WO2018093049A1 - 혈장 단백질 정제시 fxi의 제거방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈장 단백질 정제시 FXI(Factor XI)의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 FXI 및 혈장 단백질을 함유하는 혈장단백질 분획 II 페이스트(fraction II paste)를 투석 농축시킨 다음, 세라믹 재질의 양이온 교환수지를 이용하여 FXI를 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 FXI 제거방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높으므로, 안정적이고 향상된 품질의 혈장 단백질의 생산이 가능하다.

Description

혈장 단백질 정제시 FXI의 제거방법
본 발명은 혈장 유래 단백질 정제시 FXI(Factor XI, 11 인자)의 제거방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 FXI 및 다양한 혈장 단백질을 포함하는 혈장단백질 분획 Ⅱ 페이스트(fraction Ⅱ paste)를 투석 농축시킨 다음, 양이온 교환수지 정제 방법을 통해 FXI를 제거하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법에 관한 것이다.
혈장 단백질은 혈장(plasma) 내에 포함되어 있는 단백질을 의미하며, 알부민, 면역 글로블린과 피브리노겐, 트롬빈, 8 인자 등의 다양한 혈액 응고 관련 인자, 알파1안티트립신 등이 대표적인 혈장단백질이다. 이러한 혈장 단백질 들은 분리 정제되어 다양한 의약 용도 등으로 사용되고 있다.
FXIa는 FXI의 활성화된 형태로서, 하위 단계인 FIX을 활성화 시킴으로써 혈액 내 응고 반응(coagulation cascade)을 유발한다. (Wolberg AS et al., AM. J. Hematol. 2000, Vol. 65(1), pp30-34). 따라서 혈장단백질 유래 의약품이 분리 정제 과정에서 이러한 FXI이 불순물로 포함되어 있을 경우, 혈전 생성 등을 유발하여 여러가지 부작용을 발생시키는 것으로 알려져 있다.
예를 들어 혈장 유래 면역글로블린(IVIG)을 의약 용도로 이용하는 경우, FXI가 포함되지 않도록 FXI를 제거하는 것이 필수적인데, 개정된 European pharmacopoeia ver. 7.0의 “Human Normal Immunoglobulin for Intravenous Administration Monograph에 따르면, 정맥주사용 면역글로불린의 제조공정에서 혈전 생성물질(coagulation factors 및 그들의 zymogens)을 제거하는 공정을 포함하거나, 상기 공정에서 zymogen activation이 일어나지 않는다는 자료를 요구하고 있는 등, (human normal immunoglobulin for intravenous administration, European Pharmacopeia 7.0, PA/PH/Exp. 6B/T(11) 14PUB, 2012 Jan. Report No. 01/2012:0918), 혈장 단백질을 분리 정제를 통해 의약 용도로 사용하기 위해서는 FXI를 제거하는 것이 필수적이다. 하지만, 현재까지 알려진 방법들로는 FXI의 효율적이고 완전한 제거가 어려운 상황이다.
이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, FXI 및 다양한 혈장 단백질을 함유하는 혈장에서 분리한 분획 II 페이스트를 투석 농축시킨 다음, 양이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제할 경우, 혈장 내 존재하는 FXI 등의 혈전생성물질을 효율적으로 제거할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 혈장 단백질의 분리 정제시 FXI를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
(a) FXI 및 혈장 단백질을 함유하는 혈장단백질 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 용액을 투석 및/또는 농축시키는 단계; 및
(c) 상기 농축된 용액에 용매 및 세정제를 처리한 후, 양이온교환 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 FXI 및 혈장 단백질을 결합시키는 단계; 및
(d) 혈장 단백질만 선택적으로 용출시키는 단계;
를 포함하는 혈장 단백질 분리 정제에 있어 FXI(Factor XI)의 제거방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 정맥주사용 면역글로불린의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 SDS-PAGE 및 Western Blotting으로 측정한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 "혈장 단백질"이라 함은 인간 혈장 또는 인간 태반 유래 혈장에서 FXI(Factor XI 인자 11) 및 트롬빈과 같은 다양한 혈장 단백질이 포함된 크라이오 제거 혈장(Cryo poor plasma), 다양한 콘(Cohn) 분획 및 암모늄 설페이트 또는 PEG(Polson et al., Biochem Biophys Acta, 82:463, 1964); Polson and Ruiz-Bravo, Vox Sang, 23:107. 1972)에 의한 침전법을 통해 얻어지는 분획들을 포함한다. 바람직하게 혈장 단백질 분획은 콘 분획 II 이나, 콘 분획 Ⅰ, II 및 III 또는 콘 분획 II+III도 마찬가지로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 혈장으로부터 얻어진 분획 II 페이스트(fraction II paste)를 사용하였으며, 통상적인 콘 혈장 분획법에 따라서 제조하였다. 분획 II 페이스트에 포함된 다양한 리포프로테인류, 피브리노겐, α-글로불린, β-글로불린 및 다양한 응고인자들(Factor XI 등)을 제거하기 위한 후속 정제공정을 수행하였다.
따라서, 본 발명은 일관점에서,
(a) FXI 및 혈장 단백질을 함유하는 혈장단백질 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 용액을 투석 및/또는 농축시키는 단계; 및
(c) 상기 농축된 용액에 용매 및 세정제를 처리한 후, 양이온교환 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 FXI 및 혈장 단백질을 결합시키는 단계; 및
(d) 혈장 단백질만 선택적으로 용출시키는 단계;
를 포함하는 혈장 단백질 분리 정제에 있어 FXI(Factor XII) 제거방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 인간 혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)를 거쳐 FDA에서 승인된 적십자 유래 혈장을 사용하였으며, -20℃ 이하에서 보관되어 있던 혈장을 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen), 응고인자(coagulation factors) 및 FXI이 포함된 크라이오 침전물(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 크라이오 제거 혈장(cryo poor plasma)을 회수하였다. 그 후 침전과 여과 과정을 반복하여 최종적으로 분획 Ⅱ 페이스트(fraction II paste)를 수득하였다.
FXI 및 혈장단백질이 포함된 혈장을 분리하기 위한 여과과정은 필터 보조제를 첨가하여 혼합시킨 다음 필터 프레스를 사용하여 상층액과 침전물을 분리하였으며, 상기 필터 보조제는 Celite(STD), Harbolite(Expanded perlite product) 등을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈장 단백질 용액은 혈장단백질이 포함된 용액이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는, 혈장단백질 분획 II 페이스트를 용해시킨 다음, 여과하여 수득한 분획 II 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈장단백질 분획 II 페이스트의 용해는 혈장단백질분획 부피의 2 내지 10배가 되도록 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
혈장 단백질 분획은 실질적으로 비-변성 온도 및 pH에서 물 및/또는 완충액에 현탁액화(용해)되는 것이 바람직하다. "실질적으로 비변성"은 상기 언급된 조건이 면역글로불린분자 등의 혈장 단백질들의 기능성 활성의 실질적으로 비가역적인 손실, 예컨대, 항원결합 활성 및/또는 생물학적 Fc-작용의 손실을 야기시키지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서의 분리 정제하고자 하는 혈장 단백질은 면역글로블린이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예로서, 면역글로불린을 분리 정제하는 과정에서의 FXI 제거방법을 구체적으로 설명한다.
혈장 단백질 분획은 플라즈마 단백질 분획 부피의 2 내지 5, 바람직하게는 3 내지 4배의 부피로 하나 이상의 비변성 완충제로 산성화된 물에 용해시키며, 면역글로불린-함유 현탁액의 pH는 면역글로불린의 최적의 용해도를 보장할 수 있도록, 바람직하게는 pH 6.0 이하로, 더 바람직하게는 4.0 내지 6.0으로, 가장 바람직하게는 4.1 내지 4.3이 되도록 유지한다. 산성 완충액으로 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 인산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 아세트산, 염산, 물(증류수) 등을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 염화나트륨 용액을 사용하였다.
면역글로불린 현탁액은 단백질 변성을 방지하고 프로테아제 활성을 최소화 할 수 있도록 낮은 온도에서 유지시키며, 면역글로불린 현탁액과 물 또는 첨가되는 완충액은 바람직하게 0 내지 12℃, 더 바람직하게는 0 내지 7℃, 가장 바람직하게는 1 내지 4℃ 범위를 유지하도록 한다.
본 발명에 있어서, 상기 여과는 분획 Ⅱ 용액을 수득하기 위한 단계로서, 청정여과(clarifying filtration)인 것을 특징으로 하며, pH가 4.5 내지 5.5가 되도록 조절하여 수행되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 pH가 4.9 내지 5.1이 되도록 한다.
본 발명에서는, 분획 Ⅱ 페이스트를 10℃ 이하의 자켓식 반응기(jacketed vessel)로 옮기고, 분획 Ⅱ 페이스트 볼륨 4배의 0.6% 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 용해시킨 다음, 용해된 용액에 pH가 5.0±1이 되도록 1 M의 아세트산(acetic acid)을 첨가하였다. 그 다음, 용액을 심층여과 카트리지를 사용해 청정여과(clarifying filtration)하여 분획 II 용액(fraction II solution)을 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 투석농축액의 삼투압이 10 mOsmol/kg 이하까지 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 5.9 내지 6.1이 되도록 조절한다.
투석여과(diafiltration)는 투석(dialysis)과 한외여과(ultrafiltration)를 같이 수행하는 것으로, 용매와 분자크기가 다른 2가지 이상의 용질이 함유된 유체로부터 일부 용질만 제거하는 방법으로서 고분자 물질의 정제에 효과적이며, 일반 투석법에 비하여 시간과 경비가 절감되는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/ Diafiltration; UF/DF) 시스템을 사용하여 10 mOsmol/kg 이하로 분획 Ⅱ 용액을 여과하였으며, 여과액에 1M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 5.0±1.0 mM이 되도록 첨가하고 pH를 6.0±0.1로 조절하여 투석 및/또는 농축된 면역글로불린이 포함된 수용액을 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus) 등의 바이러스를 불활성시키고, 불활성화 이후, 불활성화를 위해 사용된 물질 및 남아있는 FXI를 제거하기 위한 단계로서, 바이러스-비활성화제, 바람직하게는 용매 및/또는 세정제, 가장 바람직하게는 용매-세정제 혼합물을 이용한 용매 및 세정제 처리(Solvent & Detergent Treatment)가 이용될 수 있다.
상기 (c) 단계를 통해 HIV1 및 HIV2, 간염 타입 C 및 non A-B-C, HTLV1 및 2, 헤르페스 바이러스군, CMV 및 엡스타인 바 바이러스 등의 잠재적 지질외피바이러스들이 불활성화되어, 최종 제품의 안전성이 제고될 수 있다.
상기 (c) 단계에서 사용될 수 있는 용매 및 세정제는 바이러스, 특히 지질외피바이러스를 불활성화시킬 수 있는 특성을 가진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용가능하다. 세정제는 비이온성 및 이온성 세정제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 실질적으로 비변성인 것이 바람직하다. 특히, 제거의 용이성 측면에서, 비이온성 세정제가 바람직하며, 용매는 미국등록특허 제4,764,369 호에 개시된 바와 같이 트리(n-부틸)포스페이트(TNBP : Tri-n-butyl phosphate)이 가장 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명을 수행하는 데 특히 바람직한 바이러스-비활성화제는 TNBP 및 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 혼합물이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 용매/세정제 혼합물은 면역글로불린 함유 용액 중 TNBP 농도가 0.2 내지 0.6 중량% 이내, 바람직하게는 0.24 내지 0.36 중량%가 되도록 첨가되며, 트윈 80의 농도는 0.8 내지 1.5중량% 범위 이내, 바람직하게는 0.8 내지 1.2중량%의 농도가 되도록 첨가한다.
바이러스-비활성화 단계는 지질외피바이러스를 비활성화시켜, 실질적으로 바이러스 위험성이 없는 면역글로불린 함유 용액을 생성시키는 조건 하에서 수행된다. 상기 조건에서 반응온도는 바람직하게는 4 내지 30℃, 더 바람직하게는 19 내지 28℃, 가장 바람직하게는 24 내지 26℃이며, 반응시간은 바람직하게는 1 내지 24시간, 더 바람직하게는 4 내지 12시간, 가장 바람직하게는 약 8시간이며, 바이러스 비활성화를 보장하기에 충분하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 30 내지 90cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 pH는 4.9 내지 5.1이 되도록 조절하여 수행된다. 양이온교환 수지에 로딩되는 면역글로불린은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎, 더 바람직하게는 수지 ㎖당 95 내지 105 ㎎이며, 가장 바람직하게는 84 mg 이다. 면역글로불린을 흡착시킨 후 평형 버퍼(equilibration buffer)로 세척한다. 상기 조건에서 세척에 이용되는 평형 버퍼는 컬럼 볼륨의 3배 이상, 바람직하게는 5배 이상의 부피를 사용하여 세척할 수 있으며, 세척 후 컬럼부피의 8배 이상의 용출버퍼(elution buffer)로 면역글로불린을 용출한다.
양이온교환 수지는 세파덱스(Sephardex), 세파로즈(Sepharose), 하이퍼셀(HyperCell) 또는 소스(Source) 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 다른 당업계에 공지된 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 특히 본 발명에서는 바람직하게 세라믹 계열의 양이온교환 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양이온교환수지로 세라믹 계열인 CM 하이퍼 D겔을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 평형 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용하였다.
상기 (d) 단계에 따른 양이온교환 수지로부터 면역글로불린의 용출은 면역글로불린의 효율적인 용리를 야기시키기에 충분한 pH 및 이온 세기를 갖는 실질적으로 비-변성 완충액으로 수행하여 면역글로불린 함유 용출액을 회수한다. '효율적인 용리'는 양이온교환 수지에 로딩된 면역글로불린 용액의 75% 이상, 80% 이상 등, 예컨대, 85% 이상 등이 양이온 교환수지로부터 용출되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 면역글로불린의 용출은 양이온교환 수지에서 면역글로불린을 치환하기에 충분할 정도로 높은 용출 완충액의 염 농도에서 수행될 수 있으며, 400 내지 600 mM의 염 농도, 바람직하게는 500mM의 염 농도에서 수행될 수 있다. 상기 염은 염화나트륨(NaCl)을 이용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 혈장 단백질 용출이 완료된 후, 200 내지 1000 mM의 염농도, 바람직하게는 500mM의 염농도를 가지는 수산화나트륨을 이용하여 양이온교환 수지를 세척하는 제자리 세정(Clean in place, CIP) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피 및 (d) 단계에서의 용출은 바람직하게 18 내지 25℃, 더 바람직하게는 19 내지 23℃, 가장 바람직하게는 19.5 내지 22.5℃ 범위에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.5 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 한다.
음이온교환 크로마토그래피 단계에서 사용하는 음이온교환수지는 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 사차 암모니움(Quaternary ammonium)기들로 치환된 것들을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 강염기성의 사차 암모니움기를 가지는 그룹이나 또는 약염기성의 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 가지는 음이온 교환수지 중에서 어느 하나를 선택하여 사용한다.
예를 들면, 강염기성의 음이온교환 그룹으로는 Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q, Source 15Q, Source 30Q, Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25 Q, Fractogel EMD TMAE(S), Fractogel EMD TMAE Hicap (M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M, Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5PW (30), TSKgel SuperQ-5PW (20), TSKgel SuperQ-5PW 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 공지된 음이온교환수지를 사용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 수지의 적절한 부피는 컬럼 치수, 즉, 컬럼의 직경과 수지의 높이에 의해 반영되고, 예컨대, 적용되는 용액의 면역글로불린 용액양과 사용되는 수지의 결합 성능에 따라 달라진다. 이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 전에, 이온 교화 수지는 바람직하게는 완충액으로 평형화시켜, 수지가 그의 짝 이온과 결합할 수 있도록 한다.
본 발명에서는, 음이온교환 수지로 DEAE 세파로스 젤을 사용하였으며, 컬럼 완충액으로는 인산나트륨 완충액, 구연산 완충액, 아세트산 완충액 등 당업계에 공지된 평형 버퍼(equilibration buffer), 세척버퍼(wash buffer) 및 용출버퍼(elution buffer)를 사용할 수 있다.
음이온교환 크로마토그래피에서 컬럼은 5±1.0mM 아세트산 나트륨 완충액(sodium acetate buffer)으로 pH가 6.0±0.1이 되도록 평형화시켰으며, 이동상의 유속은 95 내지 145cm/hr으로 조절하였다. 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.5 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 회수하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 정맥주사용 면역글로불린 제조시 Factor XI 제거
1-1 : 혈장(plasma)준비
혈장은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), C형 간염바이러스(HCV), B형 간염바이러스(HBV) 및 파보바이러스 B19(parvovirus B19)에 대한 핵산증폭검사(NAT; Nucleic Acid Amplification Test) 및 혈청학적 검사를 포함하는 바이오테스트(Biotest)가 이루어지고 FDA에서 승인된 혈장을 사용한다.
본 발명에서는 적십자 유래 혈장(Batch No. 600A9008)를 사용하였으며 혈장은 사용하기 전까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 혈장이 담겨져 있는 병은 커틀 기기(bottle cutting machine)로 오픈하고, 1 내지 6℃의 자켓식 반응기(jacketed vessel)에서 12 내지 72시간 동안 반응시켜 혈장을 녹였다.
상기 조건에서 혈장이 녹으면서 피브리노겐(fibrinogen) 및 응고인자(coagulation factors)이 포함된 크라이오 침전물(cryoprecipitate)이 생성되는데, 원심분리(조건 설명)를 통해 동결침강혈장을 제거시키고, 동결침강혈장이 제거된 크라이오 제거 혈장(cryo poor plasma)을 회수하였다.
1-2 : 침전(precipitation) Ⅰ 단계
상기 냉동 결핍성 혈장에서 응고인자를 추가로 제거하기 위해, 침전(precipitation) Ⅰ 단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -3±1℃에서 8 ± 0.8%가 되도록 실시예 1-1에서 회수한 냉동 결핍성 혈장에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 7.2±0.2가 되도록 조절하였다. 원심분리(조건)를 통해 침전물을 제거하고, 상층액(Addition Ⅰ supernatant)을 회수하였으며, 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-3 : 침전 II+III 단계 및 여과(filtration)
실시예 1-2에서 회수한 상층액에 포함된 면역글로불린(Immunoglbulin)을 침전시키기 위해 침전 II+III 단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 20±2%가 되도록 실시예 1-2에서 회수한 상층액에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후, 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 6.9±0.1이 되도록 조절하였다.
그 후, 혈장 ㎏ 당 필터 보조제(Celite(STD), Harbolite(Expanded perlite product)) 0.0284㎏씩 첨가하고 30±10분 동안 혼합시켰다. 혼합물을 2 내지 8℃로 유지시킨 콜드룸(cold room)안에서 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다.
상층액은 상층액(supernatant) I+II+III (또는 Ⅱ+Ⅲ)으로 명명하고, 침전물은 분획(fraction) I+II+IIIw (또는 II+IIIw)로 명명하였다 (w; wash). 분획 I+II+IIIw (또는 II+IIIw)는 즉시 사용하거나 -20℃ 이하에서 보관한다.
1-4 : 침전 Ⅲ 단계 및 여과(filtration)
면역글로불린이 포함된 분획 I+II+IIIw (또는 II+IIIw)에서 추가로 알부민(albumin), 지단백(lipoprotein), 트롬빈(thrombin) 및 다른 원하지 않는 단백질(other unwanted proteins)을 제거하기 위해 침전 III 단계를 수행하였다.
실시예 1-3에서 회수한 분획 I+II+IIIw (또는 II+IIIw)를 차가운 증류수(cold distilled water)에 녹인 후, 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다. 상기 증류수에 녹인 분획 I+II+IIIw (또는 II+IIIw)에 최종 에탄올 농도가 -5±1.0℃에서 18±1.8%이 되도록 96% 에탄올을 첨가하였으며, -6℃로 미리 준비해둔 아세테이트 버퍼(acetate buffer)를 사용하여 pH가 5.2±0.1이 되도록 조절하였다.
혼합물을 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다. 상층액은 여과액(filtrate) I+III (또는 III)로 명명하고, 침전물은 분획 I+III (또는 III)로 명명하였다. 분획 I+III (또는 III)는 폐기하고, 여과액 I+III (또는 III)는 추후 총 생균측정(total viable count)을 하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-5 : 침전 Ⅱ 단계 및 여과(filtration)
실시예 1-4의 여과액 I+III (또는 III)에서 면역글로불린을 침전시키기 위해 침전 Ⅱ단계를 수행하였다.
최종 에탄올 농도가 -10±2.0℃에서 25±2.5%가 되도록 여과액 I+III (또는 III)에 96% 에탄올(ethanol)을 첨가하고, 1M 소듐 바이카보네이트(중탄산나트륨; sodium bicarbonate)를 사용하여 pH가 7.4±0.2가 되도록 조절하였다.
혼합물을 필터 프레스(filter press, DG800K)를 사용하여 상측액과 침전물을 분리시켰다. 침전물을 분획 II 페이스트(fraction II paste)로 명명하였으며, 추후 박테리아 엔도톡신, 단백질 함량 및 구성을 측정하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
1-6 : 분획 II 페이스트 용해(dissolution) 및 청정여과(clarifying filtration)
혈장에서 분리한 면역글로불린의 함량을 높이고 혈전생성 물질을 제거하기 위한 분리 정제 과정을 수행하였다.
먼저, 실시예 1-5에서 분리한 면역글로불린이 포함된 분획 II 페이스트를 용해시켜 투석과정에 적합한 조건을 가지도록 조절하였다. 분획 II 페이스트는 10℃ 이하의 자켓식 반응기(jacketed vessel)로 옮기고, 분획 II 페이스트 볼륨 4배의 0.6% 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 용해시켰으며, 단백질 함량 및 구성을 측정하기 위해 일부 샘플링하여 보관하였다.
그 다음, 1 M의 아세트산(acetic acid)을 사용하여 용해된 용액의 pH가 5.0±1이 되도록 조절한 후, 용액을 심층여과 카트리지(depth filter cartridges; BecodiskBP01)를 사용해 청정여과(clarifying filtration)하여 분획 II 용액(fraction II solution)을 수득하였다.
1-7 : 투석여과(diafiltration)
실시예 1-6에서 수득한 면역글로불린이 포함된 분획 II 용액에서 에탄올과 저분자 이온을 제거하고, 음이온교환 크로마토그래피 과정에 적합한 조건을 가지도록 pH를 조절하였다.
면역글로불린이 포함된 분획 II 용액은 한외여과/투석여과(Ultrafiltration/Diafiltration; Millipore Pellicon2(50K)) 시스템을 사용하여 10mOsmol/kg 이하로 투석여과를 수행하였으며, 수득된 여과액은 추후 단백질 함량, 구성 및 생균을 측정하기 위해 일부를 샘플링하여 보관하였다.
상기 여과액에 1M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 5.0±1.0 mM이 되도록 첨가하고 pH를 6.0±0.1로 조절하여 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액을 수득하였다.
1-8 :음이온교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)
실시예 1-7에서 수득한 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액 속에 포함된 폴리머(polymer) 및 다른 혈장 단백질을 제거하기 위해 음이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.
음이온교환수지는 DEAE 세파로스 젤(DEAE Sepharose gel; GE Healthcare, Catalog No. 17-0709)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 6.0±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-7에서 수득한 투석 및/또는 농축된 면역글로불린 용액을 유속 120±25 cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였으며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.5 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 회수하였다.
1-9 : 바이러스 불활성화를 위한 용매 및 세정제 처리(solvent/detergent Treatment)
면역글로불린이 포함된 용액의 잠재적 지질외피바이러스(lipid enveloped virus)를 불활성시키기 위해 용매 및 세제를 처리하는 단계를 수행하였다.
먼저, 실시예 1-8에서 회수한 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획에 아세트산을 첨가하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 조절하였으며, 트리(엔-부틸)-포스페이트(Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP) 및 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80 ; Tween 80)을 각각 0.3±0.06% 및 1±0.2%의 농도가 되도록 첨가한 후, 20분 내지 30분 동안 200±50 RPM으로 교반하였다. 용액 안의 TNBP 및 Tween 80가 균일하게 혼합되었는지 일부를 샘플링하여 확인하였으며, 그 후로 25±1.0℃에서 8시간 동안 200±50 RPM으로 지속적으로 교반하였다. 교반이 완료된 다음 면역글로불린이 포함된 용액은 하드파이프 라인을 통해 바이러스 안전영역(viral secure area ; VSA)인 다른 탱크로 옮겼다.
1-10 :양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)
용매/세제 처리된 면역글로불린 용액에서 TNBP, Tween 80 및 응고인자 등이 다른 혈전생성물질을 제거하기 위해 양이온교환 크로마토그래피를 21±1.5 ℃에서 수행하였다.
양이온교환수지는 세라믹 재질인 CM 하이퍼 D겔(Pall Corporation ; Catalog No. 20050)을 컬럼에 충진한 후 이퀄리브레이션 버퍼(equilibration buffer)를 사용하여 pH가 5.0±0.1이 되도록 평형화시켰다. 이후 실시예 1-9의 용매/세제 처리된 면역글로불린 용액을 유속 60cm/hr이 되도록 컬럼에 로딩하였다. 그 후, 컬럼볼륨의 7배 볼륨의 세척버퍼로 세척한 다음 용출 버퍼 (용출버퍼 조성 : 20mM NaOAc pH 4.5 w/ 0.5M NaCl)를 사용하여 면역글로불린을 용출시켜 회수하였다. (흡착율 : 양이온교환수지 1㎖당 84㎎의 면역글로불린)
<실시예 2> 양이온교환 크로마토그래피(cation exchange chromatography)후, CIP를 통한 FXI 제거
실시예 1-10에서 사용한 컬럼에 컬럼 2배 부피의 2M NaCl을 흘려준 다음(CIP1), 0.5M NaOH를 2 컬럼 부피만큼 흘려주었다(CIP2). 그 뒤, Cation exchange chromatography 에서 FXI(FXIa)이 제거되는 공정 단계를 확인하기 위하여, CIP 1, CIP 2 수집하여, FXI(FXIa) content를 측정하였다.
그 결과, CIP 첫번째 단계인 2M NaCl 에서는 load 시료 대비 2.9% 의 FXI(FXIa) 이 측정되었으며, CIP 두번째 단계인 0.5M NaOH 에서는 detection limit (0.31 ng/mL) 미만으로 측정되었다(표 1).
CM Ceramic HyperD F resin의 CIP 방법으로 NaOH 사용을 권장하고 있으며, NaOH 의 경우 일반적으로 resin CIP 과정에 널리 사용되고 있다. 따라서, FXI(FXIa)이 CIP 두번째 단계인 0.5M NaOH에서 제거 될 것이라 추측하나, harsh condition으로 인하여 ELISA 시험법 상에서는 FXI(FXIa) 측정되지 않았다. 실제로, NaOH의 경우 peptide bond를 hydrolysis 시켜 protein degradation 유발한다는 보고가 있다.
Figure PCTKR2017011439-appb-T000001
표 1의 결과를 토대로, FXI(FXIa)이 공정 중(Flow through, Elution)에는 binding 되어 있다가 CIP에서 용출된다는 것을 확인하기 위해서, 0.5M NaOH 대신 6M guanidine HCl을 사용하여 CIP를 진행하였다. 6M guanidine HCl의 경우, 널리 알려진 protein denaturant로써 protein purification시에 많이 사용되고 있다. 6M guanidine HCl을 사용하여 CIP를 진행한 결과, 59.3%의 FXI(FXIa)이 용출 되는 것을 확인하였다.
따라서, FXI(FXIa)이 CM chromatography 공정 중에는 용출되지 않고 binding 되어있다는 것을 확인하였다(표 2).
Figure PCTKR2017011439-appb-T000002
FXI 함량 시험을 이용하여 공정시료내 FXI(FXIa)함량을 측정한 결과, load 시료내 FXI(FXIa) 418.7 ng/mL 이 Cation exchange chromatograph 공정 수행 후, elution 시료내에서는 detection limit (0.31 ng/mL) 미만으로 측정되었다. 0.5 NaOH로 CIP공정을 진행 후, FXI(FXIa) 가 완전히 제거 되었음을 확인하기 위해 추가로 6M guanidine HCl로 CIP 공정을 실시하였다.
그 결과, 6M guanidine HCl에서는 detection limit (0.31 ng/mL) 미만으로 측정되어, 0.5M NaOH에서 완전히 제거됨을 확인하였다.
각 단계별로, FXI의 농도는 ELISA로 측정하였다.
Figure PCTKR2017011439-appb-T000003
<실시예 3> 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도 측정
혈전응고제의 제거 정도를 확인하기 위해, 상기 실시예 1의 제조 단계별 여과액 또는 침전물에 포함된 FXI(Human Coagulation Factor XI)의 농도를 ELISA(Human Factor XI ELISA kit: Innovative, Cat No. IHFXIKT-TOT), SDS-PAGE 및 western blotting으로 측정하였으며, FXIa의 함량은 TGA 시험(CBER ver.3)으로 측정하였다.
본 발명의 정제 공정의 산물들의 FXI 함량을 측정한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 음이온 교환수지 크로마토그래피에서는 변화가 없었으나, 양이온 교환수지 크로마토그래피 공정의 용출액에서 측정 한계 이하로 검출되지 않으며, 해당 공정에서 FXI가 모두 제거되는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4> FXI(Human Coagulation Factor XI) 제거 효율 측정
일반적으로 Plasma 내에 존재하는 FXI 의 농도는 4-6 μg/mL 으로 알려져 있으며, 이를 근거로 하여 CM load 시료의 FXIa 농도를 4 μg/mL 되도록 조제하여 spiking test를 진행하였다. 이는 CM load 시료(656B14012)에서 측정되는 약 400 ng/mL 농도의 10 배에 해당하는 농도이다.
FXI 함량 시험을 이용하여 공정시료내 FXI(FXIa)함량을 측정한 결과, load 시료내 FXI(FXIa) 4020.1 ng/mL이 Cation exchange chromatography 공정 수행 후, elution 시료내에서는 detection limit (0.31 ng/mL) 미만으로 측정되는 것을 확인하였으며, TGA 시험을 이용하여 공정 시료내 FXIa activity를 측정한 결과, load 시료내 72837.4 mU/mL이 Cation exchange chromatograph 공정 수행 후, elution 시료내에서는 detection limit (0.156 mU/mL) 미만으로 측정되어, 양이온교환크로마토그래피 공정을 통해 과량의 FXI를 제거할 수 있음을 확인하였다(표 4).
Figure PCTKR2017011439-appb-T000004
추가로, 분획 공정의 start material인 크라이오 제거 혈장(Cryo SUP) 내에 존재하는 FXI 의 total amount 약 8 g 이다. 분획 공정에서 FXI의 제거가 이루어지지 않고, 온전히 정제공정으로 유입된다고 가정하였을 경우, 총 16 g FXI이 공정산물에 남아있게 된다(8 g × 2 batch = 16 g) 이를 Cation exchange chromatography 공정의 scale down factor인 3162로 나누면, 5 mg이 된다. CM load 시료의 FXIa 총량이 5 mg 되도록 조제하여 spiking test를 진행하였다(16 g ÷ 3162 ≒ 0.005 g = 5 mg)
이는 실제 CM load 시료(656B14012)에서 측정되는 총량인 95000ng의 약 53배에 해당하는 양이다. FXI 함량 시험을 이용하여 공정 시료내 FXI(FXIa)함량을 측정한 결과, load 시료내 total FXI(FXIa)는 약 4.7 mg이 Cation exchange chromatograph 공정 수행 후, elution 시료내에서는 total FXI(FXIa) 약 1.3 ㎍으로 측정되었다. Elution에서 미량의 FXI(FXIa)가 측정되었지만 residual ratio는 0.0% 로 load 시료 대비 99.9% 이상이 제거 되었음을 확인하였다(표 5).
Figure PCTKR2017011439-appb-T000005
<실시예 5> 과량의 FXI가 포함된 시료에서의 FXI 제거 효율 측정
실시예 3과 같은 방법으로, 정제 공정을 거치지 않은 분획 단계의 크라이오 제거 혈장(Cryo sup) 시료와 분획 I+II+III paste 시료를 CM hyper D chromatography를 수행하였을 경우 FXI의 제거 효율을 측정하였다. 이 두단계의 시료는 FXI이 과량 포함되어 있다.
그 결과, 표 6 및 표 7에 개시된 바와 같이, 약 99%의 FXI가 제거되는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2017011439-appb-T000006
Figure PCTKR2017011439-appb-T000007
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 FXI 제거방법을 이용하면, 불순물 및 혈전 생성물질을 제거효율을 높이고, 중합체 함량을 유지할 수 있으므로, 안정적이고 향상된 품질의 혈장 단백질, 특히 면역글로불린의 생산이 가능하다.

Claims (16)

  1. 다음 단계를 포함하는 혈장 단백질 분리 정제에 있어, FXI(factor XI)의 제거 방법:
    (a) FXI 및 혈장 단백질을 함유하는 혈장 단백질 용액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 용액을 투석 및/또는 농축시키는 단계; 및
    (c) 상기 농축된 용액에 용매 및 세정제를 처리한 후, 양이온교환 크로마토그래피를 수행하여 컬럼에 FXI 및 혈장 단백질을 결합시키는 단계; 및
    (d) 혈장 단백질만 선택적으로 용출시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에, 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 부착되지 않은 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 용액은 혈장단백질 분획 II 페이스트(fraction II paste)를 용해시킨 다음, 여과하여 수득된 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 분획 II 페이스트(fraction II paste)의 용해는 혈장 단백질 분획 부피의 2 내지 10배가 되도록 염화나트륨(sodium chloride) 용액을 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 여과는 청정여과(clarifying filtration)인 것을 특징으로 하며, pH가 4.5 내지 5.5가 되도록 조절하여 수행되는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 투석 및/또는 농축은 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration; UF/DF) 시스템을 이용하는 것을 특징으로 하며, 삼투압 10 mOsmol/kg 이하에서 수행한 다음, pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용매는 트리(n-부틸)-포스페이트 (Tri(n-butyl)-phosphate; TNBP)인 것을 특징으로 하며, 세정제는 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100 및 트리톤 X-45 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 400 내지 600 mM의 염 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 pH 4.5 내지 5.5, 유속 30 내지 90cm/hr의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피에 흡착되는 혈장 단백질의 흡착량은 양이온교환 수지 ㎖당 90 내지 130㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양이온교환 크로마토그래피는 세라믹 계열의 양이온교환 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계 및 (d) 단계는 18 내지 25℃의 온도범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 400 내지 600mM의 염화나트륨(NaCl)을 이용하여 혈장단백질만 선택적으로 용출하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 혈장 단백질 용출이 완료된 후, 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 양이온교환 수지를 세척하는 제자리 세정(Clean in place, CIP) 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제자리 세정(Clean in place, CIP) 단계는 200 내지 1000mM의 수산화나트륨 농도 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 음이온교환 크로마토그래피는 pH 5.5 내지 6.5, 유속 95 내지 145cm/hr의 조건에서 수행하며, 음이온교환 크로마토그래피에 부착되지 않은 분획을 1.5 내지 2.0 로딩볼륨(Loading Volume; LV)으로 수득하는 것을 특징으로 하는 FXI의 제거방법.
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