WO2015099166A1 - 改良型β－フルクトフラノシダーゼ - Google Patents

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WO2015099166A1
WO2015099166A1 PCT/JP2014/084680 JP2014084680W WO2015099166A1 WO 2015099166 A1 WO2015099166 A1 WO 2015099166A1 JP 2014084680 W JP2014084680 W JP 2014084680W WO 2015099166 A1 WO2015099166 A1 WO 2015099166A1
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WO
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fructofuranosidase
amino acid
acid sequence
improved
recombinant vector
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PCT/JP2014/084680
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French (fr)
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巧 栃尾
早岐 中村
美沙 八原
藤井　匡
圭輔 田村
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物産フードサイエンス株式会社
日本マイクロバイオファーマ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention relates to an improved ⁇ -fructofuranosidase, and in particular, an improved ⁇ -fructofurano that can efficiently produce large amounts of kestose while effectively suppressing the formation of by-products such as nystose.
  • Sidase, polypeptide containing the amino acid sequence, DNA encoding improved ⁇ -fructofuranosidase, recombinant vector containing the DNA, transformant obtained by introducing the DNA or the recombinant vector into a host The present invention relates to a method for producing improved ⁇ -fructofuranosidase and a method for producing kestose using them.
  • ⁇ -fructofuranosidase is an enzyme that recognizes fructose of sucrose and has an activity of hydrolyzing sucrose into fructose and glucose (sucrose hydrolysis activity).
  • kestose is a trisaccharide in which fructose generated by hydrolysis is transferred to sucrose (fructose transfer activity) and one molecule of glucose and two molecules of fructose are combined.
  • 1-kestose has a sweetness similar to sucrose (sugar) and produces about one third of the sweetness of sugar, while it is about half the calorie of sugar, It is known that it is a useful oligosaccharide because it is difficult to increase the value and has an allergy suppressing function (Patent Document 1).
  • ⁇ -fructofuranosidase producing 1-kestose include, for example, ⁇ -fructofuranosidase derived from Aspergillus niger and ⁇ -fructofuranoside of a mutant in which an amino acid mutation is introduced into its amino acid sequence. Sidase is disclosed (Patent Document 2). *
  • nystose When producing kestose using ⁇ -fructofuranosidase, tetrasaccharide nystose is usually produced as a by-product. Nistose is difficult to separate from kestose in chromatography, and it is likely to remain in the reaction solution even after a separation and purification step by chromatography. Further, a certain amount or more of nystose present in the liquid inhibits crystallization of kestose in the crystallization process. For these reasons, it is necessary to reduce the production of nystose in order to produce kestose efficiently. Therefore, there is a demand for ⁇ -fructofuranosidase that produces a small amount of by-products such as nystose and can efficiently produce kestose.
  • the present invention has been made to solve such a problem, and is an improved ⁇ -full product capable of efficiently producing a large amount of kestose while suppressing the rate of formation of by-products such as nystose.
  • Beijerinckia indica subsp. ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type ⁇ -fructofuranosidase derived from indica NBRC3744 (hereinafter abbreviated as “B.
  • H Histidine (H) corresponding to the 395th position from the N-terminal of the amino acid sequence of the wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 in the alignment with arginine (R) or lysine ( It has been found that by introducing an amino acid mutation to be substituted in K), the rate of generation of by-products such as nystose is significantly reduced, the rate of generation of kestose is increased, and the amount of kestose generated is increased. .
  • One embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is a ⁇ comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2.
  • histidine (H) corresponding to the 395th position from the N-terminal of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 in the alignment is substituted with arginine ( R) or an amino acid sequence into which an amino acid mutation for substitution with lysine (K) is introduced.
  • Another embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention comprises the following amino acid sequence (a) or (b): (a) the wild-type ⁇ -fructo shown in SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence in which one or two or more amino acid mutations selected from the following i) to iii) are introduced into the amino acid sequence of furanosidase; i) 123rd leucine (L) from cysteine to cysteine (C) Ii) an amino acid mutation that replaces 395th histidine (H) from the N-terminus with arginine (R) or lysine (K), iii) a 473th phenylalanine (F) from the N-terminus to tyrosine (Y (B) in the amino acid sequence (a), one or several amino acids except the amino acid introduced with the amino acid mutation are deleted, substituted, An amino acid sequence consisting of an inserted or added amino acid sequence and having ⁇ -fructofur
  • the polypeptide according to the present invention includes the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase described in (1) or (2).
  • the DNA according to the present invention encodes the improved ⁇ -fructofuranosidase described in (1) or (2).
  • a recombinant vector according to the present invention comprises the DNA described in (4).
  • the transformant according to the present invention is a transformant obtained by introducing the DNA described in (4) or the recombinant vector described in (5) into a host.
  • the host into which the DNA described in (4) or the recombinant vector described in (5) is introduced may be E. coli.
  • the method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention comprises an improved ⁇ -fructofuranosidase from a culture obtained by culturing the transformant according to (6) or (7). The process of acquiring.
  • the method for producing kestose according to the present invention comprises the improved ⁇ -fructofuranosidase according to (1) or (2), the transformant according to (6) or (7), or (6) or (7) A step of bringing the culture obtained by culturing the transformant according to (7) into contact with sucrose.
  • the transformant according to the present invention and the method for producing kestose according to the present invention, the rate of formation of by-products such as nystose is suppressed, and the efficiency of kestose is improved. Can be manufactured in large quantities.
  • the DNA according to the present invention the recombinant vector according to the present invention, the transformant according to the present invention, and the method for producing the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention
  • An improved ⁇ -fructofuranosidase that can efficiently produce a large amount of kestose can be obtained while suppressing the ratio of nystose produced.
  • FIG. 2 is an HPLC chromatogram showing the ratio of each sugar contained in a reaction solution in which a kestose production reaction was carried out by recombinant Escherichia coli introduced with a pCDF-Indica recombinant vector (upper figure) and a pCDFDuet-1 plasmid (lower figure).
  • Kestose is usually produced by binding fructose to sucrose, and three types of 1-kestose, 6-kestose and neokestose can be generated depending on the position where fructose is bound. That is, 1-kestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 1) to fructose units in sucrose, and 6-kestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 6) to fructose units in sucrose.
  • Neokestose is produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 6) to glucose units in sucrose.
  • Nistose is a tetrasaccharide produced by fructose binding ⁇ (2 ⁇ 1) to a fructose unit in 1-kestose.
  • kestose means a trisaccharide in which one molecule of glucose and two molecules of fructose are bound, and includes 1-kestose, 6-kestose and neokestose.
  • Lactosucrose is a trisaccharide formed by combining fructose, glucose and galactose, and chemically it is ⁇ -D-fructofuranosyl 4-O- ⁇ -D-galactopyranosyl- ⁇ -D-. Indicated by glucopyranoside or 4G-galactosyl sucrose. That is, it is characterized by having a partial structure of sucrose (sucrose) and lactose (lactose) in its molecular structure, and is also called “lactose oligosaccharide” or “lactose fructose oligosaccharide”. Lactosucrose is known to be a useful oligosaccharide because it increases bifidobacteria in the intestine and improves fecality and bowel movement.
  • Lactosucrose is produced by binding ⁇ -fructofuranosidase to lactose and carbohydrates containing fructose residues at the ends such as sucrose and binding fructose to lactose.
  • sucrose sucrose
  • fructose to lactose.
  • sucrose sucrose
  • oligosaccharide containing a fructose residue at the end such as kestose
  • sugar alcohols containing fructose residues at the ends and glycosides containing fructose residues at the ends can be mentioned.
  • ⁇ -fructofuranosidase is “fructosyltransferase”, “saccharase”, “ ⁇ -D-fructofuranosidase”, “invertase”, “invertase” or “invertin”. May be used interchangeably.
  • the “wild-type ⁇ -fructofuranosidase” in the present invention refers to ⁇ -fructofuranosidase having an amino acid sequence into which no amino acid mutation has been introduced using a genetic engineering technique.
  • “Fructofuranosidase” refers to ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid mutations are introduced into the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase.
  • One aspect of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is ⁇ -fructo comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2.
  • histidine (H) corresponding to the 395th position from the N-terminus of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 in the alignment is substituted with arginine (R) or lysine.
  • K consists of an amino acid sequence into which an amino acid mutation to be substituted is introduced.
  • the identity between the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 and the other amino acid sequence can be confirmed according to a conventional method.
  • FASTA http://www.genome.JP / Tool / fasta /
  • Basic local alignment search tool BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • Position-Specific IteratedBLAST PSI-Blast / pw.lp. .Nih.gov.
  • identity indicates coincidence and is used interchangeably with “identity”.
  • the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, It can be obtained by deleting, substituting, inserting or adding one or more amino acids within a range where the identity with the amino acid sequence of 2 does not become less than 60%. Further, according to a conventional method, from an amino acid sequence database such as ProteinProInformation Resource (PIR), SWISS-PROT, TrEMBL, Protein Research Foundation (PRF), GenPept (NCBI Protein database), FASTA (http: // www.
  • PIR ProteinProInformation Resource
  • SWISS-PROT SWISS-PROT
  • TrEMBL Protein Research Foundation
  • PRF Protein Research Foundation
  • GenPept NCBI Protein database
  • FASTA http: // www.
  • amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2 is any of bacteria, yeasts, molds, plants, etc. It may be the amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase derived from the organism.
  • amino acid sequence of ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2, specifically, for example, SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 one or more amino acids are deleted or substituted within a range in which the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (hereinafter sometimes referred to as “predetermined identity”) does not become less than 60%.
  • predetermined identity the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 an amino acid in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added to the extent that the identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 does not become less than 60%.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added in the case of “sequence” is, for example, 1 to 200, 1 to 180, 1 to 160, 1 to 140, 1 to 120, 1 to 100. 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, and still more preferably 1 to 30.
  • the identity value can be 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more.
  • amino acid sequence (corresponding to positions 29 to 534 of SEQ ID NO: 2) excluding the signal sequence (corresponding to positions 1 to 28 of SEQ ID NO: 2) of the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2
  • identity value include 65% or more, 66% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, and the like.
  • Alignment is sometimes called “sequence alignment” or “alignment”, but is synonymous.
  • alignment can be carried out according to a conventional method, for example, FASTA (http://www.genome.JP/tools/fasta/), Basic alignment search tool (BLAST; http: //www.ncbi. nlm.nih.gov.), Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov.), CLUSTALW (http: //www.genome.p It can be performed using a program such as MATFT (http://www.genome.jp/ja/).
  • Another embodiment of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention consists of the following amino acid sequence (a) or (b): (A) an amino acid sequence obtained by introducing one or more amino acid mutations selected from the following i) to iii) with respect to the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase shown in SEQ ID NO: 2; i) an amino acid mutation that replaces leucine (L) at position 123 from the N-terminus with cysteine (C); ii) an amino acid mutation that replaces the 395th histidine (H) from the N-terminus with arginine (R) or lysine (K); iii) an amino acid mutation that replaces the 473th phenylalanine (F) from the N-terminus with tyrosine (Y), (B)
  • the amino acid sequence (a) comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids excluding amino acids into which amino acid mutations have been introduced
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added is, for example, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to 15, It means an amino acid sequence in which any number of amino acids, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, is deleted, substituted, inserted or added.
  • All of the improved ⁇ -fructofuranosidases according to the present invention increase the production amount of kestose and significantly reduce the rate of by-products such as nystose, compared to wild-type ⁇ -fructofuranosidase. Has characteristics.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention has the following amino acid sequence (c) or (d), compared to wild-type ⁇ -fructofuranosidase, the ratio of producing lactosucrose and It has the feature that the generation amount increases.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be obtained according to a conventional method, and examples of such a method include a chemical synthesis method and a method using a gene recombination technique.
  • a chemical synthesis method for example, based on the amino acid sequence information of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention, Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method)
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be synthesized according to chemical synthesis methods such as the above, and various commercially available peptide synthesizers can also be used for synthesis.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be obtained by expressing the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention in a suitable expression system. it can. That is, a transformant is obtained by introducing DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention into a suitable host. Alternatively, as shown in Example 3 and Example 4 described later, after a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is inserted into an appropriate vector to obtain a recombinant vector, A recombinant vector is introduced into an appropriate host to obtain a transformant. Then, the improved transformant according to the present invention can be obtained by culturing the obtained transformant to express the improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention can be synthesized using various commercially available DNA synthesizers and also encodes the wild type ⁇ -fructofuranosidase.
  • DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase as a template can be obtained by performing a polymerase chain reaction (PCR).
  • DNA primer is designed, and PCR is performed using the DNA primer as a template with DNA encoding wild-type ⁇ -fructofuranosidase or improved ⁇ -fructofuranosidase into which the amino acid mutation is not introduced. Can be obtained.
  • DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase having the amino acid sequence of (b) above can also be obtained by PCR. That is, first, in the amino acid sequence (a), a DNA primer encoding an amino acid sequence corresponding to a position where an amino acid is deleted, substituted, inserted or added is designed, and using the DNA primer, the amino acid sequence (a) Can be obtained by performing PCR using a DNA encoding as a template.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the present invention also provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or equivalent configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is omitted.
  • the sequence length is not particularly limited, and the amino acid of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention is not limited.
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention may be an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are added to the amino terminus and / or carboxyl terminus. But you can.
  • the polypeptide according to the present invention can be obtained by the same method as the method for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention described above.
  • the present invention provides a DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or equivalent configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase and polypeptide according to the present invention is omitted. .
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • a recombinant vector comprising DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide and DNA according to the present invention is omitted.
  • the recombinant vector according to the present invention can be obtained, for example, by inserting a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention into the vector. Insertion of DNA into a vector can be performed according to a conventional method, for example, by ligating DNA with a DNA fragment of a linearized vector.
  • examples of the vector include a phage vector, a plasmid vector, a cosmid, and a phagemid, and can be appropriately selected depending on the host, operability, and the like.
  • the recombinant vector according to the present invention includes a selection marker gene for a transformant such as a drug resistance marker gene and an auxotrophic marker gene, It may contain a transcription regulatory signal such as a promoter necessary for expression of the improved ⁇ -fructofuranosidase, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, a translation regulation signal, and the like.
  • a selection marker gene for a transformant such as a drug resistance marker gene and an auxotrophic marker gene
  • a transcription regulatory signal such as a promoter necessary for expression of the improved ⁇ -fructofuranosidase, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, a translation regulation signal, and the like.
  • the present invention also provides a transformant.
  • the description of the same or corresponding configuration as the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA and recombinant vector according to the present invention is omitted.
  • the transformant according to the present invention is obtained by introducing into a host a DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase or a recombinant vector containing the DNA encoding the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention. It is done.
  • the host include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeasts, molds, filamentous fungi, and the like, which can be appropriately selected according to the type and operability of the recombinant vector.
  • Introduction (transformation) of DNA or a recombinant vector into a host can be performed according to a conventional method. For example, when a recombinant vector using a plasmid is introduced into E.
  • the present invention provides a method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • the method for producing an improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention includes a step of obtaining an improved ⁇ -fructofuranosidase from a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention.
  • the same or equivalent to the above-described improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector and transformant according to the present invention The description of the configuration to be repeated is omitted.
  • the method for obtaining the improved ⁇ -fructofuranosidase includes a mode of the transformant, etc. It can be selected as appropriate according to the conditions.
  • the culture obtained by culturing the transformant may be obtained as an improved ⁇ -fructofuranosidase as it is, or obtained by purifying the improved ⁇ -fructofuranosidase from the culture. May be.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase is expressed on the cell surface or inside the cell of the transformant. If the DNA or recombinant vector is designed as described above, the culture is subjected to centrifugation, and the transformant is recovered and directly obtained as an improved ⁇ -fructofuranosidase. A method of crushing the body and obtaining it as an improved ⁇ -fructofuranosidase can be mentioned.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase As a method for purifying the improved ⁇ -fructofuranosidase from the culture, for example, when a DNA or a recombinant vector is designed so that the improved ⁇ -fructofuranosidase is secreted outside the transformant.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase can be purified by subjecting the culture to centrifugation and collecting the culture supernatant.
  • the culture is subjected to centrifugation to recover the precipitated transformant, which is suspended in a buffer solution.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase can be purified by crushing the transformant by freeze-thawing, sonication or grinding, etc., and collecting the supernatant by centrifugation.
  • Other purification methods include heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse Examples of the method include phase chromatography and isoelectric focusing.
  • the present invention also provides a method for producing kestose.
  • the method for producing kestose according to the present invention comprises the improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention, the transformant according to the present invention or a culture obtained by culturing the transformant according to the present invention and sucrose. A step of contacting.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant and improved ⁇ -fructofuranosidase according to the present invention described above are produced. A description of the same or corresponding configuration as the method is omitted.
  • the improved ⁇ -fructofuranosidase is added to a solution containing sucrose, and the reaction is carried out at 20 ° C. to 60 ° C. for about 20 hours. The method of leaving still can be mentioned.
  • the transformant according to the present invention is added to a solution containing sucrose and shaken at 50 ° C. for several days. A method for culturing can be mentioned.
  • the culture obtained by culturing the transformant according to the present invention is put into a solution containing sucrose.
  • the method include adding and allowing to stand at 20 ° C. to 60 ° C. for about 20 hours or shaking.
  • the culture according to the present invention is crushed, ground, suspended in a buffer, freeze-thawed, sonication, centrifugation, heat treatment, salt precipitation, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, or any treatment such as isoelectric focusing may be used. .
  • the present invention provides a method for producing lactosucrose.
  • the method for producing lactosucrose according to the present invention comprises the following improved ⁇ -fructofuranosidase (I), a transformant (II) or a culture (III), and a carbohydrate containing a fructose residue at the end.
  • Examples of the method of bringing the improved ⁇ -fructofuranosidase (I) into contact with a saccharide and a lactose containing fructose residues at the ends include, for example, the improved ⁇ -fructofuranosidase (I) and the fructose at the ends. Examples thereof include a method of adding to a solution containing a carbohydrate containing a residue and lactose and allowing to stand at 20 ° C. to 60 ° C. for about 20 hours.
  • the transformant according to the present invention is used at the end with fructose.
  • examples thereof include a method of adding to a solution containing a carbohydrate containing a residue and lactose and culturing the mixture at 50 ° C. for several days with shaking.
  • the culture of (III) is prepared by adding a sugar and lactose containing fructose residues at the ends.
  • the method include adding the solution to the solution and allowing to stand at 20 ° C. to 60 ° C. for 20 hours or shaking.
  • the method for producing kestose and the method for producing lactosucrose according to the present invention may have other steps as long as the characteristics of the method for producing kestose and the method for producing lactosucrose according to the present invention are not impaired. It may have a kestose separation step by chromatography, a crystallization step such as sucrose, a drying step, a washing step, a filtration step, a sterilization step, a step of adding food additives, and the like.
  • improved ⁇ -fructofuranosidase, polypeptide, DNA, recombinant vector, transformant according to the present invention, method for producing improved ⁇ -fructofuranosidase, method for producing kestose, and method for producing lactosucrose Will be described based on each example. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
  • B. Indica nucleotide sequence of Indica-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase Beijerinckia indica subsp. ⁇ -fructofuranosidase of indica NBRC3744 (hereinafter abbreviated as “B. Indica”) was cloned. Specifically, first, B.I. Indica genomic DNA was extracted according to a conventional method. Subsequently, primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 below were designed. Subsequently, by performing polymerase chain reaction (PCR) under the following conditions, B.I.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a DNA encoding wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica was amplified.
  • B. The full-length base sequence of DNA encoding Indica-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase is shown in SEQ ID NO: 1
  • B. The amino acid sequence of Indica-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase is shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Beijerinckia indica subsp.
  • the SignalP4.1 server http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP The signal sequence was predicted using /).
  • B.I It was revealed that the signal sequence corresponds to positions 1 to 28 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of wild-type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica.
  • ⁇ -fructofuranosidase expression system (1) Construction of Escherichia coli intracellular expression system [1-1] Recombinant vector First, PCR was carried out under the following conditions. A DNA encoding wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica was amplified. ⁇ B.
  • PCR was performed under the following conditions to amplify the DNA of the pET28a plasmid.
  • PCR conditions for DNA amplification of pET28a plasmid >> Template: pET28a plasmid (Merck) Forward primer; 5′-ctcgagccaccaccaccaccactact-3 ′ (SEQ ID NO: 7) Reverse primer; 5′-atggctgccgcgcggcaccagggccgct-3 ′ (SEQ ID NO: 8) Enzyme for PCR; KOD-Plus- (Toyobo) Reaction conditions: 30 cycles of 95 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 20 seconds and 68 ° C. for 6 minutes.
  • Amplified B The DNA fragment encoding Indica-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase and the DNA fragment of the pET28a plasmid were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to the pET28a plasmid. A DNA encoding wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica was inserted, and this was used as a pET28a-indica recombinant vector.
  • M9 SEED medium (total 100 mL); water 72 mL, 5 ⁇ M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 20% D-glucose 2 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 2.5 M MgCl 2 40 ⁇ L, 100 mg / mL FeSO 4 28 ⁇ L, 25 mg / mL kanamycin salt 120 ⁇ L M9 Main medium (total 100 mL); water 67 mL, 5 ⁇ M9 salt 20 mL, 20% casamino acid 5 mL, 2 mg / mL thymine 1 mL, 50 mM CaCl 2 0.2 mL, 100 mg / mL FeSO 4 28 ⁇ L, Overnight Expression Automation 1 N.E .; Merck) Sol. 12 mL, O.I. N. E. Sol. 2 5 mL, O.D. N. E
  • the kestose production reaction solution is subjected to HPLC under the following conditions to confirm the ratio of each sugar (fructose, glucose, sucrose, kestose, nystose and other sugars) contained in the kestose production reaction solution and the amount of kestose and nystose. did.
  • the ratio of each sugar was calculated as a percentage as the ratio of the area of each peak to the total area of all detected peaks.
  • the amount of kestose and nystose was calculated by multiplying the mass of sucrose in the kestose production reaction solution by the respective ratio of kestose and nystose.
  • the base sequence of the PgsA-DNA fragment was confirmed according to a conventional method.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the confirmed PgsA anchor protein is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of the PgsA anchor protein encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 12, respectively.
  • PCR was performed under the following conditions.
  • a DNA encoding wild type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica was amplified and digested with restriction enzymes BamHI and XhoI according to a conventional method.
  • Indica-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase DNA fragment was used. ⁇ B.
  • DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (Takara Bio Inc.) and the PgsA-DNA fragment and B. cerevisiae at the NdeI site and XhoI site of the pCDFDuet-1 plasmid (Merck) according to the attached instructions.
  • An Indiana-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase DNA fragment was inserted and used as a pCDF-Indica recombinant vector.
  • Example 2 Transformation and culture and recovery of transformant Example 2 (2) [2-1] The pCDF-Indica recombinant vector of ⁇ 2-1-1>, and pCDFDuet-1 as a control The plasmid was introduced into E. coli by the method described in Example 2 (1) [1-2], and the resulting recombinant E. coli was cultured and recovered. However, the M9 SEED medium was changed to 0.5 mL instead of 1 mL, and the culture time in the M9 SEED medium was changed to 20 hours instead of 18 hours. As the antibiotic, “50 mg / mL streptomycin sulfate 100 ⁇ L” was used instead of “25 mg / mL kanamycin salt 120 ⁇ L”.
  • kestose was not confirmed in the kestose production reaction solution using the recombinant Escherichia coli introduced with the pCDFDuet-1 plasmid.
  • kestose was confirmed in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the pCDF-Indica recombinant vector was introduced. From this result, it was revealed that when ⁇ -fructofuranosidase is presented on the cell surface of E. coli, kestose can be produced using the E. coli.
  • CapA anchor protein [2-2] Cell surface display by CapA anchor protein ⁇ 2-2-1> Construction of recombination vector PgsA anchor protein was searched using Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), and the identity with PgsA anchor protein was 55. % Capac anchor protein of Bacillus megaterium DSM319 strain was extracted. A base sequence in which the CapA anchor protein was encoded by an optimized codon of E. coli was designed and used as a capA_opti gene. The base sequence of the capA_opti gene is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • DNA encoding the capA anchor protein was amplified by artificially synthesizing the capA_opti gene DNA and using this as a template under the following conditions.
  • the obtained PCR product was used as a capA_opti-DNA fragment.
  • ⁇ Conditions for PCR for DNA amplification of CapA sequence >> Template: artificially synthesized capA_opti gene DNA Forward primer; 5'-taagaaggagatacatatagatagaagaagaaaagagaactgaacttcccaag-3 '(SEQ ID NO: 17) Reverse primer; 5′-cgggtacaccgattgagatatctattgcctgggctttcgtttttttttttg-3 ′ (SEQ ID NO: 18) Enzyme for PCR; KOD-Plus- (Toyobo) Reaction conditions: 94 cycles for 15 seconds, 58 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 2 minutes for 21 cycles.
  • inverse PCR was performed under the following conditions to amplify the DNA encoding improved ⁇ -fructofuranosidase, and the resulting PCR product was used as an improved ⁇ -fructofuranosidase DNA fragment.
  • ⁇ Conditions for PCR for DNA amplification encoding improved ⁇ -fructofuranosidase >> Template: Indica-H395R / F473Y recombinant vector forward primer of Example 3 (1) [1-1]; 5′-agatctcaatcgggtacccgataccgac-3 ′ (SEQ ID NO: 19) Reverse primer; 5'-catgtgtatactccttcttttttaacttaac-3 '(SEQ ID NO: 20) Enzyme for PCR; KOD-Plus- (Toyobo) Reaction conditions: 35 cycles of 15 seconds at 94 ° C and 6 minutes at 68 ° C for one cycle.
  • capA_opti gene DNA fragment and the ⁇ -fructofuranosidase DNA fragment are ligated using In-Fusion HD Cloning ⁇ ⁇ ⁇ Kit (Takara Bio) to replace the DNA encoding the PgsA anchor protein with a CapA anchor.
  • An Indica-H395R / F473Y recombinant vector into which a DNA encoding a protein was inserted was obtained and used as an Indica-CapA-H395R / F473Y recombinant vector.
  • the Kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the Indica-CapA-H395R / F473Y recombinant vector was introduced was also the Kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the Indica-H395R / F473Y recombinant vector was introduced.
  • kestose was produced, and the amount of nystose was below the detection limit. From this result, it is clarified that when ⁇ -fructofuranosidase is presented on the cell surface of E. coli using PgsA anchor protein, CapA anchor protein, etc., kestose can be efficiently produced using the E. coli. It was.
  • ⁇ Example 3> Preparation and evaluation of improved ⁇ -fructofuranosidase
  • the 123rd leucine (L) from the N-terminus is cysteine (C)
  • the 395th histidine (H) is arginine (R).
  • lysine (K), 473th phenylalanine (F) is substituted with tyrosine (Y), and amino acid mutations (hereinafter referred to as “L123C”, “H395R”, “H395K” and “F473Y”) (Abbreviated)) single-, double- and triple-mutant ⁇ -fructofuranosidases consisting of amino acid sequences introduced with the above were prepared, and these were designated as improved ⁇ -fructofuranosidases. The specific procedure is shown below.
  • PCR was performed under the following conditions to amplify DNA encoding improved ⁇ -fructofuranosidase.
  • Conditions for PCR for DNA amplification encoding improved ⁇ -fructofuranosidase >> Template: Forward primer and reverse primer as shown in Table 2; PCR enzyme as shown in Table 2; KOD-Plus-NEO (Toyobo) Reaction conditions: 15 cycles of 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 10 seconds, 68 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 3.5 minutes.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the PCR product and digested at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out and purify the gel.
  • Ligation high Toyobo Co., Ltd.
  • T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) were added thereto and allowed to stand at 16 ° C. for 1 hour to construct a recombinant vector.
  • a recombinant vector into which DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase into which L123C, H395R and F473Y were respectively introduced was inserted into an Indica-L123C recombinant vector, Indica-H395R recombinant vector and Indica-F473Y recombinant vector were used.
  • a recombinant vector into which DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase into which H395R and L123C, H395R and F473Y, and F473Y and L123C were introduced respectively, Indica-H395R / L123C recombinant vector, Indica-H395R / F473Y recombinant vector and Indica-F473Y / L123C recombinant vector were used.
  • a recombinant vector into which DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase introduced with L123C, H395R and F473Y was inserted was used as the Indica-H395R / F473Y / L123C recombinant vector. It was.
  • Example 3 (1) [1-1] was prepared according to the method described in Example 2 (1) [1-2].
  • the recombinant E. coli was recovered by introduction into E. coli JM109 competent cells. Subsequently, the recombinant vector was recovered from the recombinant E. coli.
  • E. coli BL21 (DE3) competent cell (Cosmo Bio) was used to obtain recombinant E. coli as a transformant.
  • the plate was cultured at 37 ° C. for 20 hours, and then a recombinant E.
  • coli clone was picked up and inoculated into 0.5 mL of M9 SEED medium, followed by shaking culture at 30 ° C. and 800 rpm for 20 hours. Subsequently, 5 ⁇ L of the culture was transferred to 2 mL of M9 Main medium and cultured with shaking at 25 ° C. and 800 rpm for 23 hours. Thereafter, the recombinant E. coli was recovered by centrifuging the culture at 3500 rpm for 10 minutes.
  • the amount of kestose was 39.7 mg in the kestose production reaction solution of the recombinant Escherichia coli introduced with the pCDF-Indica recombinant vector, whereas the amount of kestose was changed to the Indica-L123C recombinant vector, Indica- H395R recombinant vector, Indica-H395K recombinant vector, Indica-F473Y recombinant vector, Indica-H395R / L123C recombinant vector, Indica-H395R / F473Y recombinant vector, Indica-F473Y / L123C recombinant vector and Indica-H395R / In the kestose production reaction solution of recombinant E.
  • coli introduced with the F473Y / L123C recombinant vector 44.5 mg, 163.5 mg, 105.3 mg, 89.9 mg, 175.5, respectively.
  • g, 184.3mg was 120.5mg and 218.8mg.
  • the ratio of kestose was 10.25% in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the pCDF-Indica recombinant vector was introduced, whereas the Indica-L123C recombinant vector, Indica-H395R recombinant vector , Indica-H395K recombinant vector, Indica-F473Y recombinant vector, Indica-H395R / L123C recombinant vector, Indica-H395R / F473Y recombinant vector, Indica-F473Y / L123C recombinant vector and Indica-H395R / F473Y / L123C In the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the replacement vector, 11.50%, 42.26%, 27.20%, 23.23%, 45.34%, 47.63, respectively. , It was 31.13% and 56.5
  • the ratio of nystose was 5.11% in the kestose production reaction solution of recombinant E. coli into which the pCDF-Indica recombinant vector was introduced, whereas the Indica-L123C recombinant vector and the Indiana-H395R recombinant vector , Indica-H395K recombinant vector, Indica-F473Y recombinant vector, Indica-H395R / L123C recombinant vector, Indica-H395R / F473Y recombinant vector, Indica-F473Y / L123C recombinant vector and Indica-H395R / F473Y / L123C In the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the replacement vector, 3.99% and n. d. 1.95%, 3.42%, n. d. N. d. 1.32% and 0.07%.
  • the ratio of other sugars was 9.02% in the recombinant E. coli kestose production reaction solution into which the pCDF-Indica recombinant vector was introduced, whereas the Indica-L123C recombinant vector, Indica-H395R group Replacement vectors, Indica-H395K recombinant vector, Indica-F473Y recombinant vector, Indica-H395R / L123C recombinant vector, Indica-H395R / F473Y recombinant vector, Indica-F473Y / L123C recombinant vector and Indica-H395R / F473Y / In the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the L123C recombinant vector, 3.52%, 2.41%, 3.28%, 8.37%, 0.32%, 2.95%, .68 And was 1.51%.
  • the amount of lactosucrose was 29.4 mg in the reaction solution for producing lactosucrose of recombinant E. coli into which the pCDF-Indica recombinant vector was introduced, whereas the amount of Indica-L123C recombinant vector and In the reaction solution for producing lactosucrose of recombinant Escherichia coli into which the Indica-F473Y recombinant vector was introduced, the amounts were 54.8 mg and 45.6 mg, respectively.
  • the ratio of lactosucrose was 17.8% in the reaction solution for producing lactosucrose of recombinant Escherichia coli introduced with the pCDF-Indica recombinant vector, whereas the combination of Indica-L123C recombinant vector and Indica-F473Y In the reaction solution for producing lactosucrose of recombinant Escherichia coli into which the replacement vector was introduced, they were 33.2% and 27.6%, respectively.
  • the lactosucrose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the Indica-L123C recombinant vector and the Indica-F473Y recombinant vector was compared with the lactosucrose production reaction solution of the recombinant E. coli introduced with the pCDF-Indica recombinant vector.
  • the amount of lactosucrose and the ratio of lactosucrose were significantly increased.
  • the lactosucrose production reaction by improved ⁇ -fructofuranosidase consisting of an amino acid sequence introduced with at least one amino acid mutation of L123C and F473Y is compared with the lactosucrose production reaction by wild-type ⁇ -fructofuranosidase.
  • the ratio of lactosucrose and the amount of lactosucrose increased.
  • the 395th histidine from the N terminus (H) in the amino acid sequence of wild-type ⁇ -fructofuranosidase derived from Indica is (A), the 393th histidine from the N terminus (H), and To histidine (H).
  • Glucono_opti gene a base sequence encoding the amino acid sequence of Glucono ⁇ -fructofuranosidase (GenBank: AAB36606.1) with an optimized codon of E. coli was designed, and this was used as the Glucono_opti gene.
  • the base sequence of the Glucono_opti gene is shown in SEQ ID NO: 41, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 42, respectively.
  • DNA encoding Glucono-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase is amplified by artificially synthesizing Glucono_opti DNA and performing PCR under the following conditions using this as a template. A Glucono wild-type DNA fragment was used.
  • Glucono-derived wild-type ⁇ -fructofuranosidase-encoding PCR conditions for DNA amplification >> Template: Artificially synthesized Glucono_opti DNA Forward primer; 5′-aaaactaaaaactctaaagatctcaaggcaattttttcccccagagag-3 ′ (SEQ ID NO: 43) Reverse primer; 5′-ggttttttaccacagactcgagtttattgattcagaaaattgacggacaccgt-3 ′ (SEQ ID NO: 44) Enzyme for PCR; KOD-Plus- (Toyobo) Reaction conditions: 94 cycles for 15 seconds, 58 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 2 minutes for 21 cycles.
  • PCR was performed under the following conditions to amplify the DNA of the pCDFDuet-1 plasmid into which the DNA encoding the PgsA anchor protein was inserted, and the resulting PCR product was used as a pCDF-PgsA-DNA fragment.
  • Burk wild-type DNA fragment and pCDF-PgsA-DNA fragment, and Glucono wild-type DNA fragment and pCDF-PgsA-DNA fragment were respectively ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.).
  • the former was designated as pCDF-Burk recombinant vector, and the latter was designated as pCDF-Glucono recombinant vector.
  • the inserted recombinant vector was prepared. However, PCR templates and primers described in Table 5 were used. With respect to the obtained single mutant recombinant vector, a recombinant vector into which DNA encoding an improved ⁇ -fructofuranosidase having an amino acid sequence into which Burk-H393R and Glucono-H419R were respectively introduced was inserted. -H393R recombinant vector and Glucono-H419R recombinant vector.
  • the amount of kestose was 57.6 mg in the kestose production reaction solution of the recombinant Escherichia coli introduced with the pCDF-Burk recombinant vector, pCDF-Glucono recombinant vector and pCDF-Indica recombinant vector, In contrast to the 56.8 mg and 39.7 mg, in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the Burk-H393R recombinant vector, Glucono-H419R recombinant vector and Indica-H395R recombinant vector were introduced, respectively. .4 mg, 60.3 mg and 163.5 mg, all increased.
  • the ratio of kestose was 14.87% and 14.67% in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the pCDF-Burk recombinant vector, pCDF-Glucono recombinant vector and pCDF-Indica recombinant vector, respectively.
  • the Kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the Burk-H393R recombinant vector, Glucono-H419R recombinant vector and Indica-H395R recombinant vector was 27. 49%, 15.59% and 42.26%, all of which increased.
  • the ratio of nystose is 4.53% and 5.03% in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli introduced with the pCDF-Burk recombinant vector, pCDF-Glucono recombinant vector and pCDF-Indica recombinant vector, respectively. And 5.11%, in the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the Burk-H393R recombinant vector, Glucono-H419R recombinant vector and Indica-H395R recombinant vector were introduced, respectively. d. 0.23% and n. d. And both decreased.
  • the ratios of other sugars were 3.26% and 4.4%, respectively, in the kestose production reaction solution of recombinant E. coli into which the pCDF-Burk recombinant vector, pCDF-Glucono recombinant vector and pCDF-Indica recombinant vector were introduced.
  • the kestose production reaction solution of recombinant Escherichia coli into which the Burk-H393R recombinant vector, Glucono-H419R recombinant vector and Indica-H395R recombinant vector were introduced respectively. .82%, 0.99%, and 2.41%, all of which decreased.

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Abstract

【課題】　ニストースなどの副生成物が生成する割合を抑えてケストースを効率よく生成することができる改良型β－フルクトフラノシダーゼを提供する。 【解決手段】　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ。

Description

改良型β－フルクトフラノシダーゼ
　本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼに関し、特に、ニストースなどの副生成物が生成することを効果的に抑えてケストースを効率よく大量に生成することができる改良型β－フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびそれらを用いたケストースの製造方法に関する。
　β－フルクトフラノシダーゼは、スクロースのフルクトースを認識して、スクロースをフルクトースとグルコースとに加水分解する活性（スクロース加水分解活性）を有する酵素である。β－フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解によって生じたフルクトースをスクロースに転移させる活性（フルクトース転移活性）を有し、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖であるケストースを生成するものも存在する。
　ケストースの中でも１－ケストースは、スクロース（砂糖）と似た甘味質であり、砂糖の三分の一程度の甘さを生じる一方で、砂糖の約半分のカロリーであること、摂取しても血糖値を上昇させにくいこと、アレルギー抑制機能を奏すること（特許文献１）などから、有用なオリゴ糖であることが知られている。１－ケストースを生成するβ－フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のβ－フルクトフラノシダーゼおよびそのアミノ酸配列にアミノ酸変異を導入した変異体のβ－フルクトフラノシダーゼが開示されている（特許文献２）。　
特許第４１６２１４７号公報 特許第３６２８３３６号公報
　β－フルクトフラノシダーゼを用いてケストースを製造する際には、通常、副生成物として４糖のニストースが生成する。ニストースはクロマトグラフィーにおいてケストースとの分離が困難であり、クロマトグラフィーによる分離精製工程を経ても反応液中に残存し易い。また、液中に存在する一定量以上のニストースは、晶析工程でのケストースの結晶化を阻害する。これらのことから、ケストースを効率的に製造するためにはニストースの生成を低減させることが必要である。そこで、ニストースなどの副生成物を生成する割合が小さく、効率的にケストースを生成することができるβ－フルクトフラノシダーゼが求められている。
　本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ニストースなどの副生成物が生成する割合を抑えてケストースを効率よく大量に生成することができる改良型β－フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびそれらを用いたケストースの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＮＢＲＣ３７４４（以下「Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ」と略記する。）由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースなどの副生成物の生成する割合が顕著に低下し、ケストースの生成する割合が増加して、ケストースの生成量が増加することを見出した。
　また、前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して、ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、ｉｉ）Ｎ末端から３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、およびｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異のｉ）～ｉｉｉ）のアミノ酸変異のうち、少なくとも１のアミノ酸変異を導入することにより、ニストースなどの副生成物の生成する割合が顕著に低下し、ケストースの生成する割合が増加して、ケストースの生成量が増加することを見出した。
　また、前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼに対して、ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異およびｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異のｉ）およびｉｉｉ）のアミノ酸変異のうち、少なくとも１のアミノ酸変異を導入することにより、ラクトスクロースの生成する割合およびラクトスクロースの生成量が増加することを見出した。
　そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
（１）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。
（２）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；（ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、ｉｉ）Ｎ末端から３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、ｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
（３）本発明に係るポリペプチドは、（１）または（２）に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。
（４）本発明に係るＤＮＡは、（１）または（２）に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードする。
（５）本発明に係る組換えベクターは、（４）に記載のＤＮＡを含む。
（６）本発明に係る形質転換体は、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。
（７）本発明に係る形質転換体において、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを導入する宿主は大腸菌であってもよい。
（８）本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法は、（６）または（７）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。
（９）本発明に係るケストースの製造方法は、（１）もしくは（２）に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、（６）もしくは（７）に記載の形質転換体または（６）もしくは（７）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼや本発明に係る形質転換体、本発明に係るケストースの製造方法によれば、ニストースなどの副生成物が生成する割合を抑えて、ケストースを効率よく大量に製造することができる。また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法によれば、ニストースが生成する割合を抑えてケストースを効率よく大量に製造することができる改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクター（上図）およびｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミド（下図）を導入した組換え大腸菌によりケストース生成反応を行った反応液に含まれる各糖の比率を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
　以下、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法について詳細に説明する。
　ケストースは、通常、スクロースにフルクトースが結合して生成され、フルクトースが結合する位置により、１－ケストース、６－ケストースおよびネオケストースの３種類が生じうる。すなわち、１－ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成し、６－ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→６）結合して生成し、ネオケストースはフルクトースがスクロース中のグルコース単位にβ（２→６）結合して生成する。また、ニストースは、フルクトースが１－ケストース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成する４糖である。
　本発明における「ケストース」とは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖を意味し、１－ケストース、６－ケストースおよびネオケストースを包含する。
　また、ラクトスクロースは、フルクトース、グルコースおよびガラクトースが結合してなる３糖であり、化学的にはβ－Ｄ－フルクトフラノシル４－Ｏ－β－Ｄ－ガラクトピラノシル－α－Ｄ－グルコピラノシドまたは４Ｇ－ガラクトシルスクロースで示される。すなわち、その分子構造のなかに、スクロース（ショ糖）とラクトース（乳糖）の部分構造を有することを特徴としており、「乳果オリゴ糖」、「乳糖果糖オリゴ糖」とも呼ばれる。ラクトスクロースは、腸内のビフィズス菌を増やして便性・便通を改善することなどから、有用なオリゴ糖であることが知られている。
　ラクトスクロースは、スクロースなどの末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースにβーフルクトフラノシダーゼを作用させて、ラクトースにフルクトースを結合することにより生成する。ここで、「末端にフルクトース残基を含む糖質」としては、具体的には、例えば、スクロースなどの末端にフルクトース残基を含む二糖やケストースなどの末端にフルクトース残基を含むオリゴ糖、末端にフルクトース残基を含む多糖のほか、末端にフルクトース残基を含む糖アルコールや末端にフルクトース残基を含む配糖体などを挙げることができる。
　なお、本発明において、「β－フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β－Ｄ－フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β－フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β－フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼをいう。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列とそれ以外のアミノ酸配列との同一性は、常法に従って確認することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて確認することができる。なお、「同一性」とは一致性を指し、「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」と交換可能に用いられる。
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が６０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより得ることができる。また、常法に従い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）などのアミノ酸配列データベースから、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて配列番号２のアミノ酸配列とのホモロジー検索をすることにより得ることができる。
　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、細菌や酵母、カビ、植物などのいずれの生物に由来するβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列でもよい。配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列として、具体的には、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性(以下、「所定の同一性」という場合がある。)が６０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列や、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＡＴＣＣ９０３９由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＢ９５６４３．１；所定の同一性９９％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＣＥ４７３４８．１；所定の同一性７７％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＣ７５１０９．１；所定の同一性７５％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＲＪ３８４４０．１；所定の同一性７７％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＢ６６６３５．１；所定の同一性７６％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ＧＧ４由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＱ５０７３４．１；所定の同一性７６％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＤＴ０９０１４．１；所定の同一性７４％）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ． ＨＰＣ（Ｌ）由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＳＪ２３１３３．１；所定の同一性７０％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ １１０６ａ由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＲ１８７１１．１；所定の同一性７３％）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＳＲＴ４由来β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ３６６０６．１；所定の同一性６６％）などを挙げることができる。
　ここで、本発明において「配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が６０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列」という場合の、欠失、置換、挿入または付加するアミノ酸の個数は、例えば、１～２００個、１～１８０個、１～１６０個、１～１４０個、１～１２０個、１～１００個、１～８０個、好ましくは１～６０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、よりさらに好ましくは１～３０個を挙げることができる。
　また、本発明に係る「配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列」において、同一性の値は、６０％以上を挙げることができるほか、例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上などを挙げることができる。「配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のうち、シグナル配列（配列番号２の１～２８番目に相当）を除いたアミノ酸配列（配列番号２の２９～５３４番目に相当）」との同一性の値としては、例えば、６５％以上、６６％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上などを挙げることができる。
　アラインメントは、「シーケンスアラインメント」や「アライメント」と呼ばれる場合があるが、同義である。本発明において、アラインメントは常法に従って行うことができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｔｅｒａｔｅｄ　ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）などのプログラムを用いて行うことができる。
　次に、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
　（ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
　ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、
　ｉｉ）Ｎ末端から３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
　ｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
　（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
　上記（ｂ）の「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、１～３０個、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個、よりさらに好ましくは１～５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼは、いずれも野生型β－フルクトフラノシダーゼに比べ、ケストースの生成量が増加し、ニストースなどの副生物が生成する割合が顕著に低下するという特徴を有する。
　また、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼが、下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる場合は、野生型β－フルクトフラノシダーゼに比べ、ラクトスクロースを生成する割合および生成量が増加するという特徴を有する。
（ｃ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉｉ）から選択される１または２のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
　ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、
　ｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
　（ｄ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼは、常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法では、例えば、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
　また、遺伝子組換え技術による方法では、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させることにより、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例３および実施例４に示すように、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β－フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
　ここで、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。
　例えば、アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例３および実施例４に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β－フルクトフラノシダーゼまたは当該アミノ酸変異を導入していない改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより得ることができる。
　また、上記（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、アミノ酸配列（ａ）をコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより得ることができる。
　本発明において、あるタンパク質がβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例２（１）［１－３］、実施例２（２）［２－１］〈２－１－３〉および実施例３（１）［１－３］に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で培養した後、その反応液のケストース含有量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより測定する。その結果、ケストースの含有量が有意に大きければ、当該タンパク質はβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有すると判断することができる。
　また、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。
　次に、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　また、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β－フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。
　また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る形質転換体は、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、カビ、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入するには、相同組換え法などを用いることができる。
　次に、本発明は、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供する。本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法は、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。なお、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程において、改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する方法は、形質転換体の態様などに応じて適宜選択することができる。具体的には、形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得してもよく、培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製して取得してもよい。
　形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得する方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の細胞表面あるいは細胞内部に発現されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して形質転換体を回収し、これをそのまま改良型βフルクトフラノシダーゼとして取得する方法や、回収した形質転換体を破砕して、これを改良型β－フルクトフラノシダーゼとして取得する方法を挙げることができる。
　培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製する方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の外部に分泌されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して培養上清を回収することにより改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製することができる。また、改良型β－フルクトフラノシダーゼが形質転換体の内部に発現される場合は、培養物を遠心分離に供して沈殿させた形質転換体を回収し、これを、緩衝液中に懸濁、凍結融解、超音波処理または磨砕するなどして形質転換体を破砕した後、遠心分離に供して上清を回収することにより改良型β－フルクトフラノシダーゼを精製することができる。その他、精製する方法としては、培養物を熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などに供する方法を挙げることができる。
　また、本発明は、ケストースの製造方法を提供する。本発明に係るケストースの製造方法は、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。なお、本発明に係るケストースの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β－フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、２０℃～６０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪培養する方法を挙げることができる。
　また、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、２０℃～６０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、本発明に係る培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
　最後に、本発明はラクトスクロースの製造方法を提供する。本発明に係るラクトスクロースの製造方法は、下記（Ｉ）の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、（ＩＩ）の形質転換体または（ＩＩＩ）の培養物と、末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースとを接触させる工程を有する；
　（Ｉ）下記（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ
　　（ｃ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）およびｉｉｉ）から選択される１または２のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
　ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、
　ｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
　　（ｄ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
　（ＩＩ）上記（Ｉ）の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、または、当該ＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体、
　（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の形質転換体を培養して得られる培養物。
　なお、本発明に係るラクトスクロースの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
　（Ｉ）の改良型β－フルクトフラノシダーゼと末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースとを接触させる方法としては、例えば（Ｉ）の改良型β－フルクトフラノシダーゼを、末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースを含む溶液に添加し、２０℃～６０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、（ＩＩ）の形質転換体と末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体を、末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪培養する方法を挙げることができる。
　また、（ＩＩＩ）の培養物と末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースとを接触させる方法としては、例えば、（ＩＩＩ）の培養物を、末端にフルクトース残基を含む糖質およびラクトースを含む溶液に添加し、２０℃～６０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。
　本発明に係るケストースの製造方法やラクトスクロースの製造方法には、本発明に係るケストースの製造方法やラクトスクロースの製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、クロマトグラフィーによるケストースの分離工程や煎糖などの結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
　以下、本発明に係る改良型β－フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法、ケストースの製造方法およびラクトスクロースの製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
＜実施例１＞ Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼの塩基配列の決定
　Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＮＢＲＣ３７４４（以下「Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ」と略記する。）のβ－フルクトフラノシダーゼのクローニングを行った。具体的には、まず、Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、下記配列番号３および配列番号４のプライマーを設計した。続いて、下記の条件でポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。また、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡについて、常法に従って全長の塩基配列を決定した。Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号１に、また、それにコードされるＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に、それぞれ示す。
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ａｔｇｇｃａａｇｔｃｇａｔｃｇｔｔｔａａｔｇｔｔｔｇｔａｔａｃ－３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’－ｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃ－３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
　続いて、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａ ＡＴＣＣ９０３９(ゲノムＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００１０１６．１）のβ－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を参考に、ＳｉｇｎａｌＰ４．１サーバー(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いてシグナル配列を予測した。その結果、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）において、シグナル配列は１～２８番目に相当することが明らかになった。
＜実施例２＞β－フルクトフラノシダーゼ発現系の構築
（１）大腸菌菌体内発現系
［１－１］組換えベクターの構築
　まず、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃａｔｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃｇｃａｔｔｃｇｇｇａｃａａｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃ－３’（配列番号５）
リバースプライマー；５’－ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｔｔａｃｃｔｔｇｇｃｃａａｇｃｇｃｇｇｇａａｇａｔ－３’（配列番号６）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
　続いて、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ｐＥＴ２８ａプラスミドのＤＮＡを増幅した。
《ｐＥＴ２８ａプラスミドのＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＥＴ２８ａプラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）
フォワードプライマー；５’－ｃｔｃｇａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｔｇａ－３’（配列番号７）
リバースプライマー；５’－ａｔｇｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｃｃａｇｇｃｃｇｃｔ －３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で６分を１サイクルとして３０サイクル。
　増幅したＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ断片とｐＥＴ２８ａプラスミドのＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、ｐＥＴ２８ａプラスミドにＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入し、これをｐＥＴ２８ａ－ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
［１－２］形質転換および形質転換体の培養と回収
　ｐＥＴ２８ａ－ｉｎｄｉｃａ組換えベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３７℃で２０時間プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地１ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで１８時間振盪培養した。続いて、培養物のうち１０μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地２ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養物を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を回収した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。
　Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水　７２ｍＬ、５×Ｍ９塩　２０ｍＬ、２０％　カザミノ酸　５ｍＬ、２０％ Ｄ－グルコース　２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン　１ｍＬ、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２　０．２ｍＬ、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２　　４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４　２８μＬ、２５ｍｇ／ｍＬ カナマイシン塩　１２０μＬ
　Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水　６７ｍＬ、５×Ｍ９塩　２０ｍＬ、２０％　カザミノ酸　５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン　１ｍＬ、５０ｍＭ　ＣａＣｌ２　０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４　２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１　２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２　５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３　１００μＬ、２５ｍｇ／ｍＬ カナマイシン塩　１２０μＬ
［１－３］β－フルクトフラノシダーゼ活性の確認
　本実施例２（１）［１－２］の組換え大腸菌にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）０．５ｍＬを加えて３７℃で３０分静置することにより菌体を破砕してタンパク質を抽出した。その後、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行って上清を回収し、これを粗β－フルクトフラノシダーゼ液とした。続いて、下記の組成のケストース生成反応液を調製して、３７℃または５０℃で２２時間静置することによりケストースの生成反応を行った。
《ケストース生成反応液の組成》
２０（ｗ／ｗ）％ スクロース水溶液；４５０μＬ
０．２Ｍ リン酸バッファー；２５μＬ
粗β－フルクトフラノシダーゼ液； ２５μＬ
　その後、ケストース生成反応液を下記の条件でＨＰＬＣに供して、ケストース生成反応液に含まれる各糖（フルクトース、グルコース、スクロース、ケストース、ニストースおよびその他の糖）の割合ならびにケストースおよびニストースの量を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、百分率で算出した。また、ケストースおよびニストースの量は、ケストース生成反応液のスクロースの質量にケストースおよびニストースのそれぞれの割合を乗じて算出した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｓｕｇａｒ－Ｄ　４．６×１５０ｍｍ
移動相；Ａ：Ｈ２Ｏ、Ｂ：７５％アセトニトリル水溶液（０～６分、８～１１分）、５０％アセトニトリル水溶液（６～８分）
流速；１．５ｍＬ／分
注入量；２．５μＬ
温度；２５℃
検出；コロナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ；日本ダイオネクス社）、レンジ：５００ｐＡ
　その結果、ケストース生成反応液に含まれるケストースは検出限界以下ないしごく微量であったことから、ケストースがほとんど生成しなかったことが明らかになった。この結果から、β－フルクトフラノシダーゼの大腸菌菌体内発現系は、ケストース生成に不適であることが示された。
（２）大腸菌細胞表面発現系
［２－１］ＰｇｓＡアンカータンパク質による細胞表面提示
〈２－１－１〉組換えベクターの構築
　下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡアンカータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片とした。
《ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）；５’－ａａａｃａｔａｔｇａａａａａａｇａａｃｔｇａｇｃｔｔｔｃａｔｇ－３’（配列番号９）
リバースプライマー（下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）；５’－ａａａａｇａｔｃｔｔｔｔａｇａｔｔｔｔａｇｔｔｔｇｔｃａｃｔａｔｇ－３’（配列番号１０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。
　また、ＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片について、常法に従って塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に、それにコードされるＰｇｓＡアンカータンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に、それぞれ示す。
　次に、下記の条件でＰＣＲを行い、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、常法に従って制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化して、これをＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼＤＮＡ断片とした。
《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂ．ＩｎｄｉｃａのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＢａｍＨＩサイトを示す）；５’－ａａａｇｇａｔｃｃｔｃｇｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃｇｃａｔｔｃｇｇｇａｃａ－３’（配列番号１３）
リバースプライマー（下線はＸｈｏＩサイトを示す）；５’－ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｔｔａａｃ－３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２０サイクル。
　続いて、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）のＮｄｅＩサイトおよびＸｈｏＩサイトにＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片およびＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼＤＮＡ断片を挿入し、これをｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターとした。
〈２－１－２〉形質転換および形質転換体の培養と回収
　本実施例２（２）［２－１］〈２－１－１〉のｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクター、およびコントロールとしてｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミドを、本実施例２（１）［１－２］に記載の方法により大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養して回収した。ただし、Ｍ９ ＳＥＥＤ培地は１ｍＬに代えて０．５ｍＬとし、Ｍ９ ＳＥＥＤ培地での培養時間は１８時間に代えて２０時間とした。また、抗生物質は、「２５ｍｇ／ｍＬ カナマイシン塩 １２０μＬ」に代えて「５０ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシン硫酸塩 １００μＬ」を使用した。
〈２－１－３〉β－フルクトフラノシダーゼ活性の確認
　本実施例２（２）［２－１］〈２－１－２〉の組換え大腸菌を用いて下記の組成のケストース生成反応液を調製し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪することにより、ケストース生成反応を行った。その後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を回収した。回収した上清に５０％アセトニトリルを加えることにより１００倍に希釈した後、本実施例２（１）［１－３］の条件でＨＰＬＣに供した。その結果のＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。
《ケストース生成反応液の組成》
２０（ｗ／ｗ）％　スクロース水溶液；４３０μＬ
０．２Ｍ リン酸バッファー；５０μＬ
組換え大腸菌；全量
　図１の下側の図に示すように、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミドを導入した組換え大腸菌を用いたケストース生成反応液においては、ケストースが確認されなかった。これに対して、同図の上側の図に示すように、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液においては、ケストースが確認された。この結果から、β－フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に提示させると、当該大腸菌を用いてケストースを生成することができることが明らかになった。
［２－２］ＣａｐＡアンカータンパク質による細胞表面提示
〈２－２－１〉組換えベクターの構築
　ＰｇｓＡアンカータンパク質についてＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いて検索し、ＰｇｓＡアンカータンパク質と同一性が５５％であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ３１９株のＣａｐＡアンカータンパク質を抽出した。ＣａｐＡアンカータンパク質を大腸菌の最適化コドンでコードした塩基配列を設計し、これをｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子とした。ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、それにコードされるアミノ酸配列を配列番号１６に、それぞれ示す。
　次に、ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡを人工合成し、これを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＣａｐＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物をｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ－ＤＮＡ断片とした。
《ＣａｐＡ配列のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；人工合成したｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇａａａｇａａａａｇａａａｃｔｇａａｃｔｔｃｃａａｇ－３’（配列番号１７）
リバースプライマー；５’－ｃｇｇｇｔａａｃｃｃｇａｔｔｇａｇａｔｃｔａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃｔｔｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇ－３’（配列番号１８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２１サイクル。
　次に、下記の条件でインバースＰＣＲを行って改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物を改良型β－フルクトフラノシダーゼＤＮＡ断片とした。
《改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例３（１）［１－１］のＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター
フォワードプライマー；５’－ａｇａｔｃｔｃａａｔｃｇｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃ－３’（配列番号１９）
リバースプライマー；５’－ｃａｔａｔｇｔａｔａｔｃｔｃｃｔｔｃｔｔａｔａｃｔｔａａｃ－３’（配列番号２０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒および６８℃で６分を１サイクルとして３５サイクル。
　続いて、ｃａｐＡ＿ｏｐｔｉ遺伝子ＤＮＡ断片とβ－フルクトフラノシダーゼＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結することにより、ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡに代えてＣａｐＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを得て、これをＩｎｄｉｃａ－ＣａｐＡ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターとした。
〈２－２－２〉形質転換および形質転換体の培養と回収
　本実施例２（２）［２－２］〈２－２－１〉のＩｎｄｉｃａ－ＣａｐＡ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、および、コントロールとして実施例３（１）［１－１］のＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを、本実施例２（１）［１－２］に記載の方法により大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養して２ｍＬの培養物から回収した。
〈２－２－３〉β－フルクトフラノシダーゼ活性の確認
　本実施例２（２）［２－２］〈２－２－２〉の組換え大腸菌を用いて、下記の組成のケストース生成反応液を調製した。これを、５０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪することによりケストース生成反応を行った。反応後のケストース生成反応液１００μＬに超純水を９００μＬ加えることにより１０倍に希釈した後、イオン交換樹脂（アンバーライト ＭＢ－４）を加え、３０秒～１分間撹拌した。続いて、１４０００×ｇで５分間遠心分離を行って上清を回収した。これを下記の条件によりＨＰＬＣに供し、本実施例２（１）［１－３］に記載の方法により各糖の割合およびケストースの量を算出した。その結果を以下の表１に示す。表１中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを示す。
《ケストース生成反応液の組成》
６０（ｗ／ｗ）％ スクロース溶液（０．０４Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ７）にスクロースを６０（ｗ／ｗ）％となるよう溶解したもの）；５００μＬ
組換え大腸菌；全量
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ－８０ ４．６×２５０ｍｍ
移動相；７０％アセトニトリル水溶液
流速；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度；７０℃
検出；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；アジレントテクノロジー社）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、Ｉｎｄｉｃａ－ＣａｐＡ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液においても、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液と同様に、ケストースが生成し、かつ、ニストースの量は検出限界以下であった。この結果から、ＰｇｓＡアンカータンパク質やＣａｐＡアンカータンパク質などを用いてβ－フルクトフラノシダーゼを大腸菌の細胞表面に提示させると、当該大腸菌を用いてケストースを効率的に生成することができることが明らかになった。
＜実施例３＞改良型β－フルクトフラノシダーゼの作成と評価
（１）改良型β－フルクトフラノシダーゼの作成
　Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち、Ｎ末から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に、３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に、４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、それぞれ置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｌ１２３Ｃ」、「Ｈ３９５Ｒ」、「Ｈ３９５Ｋ」および「Ｆ４７３Ｙ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる一重変異体、二重変異体および三重変異体のβ－フルクトフラノシダーゼを作成し、これらを改良型β－フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。
［１－１］組換えベクターの構築
　まず、下記の条件でＰＣＲを行い、改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。
《改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；表２のとおり
フォワードプライマーおよびリバースプライマー；表２のとおり
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ＮＥＯ（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１分、９５℃で１０秒、６８℃で２０秒および６８℃で３．５分を１サイクルとして１５サイクル。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　続いて、ＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出し、精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりライゲーションして、組換えベクターを構築した。
　得られた一重変異体の組換えベクターについて、Ｌ１２３Ｃ、Ｈ３９５ＲおよびＦ４７３Ｙをそれぞれ導入した改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを、それぞれ、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクターとした。
　同様に、二重変異体の組換えベクターについては、Ｈ３９５ＲおよびＬ１２３Ｃ、Ｈ３９５ＲおよびＦ４７３Ｙ、ならびにＦ４７３ＹおよびＬ１２３Ｃをそれぞれ導入した改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターとした。
　また、三重変異体の組換えベクターについては、Ｌ１２３Ｃ、Ｈ３９５ＲおよびＦ４７３Ｙを導入した改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターとした。
［１－２］形質転換および形質転換体の培養と回収
　本実施例３（１）［１－１］の組換えベクターを実施例２（１）［１－２］に記載の方法に準じてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３７℃で２０時間プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、８００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地２ｍＬに植え継ぎ、２５℃、８００ｒｐｍで２３時間振盪培養した。その後、培養物を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を回収した。
（２）改良型β－フルクトフラノシダーゼの評価
［２－１］ケストース生成活性の確認
　本実施例３（１）［１－２］の組換え大腸菌、および、コントロールとして実施例２（２）［２－１］〈２－１－２〉のｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌を用いて、実施例２（２）［２－２］〈２－２－３〉に記載の方法によりケストース生成反応を行い、ケストース生成反応液をＨＰＬＣに供した。その結果を表３に示す。表３中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、ケストースの量は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では３９．７ｍｇであったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｋ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ、４４．５ｍｇ、１６３．５ｍｇ、１０５．３ｍｇ、８９．９ｍｇ、１７５．５ｍｇ、１８４．３ｍｇ、１２０．５ｍｇおよび２１８．８ｍｇであった。
　また、ケストースの割合は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では１０．２５％であったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｋ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ、１１．５０％、４２．２６％、２７．２０％、２３．２３％、４５．３４％、４７．６３％、３１．１３％および５６．５４％であった。
　また、ニストースの割合は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では５．１１％であったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｋ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ、３．９９％、ｎ．ｄ．、１．９５％、３．４２％、ｎ．ｄ．、ｎ．ｄ．、１．３２％および０．０７％であった。
　さらに、その他の糖の割合は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では９．０２％であったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｋ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ、３．５２％、２．４１％、３．２８％、８．３７％、０．３２％、２．９５％、１．６８％および１．５１％であった。
　すなわち、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｋ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ組換えベクター、Ｉｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ／Ｆ４７３Ｙ／Ｌ１２３Ｃ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液と比較して、ケストースの量が増加するとともに、ニストースの割合およびその他の糖の割合のいずれもが低下して、ケストースの割合が増加した。このことからＬ１２３Ｃ、Ｈ３９５Ｒ、Ｈ３９５ＫおよびＦ４７３Ｙのうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼによるケストース生成反応では、野生型β－フルクトフラノシダーゼによるケストース生成反応と比較して、ニストースなどの副生成物の割合が顕著に低下してケストースの割合が向上し、その結果としてケストースの量が増加したことが明らかになった。
　これらの結果から、野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に、３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に、４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、それぞれ置換するアミノ酸変異のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入することにより、ニストースなどの副生成物が生成する割合を抑えて、ケストースを効率よく大量に生成することができるβ－フルクトフラノシダーゼを得ることができることが明らかになった。
［２－２］ラクトスクロース生成活性の確認
　本実施例３（１）［１－２］のＩｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌、ならびに、コントロールとして実施例２（２）［２－１］〈２－１－２〉のｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌を用いて、下記の組成のラクトスクロース生成反応液を調製した。
ただし、組換え大腸菌は０．５ｍＬの培養物から回収した全量を用いた。また、培養物からの組換え大腸菌の回収は、４℃、１５０００×ｇで１０分間、培養物を遠心分離に供することにより行った。
《ラクトスクロース生成反応液の組成》
スクロース／ラクトース溶液（０．０５Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ６．０）にスクロースを２２（ｗ／ｗ）％、ラクトースを１８（ｗ／ｗ）％となるよう溶解したもの）；３５０μＬ
組換え大腸菌；全量
　これを、５５℃、２２０ｒｐｍで６時間振盪することによりラクトスクロース生成反応を行った。反応後のラクトスクロース生成反応液５０μＬに超純水４５０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを加えて希釈した後、３５℃にて１０分間加熱した。続いて、２５℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離を行って上清を回収しフィルター濾過した。これを下記の条件によりＨＰＬＣに供し、実施例２（１）［１－３］に記載の方法により各糖の割合およびラクトスクロースの量を算出した。その結果を表４に示す。表４中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを示す。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ－８０ ４．６×２５０ｍｍ
移動相；７０％アセトニトリル水溶液
流速；１．０ｍＬ／分
注入量；２０μＬ
温度；３５℃
検出；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、ラクトスクロースの量は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液では２９．４ｍｇであったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液では、それぞれ、５４．８ｍｇおよび４５．６ｍｇであった。また、ラクトスクロースの割合は、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液では１７．８％であったのに対して、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液では、それぞれ、３３．２％および２７．６％であった。
　すなわち、Ｉｎｄｉｃａ－Ｌ１２３Ｃ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｆ４７３Ｙ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液では、ｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のラクトスクロース生成反応液と比較して、ラクトスクロースの量およびラクトスクロースの割合が顕著に増加した。このことからＬ１２３ＣおよびＦ４７３Ｙのうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼによるラクトスクロース生成反応では、野生型β－フルクトフラノシダーゼによるラクトスクロース生成反応と比較して、ラクトスクロースの割合およびラクトスクロースの量が増加したことが明らかになった。
　これらの結果から、野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に、４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に、それぞれ置換するアミノ酸変異のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入することにより、ラクトスクロースを効率よく大量に生成することができるβ－フルクトフラノシダーゼを得ることができることが明らかになった。
＜実施例４＞Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼと相同なβ－フルクトフラノシダーゼにおける改良型β－フルクトフラノシダーゼの作成と評価
（１）アラインメント
　Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼと７５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼとして下記（ア）を、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼと６６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼとして下記（イ）を、それぞれ抽出した。なお、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列からシグナル配列（配列番号２の１～２８番目に相当）を除いたアミノ酸配列（配列番号２の２９～５３４番目に相当）との同一性を括弧内に示す。
（ア）７５％の同一性（シグナル配列を除いた場合の同一性：７６％）：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ ＳＴＭ８１５ (以下「Ｂｕｒｋ」と略記する。)のβ－フルクトフラノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＣ７５１０９．１）
（イ）６６％の同一性（シグナル配列を除いた場合の同一性：６５％）：Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＳＲＴ４（以下「Ｇｌｕｃｏｎｏ」と略記する。）のβ－フルクトフラノシダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ３６６０６．１）
　次に、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）について、（ア）および（イ）に対してＣｌｕｓｔａｌＷ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）でアラインメントを行った。その結果、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末から３９５番目のヒスチジン（Ｈ）は、（ア）ではＮ末から３９３番目のヒスチジン（Ｈ）、（イ）ではＮ末から４１９番目のヒスチジン（Ｈ）に、それぞれ相当することが明らかになった。
（２）組換えベクターの構築
［２－１］野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターの構築
　下記の条件によりＰＣＲを行い、Ｂｕｒｋ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＢｕｒｋ野生型ＤＮＡ断片とした。Ｂｕｒｋ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３７に、それにコードされるＢｕｒｋ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号３８に、それぞれ示す。
《Ｂｕｒｋ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ＢｕｒｋのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ａａａｃｔａａａａｔｃｔａａａａｇａｔｃｔｃａｇａｃｔｇｃａａｃｇｃｃａｇｇｃｔｔｃｃｃｃｇ－３’（配列番号３９）
リバースプライマー；５’－ｇｇｔｔｔｃｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｃｃ－３’（配列番号４０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２１サイクル。
　また、Ｇｌｕｃｏｎｏのβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ３６６０６．１）を大腸菌の最適化コドンでコードする塩基配列を設計し、これをＧｌｕｃｏｎｏ＿ｏｐｔｉ遺伝子とした。Ｇｌｕｃｏｎｏ＿ｏｐｔｉ遺伝子の塩基配列を配列番号４１に、それにコードされるアミノ酸配列を配列番号４２に、それぞれ示す。
　次に、Ｇｌｕｃｏｎｏ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡを人工合成し、これを鋳型として下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇｌｕｃｏｎｏ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物をＧｌｕｃｏｎｏ野生型ＤＮＡ断片とした。
《Ｇｌｕｃｏｎｏ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；人工合成したＧｌｕｃｏｎｏ＿ｏｐｔｉ遺伝子のＤＮＡ
フォワードプライマー；５’－ａａａｃｔａａａａｔｃｔａａａａｇａｔｃｔｃａａｇｇｃａａｔｔｔｔｔｃｔｃｇｃｃａｇｇａａｇ－３’（配列番号４３）
リバースプライマー；５’－ｇｇｔｔｔｃｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｃａｇａａａｔｔｇａｃｇｇａｃｃｔｇｔ－３’（配列番号４４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡社）
反応条件；９４℃で１５秒、５８℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして２１サイクル。
　次に、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡを挿入したｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミドのＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＣＤＦ－ＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片とした。
《ＰｇｓＡアンカータンパク質をコードするＤＮＡを挿入したｐＣＤＦＤｕｅｔ－１のＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；実施例２（２）［２－１］〈２－１－１〉のｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクター
フォワードプライマー；５’－ｔｃｔｇｇｔａａａｇａａａｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｇａａａｔｔｔ－３’（配列番号４５）
リバースプライマー；５’－ｔｔｔａｇａｔｔｔｔａｇｔｔｔｇｔｃａｃｔａｔｇａｔｃａａｔ－３’（配列番号４６）
　Ｂｕｒｋ野生型ＤＮＡ断片およびｐＣＤＦ－ＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片、ならびにＧｌｕｃｏｎｏ野生型ＤＮＡ断片およびｐＣＤＦ－ＰｇｓＡ－ＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてそれぞれ連結することにより組換えベクターを得て、前者をｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクターとし、後者をｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクターとした。
［２－２］改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターの構築
　実施例３（１）［１－１］の方法により、Ｂｕｒｋ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末から３９３番目のヒスチジン残基、およびＧｌｕｃｏｎｏ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末から４１９番目のヒスチジン（Ｈ）を、それぞれアルギニン（Ｒ）に置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ」および「Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ（一重変異体）をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを調製した。ただし、ＰＣＲの鋳型およびプライマーは表５に記載のものを用いた。
　得られた一重変異体の組換えベクターについて、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３ＲおよびＧｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒをそれぞれ導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを、それぞれ、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクターおよびＧｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（３）β－フルクトフラノシダーゼ活性の確認
　本実施例４（２）［２－１］のｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクターおよびｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクター、ならびに本実施例４（２）［２－２］のＢｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクターおよびＧｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターを、実施例３（１）［１－２］の方法により大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌を培養して２ｍＬの培養物から回収した。続いて、これらの組換え大腸菌を用いて、実施例２（２）［２－２］〈２－２－３〉の方法によりケストース生成量およびニストース生成量を測定した。その結果を表６に示す。なお、比較のために、表３に示す結果のうちｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターを導入した組換え大腸菌における結果を表６の下二段に示す。表６中、ｎ．ｄ．は検出限界以下であったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、ケストースの量は、ｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクター、ｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクターおよびｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ５７．６ｍｇ、５６．８ｍｇおよび３９．７ｍｇであったのに対して、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクター、Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ１０６．４ｍｇ、６０．３ｍｇおよび１６３．５ｍｇであり、いずれも増加した。
　また、ケストースの割合は、ｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクター、ｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクターおよびｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ１４．８７％、１４．６７％および１０．２５％であったのに対して、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクター、Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ、２７．４９％、１５．５９％および４２．２６％であり、いずれも増加した。
　また、ニストースの割合は、ｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクター、ｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクターおよびｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ４．５３％、５．０３％および５．１１％であったのに対して、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクター、Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれｎ．ｄ．、０．２３％およびｎ．ｄ．であり、いずれも低下した。
　さらに、その他の糖の割合は、ｐＣＤＦ－Ｂｕｒｋ組換えベクター、ｐＣＤＦ－Ｇｌｕｃｏｎｏ組換えベクターおよびｐＣＤＦ－Ｉｎｄｉｃａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ３．２６％、４．４６％および９．０２％であったのに対して、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ組換えベクター、Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９Ｒ組換えベクターおよびＩｎｄｉｃａ－Ｈ３９５Ｒ組換えベクターを導入した組換え大腸菌のケストース生成反応液では、それぞれ０．８２％、０．９９％および２．４１％であり、いずれも低下した。
　すなわち、Ｂｕｒｋ－Ｈ３９３Ｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏ－Ｈ４１９ＲまたはＨ３９５Ｒを導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼによるケストース生成反応では、これらのアミノ酸変異を導入しない野生型β－フルクトフラノシダーゼによるケストース生成反応と比較して、ケストースの量が増加するとともに、ニストースの割合およびその他の糖の割合のいずれもが低下して、ケストースの割合が増加したことが明らかになった。
　これらの結果から、Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントでＢ．Ｉｎｄｉｃａ由来野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースなどの副生成物が生成する割合を抑えて、ケストースを効率よく大量に生成することができる改良型β－フルクトフラノシダーゼを得ることができることが明らかになった。

Claims (9)

  1. 　配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３９５番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ。
  2. 　下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β－フルクトフラノシダーゼ；
    （ａ）配列番号２に示す野生型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列；
    　ｉ）Ｎ末端から１２３番目のロイシン（Ｌ）をシステイン（Ｃ）に置換するアミノ酸変異、
    　ｉｉ）Ｎ末端から３９５番目のヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）に置換するアミノ酸変異、
    　ｉｉｉ）Ｎ末端から４７３番目のフェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換するアミノ酸変異、
    （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
  3. 　請求項１または請求項２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  4. 　請求項１または請求項２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。
  5. 　請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  6. 　請求項４に記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
  7. 　宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　請求項６または請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β－フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する改良型β－フルクトフラノシダーゼの製造方法。
  9. 　請求項１もしくは請求項２に記載の改良型β－フルクトフラノシダーゼ、請求項６もしくは請求項７に記載の形質転換体または請求項６もしくは請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有するケストースの製造方法。
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