WO2015137531A1 - 면역글로불린의 정제방법 - Google Patents

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WO2015137531A1
WO2015137531A1 PCT/KR2014/002021 KR2014002021W WO2015137531A1 WO 2015137531 A1 WO2015137531 A1 WO 2015137531A1 KR 2014002021 W KR2014002021 W KR 2014002021W WO 2015137531 A1 WO2015137531 A1 WO 2015137531A1
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immunoglobulin
exchange chromatography
fraction
iii
anion exchange
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PCT/KR2014/002021
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박동환
손기환
서강윤
최성민
이건술
김기용
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주식회사 녹십자홀딩스
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying immunoglobulins, and more particularly, after dissolving the plasma protein fraction I + II + III or fraction II + III containing the immunoglobulin. , Caprylate was added to precipitate and concentrated by dialysis to concentrate. Then, anion exchange resin and ceramic cation exchange resin purification techniques effectively remove the solvent and detergent added during virus inactivation, and eluate salt.
  • the present invention relates to a method for purifying immunoglobulins, which maintains a low polymer content by maintaining a constant concentration.
  • Immunoglobulins are plasma proteins that contain antibodies against various viruses and bacteria, and are used to prevent and treat diseases by administering them to people with innate antibody deficiencies or those who require artificial replenishment of antibodies due to viral or bacterial diseases. It is a medicine.
  • immunoglobulin is not possible due to the limited dosage of 1) the mass injection, 2) the pain at the injection site during injection, and 3) the intrinsic immunoglobulin G (ImmunoglobulinG; IgG) content with antibody capability. 4, the globulin antibody value by the protease at the injection site is reduced, and 5) the maximum blood concentration reaching time is 24 hours or more.
  • Intravenous injection of immunoglobulin has been attempted to solve the problem of intramuscular injection.
  • intravenous administration of immunoglobulin preparations results in anaphylactic reactions due to aggregates with anticomplementary activity. Severe and a variety of immediate side effects from shortness of breath to circulatory shock. The above symptoms were mainly seen in patients with immunoglobulin deficiency, and especially side effects of severe hypersensitivity symptoms were observed in patients with antibodies to IgA.
  • intravenous injection is not possible due to the above problem, development of intravenous preparations has been required, and methods have been developed that can remove such aggregates and / or prevent aggregate formation during the manufacturing process. Treated with proteolytic enzymes such as pepsin, papain, plasmin, or chemicals such as beta-propiolactone and altered the structure to prevent or destroy the formation of aggregates. Intravenous injections were made possible by lowering anticomplement activity.
  • proteolytic enzymes such as pepsin, papain, plasmin, or chemicals such as beta-propiolactone
  • IVIG Intravenous Immunoglobulin
  • the process does not include a column chromatography step, and the manufactured product is lyophilized to remain stable for a suitable period of time, and used by dissolving immediately before use.
  • some manufacturers' IVIG products have been shown to cause infections of viruses such as viral hepatitis C, which further includes one or more known virus inactivation and / or removal steps in the manufacturing process.
  • a second generation IVIG with low anticomplement activity and higher stability was initiated in the mid 80s, which was purified through several chromatographic steps.
  • Intravenous injections resolved the limitations of intramuscular immunoglobulin dosage, pain relief at the injection site, and reduced proglobin antibodies by protease. It became.
  • the semen-injected immunoglobulin changes the structure and there is almost no inherent IgG having an antibody ability, and thus the complement binding capacity is reduced or the blood half-life is short as 4 to 12 days, which is satisfactory for the prevention and treatment of the disease.
  • the first and second generation IVIG prepared in lyophilized powder form, requires further dissolution, and because of the slow dissolution rate, liquid IVIG products have been developed and improved to obtain more stable and pure IVIG products. A process was required.
  • the method (3rd generation IVIG) introduced in German Patent No. 2,604,759 and US Patent No. 4.124,576 has a unique inherent ability to antibody using a nonionic surfactant such as polyethylene glycol, unlike gamma globulin for intravenous injection.
  • a nonionic surfactant such as polyethylene glycol
  • the development of a method of obtaining IgG of the present invention has the ability of complement binding and a long half-life of blood concentration, which is effective in preventing and treating diseases.However, these preparations prepared by polyethylene glycol treatment also have anti-complementary aggregates. It is difficult to completely remove the (anti-complement value is about 0.02 units / mg) there is a problem that the occurrence of side effects remain.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 1983-0007083 also prepared an immunoglobulin for intravenous injection through polyethylene glycol from cohn fraction II or fraction II + III isolated from human plasma, but the process was complicated and yield was low. There is this.
  • immunoglobulins are purified using sodium caprylate precipitation, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography.
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying immunoglobulins that can efficiently remove impurities and thrombogenic substances in order to produce stable and high purity immunoglobulins.
  • It provides a method for purifying immunoglobulin comprising a.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the manufacturing process of the intravenous immunoglobulin according to the present invention.
  • Figure 2 is the result of measuring the purity (Thrombin / IgG) of the production stage immunoglobulin.
  • Figure 3 is the result of measuring the concentration of FXI (Human Coagulation Factor XI) contained in the filtrate or precipitate for each step by SDS-PAGE.
  • FXI Human Coagulation Factor XI
  • Plasma protein containing immunoglobulin of the present invention refers to cryoprecipitate-free plasma, various cones, from which various plasma proteins such as Factor IX and antithrombin are removed from human plasma or human placenta derived plasma. cohn) fractions and ammonium sulfate or PEG (Polson et al., Biochem Biophys Acta , 82: 463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang , 23: 107. Fractions obtained through precipitation by 1972).
  • the plasma protein fraction may be Cone Fraction II, Cone Fraction I + II + III or Cone Fraction II + III.
  • fraction I + II + III or fraction II + III obtained from human plasma was used and prepared according to the conventional corn plasma fractionation method. Subsequent purification processes were performed to remove various lipoproteins, fibrinogen, ⁇ -globulin, ⁇ -globulin and various coagulation factors contained in fraction I + II + III or fraction II + III.
  • human plasma is a nucleic acid amplification test (NAT; Nucleic Acid Amplification Test for human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis B virus (HBV) and parvovirus B19 (parvovirus B19) US-derived plasma was used after biotest, including serological tests, and plasma stored at ⁇ 20 ° C. or below was stored in a jacketed vessel at 1 ° C. to 6 ° C. Reaction was dissolved for hours.
  • NAT Nucleic Acid Amplification Test for human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis B virus (HBV) and parvovirus B19 (parvovirus B19) US-derived plasma was used after biotest, including serological tests, and plasma stored at ⁇ 20 ° C. or below was stored in a jacketed vessel at 1 ° C. to 6 ° C. Reaction was dissolved for hours.
  • the plasma is melted to produce cryoprecipitate containing fibrinogen and coagulation factors, and the cryoprecipitation plasma is removed through centrifugation, and the frozen deficiency in which the cryopreserved plasma is removed. Cryopoor plasma was recovered. Thereafter, the precipitation and filtration were repeated to obtain fraction I + II + III.
  • Filtration to separate the plasma containing immunoglobulin was added by adding a filter aid, and then mixed with the supernatant and sediment using a filter press, Celpure 300, Celpure 1000 was used as the filter aid.
  • the dissolution of the fraction I + II + III or fraction II + III of step (a) is added so that the fraction I + II + III or fraction II + III: distilled water 1: 6 to 1: 10 Characterized in that, the distilled water may be used for injection distilled water.
  • the plasma protein fraction is preferably suspended (dissolved) in water and / or buffer at substantially non-denaturing temperatures and pH.
  • substantially unmodified means that the above-mentioned conditions do not cause a substantially irreversible loss of functional activity of immunoglobulin molecules, such as loss of antigen binding activity and / or biological Fc-action.
  • the plasma protein fraction is dissolved in water acidified with one or more undenatured buffers at a volume of 6-10, preferably 7-8 times the volume of the plasma protein fraction, and the pH of the immunoglobulin-containing suspension is
  • the pH is preferably maintained at pH 6.0 or lower, more preferably at 4.0 to 6.0, and most preferably at 4.1 to 4.3.
  • Any acid known in the art may be used as the acid buffer, but preferably sodium phosphate, sodium acetate, sodium chloride, acetic acid, hydrochloric acid, water (distilled water), and the like, and distilled water or distilled water for injection was used in the present invention. .
  • step (a) is a step of separating the supernatant and other substances containing the immunoglobulin through the precipitation reaction.
  • the precipitant may use one or more materials selected from polyethylene glycol (PEG), caprylic acid and ammonium sulfate having various molecular weights, and an unmodified water-soluble protein precipitant known in the art may be used as a means of precipitation.
  • PEG polyethylene glycol
  • caprylic acid can be used.
  • Precipitation reaction according to the step (a) is added so that the precipitant is 5 to 26mM, preferably 19 to 21mM and then the pH is adjusted to 4 to 6, preferably 4.5 to 5.5.
  • the pH adjustment may include acetic acid or sodium hydroxide, but is not limited thereto, and it will be apparent to those skilled in the art that other materials that may be used for pH adjustment may be used.
  • the precipitant is carried out for about 1 hour, preferably 50 minutes to 1 hour 10 minutes, until the precipitation reaction is equilibrated between the solid phase and the liquid phase. Throughout the precipitation reaction, the suspension is kept at low temperature, preferably at 2-6 ° C., and the most suitable temperature can be adjusted according to the properties of the protein precipitant.
  • the precipitate precipitated by the precipitation reaction contains a large amount of aggregated protein material, and the supernatant contains immunoglobulin, so only the supernatant can be purified to purify the immunoglobulin, and the immunoglobulin-containing supernatant is a large aggregate, a filter.
  • a filtration step can be further performed to remove aids, residual non-dissolved pastes, and the like. The filtration is preferably performed using a depth filter and is performed using C150 AF, AF 2000 or AF 1000 (SChenk), 30 LA (Cuno) or similar filters. If desired, removal of aggregates, filter aids, residual non-dissolved protein material may also be performed by centrifugation.
  • fraction I + II + III paste protein concentration extracted by adding distilled water or WFI (injection distilled water) so that distilled water is 1: 6 to 10 Was adjusted to 15 mg / ml, the pH was adjusted to 4.2 ⁇ 0.1 with 1M acetic acid, and then the fraction I + II + III paste was extracted.
  • WFI injection distilled water
  • 1M sodium caprylate solution was added to the extract so that the concentration of caprylate was 20 ⁇ 1.0 mM, and then 1M acetic acid or 0.5M sodium hydroxide (NaOH) was used. The pH was adjusted to 5.1 ⁇ 0.1, and precipitation reaction was performed at 4 ° C. for 1 hour ⁇ 10 minutes. The supernatant was recovered and the immunoglobulin solution was filtered through a depth filter.
  • step (b) is a step of concentrating the immunoglobulin and removing impurities, through which the concentration of the immunoglobulin is adjusted to 10 to 50, preferably 20 to 30 mg / ml, Anion exchange chromatography is performed at a pH of 5.0 to 6.0, flow rate of 95 to 145 cm / hr, and fractions not attached to the anion exchange chromatography are obtained at 1.6 to 2.0 Loading Volume (LV). .
  • the pH is adjusted to 5.4 to 5.8, most preferably 5.5 to 5.7.
  • Concentrated immunoglobulin-containing solutions can be subjected to anion and cation exchange chromatography in one or more steps to remove precipitants and other plasma proteins, including immunoglobulin A (IgA), albumin, aggregates.
  • Anion exchange chromatography was performed to remove caprylic acid and other plasma proteins contained in the immunoglobulin containing solution.
  • the anion exchange resin in the anion exchange chromatography step may be substituted with diethylaminoethyl (DEAE) or quaternary ammonium groups, but is not limited thereto.
  • DEAE diethylaminoethyl
  • quaternary ammonium groups but is not limited thereto.
  • either one of a group having a strong basic quaternary ammonium group or an anion exchange resin having a weakly basic diethylaminoethyl (DEAE) group can be selected and used.
  • strong basic anion exchange resins include Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F , Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE (S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW 30, TSKgel SuperQ-5PW 20, TSKgel SuperQ-5PW etc.
  • the present invention is not limited thereto, and an anion
  • the appropriate volume of resin used in anion exchange chromatography is reflected by the column dimensions, ie the diameter of the column and the height of the resin, and depends, for example, on the amount of immunoglobulin solution in the solution applied and the binding performance of the resin used.
  • the anion exchange resin is preferably equilibrated with a buffer so that the resin can bind to its counter ions.
  • Q sepharose FF Q sepharose Fast Flow
  • column buffer an equalization buffer known in the art such as sodium phosphate buffer, citric acid buffer, acetic acid buffer, Wash buffers and elution buffers may be used.
  • the column for in anion exchange chromatography was equilibrated with 25 ⁇ 0.5 mM sodium acetate (NaOAc) buffer to pH 5.6 ⁇ 0.1 and the flow rate of the mobile phase was adjusted to 120 ⁇ 25 cm / hr.
  • the loading amount of the concentrated immunoglobulin solution was loaded to the column to be 90.0 ⁇ 20 mg / mLr.
  • the step (c) is to inactivate a virus such as a lipid enveloped virus in a solution containing an immunoglobulin and, after inactivation, to remove a substance used for inactivation.
  • virus-inactivating agents preferably solvents and / or detergents, most preferably solvent-cleaner mixtures, can be used.
  • step (c) potential lipid enveloped viruses such as HIV1 and HIV2, hepatitis type C and non ABC, HTLV1 and 2, herpes virus group, CMV and Epstein Barr virus can be inactivated, thereby enhancing the safety of the final product.
  • HIV1 and HIV2 hepatitis type C and non ABC, HTLV1 and 2, herpes virus group, CMV and Epstein Barr virus
  • CMV and Epstein Barr virus can be inactivated, thereby enhancing the safety of the final product. have.
  • Solvents and cleaning agents that can be used in step (c) can be used without limitation as long as they have properties that can inactivate viruses, particularly lipid enveloped viruses.
  • the detergent may be selected from the group consisting of nonionic and ionic detergents, preferably substantially unmodified.
  • a nonionic detergent is preferred, and the solvent is most preferably tri-n-butyl phosphate (TNBP) as disclosed in US Pat. No. 4,764,369, but It is not limited.
  • TNBP tri-n-butyl phosphate
  • virus-inactivating agents for carrying out the present invention are, but are not limited to, mixtures of one or more selected from TNBP and polysorbate 80 (Tween 80), Triton X-100 and Triton X-45. .
  • Preferred solvent / detergent mixtures are added such that the concentration of TNBP in the immunoglobulin containing solution is within 0.2 to 0.6% by weight, preferably 0.24 to 0.36% by weight, and the concentration of Tween 80 is within the range of 0.8 to 1.5% by weight, preferably Add to the concentration of 0.8 to 1.2% by weight.
  • the virus-inactivation step is performed under conditions that inactivate the lipid envelope virus, resulting in an immunoglobulin containing solution that is substantially free of virus risk.
  • the reaction temperature in the above conditions is preferably 4 to 30 °C, more preferably 19 to 28 °C, most preferably 24 to 26 °C, the reaction time is preferably 1 to 24 hours, more preferably 4 to 12 hours, most preferably about 8 hours, sufficient to ensure virus inactivation.
  • the cation exchange chromatography of step (c) is characterized in that the pH is carried out under conditions of 4.5 to 5.5, flow rate 110 to 130cm / hr, preferably the pH is adjusted to 4.9 to 5.1 do.
  • the immunoglobulin loaded into the cation exchange resin is 90 to 130 mg per ml cation exchange resin, more preferably 95 to 105 mg per ml resin. Immunoglobulins are adsorbed and then washed with equilibration buffer.
  • the equilibration buffer used for washing in the above conditions can be washed using a volume of at least 3 times, preferably at least 5 times the volume of the column, and after washing the immunoglobulin with at least 8 times the elution buffer of the column volume. Elution.
  • the cation exchange resin may be Sephadex, Sepharose, HyperCell, or Source, but is not limited thereto, and cation exchange resins known in the art may be used. .
  • a ceramic series CM hyper D gel was used as the cation exchange resin, and as the column buffer, an equalization buffer known in the art such as sodium phosphate buffer, citric acid buffer, acetic acid buffer, Washing buffer and elution buffer were used.
  • Elution of the immunoglobulin from the cation exchange resin is performed with a substantially non-denaturing buffer with sufficient pH and ionic strength to cause efficient elution of the immunoglobulin to recover the immunoglobulin containing eluate.
  • Efficient elution means that at least 75%, at least 80%, and the like, such as at least 85%, of the immunoglobulin solution loaded on the cation exchange resin are eluted from the cation exchange resin.
  • the cation exchange chromatography of step (c) may be carried out at a salt concentration of the elution buffer high enough to replace the immunoglobulin in the cation exchange resin, salt concentration of 400 to 600 mM, preferably It can be carried out at a salt concentration of 500mM.
  • step (d) finally removes impurities once more.
  • the salt concentration of the cation exchange chromatography eluate maintained at 50 to 150 mM in order to maintain the polymer content during dialysis and / or concentration.
  • the elution method of maintaining a low salt in the protein elution step can minimize the polymer content of the immunoglobulin to purify the immunoglobulin of improved quality.
  • the cation exchange resin eluate maintained a salt concentration of 100 mM or less to maintain the polymer content.
  • the dialysis and / or concentration of the step (d) is characterized in that using the ultrafiltration / diafiltration (Ultrafiltration / Diafiltration; UF / DF) system, the osmosis is carried out at 10 mOsmol / kg or less, It is characterized by adjusting the pH to 5.5 to 6.5. That is, the eluate eluted in cation exchange chromatography is dialyzed and concentrated, and diafiltration and ultrafiltration by diafiltration and concentration are performed in one step.
  • Membranes used for dialysis / ultrafiltration advantageously have an official weight cutoff in the range of 50,000 Da.
  • diafiltration was performed to remove low molecular ions from the cation exchange chromatography eluate, and the osmotic pressure of the UF / DF system was 10 mOsmol / kg or less.
  • Dialysis and / or concentrated immunoglobulin was confirmed to have been concentrated to 1.5 ⁇ 0.1 by the test results of a refractometer (T / S meter).
  • the anion exchange chromatography of the step (d) is carried out under the conditions of pH 5.5 to 6.5, flow rate 90 to 150cm / hr, loading fractions not attached to the anion exchange chromatography 0.8 to 1.2 loading volume (Loding Volume; LV).
  • the pH is adjusted to 5.78 to 6.30, most preferably 6.0 to 6.2, and fractions not attached to the anion exchange chromatography may be recovered to preferably 0.96 to 1.04 loading volume (LV).
  • the pH of the fraction that is not attached to the anion exchange chromatography in the step (d) is characterized in that it is adjusted to 4.0 to 5.5, preferably acid, preferably 1M sulfuric acid, so that the pH is 4.3 to 4.7, By addition of hydrochloric acid or acetic acid.
  • fractogel EMD TMAE Frractogel EMD TMAE
  • NaOAc sodium acetate
  • the flow rate of the bed was adjusted to 120 ⁇ 30 cm / hr.
  • the loading amount of the dialysis and / or concentrated immunoglobulin solution was loaded to the column to be 110.0 ⁇ 10 mg / mLr, and the fraction not attached to the anion exchange chromatography was recovered to 1.0 ⁇ 0.04 loading volume, and then 1M acetic acid was added to The pH was adjusted to 4.5 ⁇ 0.2.
  • the filtration of the step (e) is characterized by using a nanofiltration (nanofiltration) or ultrafiltration / diafiltration system, the nanofiltration is carried out at 2.0 to 3.0 bar pressure conditions, ultrafiltration / dialysis Filtration is carried out at an osmotic pressure of 10 mOsmol / kg or less, and then the pH is adjusted to 4.5 to 5.5.
  • nanofiltration nanofiltration
  • ultrafiltration / dialysis Filtration is carried out at an osmotic pressure of 10 mOsmol / kg or less, and then the pH is adjusted to 4.5 to 5.5.
  • Nanofiltration is an important virus removal step, in which fractions that do not adhere to the secondary anion exchange chromatography are subjected to Pall DVD pre-filters and to no more than 2.5 ⁇ 0.5 bar pressure, preferably no more than 2.5 ⁇ 0.2 bar pressure.
  • the virus contained in the immunoglobulin solution was removed by filtration through a DV20 virus filter, after which the ultrafiltration / Diafiltration (UF / DF) system was used to remove low molecular ions (10 mOsmol / kg or less). Diafiltration was carried out with.
  • UF / DF ultrafiltration / Diafiltration
  • step (e) it may further comprise the step of preparing an intravenous immunoglobulin by adding a stabilizer.
  • the additional stabilizer is characterized in that at least one selected from sugar alcohol, maltose, sorbitol, mannose, glucose, trehalose, albumin, lysine, glycine PEG and Tween 80, preferably using glycine do.
  • the stabilizer is characterized in that the addition to 200 to 300mM, and after adding the stabilizer, characterized in that to adjust the pH to 4.5 to 5.5.
  • it can be done by adding an acid, preferably sulfuric acid or hydrochloric acid so that the pH is between 4.7 and 4.9.
  • glycine glycine
  • glycine is added to the dialysis and / or concentrated immunoglobulin solution to stabilize the immunoglobulin so that the final concentration is 250 ⁇ 50mM and thoroughly mixed, 0.5N hydrochloric acid so that the pH is 4.8 ⁇ 0.1
  • the addition was controlled and sterilized using a 0.2 ⁇ m filter.
  • the sterilized intravenous immunoglobulin preparation is characterized in that the protein concentration (purified immunoglobulin) is diluted or concentrated to 1 to 30% by weight of the total volume, in the present invention, the protein concentration is 40 to 60 g / L , Preferably diluted with WFI or concentrated by ultrafiltration to 45 to 55 g / l, more preferably 49.5 to 50.5 g / l, and then glycine is added to a final concentration of 250 ⁇ 50 mM and mixed thoroughly.
  • the final formulation of the intravenous immunoglobulin preparation was prepared by adjusting hydrochloric acid to pH 4.8 ⁇ 0.1.
  • the present invention relates to an intravenous immunoglobulin prepared by the method of the present invention.
  • the immunoglobulin solution having a purity of 99% or higher as a result of measuring the purity (Thrombin / IgG) of the immunoglobulin solution at each stage of preparation and the concentration of Human Coagulation Factor XI (FXI) included in the filtrate or precipitate at each stage of preparation. It was confirmed that the purified (FIG. 2), it was confirmed that most of the thrombocoagulant FXI was also removed (Table 2 and Figure 3).
  • Biotest Biotest is made, including the use of FDA approved plasma.
  • US-derived plasma (Batch No. 600B0491) was used, and the plasma was stored at ⁇ 20 ° C. or lower until use.
  • the bottle containing plasma was opened with a bottle cutting machine, and reacted for 12 to 72 hours in a jacketed vessel at 1 to 6 ° C. to dissolve the plasma.
  • the plasma is melted to produce cryoprecipitate containing fibrinogen and coagulation factors, and the cryoprecipitation plasma is removed through centrifugation, and the frozen deficiency in which the cryopreserved plasma is removed. Cryopoor plasma was recovered.
  • precipitation II + III steps were performed to further precipitate immunoglobulins (Immunoglpbulin) contained in the deficient plasma.
  • the supernatant was named supernatant I + II + III (or II + III) and the precipitate was named fraction I + II + IIIw (or II + IIIw) (w; wash).
  • Fraction I + II + IIIw (or II + IIIw) is used immediately or stored below -20 ° C.
  • the extracted protein concentration was 15 mg / ml, and the pH was adjusted to 4.2 ⁇ 0.1 using 1M acetic acid, and then fraction I + II + for 11 ⁇ 0.5 hours at a temperature of 2 to 8 ° C. III paste was extracted.
  • Anion exchange chromatography was performed to remove caprylic acid and other plasma proteins contained in the concentrated immunoglobulin solution obtained in Examples 1-4.
  • the anion exchange resin was filled with Q sepharose FF (GE Healthcare, Catalog No. 17-0510) in the column, followed by an equalization buffer (25 ⁇ 0.5 mM sodium acetate (NaOAc), pH 5.6). Equilibrated to pH 5.6 ⁇ 0.1. Thereafter, the concentrated immunoglobulin solution obtained in Example 1-4 was loaded on the column at a flow rate of 120 ⁇ 25 cm / hr at 25 ° C. or higher, and the loading amount was 90.0 ⁇ 20 mg / mLr. Thereafter, the fractions not attached to anion exchange chromatography were recovered at 1.6 to 2.0 loading volume (LV).
  • Q sepharose FF GE Healthcare, Catalog No. 17-0510
  • an equalization buffer 25 ⁇ 0.5 mM sodium acetate (NaOAc), pH 5.6
  • Equilibrated to pH 5.6 ⁇ 0.1 Thereafter, the concentrated immunoglobulin solution obtained in Example 1-4 was loaded on the column at a flow rate of 120 ⁇ 25 cm / h
  • a step of treating the solvent and detergent was performed to inactivate the potential enveloped virus of the solution containing the immunoglobulin.
  • the pH was adjusted to 5.0 ⁇ 0.1 by adding acetic acid to the fraction which was not attached to the anion exchange chromatography recovered in Example 1-5, and tri (en-butyl) -phosphate (Tri (n-butyl)- phosphate (TNBP) and Polysorbate 80 (Polysorbate 80; Tween 80) were added at a concentration of 0.3 ⁇ 0.06% and 1 ⁇ 0.2%, respectively, and then stirred at 200 ⁇ 50 RPM for 20-30 minutes. A portion of the TNBP and Tween 80 in the solution was homogeneously mixed and sampled to confirm that thereafter, stirring was continued at 200 ⁇ 50 RPM for 8 hours at 25 ⁇ 1.0 ° C.
  • Tri (n-butyl)- phosphate (TNBP) and Polysorbate 80 Polysorbate 80; Tween 80
  • CN exchange chromatography was performed to remove other impurities such as TNBP, Tween 80 and coagulation factor in the solvent / detergent immunoglobulin solution.
  • the cation exchange resin is filled with a CM Hyper D gel (Pall Corporation; Catalog No. 20050), which is a ceramic material, to a column, and then has an pH of 5.0 using an equalization buffer (25 ⁇ 0.5 mM sodium acetate (NaOAc)). Equilibrate to ⁇ 0.1. Thereafter, the solvent / detergent treated immunoglobulin solution in Example 1-6 was loaded on the column at a flow rate of 120 ⁇ 10 cm / hr at 20 ⁇ 2 ° C., and the loading amount was 100.0 ⁇ 5 mg / mLr.
  • CM Hyper D gel Pall Corporation; Catalog No. 20050
  • immunoglobulin was eluted using at least 8 times the elution buffer of the column volume (elution buffer composition: 20 mM NaOAc pH 4.5 w / 0.5M NaCl).
  • Diafiltration was performed to remove low molecular ions from the cation exchange chromatography eluate.
  • Example 1-7 The eluate obtained in Example 1-7 was subjected to diafiltration at 10 mOsmol / kg or less using the ultrafiltration / Diafiltration (Millipore Pellicon 2 (50K)) system, and the UF / DF system maintained the polymer content. To this end, a cation exchange chromatography eluate was added to the calculated dialysis concentrate to maintain the concentration below 100 mM sodium chloride.
  • the anion exchange resin was filled with a column of Fractogel EMD TMAEQ (Fractogel EMD TMAE; Merck-Millipore, Cat No. 116887), followed by an equalization buffer (20 ⁇ 0.5 mM sodium acetate (NaOAc), pH 6.1). To equilibrate to pH 6.1 ⁇ 0.1. Thereafter, the concentrated immunoglobulin solution obtained in Example 1-8 was loaded on the column at a flow rate of 120 ⁇ 30 cm / hr at 20 ⁇ 2 ° C., and the loading amount was 110.0 ⁇ 10 mg / mLr. Thereafter, the fractions not attached to the anion exchange chromatography were recovered at 1.0 ⁇ 0.04 loading volume (LV), and the pH was adjusted to 4.5 ⁇ 0.1 by adding hydrochloric acid.
  • Fractogel EMD TMAEQ Fractogel EMD TMAE; Merck-Millipore, Cat No. 116887
  • Nanofiltration is an important virus removal step, in which the immunoglobulin solution concentrated in dialysis in Examples 1-9 is filtered with a prefilter (Florodyne II prefilter, AB1DJL7PH4) not greater than 2.0 ⁇ 0.5 bar pressure and the virus under 2.0 ⁇ 0.5 bar pressure conditions.
  • the virus contained in the immunoglobulin solution was removed by filtration through a filter (DV20, AB3DV207PH4).
  • glycine was added to the dialysis and / or concentrated immunoglobulin solution to a final concentration of 250 ⁇ 50 mM and thoroughly mixed. The pH of the stabilized immunoglobulin solution was measured and the pH was 4.8 ⁇ . 0.5N hydrochloric acid was added and adjusted to 0.1. The filtrate was then sterilized using a 0.2 ⁇ m filter and transferred to a stainless steel storage tank.
  • Immunoglobulin formulations were sterilized after pH adjustment, transferred to a filling room for filling, and prepared at product, then stored at 2-8 ° C.
  • Example 2 Thromboembolic risk measurement in immunoglobulin solution according to preparation step (Generated Thrombin / IgG)
  • the purity (Thrombin / IgG) of the immunoglobulin preparations sampled for each preparation step of Example 1 was measured.
  • Thromboembolic risk measurement in the immunoglobulin solution according to the preparation step of Example 1 in the present invention is the Thrombin Generation protocol (CBER Thrombin Generation protocol 01 Experiment (100916) of the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), one of six analytical organizations under FDA) It was carried out according to a).
  • the immunoglobulin purification process of the present invention is accompanied by a cone plasma fractionation method and an ion chromatography purification method, and as shown in FIG. 2 and Table 1, cation exchange resin chromatography in caprylic acid precipitation process and chromatography purification method. And secondary anion exchange resin chromatography was confirmed that the amount of generated thrombin caused by the thrombus generating material can be effectively removed.
  • the concentration of Human Coagulation Factor XI (FXI) included in the filtrate or precipitate of each step of preparation of Example 1 was measured using an ELISA (AsayMax Human Factor XI (FXI) ELISA Kit; ssaypro, Catalog No. EF1011-1) and SDS-PAGE.
  • ELISA AssayMax Human Factor XI (FXI) ELISA Kit; ssaypro, Catalog No. EF1011-1) and SDS-PAGE.

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Abstract

본 발명은 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+II+III(fraction I+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해한 후, 카프릴산(caprylate)을 첨가하여 침전반응을 시켜 투석 농축시킨 다음, 음이온교환 수지 및 세라믹 재질의 양이온 교환수지 정제기법을 통해 바이러스 불활성화시 첨가되는 용매 및 세정제를 효과적으로 제거하고, 용출시 염 농도를 일정하게 유지함으로써 중합체의 함량을 낮게 유지시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조방법은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III를 출발물질로 하여 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 단계의 생략이 가능하고, 카프릴산 나트륨 1차 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피 사용으로 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 면역글로불린의 생산이 가능하다.

Description

면역글로불린의 정제방법
본 발명은 면역글로불린의 정제방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해한 후, 카프릴산(caprylate)을 첨가하여 침전반응을 시켜 투석 농축시킨 다음, 음이온교환 수지 및 세라믹 재질의 양이온 교환수지 정제기법을 통해 바이러스 불활성화시 첨가되는 용매 및 세정제를 효과적으로 제거하고, 용출시 염 농도를 일정하게 유지함으로써 중합체의 함량을 낮게 유지시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법에 관한 것이다
면역글로불린은 여러 가지 바이러스 및 세균에 대한 항체를 함유하고 있는 혈장 단백으로서 선천적인 항체 결핍자 또는 바이러스성이나 세균성 질환으로 말미암아 항체의 인위적인 보충을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질환의 예방과 치료에 사용되는 약제이다.
이러한 면역글로불린을 약제로 사용하기 위해 콘 및 온클레이(Cohn & Oncley)에 따른 냉에탄올 분획법(Cohn E. et al., J. Am. Chem. Soc., 68:459, 1946) 및 키슬러 및 니츠만에 따른 변형법(Kistler P, Nitschmann HS, Vox Sang, 7:414. 1952)으로 피하 및 근육 주사용 면역글로불린이 제조되었다.
하지만, 근육 주사용 면역글로불린은 1) 투여량이 제한되어 대량 투여가 불가능하며, 2) 주사시 주사부위에 동통현상이 나타나고, 3) 항체능력을 가진 고유의 면역글로불린G(ImmunoglobulinG ; IgG) 함량이 적으며, 4) 주사부위의 단백분해효소에 의한 글로불린의 항체가가 감소되고, 5) 최대혈중농도 도달시간은 24시간 이상이 소요되는 문제점이 있다.
근육 주사의 문제점을 해결하기 위해 정맥 주사를 통한 면역글로불린의 투여가 시도되었으나, 면역글로불린 제제를 정맥으로 투여할 경우 항보체활성(Anticomplementary activity)이 있는 응집체(Aggregate)에 기인하는 부작용(Anaphylacticreaction)이 심각하여 호흡 곤란 현상에서부터 순환계 쇼크까지의 다양한 즉각적인 부작용이 나타났다. 상기의 증상은 주로 면역글로불린이 결핍된 환자들에게서 보였으며, 특히 심각한 과민성 증상의 부작용은 IgA에 대한 항체가 나타난 환자들에서 관찰되었다.
따라서, 상기 문제로 인해 정맥주사가 불가능함에 따라, 정맥주사용 제제의 개발이 요구되었으며, 제조 공정 동안에 이러한 응집체를 제거하고, 및/또는 응집체 형성을 방지할 수 있는 방법들이 개발되었다. 펩신(pepsin), 파페인(papain), 플라스민(Plasmin)등 단백분해 효소나 베타프로 피오락톤(β-propiolactone)등의 화학물질로 처리하고 구조를 변화시켜 응집체의 생성을 저지하거나 파괴하여 항보체 활성을 저하시켜 줌으로써 정맥주사가 가능하게 되었다.
제1세대 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)은 면역글로불린 응집체를 제거하기 위해 출발물질(콘 분획 II)에 펩신을 처리하였다. 상기 공정에는 컬럼 크로마토그래피 단계가 포함되어 있지 않으며, 제조된 제품은 적당한 기간 동안 안정하게 유지되도록 동결건조시키고, 사용직전에 용해시켜 사용하였다. 하지만, 일부 제조사의 IVIG 제품에서 바이러스성 간염 C등의 바이러스의 감염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며, 이에 제조 공정에 하나 이상의 공지의 바이러스 비활성화 및/또는 제거 단계가 추가로 포함되었다. 이후, 낮은 항보체 활성과 좀더 높은 안정성을 가지는 제2세대 IVIG가 80년대 중반에 개시되었으며, 상기 IVIG는 여러 단계의 크로마토그래피 단계들을 거쳐 정제되었다.
이러한 제제들은 정맥 주사함에 따라 근육주사용 면역글로불린의 단점이었던 투여량의 제한, 주사부위의 동통 현상, 단백분해 효소에 의한 글로불린의 항체가 감소 등이 해결되었으며 최대 혈중농도 도달시간도 수시간 이내로 단축되었다.
그러나, 상기 정액주사용 면역글로불린은 구조를 변화시켜 항체능력을 가진 고유의 IgG는 거의 없어 보체결합능력이 저하되거나 없고, 혈중농도 반감기도 4 내지 12일 정도로 짧아 질병의 예방과 치료에 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다. 또한, 동결건조된 분말 형태로 제조된 상기 제1 및 2세대 IVIG는 추가로 용해시키는 작업이 필요하며, 용해속도가 느리기 때문에 액상 IVIG 제품들이 개발되었으며, 좀더 안정하고 순수한 IVIG 제품을 얻을 수 있도록 향상된 공정이 요구되었다.
이에 대하여 독일특허 제 2,604,759호 및 미국특허 제 4.124,576호 등에 소개된 방법(제3세대 IVIG)은 상기 정맥 주사용 감마글로불린과는 달리 폴리에틸렌글리콜 등 비이온성 계면활성제를 사용하여 항체 능력을 가진 고유의 IgG를 얻는 방법이 개발됨으로써 보체결합 능력이 있고 혈중농도 반감기가 일정도로 길어져서 질병의 예방과 치료에 좋은 효과를 거둘 수가 있게 되었으나, 폴리에틸렌 글리콜처리로 제조된 이들 제제도 항보체 활성이 있는 응집체를 완전히 제거하기가 어려워(항보체가가 0.02단위/mg 정도를 나타냄) 부작용의 발생 소지가 남아있는 문제점이 있다.
또한, 한국공개특허 제1983-0007083호 역시, 사람 혈장으로부터 분리된 콘(cohn) 분획 II 또는 분획 II＋III로 부터 폴리에틸렌글리콜 처리를 통해 정맥주사용 면역글로불린을 제조하였으나, 공정이 복잡하며 수율이 낮은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)을 출발물질로 하여 카프릴산 나트륨 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피를 사용하여 면역글로불린을 정제하면,
기존 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결할 수 있으며, 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 Ⅰ+III, 침전 II 단계의 생략이 가능하여 정맥주사용 면역글로불린의 제조과정이 매우 용이하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 안정적이고 고순도의 면역글로불린을 생산하기 위해 불순물 및 혈전생성물질을 효율적으로 제거할 수 있는 면역글로불린의 정제방법을 제공하는데 있다.
상기목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
(a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 Ⅰ+II+III(fraction Ⅰ+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;
(b) 상기 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 여과시킨 다음, 여과액을 농축하고 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;
(c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매/세정제를 처리한 후, 상기 용매/세정제를 제거하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 투석 및/ 또는 농축시키고, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및
(e) 상기 수득된 분획을 바이러스 필터에 여과하고 투석 및/또는 농축하여 정제된 면역글로불린을 수득하는 단계;
를 포함하는 면역글로불린의 정제방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조과정을 나타낸 모식도.
도 2는 제조 단계별 면역글로불린의 순도(Thrombin/IgG)를 측정한 결과.
도 3은 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 SDS-PAGE로 측정한 결과.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 "면역글로불린을 함유하는 혈장단백질"이라 함은 인간 혈장 또는 인간 태반 유래 혈장에서 Factor IX 및 항트롬빈과 같은 다양한 혈장 단백질이 제거된 무-저온침전물(cryoprecipitate-free) 혈장, 다양한 콘(cohn) 분획 및 암모늄 설페이트 또는 PEG(Polson et al., Biochem Biophys Acta, 82:463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang, 23:107. 1972)에 의한 침전법을 통해 얻어지는 분획들을 포함한다. 바람직하게 혈장 단백질 분획은 콘 분획 Ⅱ, 콘 분획 Ⅰ+II+III 또는 콘 분획 II+III가 사용될 수 있다.
본 발명에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 분획Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분 획법에 따라서 제조되었다. 분획 Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 다양한 응고인자들을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.
본 발명에서는, 인간혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)를 거쳐 승인된 미국 유래 혈장을 사용하였으며, -20℃ 이하에서 보관되어 있던 혈장을 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다. 그 후 침전과 여과 과정을 반복하여 최종적으로 분획 Ⅰ+II+III를 수득하였다.
면역글로불린이 포함된 혈장을 분리하기 위한 여과과정은 필터 보조제를 첨가하여 혼합시킨 다음 필터 프레스를 사용하여 상측액과 침전물을 분리하였으며, 상기 필터 보조제는 Celpure 300, Celpure 1000를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 분획 Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ 또는 분획 Ⅱ+Ⅲ의 용해는 분획 Ⅰ+II+III 또는 분획 II+III : 증류수가 1 : 6 내지 1 : 10이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 상기 증류수는 주사용 증류수를 사용할 수 있다.
혈장 단백질 분획은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. “실질적으로 비변성”은 상기 언급된 조건이 면역글로불린분자들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.
유리하게는, 혈장 단백질 분획은 플라즈마 단백질 분획 부피의 6 내지 10, 바람직하게는 7 내지 8배의 부피로 하나 이상의 비변성 완충제로 산성화된 물에 용해시키며, 면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, 바람직하게는 pH 6.0 이하로, 더 바람직하게는 4.0 내지 6.0으로, 가장 바람직하게는 4.1 내지 4.3이 되도록 유지한다. 산성 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 또는 주사용 증류수를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 침전 반응을 통해 면역글로불린이 포함된 상층액과 기타 물질을 분리하는 단계이다.
상기 침전제는 다양한 분자량을 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 카프릴산 및 황산암모늄에서 선택된 하나 이상의 물질을 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 비변성 수용성 단백질 침전제를 침전법의 수단으로 사용할 수도 있다. 바람직하게는 카프릴산을 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계에 따른 침전반응은 침전제가 5 내지 26mM, 바람직하게는 19 내지 21mM이 되도록 첨가한 다음 pH가 4 내지 6, 바람직하게는 4.5 내지 5.5가 되도록 조절한다. pH 조절은 아세트산 또는 수산화나트륨을 첨가할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 pH 조절을 위해 사용될 수 있는 다른 물질이 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
침전제는 침전 반응은 고체상과 액상 사이에서 평형이 이루어질 때까지, 약 1시간 동안, 바람직하게는 50분에서 1시간 10분 동안 수행된다. 침전 반응 전반에 걸쳐, 현탁액은 저온에서, 바람직하게는 2 내지 6℃에서 유지되며, 가장 적절한 온도는 단백질 침전제의 특성에 따라 조절할 수 있다.
침전 반응으로 침전된 침전물에는 다량의 응집된 단백질 물질이 포함되며, 상층액에는 면역글로불린이 포함되어 있으므로, 상층액만 취해 면역글로불린을 정제할 수 있으며, 면역글로불린-함유 상층액은 큰 응집체, 필터보조제, 잔류 비-용해된 페이스트 등을 제거하기 위해 여과 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 여과는 바람직하게 심층필터(depth filter)를 사용하며, C150 AF, AF 2000 또는 AF 1000(SChenk), 30 LA(Cuno) 또는 유사한 필터류를 이용하여 수행된다. 경우에 따라, 응집체, 필터 보조제, 잔류 비-용해된 단백질 물질의 제거는 또한 원심분리법에 의해 수행될 수도 있다.
본 발명에서는, 분획 Ⅰ+II+III 페이스트로부터 면역글로불린을 추출하기 위해 분획 Ⅰ+II+III 페이스트 : 증류수가 1 : 6 내지 10이 되도록 증류수 또는 WFI(주사용 증류수)를 첨가하여 추출된 단백농도가 15㎎/㎖가 되도록 하고, 1M 아세트산(acetic acid)를 사용하여 pH가 4.2±0.1이 되도록 조절한 다음, 분획 Ⅰ+II+III 페이스트를 추출하였다.
상기 추출액에 카프릴산(caprylate)의 농도가 20±1.0mM이 되도록 1M의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)용액을 첨가한 다음, 1M 아세트산(acetic acid) 또는 0.5M 수산화나트륨(NaOH)를 사용하여 pH가 5.1±0.1이 되도록 조절하고, 4℃에서 1시간±10분 동안 침전반응을 수행하였으며, 상층액을 회수하여 심층필터를 통해 면역글로불린 용액을 여과하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 면역글로불린을 농축시키고, 불순물을 제거하는 단계로서, 이 단계를 통해 면역글로불린의 농도를 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 30㎎/㎖으로 조정하며, 음이온교환 크로마토그래피를 pH 5.0 내지 6.0, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 pH는 5.4 내지 5.8, 가장 바람직하게 5.5 내지 5.7이 되도록 조절한다.
농축된 면역글로불린 함유 용액은 침전제 및 면역글로불린 A(IgA), 알부민, 응집체를 포함하는 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 하나 이상의 단계에 음이온 및 양이온교환 크로마토그래피를 적용시킬 수 있으며, 본 발명에서는 농축된 면역글로불린 함유 용액 속에 포함되어 있는 카프릴산 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
음이온교환 크로마토그래피 단계에서의 음이온교환 수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 수지로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환 수지를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 음이온교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 음이온교환 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.
본 발명에서는, 음이온교환 수지로 Q 세파로스 FF(Q sepharose Fast Flow)를 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에서를 위한 컬럼은 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액으로 pH가 5.6±0.1이 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 120±25 cm/hr으로 조절하였다. 농축된 면역글로불린 용액의 로딩 양은 90.0±20 mg/mLr이 되도록 컬럼에 로딩하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질을 제거하기 위한 단계로서, 바이러스-비활성화제, 바람직하게는 용매 및/또는 세정제, 가장 바람직하게는 용매-세정제 혼합물을 이용한 용매 및 세정제 처리(Solvent ＆ Detergent Treatment)가 이용될 수 있다.
상기 (c) 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 non A-B-C, HTLV1 및 2, 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.
상기 (c) 단계에서 사용될 수 있는 용매 및 세정제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용가능하다. 세정제는 비이온성 및 이온성 세정제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세정제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)이 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 용매/세정제 혼합물은 면역글로불린 함유 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량% 이내, 바람직하게는 0.24 내지 0.36 중량%가 되도록 첨가되며, 트윈 80의 농도는 0.8 내지 1.5중량% 범위 이내, 바람직하게는 0.8 내지 1.2중량%의 농도가 되도록 첨가한다.
바이러스-비활성화 단계는 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 면역글로불린 함유 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 바람직하게는 4 내지 30℃, 더 바람직하게는 19 내지 28℃, 가장 바람직하게는 24 내지 26℃이며, 반응시간은 바람직하게는 1 내지 24시간, 더 바람직하게는 4 내지 12시간, 가장 바람직하게는 약 8시간이며, 바이러스 비활성화를 보장하기에 충분하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 110 내지 130cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 pH는 4.9 내지 5.1이 되도록 조절하여 수행된다. 양이온교환 수지에 로딩되는 면역글로불린은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎, 더 바람직하게는 수지 ㎖당 95 내지 105 ㎎이다. 면역글로불린을 흡착시킨 후 평형 버퍼(equilibration buffer)로 세척한다. 상기 조건에서 세척에 이용되는 평형 버퍼는 컬럼 볼륨의 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상의 부피를 사용하여 세척할 수 있으며, 세척 후 컬럼부피의 8배 이상의 용출버퍼(elution buffer)로 면역글로불린을 용출한다.
양이온교환 수지는 세파덱스(Sephardex), 세파로즈(Sepharose), 하이퍼셀(HyperCell) 또는 소스(Source) 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 당업계에 공지된 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게 세라믹 계열의 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온교환수지로 세라믹 계열인 CM 하이퍼 D겔을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용하였다.
양이온교환 수지로부터 면역글로불린의 용출은 면역글로불린의 효율적인 용리를 야기시키기에 충분한 pH 및 이온 세기를 갖는 실질적으로 비-변성 완충액으로 수행하여 면역글로불린 함유 용출액을 회수한다. '효율적인 용리'는 양이온교환 수지에 로딩된 면역글로불린 용액의 75% 이상, 80% 이상 등, 예컨대, 85% 이상 등이 양이온 교환수지로부터 용출되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 양이온교환 수지에서 면역글로불린을 치환하기에 충분할 정도로 높은 용출 완충액의 염 농도에서 수행될 수 있으며, 400 내지 600 mM의 염농도, 바람직하게는 500mM의 염 농도에서 수행될 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 (d) 단계는 최종적으로 불순물을 한번 더 제거하는 단계이다.
투석 및/또는 농축시 중합체 함량을 유지하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피 용출액의 염 농도를 50 내지 150mM로 유지시킨 상태에서 수행되는 것이 바람직하다. 단백질 용출단계에서 낮은 염을 유지하는 용출방법을 통해 면역글로불린의 중합체 함량을 최소화하여 향상된 품질의 면역글로불린을 정제할 수 있다. 본 발명에서는 양이온교환수지 용출액은 중합체 함량 유지를 위해 100mM 이하의 염농도를 유지하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 삼투압 10 mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 한다. 즉, 양이온교환 크로마토그래피에서 용출된 용출액은 투석되고 농축되며, 투석여과(diafiltration) 및 한외여과에 의한 투석 및 농축이 한 단계로 수행된다. 투석/한외여과에 사용되는 막은 유리하게는 50,000 Da 범위의 공식 중량 컷오프를 갖는다.
본 발명에서는 양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템의 삼투압이 10mOsmol/kg 이하가 되도록 하였다. 투석 및/또는 농축된 면역글로불린은 굴절계(T/S meter)의 시험결과 1.5±0.1로 농축된 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 90 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 0.8 내지 1.2 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 pH는 5.78 내지 6.30, 가장 바람직하게 6.0 내지 6.2가 되도록 조절하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획은 바람직하게 0.96 내지 1.04 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수할 수 있다.
또한, 상기 (d) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획의 pH는 4.0 내지 5.5가 되도록 조절하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 pH가 4.3 내지 4.7이 되도록 산, 바람직하게는 1M 황산, 염산 또는 아세트산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에서는, 음이온교환 수지로 프랙토겔 EMD TMAE (Fractogel EMD TMAE)를 사용하였으며, 컬럼에 충진시킨 후, 20±1.0mM 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액으로 pH가 6.1±0.05가 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 120±30 cm/hr 조절하였다. 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액의 로딩 양은 110.0±10 mg/mLr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0±0.04 로딩볼륨으로 회수한 다음, 1M 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5±0.2로 조정하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 또는 한외여과/투석여과 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 나노여과는 2.0 내지 3.0 bar 압력 조건에서 수행하며, 한외여과/투석여과는 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 한다.
나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 2차 음이온교환 크로마토그래피에 붙지 않은 분획을 2.5±0.5 bar 압력보다, 바람직하게는 2.5±0.2 bar 압력보다 크지 않게 폴 DVD 프리필터(Pall DVD pre-filter) 및 DV20 바이러스 필터를 통해 여과시켜 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였으며, 그 후, 저분자 이온을 제거하기 위해 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하)로 투석여과를 수행하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계를 마친 후 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 면역글로불린을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 추가 첨가되는 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신 PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 글리신을 사용한다.
상기 안정화제는 200 내지 300mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며, 안정화제를 첨가한 후, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 pH가 4.7 내지 4.9가 되도록 산, 바람직하게는 황산 또는 염산을 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에서는, 면역글로불린의 안정화를 위해 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액에 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 섞어준 후, pH가 4.8±0.1이 되도록 0.5N 염산을 추가해 조절하고, 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시켜 보관하였다.
상기 멸균된 정맥주사용 면역글로불린 제제는 단백질 농도(정제된 면역글로불린)가 전체 부피의 1 내지 30중량%이 되도록 희석시키거나 농축시키는 것을 특징으로 하며, 본 발명에서는 단백질 농도가 40 내지 60ｇ/ℓ, 바람직하게는 45 내지 55ｇ/ℓ, 더 바람직하게는 49.5 내지 50.5ｇ/ℓ이 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 혼합시키고 pH가 4.8±0.1이 되도록 염산을 추가해 조절하여 정맥주사용 면역글로불린 제제의 최종 제형 제조하였다.
본 발명은 다른 관점에서 본 발명의 제조방법으로 제조된 정맥주사용 면역글로불린에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서, 제조 단계별 면역글로불린 용액의 순도(Thrombin/IgG) 및 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 측정한 결과, 순도 99% 이상의 면역글로불린 용액을 정제한 것을 확인하였으며(도 2), 혈전응고제인 FXI도 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었다 (표 2 및 도 3).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 정맥주사용 면역글로불린 제조
1-1 : 혈장(plasma)준비
혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)가 이루어지고 FDA에서 승인된 혈장을 사용한다.
본 발명에서는 미국 유래 혈장(Batch No. 600B0491)를 사용하였으며 혈장은 사용하기 전까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 혈장이 담겨 있는 병은 커틀 기기(bottle cutting machine)로 오픈하고, 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 혈장을 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 동결침강혈장(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 냉동 결핍성 혈장(cryopoor plasma)을 회수하였다.
1-2 : 침전(precipitation) Ⅰ
최종 에탄올 농도가 -3±1℃에서 8 ± 0.8%가 되도록 실시예 1-1에서 회수한 냉동 결핍성 혈장에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 7.2±0.2이 되도록 조절하였다. 침전 Ⅰ의 회수는 공정산물의 소요량에 따라 실시여부가 달라지며, 본 발명에서는 침전 Ⅰ 공정은 실시하였으나 원심분리를 통한 침전물 제거는 실시하지 않았다.
1-3 : 침전(precipitation) II+III 및 여과(filtration)
침전 Ⅰ 공정 이후, 결핍성 혈장에 포함된 면역글로불린(Immunoglpbulin)을 추가로 침전시키기 위해, 침전 II+III 단계를 수행하였다.
침전 Ⅰ 단계를 거친 결핍성 혈장에 최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 20±2%가 되도록 96% 에탄올(ethanol)을 추가로 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 6.9±0.1이 되도록 조절하였다.
그 후, 혈장 1㎏ 당 필터 보조제(Celpure 300, Celpure 1000) 0.0284㎏씩 첨가하고 30±10분 동안 혼합시켰다. 혼합물을 2 내지 8℃로 유지시킨 콜드룸(cold room)안에서 필터 프레스(filter press, 기기정보)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다.
상층액은 상층액(supernatant) Ⅰ+II+III (또는 II+III)으로 명명하고, 침전물은 분획(fraction) Ⅰ+II+IIIw (또는 II+IIIw)로 명명하였다 (w; wash). 분획 Ⅰ+II+IIIw (또는 II+IIIw)는 즉시 사용하거나 -20℃ 이하에서 보관한다.
1-4 : 분획 Ⅰ+II+III 페이스트(fraction Ⅰ+II+III paste)의 추출, 카프릴산(caprylate) 침전, 여과 및 농축
실시예 1-3에서 수득한 분획 Ⅰ+II+III 페이스트로부터 면역글로불린을 추출하기 위해 분획 Ⅰ+II+III 페이스트 : 증류수가 1 : 6 내지 10이 되도록 증류수 또는 WFI(주사용 증류수)를 첨가하여 추출된 단백농도가 15㎎/㎖가 되도록 하고, 1M 아세트산(acetic acid)를 사용하여 pH가 4.2±0.1이 되도록 조절한 다음, 2 내지 8℃의 온도에서 11±0.5 시간 동안 분획 Ⅰ+II+III 페이스트를 추출하였다.
추출액에 카프릴산(caprylate)의 농도가 20±1.0mM이 되도록 1M의 카프릴산 나트륨(sodium caprylate)용액을 첨가한 다음, 1M 아세트산(acetic acid) 또는 0.5M 수산화나트륨(NaOH)를 사용하여 pH가 5.1±0.1이 되도록 조절하고, 4℃에서 1시간±10분 동안 침전반응을 수행하였다. 그 후, 상층액을 회수하고 농축시키기 위해 심층여과 카트리지(depth filter cartridges; Ahlstrom-924 filter, Ahlstrom-950 filter를 사용해 면역글로불린 용액을 수득하였다. 상기 수득액을 농축하여 28±2㎎/㎖으로 농축하였다.
1-5 : 1차 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)
실시예 1-4에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액 속에 포함되어 있는 카프릴산 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
음이온교환수지는 Q 세파로스 FF(Q sepharose FF; GE Healthcare, Catalog No. 17-0510)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc), pH 5.6)를 사용하여 pH가 5.6±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-4에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액을 25℃이상에서 유속 120±25 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 90.0±20 mg/mLr이 되도록 하였다. 그 후, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수하였다.
1-6 : 용매 및 세정제 처리(solvent/detergent Treatment)
면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus)를 불활성화시키기 위해 용매 및 세정제를 처리하는 단계를 수행하였다.
먼저, 실시예 1-5에서 회수한 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 아세트산을 첨가하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 조절하였으며, 트리(엔-부틸)-포스페이트(Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP) 및 폴리소어베이트 80(Polysorbate 80 ; Tween 80)를 각각 0.3±0.06% 및 1±0.2% 의 농도가 되도록 첨가한 후, 20분 내지 30분 동안 200±50 RPM으로 교반하였다. 용액 안의 TNBP 및 Tween 80가 균일하게 혼합되었는지 일부를 샘플링하여 확인하였으며, 그 후로 25±1.0℃에서 8시간 동안 200±50 RPM으로 지속적으로 교반하였다.
1-7 : 양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)
용매/세정제 처리된 면역글로불린 용액에서 TNBP, Tween 80 및 응고인자 등이 다른 불순물을 제거하기 위해 양이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
양이온교환 수지는 세라믹 재질인 CM 하이퍼 D 겔(Pall Corporation ; Catalog No. 20050)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 25±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc))를 사용하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-6에서 용매/세정제 처리된 면역글로불린 용액을 20±2℃에서 유속 120±10cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 100.0±5 mg/mLr이 되도록 하였다. 또한, 컬럼 부피의 5배 이상의 세척버퍼로 세척한 후, 컬럼 부피의 8배 이상의 용출 버퍼(용출버퍼 조성 : 20mM NaOAc pH 4.5 w/ 0.5M NaCl)를 사용하여 면역글로불린을 용출시켰다.
1-8 : 투석여과(diafiltration)
양이온교환 크로마토그래피 용출액에서 저분자 이온을 제거하기 위해 투석여과를 수행하였다.
실시예 1-7에서 수득한 용출액은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; Millipore Pellicon2(50K)) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였으며, UF/DF 시스템은 중합체 함량을 유지하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 계산된 투석농축액에 첨가하여 100mM 염화나트륨 이하의 농도를 유지시키면서 연속적으로 진행하였다.
1-9 : 2차 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)
실시예 1-8에서 수득한 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액 속에 포함되어 있는 폴리머 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 2차 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
음이온교환수지는 프랙토겔 EMD TMAEQ (Fractogel EMD TMAE; Merck-Millipore, Cat No. 116887)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer; 20±0.5mM 아세트산 나트륨(NaOAc), pH 6.1)를 사용하여 pH가 6.1±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-8에서 수득한 농축된 면역글로불린 용액을 20±2℃에서 유속 120±30 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 로딩 양은 110.0±10 mg/mLr이 되도록 하였다. 그 후, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.0±0.04 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 회수한 다음, 염산을 첨가하여 pH를 4.5±0.1로 조정하였다.
1-10 : 나노여과(nanofiltration) 및 투석여과(diafiltration)
나노여과는 중요한 바이러스 제거단계로, 실시예 1-9에서 투석 농축된 면역글로불린 용액을 2.0±0.5 bar 압력보다 크지 않게 프리필터(FlorodyneⅡ prefilter, AB1DJL7PH4 )로 여과하고, 2.0±0.5 bar 압력 조건하에서 바이러스 필터(DV20, AB3DV207PH4)를 통해 여과시켜 면역글로불린 용액 속에 포함된 바이러스를 제거하였다.
그 후, 저분자 이온을 제거하기 위해 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였다.
1-11 : 안정제(stabilizer) 추가 및 최종 제형 제조
면역글로불린의 안정화를 위해 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액에 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 섞어준 후, 안정화된 면역글로불린 용액의 pH를 측정하고 pH가 4.8±0.1이 되도록 0.5N 염산을 추가해 조절하였다. 그 다음, 여과액을 0.2 μm 필터를 이용해 멸균시키고, 스테인레스 스틸 저장탱크로 옮겨 보관하였다.
정맥주사용 면역글로불린 제제의 최종 제형은 단백질 농도가 50±0.5ｇ/ℓ가 되도록 WFI로 희석하거나 한외여과로 농축시킨 다음, 글리신(glycine)을 최종 농도가 250±50mM이 되도록 첨가하고 완전히 혼합시켰으며, 그 후, 안정화된 면역글로불린 제제의 pH를 측정하고 pH가 4.8±0.1이 되도록 염산을 추가해 조절하였다.
면역글로불린 제제는 pH 조정후 멸균시키며, 충전을 위해 충전룸으로 옮겨 제품을 제조한 뒤 2 내지 8℃에 보관하였다.
실시예 2 : 제조 단계별 면역글로불린 용액 내 Thromboembolic risk 측정 (Generated Thrombin/IgG)
상기 실시예 1의 제조단계별로 샘플링한 면역글로불린 제제의 순도(Thrombin/IgG)를 측정하였다.
2-1. 실험 방법
본 발명에서 상기 실시예 1의 제조 단계별 면역글로불린 용액 내 Thromboembolic risk 측정은 FDA 산하 6개 분석기관의 하나인 CBER (Center for Biologics Evaluation and Research)의 Thrombin Generation protocol(CBER Thrombin Generation protocol 01 Experiment (100916)a)에 따라 실시하였다.
2-2. 실험 결과
본 발명의 면역글로불린 정제 공정은 콘 혈장분획 방법과 이온 크로마토그래피의 정제기법을 동반하고 있으며, 도 2 및 표 1에서 보는 바와 같이, 카프릴산 침전공정과 크로마토그래피 정제기법 중 양이온 교환수지 크로마토그래피 및 2차 음이온 교환수지 크로마토그래피에서 혈전 생성 물질로 야기되는 Generated thrombin의 양이 효과적으로 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
표 1 제조 공정 단계별 산물 분석표
단계 (process) 비고 트롬빈(Thrombin) nM
1. 페이스트 추출 (paste extraction) 266.4
2. 카프릴산 침전(caprylate precipitation) 56.9
3. 1차 음이온 교환 크로마토그래피(1st AEX chromatography) 로딩부분 71.9
통과액 부분 40.0
4. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX chromatography) 로딩 부분 37.6
용출 부분 29.4
5. 2차 음이온 교환 크로마토그래피(2nd AEX chromatography) 로딩 부분 25.5
통과액 부분 7.4
6. 나노여과 (nanofilitration) 9.1
7. 농축 (concentration) 7.7
8. 크루드 용액 (crude solution) 14.5
이는 면역글로불린의 정맥주사로 야기될 수 있는 혈전생성을 최소화하여 혈전생성에 따른 혈전색전증을 효과적으로 방지하고, 이를 통해 면역글로불린의 안전성을 극대화할 수 있음을 보여준다.
실시예 3 : 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도 측정
혈전응고제의 제거 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 ELISA( AssayMax Human Factor XI (FXI) ELISA Kit; ssaypro, Catalog No. EF1011-1) 및 SDS-PAGE로 측정하였다.
표 2 정제 공정 상물들의 FXI 함량
단계 (process) 비고 FXI(EIA)
(ng/mL)
1 페이스트 추출 (paste extraction) 732.77
2 카프릴산 침전 (caprylate precipitation) 1.76
3 1차 음이온 교환 크로마토그래피(1st AEX chromatography) 로딩부분 4.16
4 통과액 부분 1.02
5 양이온 교환 크로마토그래피(CEX chromatography) 로딩 부분 1.93
6 용출 부분 2.16
7 2차 음이온 교환 크로마토그래피 (2nd AEX chromatography) 로딩 부분 0.31
8 통과액 부분 2.67
9 나노여과 (nanofilitration) 6.46
10 농축 (concentration) 4.89
11 크루드 용액 (crude solution) N.D
본 발명의 정제 공정의 산물들의 FXI 함량을 측정하기 위해 ELISA 및 SDS-PAGE으로 측정한 결과, 표 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 카프릴산 침전, 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지 크로마토그래피에서 FXI가 거의 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조방법은 분획 I+II+III 또는 분획 II+III를 출발물질로 하여 분획 Ⅱ를 제조하기 위한 침전 단계의 생략이 가능하고, 카프릴산 나트륨 1차 침전법과 음이온교환 크로마토그래피 및 양이온교환 크로마토그래피 사용으로 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 제조함에 있어 발생하는 공정의 번거로움과 낮은 수율의 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명에 따른 면역글로불린의 정제방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 면역글로불린의 생산이 가능하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 다음 단계를 포함하는 면역글로불린의 정제방법:
    (a) 면역글로불린을 함유하는 혈장 단백질 분획 I+II+III(fraction I+II+III) 또는 분획 II+III(fraction II+III)를 용해시킨 다음, 침전제를 첨가하여 침전반응을 수행하는 단계;
    (b) 상기 침전물을 제거하고 면역글로불린이 포함된 상층액을 여과시킨 다음, 여과액을 농축하고 음이온교환 크로마토그래피를 수행하고, 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계;
    (c) 바이러스 불활성화를 위하여 상기 수득된 분획에 용매/세정제를 처리한 후, 상기 용매/세정제를 제거하기 위하여 양이온교환 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (d) 상기 양이온교환 크로마토그래피 용출액을 투석 및/또는 농축시키고, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계; 및
    (e) 상기 수득된 분획을 바이러스 필터에 여과하고 투석 및/또는 농축하여 정제된 면역글로불린을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 분획 I+II+III 또는 분획 II+III의 용해는 분획 I+II+III 또는 분획 II+III : 증류수가 1 : 6 내지 1 : 10이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 침전제는 카프릴산(caprylate)인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 침전반응은 침전제가 5 내지 26mM이 되도록 첨가한 다음, pH가 4.0 내지 6.0이 되도록 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.0 내지 6.0, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.6 내지 2.0 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용매는 트리(엔-부틸)-포스페이트 (TNBP, Tri-n-butyl phosphate)인 것을 특징으로 하며, 세정제는 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 400 내지 600 mM의 염 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 110 내지 130cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피에 흡착되는 면역글로불린의 흡착량은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 세라믹 계열의 양이온교환 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및/또는 농축시 중합체 함량을 유지하기 위하여, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피 용출액의 염 농도를 50 내지 150mM로 유지시키는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과 (Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 90 내지 150cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 0.8 내지 1.2 로딩볼륨(Loding Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획의 pH는 4.0 내지 5.5가 되도록 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 여과는 나노여과(nanofiltration) 또는 한외여과/투석여과 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 나노여과는 2.0 내지 3.0 bar 압력 조건에서 수행하며, 상기 한외여과/투석여과는 삼투압 10mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계 이후, 안정화제를 첨가하여 정맥주사용 면역글로불린을 제조하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토스, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 안정화제는 200 내지 300mM이 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 안정화제를 첨가한 후, pH를 4.5 내지 5.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 정제방법.
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