter mündet. Dies hat den Vorteil, dass andere Verlagerungsgefäße für Pufferlösungen nicht durch die Probenflüssigkeit verunreinigt werden. Es kann auch vorgesehen sein, dass mehrere Einlasskanäle für verschiedene Flüssigkeiten vorgesehen sind.
Mit besonderem Vorteil können ein oder mehrere Elemente der Vorrichtung beheizbar sein. Beispielsweise können die Pumpe und/oder das Leitungssystem oder Teile davon und/oder der Filter und/oder gegebenenfalls ein Gefäß, das zur Vorlagerung oder zum Einbringen von Flüssigkeiten vorgesehen ist, beheizbar sein. Auf diese Weise können einzelne Verfahrensschritte temperiert durchgeführt werden. Beispielsweise kann der Lyseschritt bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden, indem der Lysepuffer vorgewärmt wird und/oder der Filter selbst beheizt wird.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung als mikrofluidisches System ausgestaltet. Bezüglich der Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung in mikrofluidischer Ausgestaltung wird auf die oben bereits erwähnten Vorteile verwiesen. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können beispielsweise mit besonderem Vorteil in der molekularen Diagnostik und/oder beispielsweise in einem Lab-on-a-Chip-System umgesetzt werden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen zeigen:
1 schematische Darstellung des Prinzips der kreisförmigen Fluidführung;
2 schematische Darstellung der Komponenten einer beispielhaften Ausführungsform einer Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
3 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
4 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
5 schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
6 schematische Darstellung einer mehrschichtigen Filterkammer als Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung;
7 mikrofluidische Vorrichtung gemäß der Erfindung in Aufsicht;
8 seitliche Ansicht des mehrschichtigen Aufbaus der mikrofluidischen Vorrichtung aus 7;
9 Schrägansicht der mikrofluidischen Vorrichtung aus 7;
10/11 Detailansichten einer beispielhaften Filterkammer einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in Seitenansicht (10) und in Aufsicht (11) und
12/13 Detailansicht einer weiteren beispielhaften Filterkammer einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in Seitenansicht (12) und in Aufsicht (13).
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Die schematische Darstellung in 1 illustriert das Prinzip eines kreisförmigen fluidischen Pfades 11, der über einen Filter 10 verläuft. Die Flüssigkeit in den fluidischen Verbindungen 11 wird über eine Pumpe 12 angetrieben. Die fluidischen Verbindungen 11 können beispielsweise durch Schläuche oder Kanäle gebildet werden. Bei der Pumpe 12 handelt es sich um eine Flüssigkeitspumpe, beispielsweise eine peristaltische Pumpe oder eine Membranpumpe. Für eine mikrofluidische Ausgestaltung der Vorrichtung können übliche integrierbare mikrofluidische Pumpen eingesetzt werden. Der hier dargestellte Filter 10 ist in Form einer Filterkammer realisiert. Die im Folgenden beschriebene Darstellung eines Filters ist in vielen Fällen als Synonym für eine Filterkammer zu verstehen. Die Filterkammer kann als mikrofluidische Komponente ausgestaltet sein. Die Art der An- und Abströmung am Filter 10 kann gegebenenfalls genau eingestellt werden. Die Filterkammer selbst kann beispielweise in einem mehrschichtigen Aufbau aus mehreren strukturierten Polymerschichten realisiert sein. Durch diese Bauweise ist eine besonders kostengünstige Fertigung möglich. Wenn die Pumpe 12 über Schläuche mit dem Ein- und Auslass der Filterkammer 10 verbunden ist, kann das Einspeisen in den fluidischen Pfad beispielsweise durch Öffnen der Schlauchverbindung und Pipettieren geschehen.
2 zeigt eine bevorzugte Variante für den schematischen Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Neben dem Filter bzw. der Filterkammer 20 und der Pumpe 22 und den fluidischen Verbindungen 21 ist ein nach oben belüftetes Gefäß 24 in den fluidischen Pfad integriert. Über dieses Gefäß 24 können Flüssigkeiten in den kreisförmigen fluidischen Pfad eingebracht werden. Die erforderlichen Lösungen oder Puffer können beispielsweise in das Gefäß 24 pipettiert werden. Hierdurch ist es in vorteilhafter Weise möglich, während des Prozesses Puffer oder andere Lösungen in den fluidischen Pfad einzuspeisen. Darüber hinaus bietet diese Ausgestaltung den Vorteil, dass Luftblasen, die in den fluidischen Pfad gelangt sind, in dem Gefäß 24 nach oben steigen und so das System verlassen können. Je nach Ausgestaltung der Anordnung kann das Volumen des Gefäßes 24 entsprechend gewählt werden, beispielsweise zwischen 100 µl und 10 ml. Das Gefäß 24 kann beispielsweise als Röhrchen oder als mikrofluidisches Element ausgeführt sein. Vorteilhafterweise befindet sich der Auslasskanal des Systems an der Unterseite des Gefäßes 24. Mit „Unterseite“ ist hierbei der Teil des Gefäßes gemeint, der sich bzgl. der Gravitation an der tiefsten Stelle befindet. Dies hat den Vorteil, dass Flüssigkeiten vollständig aus dem Gefäß entnommen werden können. Vorteilhafterhafterweise ist das Gefäß 24 dabei so ausgestaltet, dass es sich nach unten hin verjüngt.
3 zeigt eine weitere Variante der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Diese Ausgestaltung ist insbesondere als mikrofluidisches System geeignet. Allgemein hat ein mikrofluidisches System den Vorteil, dass das Totvolumen des Aufbaus sehr gering gehalten werden kann und die Gefahr der Schaumbildung gering ist. Die kreisförmige Fluidführung in den fluidischen Verbindungen 31 wird durch die Pumpe 32 angetrieben. Stromaufwärts der Pumpe befindet sich die Filterkammer 30. Weiterhin ist ein Gefäß 34 vorgesehen, das über eine Öffnung bzw. einen Entlüftungskanal 35 entlüftet werden kann. Die Öffnung bzw. der Entlüftungskanal 35 befindet sich vorteilhafterweise am bzgl. der Gravitation oberen Ende des Gefäßes. Hierdurch kann ein unbeabsichtigtes Auslaufen von Reagenzien vermieden werden. Stromaufwärts des Gefäßes 34 ist ein Einlasskanal 36 vorgesehen, wobei der Einlasskanal 36 auch direkt in das Gefäß 34 münden kann. Weiterhin können auch mehrere Einlasskanäle 36 vorhanden sein. Stromabwärts der Pumpe befindet sich ein Auslasskanal 37. Der Fluss der Flüssigkeiten wird über die integrierten Ventile 38 gesteuert, die an verschiedenen Stellen im System angeordnet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Dreh- oder Membranventile handeln.
Bei Verwendung einer solchen Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt werden: Die Probe, also die Flüssigkeit mit den biologischen Zellen, wird über den Einlasskanal 36 oder durch Einleiten (z. B. Pipettieren) durch die Öffnung 35 in das Gefäß 34 eingebracht. Das Gefäß 34 kann beispielsweise als mikrofluidische Kavität ausgeführt sein. Die im Gefäß 34 enthaltene Luft wird dabei über die Öffnung oder den Entlüftungskanal 35 freigesetzt, so dass das Gefäß 34 entlüftet wird. Die Pumpe 32 pumpt anschließend die Probe über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37. Es kann vorgesehen sein, dass der Entlüftungskanal 35 verschlossen wird, sodass die Pumpe 32 die Probe direkt über den Einlasskanal 36 ansaugen kann. Die in der Probe enthaltenen Zellen sammeln bzw. akkumulieren sich an dem Filter 30. Anschließend werden die Zellen aufgeschlossen, indem sie beispielsweise mit einem geeigneten Lysepuffer behandelt werden. Der Lysepuffer wird zunächst in das Gefäß 34 eingebracht, beispielsweise über den Einlasskanal 36. Anschließend wird der Lysepuffer von der Pumpe 32 über den kreisförmigen fluidischen Pfad 31 im Kreislauf über den Filter 30 gepumpt. Alternativ hierzu kann der Zellaufschluss auch auf andere Weise, beispielsweise mit Ultraschall, erfolgen. In diesem Fall wird der Filter 30 entsprechend beschallt. Anschließend erfolgt ein Bindeschritt, in dem die Zielmoleküle am Filter 30 adsorbieren. Hierfür wird geeigneter Bindepuffer in das Gefäß 34 eingebracht und im Kreis 31 gepumpt. Für den nachfolgenden Waschschritt wird zunächst der Waschpuffer in das Gefäß 34 eingebracht und mit der Pumpe 32 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37 gepumpt. Wenn eine Trocknung des Filters 30 vorgesehen ist, wird beispielsweise Luft oder Stickstoff vom Einlasskanal 36 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals 37 gepumpt. Es ist auch möglich, die Pumpe 32 für die Trocknung zu verwenden. Abschließend kann ein Elutionsschritt erfolgen, wobei geeigneter Elutionspuffer in das Gefäß 34 eingebracht und von der Pumpe 32 über den Filter 30 in Richtung des Auslasskanals gepumpt wird.
Allgemein kann das Einbringen der Probe und der Puffer in das Gefäß 34 beispielsweise mittels einer weiteren Pumpe oder manuell durch Pipettieren oder Ähnliches erfolgen. Hierfür kann eine wiederverschließbare Öffnung im Gefäß 34 vorgesehen sein.
4 zeigt eine weitere Variante des Systems, wobei zusätzlich zum Gefäß 34 ein oder mehrere weitere Gefäße 44, beispielsweise Vorlagerungsgefäße, vorgesehen sind. Auch diese Gefäße 44 sind mit einer Öffnung oder einem Entlüftungskanal 45 ausgestattet. Der Inhalt des Gefäßes 44 kann über ein weiteres Ventil 48 in das übrige Leitungssystem eingebracht werden. Im Übrigen entspricht das System im Wesentlichen der in 3 dargestellten Vorrichtung. Die entsprechenden Elemente sind daher mit den gleichen Bezugszeichen versehen. Zwischen dem Gefäß 34 und der Zuleitung aus dem weiteren Gefäß 44 ist ein weiteres Ventil 49 vorgesehen. In dem oder den Gefäßen 44 können verschiedene Puffer, z.B. der Lyse-, Verdau-, Denaturierungs-, Binde-, Wasch- oder Elutionspuffer, vorgelagert werden. Diese Variante hat den Vorteil, dass eine automatische Durchführung vereinfacht wird, da die Puffer nicht mehr einzeln in das Gefäß 34 eingebracht werden müssen. Das Verfahren kann so durchgeführt werden, dass insbesondere die Probe manuell in das Gefäß 34 eingebracht wird, bevor der Filter 30 damit beaufschlagt wird. Die verschiedenen benötigten Puffer in den darauffolgenden Prozessschritten können automatisiert aus dem oder den Gefäßen 44 eingeleitet werden.
5 illustriert ein weiteres bevorzugtes Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die beispielsweise in einem mikrofluidischen System realisiert werden kann. Bei diesem System ist die Pumpe 52 stromaufwärts der Filterkammer 50 angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass Flüssigkeiten mit sehr hohem Druck über den Filter 50 gepumpt werden können. Hierfür ist es besonders vorteilhaft, wenn das Kanalstück oder das Schlauchstück zwischen der Pumpe 52 und dem Filter 50 verhältnismäßig kurz ist. Der Einlasskanal 56 mündet unmittelbar vor der Pumpe 52. Dies hat den Vorteil, dass die aus dem Einlasskanal 56 über den Filter 50 gepumpten Flüssigkeiten, insbesondere die Probe mit dem Zellmaterial, nicht das Vorlagerungsgefäß 54 passieren, sodass Kontaminationen vermieden werden. Vorteilhafterweise kann das System teilweise oder abschnittsweise beheizt werden, beispielsweise kann der Filter 50 und/oder die Pumpe 52 und/oder das Gefäß 54 beheizt werden. Ein Beheizen kann zweckmäßigerweise während des Lyseschrittes erfolgen, sodass der Zellaufschluss noch effizienter ablaufen kann. Zweckmäßigerweise kann eine optimale Temperatur für die eingesetzten Lyseenzyme eingestellt werden, die beispielsweise in einem Temperaturbereich zwischen 35 und 55° Celsius liegen kann, beispielsweise bei 45° Celsius. Die Prozessführung bei dem Lyseschritt erfolgt vorzugsweise in Kreisform über den kreisförmigen fluidischen Pfad 51, vergleichbar mit den anderen beschriebenen Ausführungsbeispielen. Als Variante können weitere Einlasskanäle vorhanden sein, über die die benötigten Reagenzien in das System gepumpt werden können. Das oder die Gefäße 54 haben beispielsweise ein Volumen von 2 ml und der Filter hat beispielsweise einen Durchmesser zwischen 2 und 10 mm.
Eine Steuerung des Fluidflusses erfolgt über die Ventile 58. Die Flüssigkeiten können das System über den Auslasskanal 57 verlassen.
Eine Versuchsdurchführung zur Akkumulation und Lyse von Zellen und einer DNA-Reinigung in einem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System kann beispielsweise folgendermaßen durchgeführt werden: 10⁵ Staphylokokken in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung werden durch Pumpen über den Einlasskanal 56 oder durch Pipettieren in das Gefäß 54 in das System eingebracht und mit der Pumpe 52 über den Filter 50 gepumpt. Zur Lyse werden 100 µl Lysepuffer in das Gefäß 54 pipettiert und mit der Pumpe 52 für 10 Minuten bei gleichzeitiger Temperierung auf 45° Celsius über den Filter 50 und das Kanalsystem 51 im Kreis gepumpt. Im Anschluss werden sukzessive ein Verdaupuffer und ein Bindepuffer in das Gefäß 54 pipettiert und ebenfalls zirkuliert. Dies hat den Vorteil, dass eine sehr gute Durchmischung der Reagenzien erfolgt und Nukleinsäuren effektiv an den Filter 50 gebunden werden. Der Filter 50 wird anschließend gewaschen, indem ein Waschpuffer in das Gefäß pipettiert und über den Filter 50 in den Auslasskanal 57 gepumpt wird. Die gebundene DNA wird mit Wasser eluiert, indem Wasser in das Gefäß 54 pipettiert und über den Filter 50 in den Auslasskanal 57 gepumpt wird. Das Eluat wird aufgefangen. Parallel dazu wird eine Referenz prozessiert: 10⁵ Staphylokokken in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung werden durch Zentrifugation bei 13 000 g akkumuliert und der Überstand wird abpipettiert. 100 µl Lysepuffer werden hinzupipettiert, durchmischt und für 10 Min. bei 45 °C inkubiert. Das entstandene Lysat wird sukzessive mit Verdaupuffer und Bindepuffer gemischt und auf eine handelsübliche Säule aufgebracht. Im Anschluss wird die Säule mit Waschpuffer gewaschen und die DNA mit 100 µl Wasser eluiert. Eine Analyse der Proben erfolgt mittels einer quantitativen PCR. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vergleichbare Ergebnisse wie bei der Referenz erzielt werden können, wobei bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine erhebliche Arbeitsersparnis durch die Möglichkeiten der einfachen Automatisierung erreicht werden kann.
6 zeigt einen Schnitt durch eine beispielhafte mikrofluidische Filterkammer 60 auf der Basis eines Mehrschichtaufbaus. Zwei strukturierte Polymerplatten 61, eine dazwischen liegende Polymermembran 62 und außen aufliegende Deckelfolien 63 bilden den Mehrschichtaufbau. Der Filter 64 ist in einer Vertiefung einer der Polymerplatten 61 eingelegt. Die Flüssigkeitszufuhr und die Flüssigkeitsabfuhr erfolgen über den Einlasskanal 65 und den Auslasskanal 66. Die dem Filter 64 vorgeschaltete Membran 62 kann zusätzliche Funktionalitäten, beispielsweise eine Ventilfunktion, ausüben. Dieser Aufbau ist insbesondere für mikrofluidische Ausgestaltungen geeignet.
Die 7 bis 9 zeigen eine beispielhafte Ausführung eines mikrofluidischen Systems 700 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. 7 zeigt eine Aufsicht von vorne, 8 eine Seitenansicht und 9 eine Schrägansicht von vorne. Das mikrofluidische System ist als Mehrschichtaufbau aus zwei strukturierten Polymerplatten 750 und 760 (8) und rechts und links angeordneten Deckelfolien oder anderen Polymerschichten (nicht dargestellt) zur Abdeckung der Strukturen realisiert. Das System umfasst eine Pumpe 702, ein Gefäß 704 mit einer Belüftungsöffnung 724 und eine Filtereinrichtung 710 sowie mehrere Ventile 708, 718, 728. Die Fluidführung erfolgt in Pfeilrichtung (7, 9), wobei die Fließrichtung auch umgekehrt werden kann. Die Filtereinrichtung 710 wird von einer Vertiefung 713 (Filterkammer) in der Polymerplatte 750, einer Fritte 711 zur mechanischen Stützung des Filters und dem eigentlichen Filter 712 gebildet (8). An den Außenseiten des Systems verlaufen Kanäle 701, die durch Deckelfolien oder weitere Polymerschichten (nicht dargestellt) gedeckelt werden. Die Ventile 708, 718, 728 sind als mikrofluidische Membranventile ausgeführt. Die Pumpe 702 ist als mikrofluidische Membranpumpe mit einer Pumpkammer und einem Einlassventil 708 und zwei Auslassventilen 718, 728 ausgeführt und liegt stromabwärts der Filtereinrichtung 710. Die Auslassventile 718, 728 bilden eine T-Kreuzung und erlauben eine Umschaltung des Fluidpfads zwischen dem Kreislauf 701 (Ventil 728) und dem Auslasskanal 707 (Ventil 718). Zwischen den Polymerplatten 750 und 760 befindet sich eine nicht dargestellte Polymermembran, die für eine pneumatische Betätigung der Ventile und der Pumpe genutzt wird. Das Gefäß 704 ist so geformt, dass auch kleinste Flüssigkeitsmengen an der untersten Stelle des Gefäßes zusammenlaufen und von dort in das Kanalsystem 701 eintreten können. Das Gefäß 704 weist dazu eine Verjüngung nach unten hin auf.
Das dargestellte System 700 kann Teil eines größeren mikrofluidischen Systems sein, das weitere Funktionalitäten beinhaltet, z.B. weitere Pumpen und Mischkammern, Kammern zur Vorlagerung von Reagenzien, Kammern zur weiteren Prozessierung der biologischen Molekülen, z.B. zur Amplifikation der gewonnenen Nukleinsäuren, beispielsweise mittels PCR, und Komponenten zur Detektion von biologischen Molekülen, z.B. von Nukleinsäuren.
Bei Verwendung der mikrofluidischen Vorrichtung 700 kann das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt werden: Die Probe wird zunächst in das belüftete Gefäß 704 eingebracht, z.B. durch Pipettieren und Pumpen, und anschließend von unten über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Dann wird Lysepuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und während der Lyse mit der Pumpe 702 über die Filtereinrichtung 710 zirkuliert. Alternativ kann der Lysepuffer auch nur kurz zirkuliert werden, um die Filterkammer 713 sicher mit Flüssigkeit zu befüllen, woraufhin dann z.B. Hitze oder Ultraschall an den Filter 712 appliziert wird. Im Anschluss wird ein Bindepuffer in das belüftete Gefäß 704 gegeben und mit der Pumpe 702 über die Filtereinrichtung 710 zirkuliert. Dabei kommt es zur Vermischung von Lysat und Bindepuffer und Nukleinsäuren (als Beispiel für aufzureinigende Moleküle) binden an den Filter 712. Das Gemisch wird anschließend in den Auslasskanal 707 gepumpt. Anschließend wird ein Waschpuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Schließlich wird ein Elutionspuffer in das belüftete Gefäß 704 eingebracht und über die Filtereinrichtung 710 in den Auslasskanal 707 gepumpt. Alternativ kann der Elutionspuffer auch über den Auslasskanal 707 angesaugt und in umgekehrter Richtung über die Filtereinrichtung 710 in das belüftete Gefäß 704 gepumpt werden.
In einer Variante dieses Verfahrens können zunächst in der Probe vorhandene humane Zellen selektiv lysiert werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann nach der Lyse ein Verdau von Proteinen durchgeführt werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann vor dem Binden der DNA ein Denaturierungsschritt durchgeführt werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann der Filter vor der Elution getrocknet werden. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann die Pumprichtung zwischendurch kurz, z.B. für 5 bis 60 s, umgekehrt werden.
10 zeigt eine Seitenansicht und 11 eine Aufsicht einer beispielhaften Ausführungsform einer Filterkammer 813 für mikrofluidische Vorrichtungen. In 10 ist der mehrschichtige Aufbau aus zwei Polymerplatten 850 und 860 erkennbar. Die kreisrunde Vertiefung 814 in der Polymerplatte 850 ist als Sackloch zum Einsetzen einer Filtermembran oder einer Filtermaterialschüttung und gegebenenfalls einer Fritte vorgesehen. Unmittelbar oberhalb des einzusetzenden Filters ist eine kreisförmige Erweiterung 815 vorgesehen. In der anderen Polymerplatte 860 ist ein kreisförmiger Durchbruch 816 vorgesehen, der im montierten Zustand durch eine Deckelmembran (nicht dargestellt) abgedeckt ist. Über den Kanal 817 kann eine Zufuhr oder Abfuhr von Flüssigkeiten erfolgen. Der kreisförmige Durchbruch 816 kann beispielsweise einen Durchmesser zwischen 5 und 50 mm aufweisen und kann in etwa konzentrisch zum Filter angeordnet sein, aber auch – insbesondere bzgl. der Gravitationsrichtung nach oben – verschoben sein, z.B. um die Differenz der Radien von Filter und kreisförmigem Bereich. Durch den Durchbruch 816 und die Erweiterung 815 kann mittels einer Sonotrode Ultraschall in das Innere der Filterkammer 813 eingetragen werden, wodurch eine Ultraschall-Lyse durchgeführt werden kann. Diese Variante weist den Vorteil auf, dass eine besonders effiziente Ultraschall-Lyse möglich ist. Alternativ kann der zum Einbringen von Ultraschall vorgesehene Bereich auch oval, quadratisch oder länglich sein mit vergleichbaren Abmessungen. Weiterhin hat diese Variante den Vorteil, dass die Erweiterung 815 der Filterkammer 813 gleichzeitig die Funktion erfüllen kann, dass Luftblasen in der Erweiterung nach oben aufsteigen und somit aus dem Flüssigkeitskreislauf eliminiert werden und dass ein während der Prozessierung ansteigendes Flüssigkeitsvolumen aufgenommen wird, und damit gegebenenfalls ein anderes Gefäß des Systems ersetzen kann. Zu diesem Zweck kann ein zusätzlicher Entlüftungskanal 819 vorgesehen sein. Hierbei ist es zweckmäßig, wenn die Erweiterung beispielsweise ein Volumen zwischen 500 µl und 5 ml aufweist. Hierfür kann eine zusätzliche Erweiterung 818 vorgesehen sein. Als Filter können hier z.B. Silicamembranen, aber auch Schüttungen von Mikropartikeln zum Einsatz kommen. In einer Variante erstreckt sich der Filter bzw. die Schüttung von Mikropartikeln in die Erweiterung 815 und den Durchbruch 816 hinein, so dass auf dieser Seite Kontakt mit der Deckelmembran besteht. Dies hat den Vorteil, dass beim Einkoppeln von Ultraschall in die Deckelmembran der Filter bzw. die Schüttung von Mikropartikeln besonders effizient in Schwingung versetzt wird, wodurch die Lyse von akkumulierten Zellen mit größerer Ausbeute stattfinden kann.
12 und 13 zeigen eine weitere Ausführungsform für eine Filterkammer 913, die vergleichbar mit der Filterkammer 813 eine sacklochförmige Vertiefung 914 in der Polymerplatte 950 für die Aufnahme eines Filters oder einer Filtermaterialschüttung und gegebenenfalls einer Fritte aufweist. Über den Kanal 919 kann eine Flüssigkeitszufuhr oder -abfuhr erfolgen. In der Polymerplatte 950 ist eine teilkreisförmige Erweiterung 915 des Sacklochs 914 vorgesehen. Die andere Polymerplatte 960 weist in diesen Bereichen einen Durchbruch 916 auf, der im montierten Zustand die Verbindung zwischen dem Sackloch 914 und der Erweiterung 915 herstellt und der mit einer Deckelmembran (nicht dargestellt) abgedeckt ist. Die Erweiterung 915 und der Durchbruch 916 sind vergleichbar mit der Ausführungsform 813 ebenfalls für eine Einkopplung von Ultraschall geeignet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102005009479 A1 [0004]
DE 102010030962 A1 [0005]
DE 102010043015 A1 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Dufour, Alfred P., et al. (Applied and Environmental Microbiology, May 1981, Seiten 1152–1158 [0004]

Claims

Verfahren zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, unter Verwendung wenigstens eines Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710), dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einige der für eine Prozessführung erforderlichen Flüssigkeiten in einem Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt werden, wobei zumindest die folgenden Verfahrensschritte durchgeführt werden: – Flüssigkeit mit biologischen Zellen wird über einen Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt, – die an dem Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) zurückgehaltenen Zellen werden aufgeschlossen, – Bindepuffer zur Bindung der biologischen Moleküle an den Filter wird im Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt, – Waschpuffer zur Reinigung der an den Filter gebundenen biologischen Moleküle wird über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufschluss der Zellen Lysepuffer im Kreislauf (11; 21; 31; 51; 701) über den Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) gepumpt wird oder dass die Zellen mechanisch aufgeschlossen werden, insbesondere durch eine Ultraschallbehandlung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Behandlung mit Bindepuffer ein Denaturierungsschritt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Behandlung mit Bindepuffer ein zusätzlicher Verdauschritt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Behandlung mit Waschpuffer der Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) getrocknet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Pumpen der Flüssigkeit mit den biologischen Zellen über den Filter eine Vorbehandlung der Flüssigkeit erfolgt, wobei vorzugsweise in der Flüssigkeit vorhandene humane Zellen selektiv lysiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einige der Verfahrensschritte unter Wärmezufuhr erfolgen, insbesondere der Zellaufschluss und/oder der gegebenenfalls durchgeführte Verdauschritt und/oder das gegebenenfalls vorgesehene Trocknen des Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumprichtung bei einem oder mehreren der Verfahrensschritte ein- oder mehrfach umgekehrt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einer mikrofluidischen Vorrichtung (700) durchgeführt wird.
Vorrichtung zur Durchführung einer Aufreinigung von biologischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, mit wenigstens einer Pumpe (12; 22; 32; 52; 702) zum Pumpen von Flüssigkeiten und wenigstens einer Einrichtung zur Fixierung wenigstens eines Filters (10; 20; 30; 50; 64; 710), dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Leitungssystem (11; 21; 31; 51; 701) zum kreisförmigen Pumpen von Flüssigkeiten über den Filter umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Fixierung des Filters (64; 712) eine Filterkammer (60; 713; 813; 913) ist, die vorzugsweise einen mehrschichtigen Aufbau aufweist, wobei die Filterkammer (60; 713; 813; 913) zum Einsetzen insbesondere einer Filtermembran (64) oder eines anderen Filtermaterials, insbesondere einer Partikelschüttung, eingerichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterkammer (813; 913) eine Erweiterung (815; 915) zur Einkopplung von Ultraschall aufweist, wobei vorzugsweise die Erweiterung einen mit einer Deckelmembran verschlossener Durchbruch (816; 916) umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche Anspruch 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung wenigstens ein belüftetes Gefäß (24; 34; 44; 704) zum Einbringen von Flüssigkeiten in das System umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter (10; 20; 30; 50; 64; 710) und/oder die Pumpe (12; 22; 32; 52; 702) und/oder das gegebenenfalls vorgesehene Gefäß (24; 34; 44; 704) und/oder das Leitungssystem (11; 21; 31; 51; 701) beheizbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung als mikrofluidisches System (700) ausgestaltet ist.