KR100188448B1 - 바이러스 불활성 면역글로불린 용액 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역글로불린이 비이온성 계면활성제(차후, 소수성 물질상에서의 고상 추출에 의해 제거되는)로 처리되는 정맥내 사용을 위해 적합한 바이러스 불활성화된 면역글로불린 용액 제조방법을 설명해준다.

Description

바이러스 불활성 면역글로불린 용액 제조방법

본 발명은 정맥주사(intravenous injection)용으로 적합한 바이러스 불활성 면역글로불린 용액(virus-inactivated immunoglobulin solutions) 제조 방법에 관한 것이다.

면역글로불린은, 혈장 또는 혈청 단백질들의 전기영동(electrophoresis)시 이른바 감마분획(γ-fraction)과 더불어 이동하여, 전에는 감마-글로불린으로 불렸던, 체액 당단백질들(humoral glycoproteins)이다.

면역글로불린들은, 그들의 높은 항체 농도로 인하여, 감염의 예방조처 및 치료에 사용되어 왔다.

근육내 및 피하용 면역글로불린 제조방법은 이미 공지된 바 있다. 빈번히 사용되는 제조방법은, 6/9 방법으로도 불리는, 이른바 콘-온클레이 분획법(Cohn-Oncley fractionation)[Cohn et al. J. Am. Chem. Soc. 68, 459(1946); Oncley dt al. J. Am. Chem. Soc. 71, 541(1949)]이다.

하지만, 이 제조방법은, 단지 근육내 및 피하경로로만 사용될 수 있고 그리고 비교적 작은 볼륨(volume) 내에 고농도의 항체를 지나는 고점성용액(highly viscous solution)이 얻어지는 단점을 지닌다. 이 제조방법으로 얻어진 생성물은 4℃에서 안정하긴하나, 플라스민(plasmin) 오염에 의해 야기되는 단백질 분해(proteolysis)가 일어날 수도 있다. 더우기, 사용시, 환자에게 과민성반응을 유발시킬 수도 있는 IgA 및 IgG 이량체가 존재하게 될 수도 있다(Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry 1989, A14, pp. 93, 94).

이같은 이유로, 환자에게 향상된 내약성을 보여주는 정맥내에 사용가능한 면역글로불린들이 개발되게 됐다. 그들 면역글로불린들은, 이른바 분획 3 또는 pH 4의 콘 분획 2(Cohn fraction 2)(상기 Cohn 등 참조)로부터, 폴리(에틸렌 글리콜), 순차적으로 에탄올 침전법, 한외여과법(ultrafiltration) 또는 다이아필트레이션(diafiltration) 및 이온교환 크로마토그라피법등을 이용하여 제조된다. 이런식으로 얻어진 면역글로불린은 단- 또는 이당류(mono-or disaccharide)로 안정화된다.

그러한 향상된 방법은 EP 제 0,073,371호에 설명되어 있다.

분획 3(상기 Cohn 등 참조)에서 시작하는, 한외여과 및 다이아필트레이션은 용해 및 pH 4로 조정한 후 행해진다. 다음에, 그 획득여액은 중량비 5%의 단백질 함량까지 농축되게 하고, 그에 따라 알콜함량은 중량비 8%까지 감소되게 한다. 그런식으로 얻어진 면역글로불린 용액이 일단 최고 8%의 단백질 함량까지 농축되면, 이온강도(ionic strength) 0.01 및 pH 4.2를 지니는, 투명한 물과 같은 용액이 얻어지게 된다. 중량비 10%의 말토즈(maltose)로, 그 용액의 삼투성(tonicity)을 중량비 5%의 단백질 함량 범위로 조정한다. 다음에, 살균여과 및 동결건조를 행한다.

주사전에, 그 동결건조된 물질을 적합한 매질(media)에 용해시킨다.

이런 식으로 제조된 정맥주사용 면역글로불린들의 한가지 주요한 단점은, 사용 전, 그들이 적합한 매질에 용해되어야만 하고, 단지 동결건조된 형태로만 저장될 수 있다는 것이다.

또다른 결점은, 생산공정 중 바이러스 불활성화가 이루어지지 않으므로 해서, 이들 면역글로불린 사용시에, 바이러스가 환자에 옮겨질는지도 모른다는 것이다. 따라서, 정맥 내 면역글로불린 투여후, 간염성 질환 및 HIV 간염이 보고되기에 이르렀다(Ullmann's Encyclopedia of Ind. Chem., Vol. A14, 1989, pp. 102, 103).

그러므로, 본 발명의 기술적 문제는 정맥주사용 면역글로불린의 바이러스 불활성화 방법(즉, 사용시 환자에 대한 바이러스 감염이 일어나지않고, 그리고 심지어 동결건조 없이도, 주사액으로 직접 제조 및 저장될 수 있을 정도로 안정한 바이러스 불활성화된 면역글로불린액을 생산하는 방법)을 개발하는 것이었다.

본 발명의 기술적 문제는 면역글로불린이 바이온성 계면활성제로 처리된 뒤, 다음에 그 계면활성제가 소수성물질상에서 고상추출방법으로 제거되는 것으로 특징지워지는 방법에 의해 해결되어진다.

비이온성 계면활성제로서는, 특별히 TNBP 및/또는 Triton×100이 사용된다. 그 용액의 pH치는 5.0에서 5.5 사이가 바람직하다.

바람직한 실시예에서, 비이온성 계면활성제 처리뒤에는, 생물학적으로 적합성인 식물성오일(vegetable oil)을 사용한 이같은 비이온성 계면활성제의 추출 및 제거가 행해지게 된다. 식물성오일로서는, 캐스터오일(castor oil) 또는 소이오일(soy oil)가 사용되는 것이 바람직하다.

그 순차적 고상추출은, 또한 역상 크로마토그라피법에도 사용되는 옥타데실-유도 물질(octadecyl-derivatized material)을 사용하여 바람직한 방법으로 행해진다. 특히 더 바람직한 실시예에서, 고상 추출은 옥타데실( C-18) 수지상에서 행해지는 역상 크로마토그라피법으로 실행되게 된다.

고상추출 다음에는, 안정화를 목적으로 이당류가 최종 생성물에 첨가될 수도 있다. 그다음, 그 최종 용액은 단일 또는 다중살균여과(single or multiple sterile filtration)법으로 처리된다.

더우기, 면역글로불린 용액은 바이러스 불활성화 전에 및/또는 살균여과 후에 한외여과 또는 다이아필트레이션법으로 처리될 수 있다.

다음에, 본 발명의 생산방법을 상세히 설명하고자 한다. 공개기술로서 이미 공지된 바와같이, 차음에, 이른바 콘-분획 2를 완전히 투명한 용액이 얻어질 때까지 물에 용해시킨다. 그다음, 그 용액을 pH 4.0에서 5.0으로, 바람직스럼기로는 4.5로 조정한 뒤, 오염 물질 제거를 목적으로 여과한다.

계속하여, 그 용액을 한외여과 처리하여 그 용액을 예비농축시킨다. 한외여과 배척한계(ultrafiltration exclusion limit)는 30,000달톤(Dalton)이다. 이 단계에서는, 저분자량을 지니는 오염물질들이 제일 먼저 제거된다. 계속하여, 다이아필트레이션처리를 수행하여 이온들을 제거한 후 실제로 바이러스를 불활성화시킨다.

이를 행함에 있어, 그 용액을 우선 4℃에서 8℃까지 냉각하고, 그리고 5.0에서 5.5까지, 바람직하기로는 5.3까지의 pH로 조정한다. 그다음, 비이온성 계면활성제, 바람직하기로는 TNBP 및/또는 Triton×100을 첨가하고, 첨가후 용액을 여러 시간동안 교반한다. 계속하여, 바람직한 실시예에서는, 식물성오일 추출(vegetable oil extraction)을 실행할 수도 있다.

이때, 중량비 5%의 식물성 오일을 그 용액에 첨가하고, 그 첨가 완결 후에는, 그 용액을 실온으로 옮겨, 교반에 의해 식물성유와 혼합시킨다. 순상분리(subsequent phase separation)다음에 여과를 행한다.

그다음, 그 용액을 C 18 칼럼에 채워, 크로마토그라피 처리한다. 크로마토그라피 처리뒤에, 그 pH를 pH 4로 조정한다. 삼투성을 조정하기 위해 말토즈를 첨가한다. 다음의 살균여과뒤에, 이런식으로 얻어진 용액의 안정성을 최소한 22시간 동안 37℃에 저장하여 시험한다. 그 용액이 혼탁함을 보여주는 경우에는, 그 용액을 사용할 수 없다. 만일 그 용액이 이 기간동안 혼탁함을 보여주지 않는다면, 그 pH를 5.0에서 5.5로, 바람직스럽기로는 5.3으로 조정하고, 또다른 한외여과 및 다이아필트레이션을 행해한 후, 이렇게해서 얻어진 그 용액에 말토즈를 첨가하여 50g/l의 단백질 함량으로 조정한다. 계속하여, 또다른 살균여과를 행한 후, 그 용액을 직접 주사(주입) 병(infusion bottles)에 채운다.

이런식으로 얻어진 생산물은 바이러스를 결여한 것이므로 해서 직접 정맥주사용으로 사용할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 방법을 좀더 상세히 설명하기 위해 마련됐다.

[실시예]

콘 분획 2를 여섯배의 물을 이용해 용해시키고, 투명용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 계속해, pH를 0.5N NCl을 사용하여 4.5로 맞추었다.

pH 조정뒤, 이를 한외여과(여기서 그 용액은 90g/l까지 예비농축되는) 처리하였다. 한외여과시 사용한 막은 Novasette 30 K membrane이었다. 계속해, 다섯배의 물로 희석한 뒤, 0.3에서 0.5바(bars) 범위에서, 이를 다이아필드레이션 처리했다. 이 다이아필트레이션과 뒤에, 다이아필트레이션된 상기 용액을 단백질 함량 70g/l이 되게 조정했다. 상기 용액을 4에서 8℃까지 냉각시킨뒤, 이를 0.1N의 수산화나트륨 용액을 이용 pH 5.3으로 조정했다. 다음에, 중량비 0.3%의 TNBP 및 중량비 1%의 Triton×100을 상기 용액에 첨가한 뒤, 격렬히 흔들어주었다. 4에서 8℃에 약 4시간을 방치시킨뒤, 중량비 5%의 캐스터오일을 첨가했다. 그다음, 15℃에서 오일 추출을 행하였다. 얻어진 상들을 분리해낸뒤, 이를 Cuno sheet filter를 사용해 여과시켰다. 다음에, 상기 용액을 옥타데실-유도 물질과 함께 C18 칼럼에 채웠다. 그다음, 상기 용액을 pH 4로 조정한 뒤, 100g/l의 말토즈를 첨가했다. 그뒤 살균여과를 행하고, 이 살균여과된 용액을 37℃에 저장(22에서 24시간동안) 하였다. 그다음 투명해진 상기 용액을 0.1N의 수산화나트륨 용액을 이용 pH 5.3으로 조정했다. 재차, 한외여과 및 다이아필트레이션을 행한뒤, 100g/l의 말토즈를 첨가해, 상기 용액을 50g/l의 단백질 함량으로 조정하였다. 계속하여 살균여과한 뒤에, 그 용액을 살균 및 실리콘처리된 주입(주사) 병들에 채운뒤, 뚜껑으로 봉인하고 포장했다.

Claims (9)

1. 면역글로불린을 TNBP 및/또는 Triton×100으로 처리하고, 연이어 TNBP 및/또는 Triton×100를 소수성 물질상에서의 고상 추출로 제거하는, 정맥내 적용에 적합한 바이러스-불활성화 면역글로불린 용액의 제조방법에 있어서, TNBP 및/또는 Triton×100의 처리 후 생물학적으로 적합성인 식물성 오일로써 추출이 수행되고, 오일은 연이어 TMBP 및/또는 Triton×100과 함께 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 용액의 pH가 5.0-5.5인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물성 오일로서 캐스터 오일(caster oil) 및/또는 소이 오일(soy oil)을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 역상 크로마토그라피법에도 사용되는 옥타데실-유도물질로써 고상추출을 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상추출을 C₁₈역상 크로마토그래피법으로 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상추출시킨 다음 이당류를 용액에 가하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 최종 용액을 단일 또는 다중 살균여과 처리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이러스 불활성화 이전에 및/또는 살균여과 이후에 면역글로불린 용액을 한외여과 및 다이아필트레이션 처리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상추출 이후 또는 이당류를 가한 다음에, 제조된 용액의 안정성 시험을 행하는 것을 특징으로 하는 방법.