FI107122B - Menetelmä virusten suhteen inaktivoitujen immunoglobuliiniliuosten valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 107122

Menetelmä virusten suhteen inaktivoxtujen immunoglobulii-niliuosten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee virusten suhteen inaktivoitu-5 jen immunoglobuliiniliuosten valmistamista, jotka soveltu vat laskimonsisäisesti injektoitaviksi.

Immunoglobuliinit ovat humoraalisia glykoproteiine-ja, jotka vaeltavat plasma- tai seerumiproteiinien elektroforeesissa niin kutsuttuun gammafraktioon ja joita on 10 siksi aiemmin kutsuttu gammaglobuliineiksi.

Immunoglobuliineja käytetään suuren vasta-ainepitoisuutensa vuoksi infektioiden ennaltaehkäisyyn ja hoitoon.

Immunoglobuliineja valmistetaan tunnetusti sekä li-15 haksensisäistä että ihonalaista antoa varten. Yksi paljon käytetty valmistusmenetelmä on niin kutsuttu Cohn-Oncley-fraktiointi, jota kutsutaan myös 6/9-menetelmäksi [Cohn et ai., J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459; Oncley et ai., J.

Am. Chem. Soc. 71 (1949) 541].

20 Tämän valmistusmenetelmän haittapuolena on kuiten kin, että se johtaa hyvin jäykkäliikkeiseen liuokseen, jota voidaan antaa vain lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti suhteellisen pieninä tilavuuksina, jolloin vasta-ainepitoisuudet ovat korkeita. Saatu tuote on tosin ·· 25 stabiili lämpötilassa 4 °C, mutta siinä voi tapahtua plas man epäpuhtauksien aiheuttamaa proteolyysiä. Lisäksi läsnä voi olla IgA-jalgG-dimeerejä, jotka voivat annon yhteydessä johtaa potilaassa anafylaktiseen reaktioon (Ull-mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, voi A14, 30 1989, s. 93 ja 94).

··. Tästä syystä on kehitetty laskimonsisäisesti annet- • · tavissa olevia immunoglobuliineja, jotka ovat potilaiden paremmin sietämiä. Niitä valmistetaan niin kutsutusta fraktio 3:sta tai myös Cohn-fraktio 2:sta (Cohn et ai., 35 supra) pH:n 4 vallitessa käyttämällä polyeteeniglykolia, 2 107122 sitä seuraavaa etanolisaostusta, ultra- tai diasuodatusta ja ioninvaihtokromatografiaa. Tällä tavalla valmistettu immunoglobuliini stabiloidaan mono- tai disakkarideilla.

Tällaista parannettua menetelmää kuvataan EP-jul-5 kaisussa 0 073 371.

Lähdettäessä fraktio 3:sta (Cohn et ai., supra) tehdään liuotus, pH:n säätö arvoon 4 ja sen jälkeen ultra-suodatus tai diasuodatus. Sen jälkeen konsentroidaan saatu suodos proteiinipitoisuuteen 5 paino-% ja alkoholipitoi-10 suus alennetaan 8 paino-%:iin. Kun siten saatu immunoglo-buliiniliuos on konsentroitu proteiinipitoisuuteen 8 %, saadaan kirkas veden kaltainen liuos, jonka ionivahvuus on 0,01 ja jonka pH on 4,2. Liuoksen toonisuus säädetään käyttämällä 10 paino-% maltoosia proteiinipitoisuuden ol-15 lessa 5 paino-%. Sen jälkeen tehdään suodatussterilointi ja kylmäkuivaus. Kylmäkuivattu materiaali liuotetaan ennen injektointia sopiviin väliaineisiin.

Siten valmistettujen laskimonsisäiseen käyttöön tarkoitettujen immunoglobuliinien suurena epäkohtana on, 20 että ne täytyy ennen käyttöä liuottaa ensin sopiviin väliaineisiin ja ne ovat varastoitavissa vain kylmäkuivatussa muodossa.

Yhtenä lisäepäkohtana on, että käytettäessä näitä immunoglobuliineja potilaaseen voi kulkeutua viruksia, ;·' 25 koska valmistusmenettelyn aikana ei tapahdu virusten inak- tivointia. Niinpä on kuvattu laskimonsisäisen immunoglobu-liinin annon jälkeisiä hepatiittisairauksia ja HIV-infek-tioita (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, voi A14, 1989, s. 102 ja 103).

30 Keksinnön taustalla olevana teknisenä ongelmana oli siten menetelmän kehittäminen laskimonsisäisesti injektoi- ♦ tavissa olevien immunoglobuliinien sisältämien virusten inaktivoimiseksi, joka johtaa tuotteeseen, jonka annon yhteydessä ei tapahdu virusten siirtymistä potilaisiin ja 3 107122 joka on niin stabiili, että se voidaan valmistaa suoraan injektioliuoksena ja varastoida jopa ilman kylmäkuivausta.

Keksinnön taustalla oleva tekninen ongelma ratkaistaan menetelmällä, jolle on tunnusmerkillistä, että immu-5 noglobuliini käsitellään ionittomilla tensideillä, jotka sitten poistetaan tekemällä kiinteäfaasiuutto hydrofobisilla materiaaleilla.

Ionittomina tensideinä käytetään erityisesti TNDP:tä ja/tai Triton X100:aa. Liuoksen pH on edullisesti 10 5,0 - 5,5.

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa tehdään ionot-timilla tensideillä käsittelemisen jälkeen uutto biologisesti yheensopivilla kasviöljyillä ja erotetaan nämä sitten. Kasviöljyinä käytetään edullisesti risiiniöljyä tai 15 soijaöljyjä.

Kiinteäfaasiuutto tehdään edullisesti oktadekyyli-johdannaisaineilla, joita käytetään myös käänteisfaasikro-matografiässä. Yhdessä erityisen edullisessa suoritusmuodossa kiinteäfaasiuutto toteutetaan oktadekyyli-C18-hart-20 silla tehtävällä kääntiesfaasikromatografiällä.

Valmiiseen tuotteeseen voidaan lisätä kiinteäfaa-siuuton jälkeen disakkaridia stabilointiaineeksi. Valmiste liuos steriloidaan sitten kerran tai useammin suodattamalla.

;*< 25 Immunoglobuliiniliuokselle voidaan lisäksi tehdä ennen virusten inaktivointia ja/tai suodatussterilointia ultra- ja diasuodatus.

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti. Ensin niin kutsuttu Cohn-fraktio II 30 liuotetaan tekniikan tasoa vastaavalla tavalla veteen ' **. kirkkaaksi liuokseksi. Liuoksen pH säädetään sitten arvoon 4,0 - 5,0, edullisesti 4,5, ja se suodatetaan epäpuhtauksien poistamiseksi.

Sitten liuos ultrasuodatetaan ja konsentroidaan. 35 Ultrasuodatuksen moolimassaraja on 30 000 daltöniä. Tässä . 107122 4 vaiheessa poistuvat erityisesti moolimassaltaan alhaiset epäpuhtaudet. Sen jälkeen tehdään diasuodatus ionien poistamiseksi, minkä jälkeen tapahtuu varsinainen virusten inaktivointi.

5 Tämän tekemiseksi liuos jäähdytetään ensin lämpöti laan 4 - 8 °C ja säädetään sen pH arvoon 5,0 - 5,5, edullisesti 5,3. Sitten lisätään ionittomia tensidejä, edullisesti TNBP:tä ja/tai Triton X100:aa, ja sekoitetaan tätä liuosta useita tunteja. Tämän käsittelyn päätteeksi voi-10 daan yhdessä edullisessa suoritusmuodossa tehdä kasviöljy-uutto. Siinä lisätään liuokseen 5 paino-% kasviöljyä, annetaan liuoksen lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoitetaan sitä yhdessä kasviöljyn kanssa. Tätä seuraavan faasien erottumisen jälkeen tehdään suodatus.

15 Liuos laitetaan sitten Cl8-pylväälle ja käsitellään kromatografisesti. Kromatografian jälkeen säädetään pH arvoon 4. Toonisuuden säätämiseksi lisätään maltoosin. Sitä seuraavan suodatussteriloinnin jälkeen testataan saadun liuoksen stabiilius pitämällä sitä vähintään 22 tuntea 20 lämpötilassa 37 °C. Jos liuoksessa esiintyy samentumista, se ei ole käyttökelpoisa. Ellei liuoksessa tämän ajan kuluessa esiinny samentumista, sen pH säädetään arvopn 5,0 - 5,5, edullisesti 5,3, tehdään toinen ultra- ja dia-suodatus ja säädetään siten saadun liuoksen proteiinipi-25 toisuus maltoosin lisäämisen jälkeen arvoon 50 g/1. SUn jälkeen tehdään vielä suodatussterilointi ja pakataan liuos suodaan infuusiopulloihin.

Siten saatua tuotetta voidaan ruiskuttaa suoraan laskimonsisäisesti, ja se on viruksetonta.

30 Keksinnön mukaista menetelmää valaistaan tarkemmin seuraavalla suoritusesimerkillä.

• ·

Suoritusesimerkki

Cohn-fraktio II liuotetaan kuusinkertaiseen määräin vettä ja sekoitetaan niin pitkään, että muodostuu kirkas 35 liuos. Sen jälkeen pH säädetään arvoon 4,5 HCl-liuoksella 5 107122 (0,5 ekv/1). Sen jälkeen tehdään ultrasuodatus, jossa liuos konsentroituu pitoisuuteen 90 g/1. Kalvotyyppinä ‘ käytetään Novasette 30 K:ta. Sitten liuos laimennetaan viisinkertaisella määrällä vettä ja tehdään diasuodatus 5 paineella 0,3 - 0,5 bar. Tämän diasuodatuksen jälkeen säädetään diasuodatetun liuoksen proteiinipitoisuus arvoon 70 g/1. Liuos jäähdytetään lämpötilaan 4 - 8 °C ja säädetään sen pH arvoon 5,3 natriumhydroksidiliuoksella (0,1 ekv/1). Sitten liuokseen lisätään 0,3 paino-% 10 TNBP:tä ja 1 paino-% Triton X100:aa ja sekoitetaan voimakkaasti. Noin 4 tunnin kuluttua lisätään lämpötilassa 4 - 8 °C 5 paino-% risiiniöljyä. Sen jälkeen tehdään öl-jyuutto lämpötilassa 15 °C. Muodostuneet faasit erotetaan ja tehdään sitten suodatus Cuno-kerrossuodattimella. Sen 15 jälkeen liuos laitetaan oktadekyylijohdannaisaineilla täytetylle C18-pylväälle. Liuoksen pH säädetään sitten arvoon 4 ja lisätään 100 g/1 maltoosia. Sen jälkeen tehdään suo-datussterilointi ja pidetään steriiliksi suodatettua liuosta 22 - 24 tuntia lämpötilassa 37 °C. Tämän jälkeen 20 kirkkaan liuoksen pH säädetään arvoon 5,3 natriumhydroksidiliuoksella (0,1 ekv/1). Seuraavaksi tehdään jälkeen ultra- ja diasuodatus ja sen jälkeen maltoosin lisääminen pitoisuudeksi 100 g/1 ja liuoksen proteiinipitoisuuden säätö arvoon 50 g/1. Kun on tehty vielä suodatussteriloin-25 ti, liuos pakataan steriloituihin ja silikonikäsiteltyihin 50 ml:n infuusiopulloihin, suljetaan pullot tulpilla ja varustetaan ne kauluksilla.

* **« « • ·

Claims (10)

1. 6 107122
2. 1. Menetelmä laskimonsisäiseen antoon soveltuvien, virusten suhteen inaktivoitujen immunoglobuliiniliuosten 5 valmistamiseksi, jossa menetelmässä immunoglobuliini käsitellään ionittomilla tensideillä, jotka sitten poistetaan hydrofobisilla, materiaaleilla tehtävällä kiinteäfaasiuu-tolla, tunnettu siitä, että ionittomilla tensideillä tehdyn käsittelyn jälkeen tehdään uutto biologises-10 ti yhteensopivilla kasviöljyillä ja poistetaan nämä sitten.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH-arvo 5,0 - 5,5.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä., 15 tunnettu siitä, että ionittomina tensideinä käyte“ tään TNBP:tä (tri-n-butyyli-fosfaattia) ja/tai Triton X100:aa.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasviöljyinä käyte- 20 tään risiiniöljyä ja/tai soijaöljyä.
6. 5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteäfaasiuutto tehdään oktadekyylijohdannaisaineilla, joita käytetään myös kään-teisfaasikromatografiässä.
7. 6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä; tunnettu siitä, että kiinteäfaasiuutto tehdään C18-käänteisfaasikromatografiällä.
8. 7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuokseen lisätään kiinteä-30 faasiuuton jälkeen disakkaridia. ·, 8. Patenttivaatimusten 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmis liuos steriloidaan suodattamalla yhteen tai useampaan kertaan.
9. 9. Patenttivaatimusten 1-8 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että immunoglobuliiniliuokselle 107122 tehdään ennen virusten inaktivointia ja/tai suodatussteri-loinnin jälkeen ultra- ja diasuodatus.
10. 10. Patenttivaatimusten 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetun liuoksen stabii-5 lius testataan kiinteätaasiuuton tai disakkaridin lisäämisen jälkeen. • · * · t > « 8 107122