ES2092604T5 - Procedimiento para la preparacion de soluciones de inmunoglobulina inactivadas con virus. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE SOLUCIONES DE INMUNOGLOBULINA CON VIRUS INACTIVADOS APROPIADAS PARA LA APLICACION INTRAVENOSA, QUE SE CARACTERIZA POR EL HECHO DE QUE LA INMUNOGLOBINA ES TRATADA CON AGENTES TENSIOACTIVOS NO IONICOS QUE SE ELIMINAN SEGUIDAMENTE POR EXTRACCION DE FASE SOLIDA EN MATERIALES HIDROFOBOS.

Description

Procedimiento para la preparación de soluciones de inmunoglobulina inactivadas con virus.

El objeto del invento es un procedimiento para la preparación de soluciones de inmunoglobulina inactivadas con virus, adecuadas para la inyección intravenosa.

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas humorales, que en la electroforesis de las proteínas del plasma y del suero se desplazan a la denominada fracción gamma y que, por lo tanto, se las denominaba antes gamma-globulinas.

Las inmunoglobulinas, por su elevado contenido en anticuerpos, se utilizan para la profilaxis y terapia de infecciones.

Es conocido el hecho de preparar inmunoglobulinas tanto para la administración por vía intramuscular como también por vía subcutánea. Un método de preparación muy empleado es el denominado fraccionamiento de Cohn-Oncley, denominado también Método 6/9 (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71, 541 (1949)).

Este procedimiento de preparación tiene sin embargo el inconveniente de que conduce a una solución altamente viscosa que sólo puede administrarse por vía intramuscular o subcutánea, con elevadas concentraciones en anticuerpos, en volúmenes relativamente pequeños. El producto obtenido es ciertamente estable a 4ºC, pero puede aparecer una proteolisis por impurezas del plasma. Además, pueden existir dímeros de IgA e IgG, que en la administración pueden dar lugar a una reacción anafiláctica de los pacientes (Ullman, Enzyklopädie of Industrial Chemistry, 1989, A14, páginas 93, 94).

Por este motivo, se desarrollaron inmunoglobulinas administrables por vía intravenosa, que muestran en los pacientes una mejor compatibilidad. Estas se preparan a partir de la denominada fracción 3 o también fracción de Cohn 2 (Cohn et al. véase cita anterior) a pH 4, utilizando polietilenglicol, una subsiguiente precipitación en etanol, ultrafiltración o diafiltración y cromatografía de intercambio iónico. La inmunoglobulina, obtenida de esta manera, se estabiliza con monosacáridos o disacáridos.

Un procedimiento mejorado de este tipo se describe en el documento EP 0 073 371.

Partiendo de la fracción 3 (Cohn et al. véase cita anterior), se realiza una ultrafiltración y una diafiltración después de la disolución y el ajuste del valor del pH a pH 4. A continuación, el filtrado obtenido se concentra hasta un contenido en proteínas del 5% en peso y el contenido en alcohol se reduce hasta 8% en peso. Después de concentrar el contenido en proteínas de la solución de inmunoglobulinas a 8%, se obtiene una solución acuosa transparente con una fuerza iónica de 0,01 y un valor del pH de 4,2. La tonicidad de la solución se ajusta, con maltona al 10% en peso, a un contenido en proteínas del 5% en peso. A continuación, se filtra en condiciones estériles y se liofiliza. El material liofilizado se disuelve en medios adecuados antes de la inyección.

Un gran inconveniente de las inmunoglobulinas preparadas de este modo para la administración intravenosa es que antes de ser utilizadas tienen que disolverse primero en medios adecuados, y sólo son almacenables en forma liofilizada.

Otro inconveniente consiste en que durante la administración de estas inmunoglobulinas pueden trasmitirse virus a los pacientes, puesto que durante el procedimiento de preparación no tiene lugar inactivación alguna de los virus. Así, después de la administración intravenosa de inmunoglobulinas se informó de afecciones de hepatitis e infecciones por VIH (Ullmann's, Encycl. of Ind. Chem., Vol. A14, 1989, páginas 102, 103).

El documento EP-A1-366946 describe la separación de detergentes no fónicos, los cuales se emplean para la inactivación de los virus, a partir de fluidos biológicos, tales como inmunoglobulina. Para ello se emplea una cromatografía de interacción hidrófuga.

El documento EP-A2-239859 describe la separación de los detergentes inactivantes de virus a partir de los fluidos biológicos, tales como inmunoglobulina, con ayuda de una extracción con aceites.

El problema técnico del invento era, por lo tanto, desarrollar un procedimiento que condujera a un producto que fuera tan estable como para poder ser preparado y almacenado directamente, incluso sin liofilización, como solución para inyección, y en cuya administración no aparecieran transmisiones de virus a los pacientes.

El problema técnico del invento se soluciona mediante un procedimiento, en el cual la inmunoglobulina se trata con tensioactivos no iónicos que, a continuación, se separan por extracción en fase sólida en materiales hidrófugos, y que, después del tratamiento con los tensioactivos no iónicos, se extraen con aceites vegetales biológicamente compatibles, separándose éstos y llevándose luego a cabo la extracción en fase sólida.

Como tensioactivos no iónicos se utilizan preferentemente TNBP y/o Triton X 100. El valor del pH de la solución es preferentemente 5,0 a 5,5.

Como aceites vegetales se utilizan preferentemente aceite de ricino o aceites de soja.

La subsiguiente extracción en fase sólida se efectúa preferentemente con sustancias derivatizadas de octadecilo, las cuales se utilizan también para la cromatografía de fases de inversión. En una forma de realización especialmente preferida, la extracción en fase sólida tiene lugar por una cromatografía de fases de inversión con resina octadecílica (C-18).

Después de la extracción en fase sólida puede añadirse al producto acabado un disacárido para la estabilización. La solución acabada se filtra a continuación una o varias veces en condiciones estériles.

La solución de inmunoglobulina, antes de la activación de los virus y/o después de la filtración en condiciones estériles, puede someterse, además, a una ultrafiltración y diafiltración.

A continuación, se explicará en detalle el procedimiento de preparación conforme al invento. Primeramente, tal como se conoce del estado de la técnica, se disuelve en agua la denominada fracción II de Cohn, hasta que se obtiene una solución totalmente transparente. La solución se ajusta entonces a un valor del pH de 4,0 a 5,0, preferentemente 4,5, y se filtra para la separación de impurezas.

A continuación, se efectúa con la solución una ultracentrifugación, iniciándose la concentración de la solución. El límite de exclusión de la ultrafiltración es 30.000 Dalton. En esta etapa se separan especialmente impurezas con pesos moleculares bajos. A continuación de esto, se procede a una diafiltración para la separación de iones, a lo que sigue la inactivación de los virus propiamente dicha.

Para ello, la solución se enfría primero a 4 hasta 8ºC, y el valor del pH se ajusta a 5,0 hasta 5,5, preferentemente 5,3. Después, se añaden tensioactivos no iónicos, preferentemente TNBP y/o Triton X 100, esta solución se agita después esta solución durante varias horas. A continuación de esto, se efectúa una extracción con aceites vegetales. En este caso, se añade a la solución aceite vegetal al 5% en peso, se lleva después la solución a la temperatura ambiente y se mezcla con agitación con el aceite vegetal. A la separación de fases subsiguiente, le sigue una filtración.

La solución se añade entonces a una columna C18 y se cromatografía. Después de la cromatografía tiene lugar un ajuste del valor del pH a pH 4. Para ajustar la tonicidad se añade maltosa. Después de la subsiguiente filtración en condiciones estériles, se efectúa un ensayo de estabilidad en la solución así obtenida, conservándose ésta durante al menos 22 horas a 37ºC. Si la solución presenta turbideces, no es utilizable. Si durante este tiempo la solución no presenta turbidez alguna, se ajusta el valor del pH a 5,0 hasta 5,5, preferentemente 5,3, se efectúa otra ultrafiltración y diafiltración y la solución así obtenida, después de la adición de maltosa, se ajusta a un contenido en proteínas de 50 g/l. A continuación se efectúa otra filtración en condiciones estériles y se envasa directamente en frascos para infusión.

El producto, así obtenido, puede inyectarse directamente por vía intravenosa y está libre de virus.

El ejemplo de realización siguiente debe explicar con más detalle el procedimiento conforme al invento.

Ejemplo de realización

La fracción II de Cohn se disuelve con la séxtuple cantidad de agua y se agita hasta que se obtiene una solución transparente. A continuación se ajusta el valor del pH a 4,5 con HCl 0,5 normal. Primeramente, se une una ultrafiltración, con la que la solución se concentra inicialmente hasta 90 g/l. Como tipo de membrana se utiliza Novasette 30 K. A continuación de esto, se diluye con la quíntuple cantidad de agua y se efectúa una diafiltración a 0,3 hasta 0,5 bar. Después de esta diafiltración, la solución diafiltrada se ajusta a un contenido en proteínas de 70 g/l. La solución se enfría hasta 4 a 8ºC y se ajusta a un valor del pH de 5,3 mediante lejía de sosa 0,1 normal. A continuación, se añade a la solución TNBP al 0,3 en peso y Triton X 100 al 1% en peso y se agita fuertemente. Al cabo de aproximadamente 4 horas a 4 hasta 8ºC se efectúa otra adición de aceite de ricino al 5% en peso. Se efectúa entonces una extracción del aceite a 15ºC. Las fases resultantes se separan y a continuación se filtra con un filtro de decantación de Cuno. Después se dispone la solución en una columna C18, cargada con sustancias derivatizadas de octadecilo. La solución se ajusta entonces a pH 4 y se añaden 100 g/l de maltosa. Seguidamente se efectúa una filtración en condiciones estériles y la solución filtrada en condiciones estériles se conserva entre 22 y 24 horas a 37ºC. La subsiguiente solución transparente se ajusta a un valor del pH de 5,3 mediante lejía de sosa 0,1 normal. Se efectúa de nuevo una ultrafiltración y una diafiltración, después una adición de maltosa de 100 g/l y el ajuste de la solución a un contenido en proteínas de 50 g/l. Tras la filtración en condiciones estériles siguiente, la solución se envasa en frascos para infusión de 50 ml, esterilizados y siliconizados, se cierran con tapones y se rebordean.

Claims (10)

1. Procedimiento para la preparación de soluciones de inmunoglobulinas inactivadas con virus, adecuadas para la administración por vía intravenosa, en el cual la inmunoglobulina se trata con tensioactivos no iónicos que después se separan por extracción en fase sólida en materiales hidrófugos, caracterizado porque después del tratamiento con tensioactivos no jónicos, se extrae con aceites vegetales biológicamente compatibles, éstos se separan y la extracción se lleva luego a cabo en fase sólida.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el valor del pH de la solución es 5,0 a 5,5.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque como tensioactivos no iónicos se utilizan TNBP (fosfato de tri-n-butilo) y/o Triton X 100.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque como aceites vegetales se utilizan aceite de ricino y/o aceite de soja.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la extracción en fase sólida se lleva a cabo con sustancias derivatizadas de octadecilo, las cuales también se utilizan para la cromatografía de fases de inversión.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la extracción en fase sólida se efectúa por cromatografía de fase de inversión C 18.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque después de la extracción en fase sólida se añade a la solución un disacárido.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la solución acabada se filtra una o varias veces en condiciones estériles.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la solución de inmunoglobulinas, antes de la inactivación de los virus y/o después de la filtración en condiciones estériles, se somete a una ultrafiltración y diafiltración.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la solución preparada se somete a un ensayo de estabilidad, después de la extracción en fase sólida o de la adición del disacárido.