KR102245498B1

KR102245498B1 - 개량형 β-프룩토프라노시다아제

Info

Publication number: KR102245498B1
Application number: KR1020167020404A
Authority: KR
Inventors: 다쿠미 도치오; 사키 나카무라; 미사 야하라; 다다시 후지이; 게이스케 다무라
Original assignee: 붓산 푸드사이언스 가부시키가이샤; 니혼 마이크로바이오팜 가부시키가이샤
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2021-04-27
Also published as: BR112016015035A2; JPWO2015099166A1; CN105899661A; EP3088520A4; US20160319263A1; CN105899661B; US9963691B2; EP3088520B1; JP2017038618A; KR20160108375A; AU2014370874A1; WO2015099166A1; EP3088520A1; JP6068671B2

Abstract

(과제)본 발명은, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 제공한다.
(해결수단)배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으로부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제이다.

Description

개량형 β-프룩토프라노시다아제{IMPROVED β-FRUCTOFURANOSIDASE}

본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제에 관한 것으로서, 특히 니스토오스(nystose) 등의 부생성물(副生成物)이 생성되는 것을 효과적으로 억제하고 케스토오스(kestose)를 효율적으로 대량으로 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 그 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ, 당해 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector), 당해 ＤＮＡ 또는 당해 재조합 벡터를 숙주(宿主)에 도입해서 얻어지는 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 그들을 사용한 케스토오스의 제조방법에 관한 것이다.

β-프룩토프라노시다아제는, 수크로오스(sucrose)의 프룩토오스(fructose)를 인식하여 수크로오스를 프룩토오스와 글루코오스(glucose)로 가수분해하는 활성(수크로오스 가수분해활성)을 구비하는 효소이다. β-프룩토프라노시다아제 중에는, 가수분해에 의해 발생한 프룩토오스를 수크로오스로 전이(轉移)시키는 활성(프룩토오스 전이활성)을 구비하고, 1분자의 글루코오스와 2분자의 프룩토오스가 결합한 3당(糖)인 케스토오스를 생성하는 것도 존재한다.

케스토오스 중에서도 1-케스토오스는, 수크로오스(설탕)와 비슷한 감미질(甘味質)로서, 설탕의 3분의 1 정도의 단맛이 나는 한편 설탕의 약 반 정도의 칼로리인 것, 섭취해도 혈당값을 상승시키기 어려운 것, 알레르기 억제 기능을 발휘하는 것(특허문헌1) 등 때문에, 유용한 올리고당인 것이 알려져 있다. 1-케스토오스를 생성하는 β-프룩토프라노시다아제로서는, 예를 들면 아스페르길루스·니거(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ) 유래의 β-프룩토프라노시다아제 및 그 아미노산 배열에 아미노산 변이를 도입한 변이체의 β-프룩토프라노시다아제가 개시되어 있다(특허문헌2).

일본국 특허 제4162147호 공보 일본국 특허 제3628336호 공보

β-프룩토프라노시다아제를 사용해서 케스토오스를 제조할 때에는, 보통 부생성물로서 4당의 니스토오스가 생성된다. 니스토오스는 크로마토그래피에 있어서 케스토오스와의 분리가 곤란하여, 크로마토그래피에 의한 분리 정제공정을 거쳐도 반응액중에 잔존하기 쉽다. 또한 액중에 존재하는 일정량 이상의 니스토오스는, 정석공정(晶析工程; crystallization step)에서의 케스토오스의 결정화(結晶化)를 저해한다. 이런 이유로부터, 케스토오스를 효율적으로 제조하기 위해서는 니스토오스의 생성을 저감시키는 것이 필요하다. 그래서 니스토오스 등의 부생성물을 생성하는 비율이 작고, 효율적으로 케스토오스를 생성할 수 있는 β-프룩토프라노시다아제가 요구되고 있다.

본 발명은, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로서, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 대량으로 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 그 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ, 당해 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터, 당해 ＤＮＡ 또는 당해 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 그들을 사용한 케스토오스의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 예의 연구한 결과, Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｉｎｄｉｃａｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａＮＢＲＣ3744 (이하, 「Ｂ.Ｉｎｄｉｃａ」라고 약기한다) 유래의 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으로부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율이 현저하게 저하하고 케스토오스가 생성되는 비율이 증가하여 케스토오스의 생성량이 증가하는 것을 찾아냈다.

또한 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제에 대하여, ｉ)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이, ｉｉ)Ｎ말단으로부터 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이 및 ｉｉｉ)Ｎ말단으로부터 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로 치환하는 아미노산 변이의 ｉ)∼ｉｉｉ)의 아미노산 변이 중에서 적어도 하나의 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율이 현저하게 저하하고 케스토오스가 생성되는 비율이 증가하여 케스토오스의 생성량이 증가하는 것을 찾아냈다.

또한 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제에 대하여, i)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이 및 ｉｉｉ)Ｎ말단으로부터 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로 치환하는 아미노산 변이의 ｉ) 및 ｉｉｉ)의 아미노산 변이 중에서 적어도 하나의 아미노산 변이를 도입함으로써, 락토수크로오스가 생성되는 비율 및 락토수크로오스의 생성량이 증가하는 것을 찾아냈다.

여기에서 이들 지견에 의거하여 하기의 각 발명을 완성하였다.

(1)본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 하나의 태양은, 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으로부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어진다.

(2)본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 또 하나의 태양은, 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어진다; (a)배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ)∼ｉｉｉ)으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열; i)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이, ｉｉ)Ｎ말단으로부터 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이, ｉｉｉ)Ｎ말단으로부터 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로 치환하는 아미노산 변이, (b)아미노산 배열(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

(3)본 발명에 관한 폴리펩티드는, (1) 또는 (2)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함한다.

(4)본 발명에 관한 ＤＮＡ는, (1) 또는 (2)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드한다.

(5)본 발명에 관한 재조합 벡터는, (4)에 기재되어 있는 ＤＮＡ를 포함한다.

(6)본 발명에 관한 형질전환체는, (4)에 기재되어 있는 ＤＮＡ 또는 (5)에 기재되어 있는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체이다.

(7)본 발명에 관한 형질전환체에 있어서, (4)에 기재되어 있는 ＤＮＡ 또는 (5)에 기재되어 있는 재조합 벡터를 도입하는 숙주는 대장균이더라도 좋다.

(8)본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법은, (6) 또는 (7)에 기재되어 있는 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비한다.

(9)본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법은, (1) 혹은 (2)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, (6) 혹은 (7)에 기재되어 있는 형질전환체 또는 (6) 혹은 (7)에 기재되어 있는 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스와를 접촉시키는 공정을 구비한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제나 본 발명에 관한 형질전환체, 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법에 의하면, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 대량으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 관한 폴리펩티드나 본 발명에 관한 ＤＮＡ, 본 발명에 관한 재조합 벡터, 본 발명에 관한 형질전환체, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법에 의하면, 니스토오스가 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 대량으로 제조할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다.

[도1]ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터(상측 도면) 및 ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1 플라스미드(하측 도면)를 도입한 재조합 대장균에 의해 케스토오스 생성반응을 한 반응액에 포함되는 각 당의 비율을 나타내는 ＨＰＬＣ 크로마토그램이다.

이하, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 케스토오스의 제조방법에 대하여 상세하게 설명한다.

케스토오스는 보통 수크로오스에 프룩토오스가 결합해서 생성되며, 프룩토오스가 결합하는 위치에 따라 1-케스토오스, 6-케스토오스 및 네오케스토오스의 3종류가 발생할 수 있다. 즉, 1-케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→1) 결합해서 생성되고, 6-케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→6) 결합해서 생성되며, 네오케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 글루코오스 단위에 β(2→6) 결합해서 생성된다. 또한 니스토오스는, 프룩토오스가 1-케스토오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→1) 결합해서 생성되는 4당이다.

본 발명에 있어서의 「케스토오스」란, 1분자의 글루코오스와 2분자의 프룩토오스가 결합한 3당을 의미하고, 1-케스토오스, 6-케스토오스 및 네오케스토오스를 포함한다.

또한 락토수크로오스(lactosucrose)는, 프룩토오스, 글루코오스 및 갈락토오스(galactose)가 결합해서 이루어지는 3당이며, 화학적으로는 β-D-프룩토프라노실4-O-β-D-갈락토피라노실-α-D-글루코피라노시드 또는 4G-갈락토실수크로오스로 나타내진다. 즉, 그 분자구조 내에 수크로오스(자당)와 락토오스(유당)의 부분구조를 구비하는 것을 특징으로 하고 있어, 「유과올리고당(乳果oligo糖)」, 「유당과당올리고당」이라고도 불린다. 락토수크로오스는 장내(腸內)의 비피더스균을 늘려서 변성(便性)·변통(便通)을 개선하는 것 등 때문에, 유용한 올리고당인 것이 알려져 있다.

락토수크로오스는, 수크로오스 등과 같이 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질(糖質) 및 락토오스에 β―프룩토프라노시다아제를 작용시켜서, 락토오스에 프룩토오스를 결합시킴으로써 생성한다. 여기에서 「말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질」로서는, 구체적으로는, 예를 들면 수크로오스 등과 같이 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 2당이나 케스토오스 등과 같이 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 올리고당, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 다당(多糖) 외에, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당알코올이나 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 배당체 등을 들 수 있다.

또 본 발명에 있어서, 「β-프룩토프라노시다아제」는, 「프룩토실트랜스퍼라아제」, 「사카라아제」, 「β-D-프룩토프라노시다아제」, 「인베르타아제(invertase)」 또는 「인베르틴(invertin)」과 교환 가능하게 사용되는 경우가 있다. 또한 본 발명에 있어서의 「야생형 β-프룩토프라노시다아제」란, 유전자공학의 방법을 사용해서 아미노산 변이를 도입하지 않고 있는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제를 말하고, 「개량형 β-프룩토프라노시다아제」란, 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여 1 또는 2 이상의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제를 말한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 하나의 태양은, 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으로부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어진다.

배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 그 이외의 아미노산 배열과의 동일성은, 보통의 방법에 따라서 확인할 수 있고, 예를 들면 ＦＡＳＴＡ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ/ｔｏｏｌｓ/ｆａｓｔａ/), Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.), Ｐｏｓｉｔｉｏｎ-ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｔｅｒａｔｅｄＢＬＡＳＴ(ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.) 등의 프로그램을 사용해서 확인할 수 있다. 또 「동일성」이란 일치성을 가리키고, 「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」와 교환 가능하게 사용된다.

배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열은, 배열번호2의 아미노산 배열에 있어서, 배열번호2의 아미노산 배열과의 동일성이 60% 미만이 되지 않는 범위에서 1개 또는 복수 개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 또는 부가함으로써 얻을 수 있다. 또한 보통의 방법을 따르고, ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＲｅｓｏｕｒｃｅ(ＰＩＲ), ＳＷＩＳＳ-ＰＲＯＴ, ＴｒＥＭＢＬ, ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ(ＰＲＦ), ＧｅｎＰｅｐｔ(ＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅ) 등의 아미노산 배열 데이터베이스로부터, ＦＡＳＴＡ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ/ｔｏｏｌｓ/ｆａｓｔａ/), Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.), Ｐｏｓｉｔｉｏｎ-ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｔｅｒａｔｅｄＢＬＡＳＴ(ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.) 등의 프로그램을 사용해서 배열번호2의 아미노산 배열과의 호몰로지(homology) 검색을 함으로써 얻을 수 있다.

배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열은, 세균이나 효모, 곰팡이, 식물 등의 어느 생물에서 유래되는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열이어도 좋다. 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열로서, 구체적으로는, 예를 들면 배열번호2의 아미노산 배열에 있어서 배열번호2의 아미노산 배열과의 동일성(이하, 「소정의 동일성」이라고 하는 경우가 있다)이 60% 미만이 되지 않는 범위에서 1개 또는 복수 개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 또는 부가한 아미노산 배열이나, Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｉｎｄｉｃａｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａＡＴＣＣ9039 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＣＢ95643.1 ; 소정의 동일성 99%), Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＣＣＥ47348.1 ; 소정의 동일성 77%), ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｈｙｍａｔｕｍＳＴＭ815 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＣＣ75109.1 ; 소정의 동일성 75%), Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＥＲＪ38440.1 ; 소정의 동일성 77%), ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａａｍｂｉｆａｒｉａＡＭＭＤ 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＣＢ66635.1 ; 소정의 동일성 76%), ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａＧＧ4 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＦＱ50734.1 ; 소정의 동일성 76%), Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＥＤＴ09014.1 ; 소정의 동일성 74%), Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓｓｐ．ＨＰＣ(Ｌ) 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＥＳＪ23133.1 ; 소정의 동일성 70%), Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ 1106ａ 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＦＲ18711.1 ; 소정의 동일성 73%), ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓＳＲＴ4 유래 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＡＢ36606.1 ; 소정의 동일성 66%) 등을 들 수 있다.

여기에서 본 발명에 있어서 「배열번호2의 아미노산 배열에 있어서 배열번호2의 아미노산 배열과의 동일성이 60% 미만이 되지 않는 범위에서 1개 또는 복수 개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 또는 부가한 아미노산 배열」이라고 하는 경우의 결실, 치환, 삽입 또는 부가하는 아미노산의 개수는, 예를 들면 1∼200개, 1∼180개, 1∼160개, 1∼140개, 1∼120개, 1∼100개, 1∼80개, 바람직하게는 1∼60개, 더 바람직하게는 1∼50개, 더욱 바람직하게는 1∼40개, 보다 더욱 바람직하게는 1∼30개를 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 「배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 동일성을 구비하는 아미노산 배열」에 있어서, 동일성의 값은, 60% 이상을 들 수 있는 것 외에, 예를 들면 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 등을 들 수 있다. 「배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열 중, 시그널 배열(배열번호2의 1∼28번째에 상당)을 제외한 아미노산 배열(배열번호2의 29∼534번째에 상당)」과의 동일성의 값으로서는, 예를 들면 65% 이상, 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 등을 들 수 있다.

얼라인먼트는 「시퀀스 얼라인먼트」나 「얼라인먼트」라고 불리는 경우가 있지만, 동의(同義)이다. 본 발명에 있어서, 얼라인먼트는 보통의 방법에 따라서 할 수 있고, 예를 들면 ＦＡＳＴＡ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ/ｔｏｏｌｓ/ｆａｓｔａ/), Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.), Ｐｏｓｉｔｉｏｎ-ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｔｅｒａｔｅｄＢＬＡＳＴ(ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.), ＣＬＵＳＴＡＬＷ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ/ｊａ/), ＭＡＦＦＴ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ/ｊａ/) 등의 프로그램을 사용해서 할 수 있다.

다음에 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 또 하나의 태양은, 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어진다;

(a)배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ)∼ｉｉｉ)으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열；

ｉ)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이,

ｉｉ)Ｎ말단으로부터 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이,

ｉｉｉ)Ｎ말단으로부터 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로 치환하는 아미노산 변이,

(b)아미노산 배열(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

상기 (b)의 「1개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열」이란, 예를 들면 1∼30개, 1∼20개, 바람직하게는 1∼15개, 더 바람직하게는 1∼10개, 보다 더욱 바람직하게는 1∼5개의 임의의 수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열을 의미한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제는, 모두 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 비교하여, 케스토오스의 생성량이 증가하고 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율이 현저하게 저하한다고 하는 특징을 구비한다.

또한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제가, 하기 (c) 또는 (d)의 아미노산 배열로 이루어지는 경우에는, 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 비교하여, 락토수크로오스를 생성하는 비율 및 생성량이 증가한다고 하는 특징을 구비한다.

(c)배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ) 및 ｉｉｉ)으로부터 선택되는 1 또는 2의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열；

(d)아미노산 배열(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제는 보통의 방법에 따라서 얻을 수 있고, 그러한 방법으로서는, 예를 들면 화학합성하는 방법이나, 유전자 재조합 기술(gene recombination technique)에 의한 방법을 들 수 있다. 화학합성하는 방법에서는, 예를 들면 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열정보에 의거하여 Ｆｍｏｃ법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), ｔＢｏｃ법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 따라 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 합성할 수 있는 것 외에, 각종 시판되는 펩티드 합성기를 이용해서 합성할 수도 있다.

또한 유전자 재조합 기술에 의한 방법에서는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 적합한 발현계에서 발현시킴으로써, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다. 즉 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 적당한 숙주에 도입해서 형질전환체를 얻는다. 또는 후술하는 실시예3 및 실시예4에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 적당한 벡터에 삽입해서 재조합 벡터(recombinant vector)를 얻은 후, 그 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입해서 형질전환체를 얻는다. 그리고 얻어진 형질전환체를 배양해서 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 발현시킴으로써, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다.

여기에서 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ는, 시판되고 있는 다양한 ＤＮＡ합성기를 사용해서 합성할 수 있는 것 이외에, 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ나 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 주형(鑄型; template)으로 하여, 폴리머라아제 연쇄반응(ＰＣＲ)을 함으로써 얻을 수 있다.

예를 들면 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 얻는 경우에는, 후술하는 실시예3 및 실시예4에 나타나 있는 바와 같이 우선 도입하는 아미노산 변이를 코드하는 ＤＮＡ 프라이머(primer)를 설계하고, 그 ＤＮＡ 프라이머를 사용하여, 야생형 β-프룩토프라노시다아제 또는 당해 아미노산 변이를 도입하지 않고 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 주형으로 하여 ＰＣＲ을 함으로써 얻을 수 있다.

또한 상기 (b)의 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ도 또한 ＰＣＲ에 의해 얻을 수 있다. 즉, 우선 아미노산 배열(a)에 있어서, 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 개소(個所; site)에 상당하는 아미노산 배열을 코드하는 ＤＮＡ 프라이머를 설계하고, 그 ＤＮＡ 프라이머를 사용하여, 아미노산 배열(a)를 코드하는 ＤＮＡ를 주형으로 하여 ＰＣＲ을 함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 어떤 단백질이 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 것인가 아닌가는, 보통의 방법에 따라 확인할 수 있고, 예를 들면 후술하는 실시예2(1)[1-3], 실시예2(2)[2-1]<2-1-3> 및 실시예3(1)[1-3]에 나타나 있는 바와 같이, 당해 단백질을 수크로오스를 포함하는 반응액중에서 인큐베이트(incubate) 하고, 또는 당해 단백질을 발현시킨 형질전환체를 수크로오스를 포함하는 반응액중에서 배양한 후, 그 반응액의 케스토오스 함유량을 고속액체 크로마토그래피(ＨＰＬＣ) 등에 의해 측정한다. 그 결과, 케스토오스의 함유량이 유의(有意)하게 크면 당해 단백질은 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비한다고 판단할 수 있다.

본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 본 발명에 관한 폴리펩티드에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 반복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 폴리펩티드는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 한, 그 배열길이는 특별하게 한정되지 않고, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열만으로 이루어지는 것이라도 좋고, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 아미노 말단 및/또는 카르복실 말단에, 1개 혹은 복수 개의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 것이라도 좋다. 또한 본 발명에 관한 폴리펩티드는, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻는 방법과 동일한 방법에 의해 얻을 수 있다.

그리고 본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 제공한다. 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제 및 폴리펩티드와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

또한 본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 본 발명에 관한 재조합 벡터에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드 및 ＤＮＡ와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 재조합 벡터는, 예를 들면 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 벡터에 삽입함으로써 얻을 수 있다. ＤＮＡ의 벡터에의 삽입은, 보통의 방법에 따라 할 수 있고, 예를 들면 ＤＮＡ와 선상화(線狀化) 한 벡터의 ＤＮＡ 단편(斷片)과를 라이게이션(ligation) 함으로써 할 수 있다. 여기에서 벡터로서는, 예를 들면 파지 벡터(phage vector)나 플라스미드 벡터(plasmid vector), 코스미드(cosmid), 파지미드(phagemid) 등을 들 수 있고, 숙주나 조작성 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 또한 본 발명에 관한 재조합 벡터는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 이외에, 약제내성 마커 유전자(藥劑耐性 marker 遺傳子)나 영양요구 마커 유전자(榮養要求 marker 遺傳子) 등의 형질전환체의 선택 마커 유전자, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 발현에 필요한 프로모터(promoter), 전사개시신호, 리보솜 결합부위, 번역정지 시그널, 전사종결신호 등의 전사조절신호나 번역조절신호 등을 포함하는 것이더라도 좋다.

본 발명은 형질전환체도 제공한다. 또 본 발명에 관한 형질전환체에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ 및 재조합 벡터와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 형질전환체는, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 또는 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어진다. 여기에서 숙주로서는, 예를 들면 대장균(大腸菌)이나 고초균(枯草菌) 등의 세균, 효모, 곰팡이, 사상균(絲狀菌) 등을 들 수 있고, 재조합 벡터의 종류나 조작성 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. ＤＮＡ나 재조합 벡터의 숙주에의 도입(형질전환)은 보통의 방법에 따라 할 수 있고, 예를 들면 플라스미드를 사용한 재조합 벡터를 대장균에 도입하는 경우이면, 대장균의 컴피턴트 세포(competent cell)에 재조합 벡터를 가하여 빙상(氷上)에서 30분간 정치(靜置)하고, 계속하여 42도의 워터 배스(water bath)에 넣어서 45초간 정치한 후, 빙상에서 2분간 정치하고, 그 후에 배지를 가하여 37도에서 1시간 진탕(振蕩)함으로써 할 수 있다. 또한 숙주의 염색체에 직접 원하는 ＤＮＡ를 도입하기 위해서는, 상동재조합법(homologous recombination method) 등을 사용할 수 있다.

다음에 본 발명은 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법은, 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비한다. 또 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터 및 형질전환체와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정에 있어서, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 방법은, 형질전환체의 태양 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 구체적으로는, 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 그대로 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하더라도 좋고, 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제해서 취득하더라도 좋다.

형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 그대로 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 세포 표면 혹은 세포 내부에 발현되도록 ＤＮＡ 혹은 재조합 벡터를 설계하였을 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 형질전환체를 회수하고, 이것을 그대로 개량형 β프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법이나, 회수한 형질전환체를 파쇄하여 이것을 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법을 들 수 있다.

배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제하는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 외부에 분비되도록 ＤＮＡ 혹은 재조합 벡터를 설계하였을 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 배양 상청(上淸; 표면에 떠 있는 부분)을 회수함으로써 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제할 수 있다. 또한 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 내부에 발현되어지는 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 침전시킨 형질전환체를 회수하고, 이것을 완충액중에 현탁, 동결 융해, 초음파처리 또는 마쇄(磨碎)하는 등 해서 형질전환체를 파쇄한 후, 원심분리에 제공해서 상청을 회수함으로써 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제할 수 있다. 그 밖에 정제하는 방법으로서는, 배양물을 열처리, 염침전, 용매침전, 투석, 한외 여과, 겔 여과, ＳＤＳ-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수(疏水) 크로마토그래피, 역상(逆相) 크로마토그래피, 등전점전기영동 등에 제공하는 방법을 들 수 있다.

본 발명은 케스토오스의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법은, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 본 발명에 관한 형질전환체 또는 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스와를 접촉시키는 공정을 구비한다. 또 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체 및 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법과 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제와 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 20도∼60도로 20시간 정도 정치하는 방법을 들 수 있다. 또한 본 발명에 관한 형질전환체와 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 숙주가 대장균인 경우에는, 본 발명에 관한 형질전환체를 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 50도로 몇 일간 진탕배양(振蕩培養)하는 방법을 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 20도∼60도로 20시간 정도 정치 혹은 진탕하는 방법을 들 수 있다. 여기에서 본 발명에 관한 배양물은, 파쇄, 마쇄, 완충액에의 현탁, 동결 융해, 초음파처리, 원심분리, 열처리, 염침전, 용매침전, 투석, 한외 여과, 겔 여과, ＳＤＳ-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 등전점전기영동 등의 어떠한 처리에 제공한 것이더라도 좋고, 처리에 제공하지 않고 있는 것이더라도 좋다.

마지막으로, 본 발명은 락토수크로오스의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 관한 락토수크로오스의 제조방법은, 하기 (Ｉ)의 개량형 β-프룩토프라노시다아제, (ＩＩ)의 형질전환체 또는 (ＩＩＩ)의 배양물과, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스와를 접촉시키는 공정을 구비한다;

(Ｉ)하기 (c) 또는 (d)의 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제

i)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이,

(d)아미노산 배열(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열,

(ＩＩ)상기 (I)의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 또는 당해 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체,

(ＩＩＩ)상기 (ＩＩ)의 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물.

본 발명에 관한 락토수크로오스의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 케스토오스의 제조방법과 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

(Ｉ)의 개량형 β-프룩토프라노시다아제와 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 (Ｉ)의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스를 포함하는 용액에 첨가하고, 20도∼60도로 20시간 정도 정치하는 방법을 들 수 있다. 또한 (ＩＩ)의 형질전환체와 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 숙주가 대장균인 경우에는, 본 발명에 관한 형질전환체를, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스를 포함하는 용액에 첨가하고, 50도로 몇 일간 진탕배양하는 방법을 들 수 있다.

또한 (ＩＩＩ)의 배양물과 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 (ＩＩＩ)의 배양물을, 말단에 프룩토오스 잔기를 포함하는 당질 및 락토오스를 포함하는 용액에 첨가하고, 20도∼60도로 20시간 정도 정치 혹은 진탕하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법이나 락토수크로오스의 제조방법에는, 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법이나 락토수크로오스의 제조방법의 특징을 손상하지 않는 한, 다른 공정을 구비하더라도 좋고, 예를 들면 크로마토그래피에 의한 케스토오스의 분리공정이나 전당(煎糖) 등의 결정화공정, 건조공정, 세정공정, 여과공정, 살균공정, 식품첨가물을 첨가하는 공정 등을 구비해도 좋다.

이하, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법, 케스토오스의 제조방법 및 락토수크로오스의 제조방법에 대해서, 각 실시예에 의거하여 설명한다. 또 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 의해 나타내지는 특징에 한정되지 않는다.

실시예

<실시예1>Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 염기배열의 결정

Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｉｎｄｉｃａｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａＮＢＲＣ3744(이하, 「Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ」라고 약기한다)의 β-프룩토프라노시다아제의 클로닝(cloning)을 하였다. 구체적으로는, 우선 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ의 게놈ＤＮＡ를 보통의 방법에 따라 추출했다. 계속하여 하기 배열번호3 및 배열번호4의 프라이머를 설계했다. 계속하여 하기의 조건으로 폴리머라아제 연쇄반응(ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ; ＰＣＲ)을 함으로써, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시켰다. 또한 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ에 대해서, 보통의 방법에 따라 전장(全長)의 염기배열을 결정했다. Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 전장의 염기배열을 배열번호1로, 또한 그것에 코드되는 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 배열번호2로, 각각 나타낸다.

《Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머 ; 5’－ａｔｇｇｃａａｇｔｃｇａｔｃｇｔｔｔａａｔｇｔｔｔｇｔａｔａｃ-3’（배열번호3)

리버스 프라이머 ; 5’－ｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃ-3’（배열번호4)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-(도요보사(東洋紡社))

반응조건 ; 95도로 10초, 60도로 20초 및 68도로 2분을 1사이클로 하여 30사이클.

계속하여 Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｉｎｄｉｃａｓｕｂｓｐ．ｉｎｄｉｃａＡＴＣＣ9039(게놈ＤＮＡ ; ＧｅｎＢａｎｋ : ＣＰ001016.1)의 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 참고로, ＳｉｇｎａｌＰ4.1 서버(server)(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ/)를 사용해서 시그널 배열(signal sequence)을 예측했다. 그 결과, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 있어서, 시그널 배열은 1∼28번째에 상당하는 것이 밝혀졌다.

<실시예2>β-프룩토프라노시다아제 발현계의 구축

(1)대장균 균체내 발현계

[1-1]재조합 벡터의 구축

우선 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시켰다.

주형 ; Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머 ; 5’－ｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃａｔｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃｇｃａｔｔｃｇｇｇａｃａａｇｃｃｔａｔｇａｔｃｃ-3’（배열번호5)

리버스 프라이머 ; 5’－ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｔｔａｃｃｔｔｇｇｃｃａａｇｃｇｃｇｇｇａａｇａｔ-3’（배열번호6)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

계속하여 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, ｐＥＴ２８ａ 플라스미드의 ＤＮＡ를 증폭시켰다.

《ｐＥＴ２８ａ 플라스미드의 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ；ｐＥＴ２８ａ플라스미드（Ｍｅｒｃｋ사）

포워드 프라이머 ；５’－ｃｔｃｇａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｔｇａ－３’（배열번호7）

리버스 프라이머 ；５’－ａｔｇｇｃｔｇｃｃｇｃｇｃｇｇｃａｃｃａｇｇｃｃｇｃｔ－３’（배열번호８）

ＰＣＲ용 효소 ；ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（도요보사）

반응조건 ； 95도로 10초, 60도로 20초 및 68도로 6분을 １사이클로 하여 30사이클.

증폭시킨 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 단편과 ｐＥＴ２８ａ 플라스미드의 ＤＮＡ 단편과를, Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(다카라바이오사(Takara Bio Inc.))를 사용해서 연결함으로써, ｐＥＴ２８ａ 플라스미드에 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입하고, 이것을 ｐＥＴ２８ａ-ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터로 했다.

[1-2]형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

ｐＥＴ２８ａ-ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ21(ＤＥ3) 컴피턴트 세포(코스모바이오사(Cosmo Bio Co., Ltd.))에 도입하여 형질전환체로서 재조합 대장균을 얻었다. 이것을 37도로 20시간 플레이트 배양한 후, 재조합 대장균의 클론(clone)을 픽업해서 Ｍ9 ＳＥＥＤ배지 1ｍＬ에 식균(植菌)하고, 30도, 220ｒｐｍ으로 18시간 진탕배양했다. 계속하여 배양물 중에서 10μＬ를 Ｍ9 Ｍａｉｎ배지 2ｍＬ에 계속해서 심고, 25도, 220ｒｐｍ으로 24시간 진탕배양했다. 그 후에 배양물을 3500ｒｐｍ으로 10분간 원심분리 함으로써 재조합 대장균을 회수했다. Ｍ9 ＳＥＥＤ배지 및 Ｍ9 Ｍａｉｎ배지의 조성을 이하에 나타낸다.

Ｍ9 ＳＥＥＤ배지(계 100ｍＬ) ; 물 72ｍＬ, 5×Ｍ9염 20ｍＬ, 20% 카사미노산 5ｍＬ, 20％ D-글루코오스 2ｍＬ, 2ｍｇ/ｍＬ 티민 1ｍＬ, 50ｍＭＣａＣｌ₂ 0.2ｍＬ, 2.5ＭＭｇＣｌ₂ 40μＬ, 100ｍｇ/ｍＬＦｅＳＯ₄ 28μＬ, 25ｍｇ/ｍＬ 카나마이신염 120μＬ

Ｍ9 Ｍａｉｎ배지(계 100ｍＬ) ; 물 67ｍＬ, 5×Ｍ9염 20ｍＬ, 20% 카사미노산 5ｍＬ, 2ｍｇ/ｍＬ 티민 1ｍＬ, 50ｍＭＣａＣｌ₂ 0.2ｍＬ, 100ｍｇ/ｍＬＦｅＳＯ₄ 28μＬ, ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ1(Ｏ．Ｎ．Ｅ．; Ｍｅｒｃｋ사) Ｓｏｌ．1 2ｍＬ, Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．2 5ｍＬ, Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．3 100μＬ, 25ｍｇ/ｍＬ 카나마이신염 120μＬ

[1-3]β-프룩토프라노시다아제 활성의 확인

본 실시예2(1)[1-2]의 재조합 대장균에 ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ(Ｎｏｖａｇｅｎ사) 0.5ｍＬ를 가하여 37도로 30분 정치함으로써 균체를 파쇄해서 단백질을 추출했다. 그 후에 12000ｒｐｍ으로 30분간 원심분리를 하여 상청을 회수하고, 이것을 크루드(粗; crude) β-프룩토프라노시다아제액으로 했다. 계속하여 하기의 조성의 케스토오스 생성반응액을 조제하여 37도 또는 50도로 22시간 정치함으로써 케스토오스의 생성반응을 하였다.

《케스토오스 생성반응액의 조성》

20(w/w）％ 수크로오스 수용액 ; 450μＬ

0.2Ｍ 인산 버퍼 ; 25μＬ

크루드 β-프룩토프라노시다아제액 ; 25μＬ

그 후에 케스토오스 생성반응액을 하기의 조건으로 ＨＰＬＣ에 제공하고, 케스토오스 생성반응액에 포함되는 각 당(프룩토오스, 글루코오스, 수크로오스, 케스토오스, 니스토오스 및 기타의 당)의 비율 및 케스토오스 및 니스토오스의 양을 확인했다. 각 당의 비율은, 검출된 전(全) 피크의 면적의 총합계에 대한 각 피크의 면적의 비율로서, 백분율로 산출했다. 또한 케스토오스 및 니스토오스의 양은, 케스토오스 생성반응액에 있어서 수크로오스의 질량에 케스토오스 및 니스토오스의 각각의 비율을 곱해서 산출했다.

《ＨＰＬＣ의 조건》

칼럼 ; ＣｏｓｍｏｓｉｌＳｕｇａｒ-Ｄ 4.6×150mm

이동상 ; Ａ : Ｈ₂Ｏ, B : 75% 아세트니트릴 수용액(0∼6분, 8∼11분), 50% 아세트니트릴 수용액(6∼8분)

유속 ; 1.5ｍＬ/분

주입량 ; 2.5μＬ

온도 ; 25도

검출 ; 코로나 하전화입자검출기(ＣＡＤ ; 일본다이오네쿠스사(Nippon Dionex K.K.)), 레인지 : 500ｐＡ

그 결과, 케스토오스 생성반응액에 포함되는 케스토오스는 검출 한계 이하 또는 극히 미량이었던 것으로부터, 케스토오스가 거의 생성되지 않은 것이 밝혀졌다. 이 결과로부터, β-프룩토프라노시다아제에 있어서 대장균 균체내 발현계는 케스토오스 생성에 적당하지 않은 것이 드러났다.

(2)대장균 세포 표면 발현계

[2-1]ＰｇｓＡ앵커(anchor) 단백질에 의한 세포표면제시

<2-1-1>재조합 벡터의 구축

하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＩＡＭ1026, ＡＴＣＣ9466)의 ＰｇｓＡ앵커 단백질(ＧｅｎＢａｎｋ : ＡＢ016245.1)을 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시켰다. 얻어진 ＰＣＲ산물을 보통의 방법에 따라 제한효소 ＮｄｅＩ 및 ＢｇｌＩＩ에 의하여 소화하고, 이것을 ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편으로 했다.

《ＰｇｓＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＩＡＭ1026, ＡＴＣＣ9466)의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머(밑줄은 ＮｄｅＩ 사이트를 나타낸다) ; 5’－ａａａｃａｔａｔｇａａａａａａｇａａｃｔｇａｇｃｔｔｔｃａｔｇ-3’（배열번호9)

리버스 프라이머(밑줄은 ＢｇｌＩＩ 사이트를 나타낸다) ; 5’－ａａａａｇａｔｃｔｔｔｔａｇａｔｔｔｔａｇｔｔｔｇｔｃａｃｔａｔｇ-3’（배열번호10)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편에 대해서 보통의 방법에 따라 염기배열을 확인했다. 확인한 ＰｇｓＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 배열번호11로, 그것에 코드되는 ＰｇｓＡ앵커 단백질의 아미노산 배열을 배열번호12로, 각각 나타낸다.

다음에 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 하여, Ｂ.Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시키고, 보통의 방법에 따라 제한효소 ＢａｍＨＩ 및 ＸｈｏＩ에 의하여 소화하여 이것을 Ｂ.Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제 ＤＮＡ 단편으로 했다.

주형 ; Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머(밑줄은 ＢａｍＨＩ 사이트를 나타낸다) ; 5’－ａａａｇｇａｔｃｃｔｃｇｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃｇｃａｔｔｃｇｇｇａｃａ-3’（배열번호13)

리버스 프라이머(밑줄은 ＸｈｏＩ 사이트를 나타낸다) ; 5’－ｃｃｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｃｇｔｔｃｇｔｇａｃａｃｃａｔｇｇｃｃａｔｔａａｃ-3’（배열번호14)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-(도요보사)

반응조건 ; 95도로 10초, 60도로 20초 및 68도로 2분을 1사이클로 하여 20사이클.

계속하여 ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．2.1(다카라바이오사)을 사용하여 첨부의 사용서에 따라, ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1 플라스미드(Ｍｅｒｃｋ사)의 ＮｄｅＩ 사이트 및 ＸｈｏＩ 사이트에 ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편 및 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제 ＤＮＡ 단편을 삽입하고, 이것을 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터로 하였다.

<2-1-2>형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

본 실시예2(2)[2-1]<2-1-1>의 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터, 및 컨트롤로서 ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1 플라스미드를, 본 실시예2(1)[1-2]에 기재되어 있는 방법에 의해 대장균에 도입하고, 얻어진 재조합 대장균을 배양해서 회수했다. 다만 Ｍ9 ＳＥＥＤ배지는 1ｍＬ 대신에 0.5ｍＬ로 하고, Ｍ9 ＳＥＥＤ배지에서의 배양 시간은 18시간 대신에 20시간으로 했다. 또한 항생물질은 「25ｍｇ/ｍＬ 카나마이신염 120μＬ」 대신에 「50ｍｇ/ｍＬ 스트렙토마이신 황산염 100μＬ」를 사용했다.

<2-1-3>β-프룩토프라노시다아제 활성의 확인

본 실시예2(2)[2-1]<2-1-2>의 재조합 대장균을 사용해서 하기의 조성의 케스토오스 생성반응액을 조제하고, 30도, 220ｒｐｍ으로 20시간 진탕함으로써 케스토오스 생성반응을 하였다. 그 후에 3500ｒｐｍ으로 10분간 원심분리를 하여 상청을 회수했다. 회수한 상청에 50% 아세트니트릴을 가함으로써 100배로 희석한 후, 본 실시예2(1)[1-3]의 조건으로 ＨＰＬＣ에 제공했다. 그 결과의 ＨＰＬＣ 크로마토그램을 도1에 나타낸다.

《케스토오스 생성반응액의 조성》

20(w/w）％ 수크로오스 수용액 ; 430μＬ

0.2M 인산 버퍼 ; 50μＬ

재조합 대장균 ; 전량

도1의 하측의 도면에 나타나 있는 바와 같이, ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1 플라스미드를 도입한 재조합 대장균을 사용한 케스토오스 생성반응액에 있어서는, 케스토오스가 확인되지 않았다. 이에 대하여 동(同)도의 상측의 도면에 나타나 있는 바와 같이, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에 있어서는, 케스토오스가 확인되었다. 이 결과로부터, β-프룩토프라노시다아제를 대장균의 세포 표면에 제시시키면, 당해 대장균을 사용해서 케스토오스를 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다.

[2-2]ＣａｐＡ앵커 단백질에 의한 세포표면제시

<2-2-1>재조합 벡터의 구축

ＰｇｓＡ앵커 단백질에 대해서 ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ)을 사용해서 검색하여, ＰｇｓＡ앵커 단백질과 동일성이 55%인 ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＤＳＭ319주(株)의 ＣａｐＡ앵커 단백질을 추출했다. ＣａｐＡ앵커 단백질을 대장균의 최적화 코돈(codon)으로 코드한 염기배열을 설계하고, 이것을 ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ 유전자로 했다. ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ 유전자의 염기배열을 배열번호15로, 그것에 코드되는 아미노산 배열을 배열번호16으로, 각각 나타낸다.

다음에 ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ 유전자의 ＤＮＡ를 인공합성하고, 이것을 주형으로 하여 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, ＣａｐＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시켰다. 얻어진 ＰＣＲ산물을 ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ-ＤＮＡ 단편으로 했다.

《ＣａｐＡ배열의 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; 인공합성한 ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ 유전자의 ＤＮＡ

포워드 프라이머 ; 5’－ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇａａａｇａａａａｇａａａｃｔｇａａｃｔｔｃｃａａｇ-3’（배열번호17)

리버스 프라이머 ; 5’－ｃｇｇｇｔａａｃｃｃｇａｔｔｇａｇａｔｃｔａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃｔｔｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｇ-3’（배열번호18)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

반응조건 ; 94도로 15초, 58도로 20초 및 68도로 2분을 1사이클로 하여 21사이클.

다음에 하기의 조건으로 인버스 ＰＣＲ을 하여 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시키고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 개량형 β-프룩토프라노시다아제 ＤＮＡ 단편으로 했다.

《개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; 실시예3(1)[1-1]의 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터

포워드 프라이머 ; 5’－ａｇａｔｃｔｃａａｔｃｇｇｇｔｔａｃｃｃｇａｔａｃｃｇａｃ-3’（배열번호19)

리버스 프라이머 ; 5’－ｃａｔａｔｇｔａｔａｔｃｔｃｃｔｔｃｔｔａｔａｃｔｔａａｃ-3’（배열번호20)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-(도요보사)

반응조건 ; 94도로 15초 및 68도로 6분을 1사이클로 하여 35사이클.

계속하여 ｃａｐＡ_ｏｐｔｉ 유전자 ＤＮＡ 단편과 β-프룩토프라노시다아제 ＤＮＡ 단편과를, Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(다카라바이오사)를 사용해서 연결함으로써 ＰｇｓＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ 대신에 ＣａｐＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ가 삽입된 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 얻고, 이것을 Ｉｎｄｉｃａ-ＣａｐＡ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터로 했다.

<2-2-2>형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

본 실시예2(2)[2-2]<2-2-1>의 Ｉｎｄｉｃａ-ＣａｐＡ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, 및 컨트롤로서 실시예3(1)[1-1]의 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를, 본 실시예2(1)[1-2]에 기재되어 있는 방법에 의해 대장균에 도입하고, 얻어진 재조합 대장균을 배양해서 2ｍＬ의 배양물로부터 회수했다.

<2-2-3>β-프룩토프라노시다아제 활성의 확인

본 실시예2(2)[2-2]<2-2-2>의 재조합 대장균을 사용하여 하기의 조성의 케스토오스 생성반응액을 조제했다. 이것을 50도, 200ｒｐｍ으로 24시간 진탕함으로써 케스토오스 생성반응을 시켰다. 반응후의 케스토오스 생성반응액 100μＬ에 초순수를 900μＬ 가함으로써 10배로 희석한 후, 이온교환수지(앰버라이트(amberlite) ＭＢ-4)를 가하고 30초∼1분간 교반했다. 계속하여 14000×g로 5분간 원심분리를 하여 상청을 회수했다. 이것을 하기의 조건으로 ＨＰＬＣ에 제공하고, 본 실시예2(1)[1-3]에 기재되어 있는 방법에 의해 각 당의 비율 및 케스토오스의 양을 산출했다. 그 결과를 이하의 표1에 나타낸다. 표1중에서 ｎ．ｄ．는 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

《케스토오스 생성반응액의 조성》

60(w/w）％ 수크로오스 용액(0.04M 인산 버퍼(ｐＨ7)에 수크로오스를 60(w/w)％가 되도록 용해한 것) ; 500μＬ

재조합 대장균 ; 전량

《ＨＰＬＣ의 조건》

칼럼 ; ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ-80 4.6×250mm

이동상 ; 70% 아세트니트릴 수용액

유속 ; 1.0ｍＬ/분

주입량 ; 20μＬ

온도 ; 70도

검출 ; 시차굴절율검출기(ＲＩＤ ; 아질런트테크놀로지사(Agilent Technologies, Inc.))

표1에 나타나 있는 바와 같이 Ｉｎｄｉｃａ-ＣａｐＡ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에 있어서도, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액과 마찬가지로, 케스토오스가 생성되고 또한 니스토오스의 양은 검출한계 이하이었다. 이 결과로부터, ＰｇｓＡ앵커 단백질이나 ＣａｐＡ앵커 단백질 등을 사용해서 β-프룩토프라노시다아제를 대장균의 세포 표면에 제시시키면, 당해 대장균을 사용해서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예3>개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성과 평가

(1)개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성

Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)중, Ｎ말단으부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로, 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로, 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로, 각각 치환하는 아미노산 변이(이하, 각각의 아미노산 변이를 「Ｌ123Ｃ」, 「Ｈ395Ｒ」, 「Ｈ395Ｋ」 및 「Ｆ473Ｙ」라고 약기한다)를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 1중변이체, 2중변이체 및 3중변이체의 β-프룩토프라노시다아제를 작성하고, 이들을 개량형 β-프룩토프라노시다아제로 했다. 구체적인 순서를 이하에 나타낸다.

[1-1]재조합 벡터의 구축

우선 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 하여, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시켰다.

주형 ; 표2와 같음

포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 ; 표2와 같음

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-ＮＥＯ(도요보사)

반응조건 ; 95도로 1분, 95도로 10초, 68도로 20초 및 68도로 3.5분을 1사이클로 하여 15사이클.

계속하여 ＰＣＲ산물에 제한효소 ＤｐｎＩ를 가하여 37도로 1시간 소화한 후, 아가로스겔 전기영동에 제공해서 겔을 잘라내어 정제했다. 이것에 Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ(도요보사) 및 Ｔ4 ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎａｓｅ(도요보사)를 가하여 16도로 1시간 정치함으로써 라이게이션 하여 재조합 벡터를 구축했다.

얻어진 1중변이체의 재조합 벡터에 대해서, Ｌ123Ｃ, Ｈ395Ｒ 및 Ｆ473Ｙ를 각각 도입한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터를, 각각 Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터로 했다.

마찬가지로, 2중변이체의 재조합 벡터에 대해서는, Ｈ395Ｒ 및 Ｌ123Ｃ, Ｈ395Ｒ 및 Ｆ473Ｙ, Ｆ473Ｙ 및 Ｌ123Ｃ를 각각 도입한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터를, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터로 했다.

또한 3중변이체의 재조합 벡터에 대해서는, Ｌ123Ｃ, Ｈ395Ｒ 및 Ｆ473Ｙ를 도입한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터를, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터로 했다.

[1-2]형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

본 실시예3(1)[1-1]의 재조합 벡터를 실시예2(1)[1-2]에 기재되어 있는 방법에 준해서 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ109 컴피턴트 세포에 도입하여 재조합 대장균을 회수했다. 계속하여 재조합 대장균으로부터 재조합 벡터를 회수하고, 이것을 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ21(ＤＥ3) 컴피턴트 세포(코스모바이오사)에 도입하여 형질전환체로서 재조합 대장균을 얻었다. 이것을 37도로 20시간 플레이트 배양한 후, 재조합 대장균의 클론을 픽업해서 Ｍ9 ＳＥＥＤ배지 0.5ｍＬ에 식균하고, 30도, 800ｒｐｍ으로 20시간 진탕배양했다. 계속하여 배양물 중 5μＬ를 Ｍ9 Ｍａｉｎ배지 2ｍＬ에 계속해서 심어 25도, 800ｒｐｍ으로 23시간 진탕배양했다. 그 후에 배양물을 3500ｒｐｍ으로 10분간 원심분리 함으로써 재조합 대장균을 회수했다.

(2)개량형 β-프룩토프라노시다아제의 평가

[2-1]케스토오스 생성 활성의 확인

본 실시예3(1)[1-2]의 재조합 대장균, 및 컨트롤로서 실시예2(2)[2-1]<2-1-2>의 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균을 사용하여, 실시예2(2)[2-2]<2-2-3>에 기재되어 있는 방법에 의해 케스토오스 생성반응을 하고, 케스토오스 생성반응액을 ＨＰＬＣ에 제공했다. 그 결과를 표3에 나타낸다. 표3중에서 ｎ．ｄ．는 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

표3에 나타나 있는 바와 같이 케스토오스의 양은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는 39.7mg이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｋ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 44.5mg, 163.5mg, 105.3mg, 89.9mg, 175.5mg, 184.3mg, 120.5mg 및 218.8mg이었다.

또한 케스토오스의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는 10.25%이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｋ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 11.50%, 42.26%, 27.20%, 23.23%, 45.34%, 47.63%, 31.13% 및 56.54%이었다.

또한 니스토오스의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는 5.11%이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｋ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 3.99%, ｎ．ｄ．, 1.95%, 3.42%, ｎ．ｄ．, ｎ．ｄ．, 1.32% 및 0.07%이었다.

또한 기타의 당의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는 9.02%이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｋ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 3.52%, 2.41%, 3.28%, 8.37%, 0.32%, 2.95%, 1.68% 및 1.51%이었다.

즉, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｋ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ 재조합 벡터, Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ/Ｆ473Ｙ/Ｌ123Ｃ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액과 비교하여, 케스토오스의 양이 증가함과 아울러 니스토오스의 비율 및 기타의 당의 비율 모두가 저하하여 케스토오스의 비율이 증가했다. 이것으로부터 Ｌ123Ｃ, Ｈ395Ｒ, Ｈ395Ｋ 및 Ｆ473Ｙ중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 케스토오스 생성반응에서는, 야생형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 케스토오스 생성반응과 비교하여, 니스토오스 등의 부생성물의 비율이 현저하게 저하해서 케스토오스의 비율이 향상하고, 그 결과로서 케스토오스의 양이 증가한 것이 밝혀졌다.

이들 결과로부터, 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대하여, Ｎ말단으부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로, 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로, 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로, 각각 치환하는 아미노산 변이 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 대량으로 생성할 수 있는 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

[2-2]락토수크로오스 생성 활성의 확인

본 실시예3(1)[1-2]의 Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균, 및 컨트롤로서 실시예2(2)[2-1]<2-1-2>의 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균을 사용하여, 하기의 조성의 락토수크로오스 생성반응액을 조제했다.

단, 재조합 대장균은 0.5ｍＬ의 배양물로부터 회수한 전량을 사용했다. 또한 배양물로부터의 재조합 대장균의 회수는, 4도, 15000×g로 10분간 배양물을 원심분리에 제공함으로써 이루어졌다.

《락토수크로오스 생성반응액의 조성》

수크로오스/락토오스 용액(0.05M 인산 버퍼(ｐＨ6.0)에 수크로오스를 22(w/w）％, 락토오스를 18(w/w)%가 되도록 용해한 것) ; 350μＬ

재조합 대장균 ; 전량

이것을 55도, 220ｒｐｍ으로 6시간 진탕함으로써 락토수크로오스 생성반응을 하였다. 반응후의 락토수크로오스 생성반응액 50μＬ에 초순수 450μＬ 및 아세트니트릴 500μＬ를 가하여 희석한 후, 35도로 10분간 가열했다. 계속하여 25도, 15000×g로 10분간 원심분리를 하여 상청을 회수해 필터 여과했다. 이것을 하기의 조건에 의해 ＨＰＬＣ에 제공하고, 실시예2(1)[1-3]에 기재되어 있는 방법에 의해 각 당의 비율 및 락토수크로오스의 양을 산출했다. 그 결과를 표4에 나타낸다. 표4중에서 ｎ．ｄ．는 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

《ＨＰＬＣ의 조건》

칼럼 ; ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ-80 4.6×250mm

이동상 ; 70% 아세트니트릴 수용액

유속 ; 1.0ｍＬ/분

주입량 ; 20μＬ

온도 ; 35도

검출 ; 시차굴절율 검출기(ＲＩＤ ; 쇼와전공사(Showa Denko K.K.))

표4에 나타나 있는 바와 같이 락토수크로오스의 양은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액에서는 29.4mg이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액에서는, 각각 54.8mg 및 45.6mg이었다. 또한 락토수크로오스의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액에서는 17.8%이었던 것에 대해서, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액에서는, 각각 33.2% 및 27.6%이었다.

즉, Ｉｎｄｉｃａ-Ｌ123Ｃ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｆ473Ｙ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액에서는, ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 락토수크로오스 생성반응액과 비교하여, 락토수크로오스의 양 및 락토수크로오스의 비율이 현저하게 증가했다. 이것으로부터 Ｌ123Ｃ 및 Ｆ473Ｙ중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 락토수크로오스 생성반응에서는, 야생형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 락토수크로오스 생성반응과 비교하여 락토수크로오스의 비율 및 락토수크로오스의 양이 증가한 것이 밝혀졌다.

이들 결과로부터, 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대하여, Ｎ말단으부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로, 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로, 각각 치환하는 아미노산 변이 중 적어도 1개의 아미노산 변이를 도입함으로써, 락토수크로오스를 효율적으로 대량으로 생성할 수 있는 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예4>Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 상동의 β-프룩토프라노시다아제에 있어서의 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성과 평가

(1)얼라인먼트

Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 75%의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제로서 하기 (가)를, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 66%의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제로서 하기 (나)를, 각각 추출했다. 또 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열로부터 시그널 배열(배열번호2의 1∼28번째에 상당)을 제외한 아미노산 배열(배열번호2의 29∼534번째에 상당)과의 동일성을 괄호내에 나타낸다.

(가)75%의 동일성(시그널 배열을 제외했을 경우의 동일성 : 76%) : ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｈｙｍａｔｕｍＳＴＭ815(이하, 「Ｂｕｒｋ」라고 약기한다)의 β-프룩토프라노시다아제(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＣＣ75109.1)

(나)66%의 동일성(시그널 배열을 제외했을 경우의 동일성 : 65%) : ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓＳＲＴ4(이하, 「Ｇｌｕｃｏｎｏ」라고 약기한다)의 β-프룩토프라노시다아제(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＡＢ36606.1)

다음에 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대해서, (가) 및 (나)에 대하여 ＣｌｕｓｔａｌＷ법(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ/ｔｏｏｌｓ/ｃｌｕｓｔａｌｗ/)에 의하여 얼라인먼트를 하였다. 그 결과, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 있어서의 Ｎ말단으부터 395번째의 히스티딘(Ｈ)은, (가)에서는 Ｎ말단으부터 393번째의 히스티딘(Ｈ), (나)에서는 Ｎ말단으부터 419번째의 히스티딘(Ｈ)에, 각각 상당하는 것이 밝혀졌다.

(2)재조합 벡터의 구축

[2-1]야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터의 구축

하기의 조건에 의해 ＰＣＲ을 하여, Ｂｕｒｋ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시키고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 Ｂｕｒｋ 야생형 ＤＮＡ 단편으로 했다. Ｂｕｒｋ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 배열번호37로, 그것에 코드되는 Ｂｕｒｋ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 배열번호38로, 각각 나타낸다.

《Ｂｕｒｋ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; Ｂｕｒｋ의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머 ; 5’－ａａａｃｔａａａａｔｃｔａａａａｇａｔｃｔｃａｇａｃｔｇｃａａｃｇｃｃａｇｇｃｔｔｃｃｃｃｇ-3’（배열번호39)

리버스 프라이머 ; 5’－ｇｇｔｔｔｃｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇｔｔｔｃｃ-3’（배열번호40)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

또한 Ｇｌｕｃｏｎｏ의 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＡＢ36606.1)을 대장균의 최적화 코돈으로 코드하는 염기배열을 설계하고, 이것을 Ｇｌｕｃｏｎｏ_ｏｐｔｉ 유전자로 했다. Ｇｌｕｃｏｎｏ_ｏｐｔｉ 유전자의 염기배열을 배열번호41로, 그것에 코드되는 아미노산 배열을 배열번호42로, 각각 나타낸다.

다음에 Ｇｌｕｃｏｎｏ_ｏｐｔｉ 유전자의 ＤＮＡ를 인공합성하고, 이것을 주형으로 하여 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, Ｇｌｕｃｏｎｏ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭시키고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 Ｇｌｕｃｏｎｏ 야생형 ＤＮＡ 단편으로 했다.

《Ｇｌｕｃｏｎｏ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; 인공합성한 Ｇｌｕｃｏｎｏ_ｏｐｔｉ 유전자의 ＤＮＡ

포워드 프라이머 ; 5’－ａａａｃｔａａａａｔｃｔａａａａｇａｔｃｔｃａａｇｇｃａａｔｔｔｔｔｃｔｃｇｃｃａｇｇａａｇ-3’（배열번호43)

리버스 프라이머 ; 5’－ｇｇｔｔｔｃｔｔｔａｃｃａｇａｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｇａｔｔｃａｇａａａｔｔｇａｃｇｇａｃｃｔｇｔ-3’（배열번호44)

ＰＣＲ용 효소 ; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

다음에 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, ＰｇｓＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1 플라스미드의 ＤＮＡ를 증폭시키고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편으로 했다.

《ＰｇｓＡ앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1의 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형 ; 실시예2(2)[2-1]<2-1-1>의 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터

포워드 프라이머 ; 5’－ｔｃｔｇｇｔａａａｇａａａｃｃｇｃｔｇｃｔｇｃｇａａａｔｔｔ-3’（배열번호45)

리버스 프라이머 ; 5’－ｔｔｔａｇａｔｔｔｔａｇｔｔｔｇｔｃａｃｔａｔｇａｔｃａａｔ-3’（배열번호46)

Ｂｕｒｋ 야생형 ＤＮＡ 단편 및 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편, 및 Ｇｌｕｃｏｎｏ 야생형 ＤＮＡ 단편 및 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편을, Ｉｎ-ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(다카라바이오사)를 사용해서 각각 연결함으로써 재조합 벡터를 얻고, 전자를 ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터로 하고 후자를 ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터로 했다.

[2-2]개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터의 구축

실시예3(1)[1-1]의 방법에 의하여, Ｂｕｒｋ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 있어서의 Ｎ말단으부터 393번째의 히스티딘 잔기, 및 Ｇｌｕｃｏｎｏ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으부터 419번째의 히스티딘(Ｈ)을, 각각 아르기닌(Ｒ)으로 치환하는 아미노산 변이(이하, 각각의 아미노산 변이를 「Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ」 및 「Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ」이라고 약기한다)를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제(1중변이체)를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터를 조제했다. 단, ＰＣＲ의 주형 및 프라이머는 표5에 기재되어 있는 것을 사용했다.

얻어진 1중변이체의 재조합 벡터에 대해서, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 및 Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ을 각각 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 재조합 벡터를, 각각 Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터 및 Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터로 했다.

(3)β-프룩토프라노시다아제 활성의 확인

본 실시예4(2)[2-1]의 ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터 및 ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터, 및 본 실시예4(2)[2-2]의 Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터 및 Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터를, 실시예3(1)[1-2]의 방법에 의해 대장균에 도입하고, 얻어진 재조합 대장균을 배양해서 2ｍＬ의 배양물로부터 회수했다. 계속하여 이들의 재조합 대장균을 사용하여 실시예2(2)[2-2]<2-2-3>의 방법에 의해 케스토오스 생성량 및 니스토오스 생성량을 측정했다. 그 결과를 표6에 나타낸다. 또 비교를 위하여, 표3에 나타내는 결과 중 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에 있어서의 결과를 표6 아래 2단에 나타낸다. 표6중에서 ｎ．ｄ．는 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

표6에 나타나 있는 바와 같이 케스토오스의 양은, ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터, ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터 및 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 57.6mg, 56.8mg 및 39.7mg이었던 것에 대해서, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터, Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 106.4mg, 60.3mg 및 163.5mg로, 모두 증가했다.

또한 케스토오스의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터, ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터 및 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 14.87%, 14.67% 및 10.25%이었던 것에 대해서, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터, Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 27.49%, 15.59% 및 42.26%로, 모두 증가했다.

또한 니스토오스의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터, ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터 및 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 4.53%, 5.03% 및 5.11%이었던 것에 대해서, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터, Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 ｎ．ｄ．, 0.23% 및 ｎ．ｄ．로, 모두 저하했다.

또한 기타의 당의 비율은, ｐＣＤＦ-Ｂｕｒｋ 재조합 벡터, ｐＣＤＦ-Ｇｌｕｃｏｎｏ 재조합 벡터 및 ｐＣＤＦ-Ｉｎｄｉｃａ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 3.26%, 4.46% 및 9.02%이었던 것에 대해서, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ 재조합 벡터, Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 재조합 벡터 및 Ｉｎｄｉｃａ-Ｈ395Ｒ 재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 케스토오스 생성반응액에서는, 각각 0.82%, 0.99% 및 2.41%로, 모두 저하했다.

즉, Ｂｕｒｋ-Ｈ393Ｒ, Ｇｌｕｃｏｎｏ-Ｈ419Ｒ 또는 Ｈ395Ｒ을 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 케스토오스 생성반응에서는, 이들의 아미노산 변이를 도입하지 않는 야생형 β-프룩토프라노시다아제에 의한 케스토오스 생성반응과 비교하여, 케스토오스의 양이 증가함과 아울러 니스토오스의 비율 및 기타의 당의 비율 모두가 저하하여 케스토오스의 비율이 증가한 것이 밝혀졌다.

이들 결과로부터, Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 Ｂ．Ｉｎｄｉｃａ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 있어서의 Ｎ말단으부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을, 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스 등의 부생성물이 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 대량으로 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

<110> B Food Science Co., Ltd. MicroBiopharm Japan Co., Ltd. <120> Improved beta-fructofuranosidase <130> PCT0615 <150> JP2013-273402 <151> 2013-12-27 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Beijerinckia indica <400> 1 atggcaagtc gatcgtttaa tgtttgtata cgtagcctca tcgcgggctc gcttctgact 60 gccacagcac tgtccgctca ggctcaatcg ggttacccga taccgactcc gcattcggga 120 caagcctatg atccatttgc agattttacc gccaaatgga cgcgcgccaa tgcccgtcaa 180 atcaaggcgc aatcacatgt cccggtgtca cccgatcaga attcgctgcc gctcaatctg 240 acgatgcccg atatccctgc cgatttcccg caaaccaacc cggacgtgtg ggtgtgggat 300 acgtggcctc tcgccgatgt gcatggcaat cagctgagct tccaggggtg ggaggtcatt 360 ttctcgctga ccgctgatcc gcatgccggt tatgttttcg atgatcgcca cgttcacgca 420 cgtatcggct tcttttatcg caaggccgga attcccgcga accagcgccc gattgatggc 480 ggctggatct atggcgggca tttgttcccg gatggtagca gcgtcaaagt cttcggtaac 540 gtccccatga cgcaaaacgc ggaatggtcc ggcggcgccc gcttcgtggg cggcccttat 600 gctgatggcc cgcaacacgc ctacctgaag aacaacaacg tcagcctcta ttacacggcg 660 acatcgttca accgtaatgc tcagggcggt aacatcacac cgccgatcgc catcatctcg 720 cgcgcggatg gacaaattca agcagatgat aagcatgtgt ggttcacggg attcgatcaa 780 catctcccgc tgctcgcacc cgacggcaaa tattatcaga ccggtcagca gaacgagttc 840 ttctccttcc gcgatcccta tgtcttcctt gaccccgctc atccgggcaa gaccttcatg 900 gtcttcgaag gcaataccgc cgtgcagcgc ggctcccgct cctgcaccga ggcagatctc 960 ggatattctc ccaatgaccc gaacaaagaa gacctgaatg cggtcatgga ctccggagcc 1020 atttaccaaa tggccaatgt cggtcttgcc gtggcgacga acgatgaact gacgcagtgg 1080 aagttcctgc cgccgatcct gtccggtaat tgcgtgaacg atcagaccga acgtcctcag 1140 atctatctga aggatggaaa atattacctg ttcacgatca gccaccgcac gacctatgcg 1200 gcgggcgtcg atgggccgga cggcgtctat ggcttcgtcg gtgatggcat tcgcagcgac 1260 ttcattcccc tgaatggcct cagcggtctc acgctcggca acccgaccga tctctatcag 1320 ccggccggcg ctccttacgc cttgaatcca aaccaaaatc ctcggacgtt ccagtcctat 1380 tcgcattatg tcatgccggg cggcctcgtt gaatcgttta tcgatgccat cggccctcgt 1440 cgcggtggcg cgctggctcc gacggtgaag atcaacatca acggaacttc taccatcctc 1500 gacaggacct atggcaatgc cggattgggt ggctatggcg acatcccggc caatcttccc 1560 gcgcttggcc aagttaatgg ccatggtgtc acgaacggcc agtaa 1605 <210> 2 <211> 534 <212> PRT <213> Beijerinckia indica <400> 2 Met Ala Ser Arg Ser Phe Asn Val Cys Ile Arg Ser Leu Ile Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Leu Thr Ala Thr Ala Leu Ser Ala Gln Ala Gln Ser Gly Tyr 20 25 30 Pro Ile Pro Thr Pro His Ser Gly Gln Ala Tyr Asp Pro Phe Ala Asp 35 40 45 Phe Thr Ala Lys Trp Thr Arg Ala Asn Ala Arg Gln Ile Lys Ala Gln 50 55 60 Ser His Val Pro Val Ser Pro Asp Gln Asn Ser Leu Pro Leu Asn Leu 65 70 75 80 Thr Met Pro Asp Ile Pro Ala Asp Phe Pro Gln Thr Asn Pro Asp Val 85 90 95 Trp Val Trp Asp Thr Trp Pro Leu Ala Asp Val His Gly Asn Gln Leu 100 105 110 Ser Phe Gln Gly Trp Glu Val Ile Phe Ser Leu Thr Ala Asp Pro His 115 120 125 Ala Gly Tyr Val Phe Asp Asp Arg His Val His Ala Arg Ile Gly Phe 130 135 140 Phe Tyr Arg Lys Ala Gly Ile Pro Ala Asn Gln Arg Pro Ile Asp Gly 145 150 155 160 Gly Trp Ile Tyr Gly Gly His Leu Phe Pro Asp Gly Ser Ser Val Lys 165 170 175 Val Phe Gly Asn Val Pro Met Thr Gln Asn Ala Glu Trp Ser Gly Gly 180 185 190 Ala Arg Phe Val Gly Gly Pro Tyr Ala Asp Gly Pro Gln His Ala Tyr 195 200 205 Leu Lys Asn Asn Asn Val Ser Leu Tyr Tyr Thr Ala Thr Ser Phe Asn 210 215 220 Arg Asn Ala Gln Gly Gly Asn Ile Thr Pro Pro Ile Ala Ile Ile Ser 225 230 235 240 Arg Ala Asp Gly Gln Ile Gln Ala Asp Asp Lys His Val Trp Phe Thr 245 250 255 Gly Phe Asp Gln His Leu Pro Leu Leu Ala Pro Asp Gly Lys Tyr Tyr 260 265 270 Gln Thr Gly Gln Gln Asn Glu Phe Phe Ser Phe Arg Asp Pro Tyr Val 275 280 285 Phe Leu Asp Pro Ala His Pro Gly Lys Thr Phe Met Val Phe Glu Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Val Gln Arg Gly Ser Arg Ser Cys Thr Glu Ala Asp Leu 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Pro Asn Asp Pro Asn Lys Glu Asp Leu Asn Ala Val Met 325 330 335 Asp Ser Gly Ala Ile Tyr Gln Met Ala Asn Val Gly Leu Ala Val Ala 340 345 350 Thr Asn Asp Glu Leu Thr Gln Trp Lys Phe Leu Pro Pro Ile Leu Ser 355 360 365 Gly Asn Cys Val Asn Asp Gln Thr Glu Arg Pro Gln Ile Tyr Leu Lys 370 375 380 Asp Gly Lys 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Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ccgcgcggca gccatggtta cccgataccg actccgcatt cgggacaagc ctatgatcc 59 <210> 6 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gtggtggtgc tcgagttact ggccgttcgt gacaccatgg ccattacctt ggccaagcgc 60 gggaagat 68 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 ctcgagcacc accaccacca ccactga 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 atggctgccg cgcggcacca ggccgct 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 aaacatatga aaaaagaact gagctttcat g 31 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 aaaagatctt ttagatttta gtttgtcact atg 33 <210> 11 <211> 1143 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 11 atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60 aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120 atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt attctgacga cgtactctca 180 gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240 ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300 ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360 catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaattt cacggttctc 420 aacagcgcca acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480 gaatttgcga agcaaaatct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540 aagaaaattt cgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg cgacgcttgg ctttaccgat 600 gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660 gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg cggacattgt tgttgtgcag 720 tcacactggg gacaagagta tgacaatgat ccaaatgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780 gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc acccgcacgt cttagaaccg 840 attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgaccaa 900 ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960 ggacgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcgcc tgtgaaaaaa 1020 gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080 aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140 taa 1143 <210> 12 <211> 380 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 12 Met Lys Lys Glu Leu Ser Phe His Glu Lys Leu Leu Lys Leu Thr Lys 1 5 10 15 Gln Gln Lys Lys Lys Thr Asn Lys His Val Phe Ile Ala Ile Pro Ile 20 25 30 Val Phe Val Leu Met Phe Ala Phe Met Trp Ala Gly Lys Ala Glu Thr 35 40 45 Pro Lys Val Lys Thr Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ser Ala Ser Phe Val 50 55 60 Gly Asp Ile Met Met Gly Arg Tyr Val Glu Lys Val Thr Glu Gln Lys 65 70 75 80 Gly Ala Asp Ser Ile Phe Gln Tyr Val Glu Pro Ile Phe Arg Ala Ser 85 90 95 Asp Tyr Val Ala Gly Asn Phe Glu Asn Pro Val Thr Tyr Gln Lys Asn 100 105 110 Tyr Lys Gln Ala Asp Lys Glu Ile His Leu Gln Thr Asn Lys Glu Ser 115 120 125 Val Lys Val Leu Lys Asp Met Asn Phe Thr Val Leu Asn Ser Ala Asn 130 135 140 Asn His Ala Met Asp Tyr Gly Val Gln Gly Met Lys Asp Thr Leu Gly 145 150 155 160 Glu Phe Ala Lys Gln Asn Leu Asp Ile Val Gly Ala Gly Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Asp Ala Lys Lys Lys Ile Ser Tyr Gln Lys Val Asn Gly Val Thr 180 185 190 Ile Ala Thr Leu Gly Phe Thr Asp Val Ser Gly Lys Gly Phe Ala Ala 195 200 205 Lys Lys Asn Thr Pro Gly Val Leu Pro Ala Asp Pro Glu Ile Phe Ile 210 215 220 Pro Met Ile Ser Glu Ala Lys Lys His Ala Asp Ile Val Val Val Gln 225 230 235 240 Ser His Trp Gly Gln Glu Tyr Asp Asn Asp Pro Asn Asp Arg Gln Arg 245 250 255 Gln Leu Ala Arg Ala Met Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ile Ile Val Gly 260 265 270 His His Pro His Val Leu Glu Pro Ile Glu Val Tyr Asn Gly Thr Val 275 280 285 Ile Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Phe Asp Gln Gly Trp Thr Arg 290 295 300 Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Gln Tyr His Leu Lys Lys Asn Gly Thr 305 310 315 320 Gly Arg Phe Glu Val Thr Pro Ile Asp Ile His Glu Ala Thr Pro Ala 325 330 335 Pro Val Lys Lys Asp Ser Leu Lys Gln Lys Thr Ile Ile Arg Glu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Ser Asn Phe Ala Trp Lys Val Glu Asp Gly Lys 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ttccgctaaa 480 ggcctggaag acacgattag cacctttgaa gcaaataagc tggatttcgt gggcgctggt 540 cgtaactctg aagaagcgaa acatatcagt tacaaggatg ccgacggcat tcgcatcgca 600 acggttggtt ttaccgatgt ccactcagac ggcatgtcgg ccggtaaaaa caatccgggt 660 attctgaagg cagatccgga cctgattttc tcgaccatcc agcaagcaaa agctaatgcg 720 gatctggtgg ttgtcaacgc ccattggggc gaagaatatg acgcacagcc gagtccgcgc 780 caagaaggtc tggccaaagc aatggtcgat gctggcgcgg acattatcat tggtcatcac 840 ccgcacgtgc tgcagagcta tgatgtgtac aaaggtagcg ttatctttta ttctctgggc 900 aacttcatct tcgatcaggg ttggagctct acgaagaata ccgccatggt gcaataccat 960 ctgaacaaac agggccaagc taagattgat gttatcccga tggtcattaa agcgggtacc 1020 ccgacgccga ccgataatcc gtggcgtatg aaacgcatct ataacgacct gaataagttt 1080 agttccaacc cggaactgct ggaaaaagaa cgtaacaagt tcgaactgaa tctggatcat 1140 tcccgtatca ttaaacacgc ggaagaacgc aaaaagaacg aagcccaggc aaattaa 1197 <210> 16 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> capA_opti gene amino acid sequence <400> 16 Met Lys Glu Lys Lys Leu Asn Phe 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primer <400> 33 tgtaccgctg atccgcatgc cggttatgt 29 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 34 cgagaaaatg acctcccacc cctggaagct 30 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 35 tgtaccgctg atccgcatgc cggttatgt 29 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 36 cgagaaaatg acctcccacc cctggaagct 30 <210> 37 <211> 1596 <212> DNA <213> Burkholderia phymatum STM815 <400> 37 atgaacgttg gccaccaccc gcgggtcccc cggatcaccc cccggctgcg cgcgcacttc 60 ctgtcggcag cggtgctgtc ggctgttgcc ctaccggcgc tggctcagac tgcaacgcca 120 ggcttccccg cgccgacgcc gcactcgcag caggcatacg accccgagag cagtttcacg 180 atgcgctgga cccgtgccga catccgtcag atcaaggcgc agtcgcatgc cgcgacggcg 240 gcggacaaga actcgctgcc gctttcgctg accatgccgg acatcccgca ggatttcccg 300 ctgatcaatc cgaacgtctg ggtgtgggac acgtggccgc tggccgacat gcgggcgaac 360 cagctggcgt acaagggctg ggaggtgatc ttttcgctga cggccgatcc gcatgccggc 420 tatacgttcg acgaccgtca cgttcacgcg cgcatcggct tcttctaccg ccgcgcgggc 480 attcccgcat cgcagcgacc cgcgaacggc ggctggacct ggggcggcca tctgttcccg 540 gacggtgcga gcgtcaaggt attcggcacg tcgccgatga ccgacaacgc cgaatggtcg 600 ggctcggcgc gtctcacgca cggcgacaac gtcagcctct actacaccgc gacgtcgttc 660 aaccgttcgg cccccggcgg cgccgacatt acgccgccgc aggcgatcat cacgcgcgcc 720 gacggtcaca tccacgccga cgacagtcat gtgtggttct caggcttcga cgatcaccag 780 gcattgctca agccggacgg cacctactac cagaccggcg agcagaacac ctacttctca 840 taccgggatc cgttcgtgtt catcgatccc gcgcatccag gcaagaccta catggtgttc 900 gaaggcaaca cgggcggtcc gcgcggcgcg cgcacctgta cggaagccga cctcggctat 960 gcgccgaacg atccgcaacg ggaagacctg aacgcggtga tgaactcggg cgcggcgtat 1020 cagaaggcca atgttggtct cgcggtcgcg acgaatccgc aactgaccga atggaagttc 1080 ctgccaccga tcctgtcggc gaactgcgtc gatgatcaga ccgagcgccc gcagatttac 1140 ctgaaggacg gcaagtacta cctgttcacg atcagccacc gcacaacgat ggcagcaggc 1200 gttgacggac cggacggtgt ctacggcttc gtcggcaacg gcatccgcag cgacttcttg 1260 ccgctgaacg gcggcagcgg cctcgtactc ggcaacccga ccgacttttc cgccccggcg 1320 ggtgcgccgt acgcgcagga cccgaaccag aacccgcgcg agttccagtc gtactcgcac 1380 tacgtgatgc cgggtggtct cgtcgagtcg tttatcgatg caatcggctc gcggcgcggc 1440 ggcacgcttg cgccgaccgt caagatcaac atcaacggtg acacgacggt cgtggaccgg 1500 acgtatggca agggcggtct cggcggctac ggcgacattc ccgcaaacca gtcggcgccc 1560 ggcaatggaa acgggcaggg cggcaacagc cagtaa 1596 <210> 38 <211> 531 <212> PRT <213> Burkholderia phymatum STM815 <400> 38 Met Asn Val Gly His His Pro Arg Val Pro Arg Ile Thr Pro Arg Leu 1 5 10 15 Arg Ala His Phe Leu Ser Ala Ala Val Leu Ser Ala Val Ala Leu Pro 20 25 30 Ala Leu Ala Gln Thr Ala Thr Pro Gly Phe Pro Ala Pro Thr Pro His 35 40 45 Ser Gln Gln Ala Tyr Asp Pro Glu Ser Ser Phe Thr Met Arg Trp Thr 50 55 60 Arg Ala Asp Ile Arg Gln Ile Lys Ala Gln Ser His Ala Ala Thr Ala 65 70 75 80 Ala Asp Lys Asn Ser Leu Pro Leu Ser Leu Thr Met Pro Asp Ile Pro 85 90 95 Gln Asp Phe Pro Leu Ile Asn Pro Asn Val Trp Val Trp Asp Thr Trp 100 105 110 Pro Leu Ala Asp Met Arg Ala Asn Gln Leu Ala Tyr Lys Gly Trp Glu 115 120 125 Val Ile Phe Ser Leu Thr Ala Asp Pro His Ala Gly Tyr Thr Phe Asp 130 135 140 Asp Arg His Val His Ala Arg Ile Gly Phe Phe Tyr Arg Arg Ala Gly 145 150 155 160 Ile Pro Ala Ser Gln Arg Pro Ala Asn Gly Gly Trp Thr Trp Gly Gly 165 170 175 His Leu Phe Pro Asp Gly Ala Ser Val Lys Val Phe Gly Thr Ser Pro 180 185 190 Met Thr Asp Asn Ala Glu Trp Ser Gly Ser Ala Arg Leu Thr His Gly 195 200 205 Asp Asn Val Ser Leu Tyr Tyr Thr Ala Thr Ser Phe Asn Arg Ser Ala 210 215 220 Pro Gly Gly Ala Asp Ile Thr Pro Pro Gln Ala Ile Ile Thr Arg Ala 225 230 235 240 Asp Gly His Ile His Ala Asp Asp Ser His Val Trp Phe Ser Gly Phe 245 250 255 Asp Asp His Gln Ala Leu Leu Lys Pro Asp Gly Thr Tyr Tyr Gln Thr 260 265 270 Gly Glu Gln Asn Thr Tyr Phe Ser Tyr Arg Asp Pro Phe Val Phe Ile 275 280 285 Asp Pro Ala His Pro Gly Lys Thr Tyr Met Val Phe Glu Gly Asn Thr 290 295 300 Gly Gly Pro Arg Gly Ala Arg Thr Cys Thr Glu Ala Asp Leu Gly Tyr 305 310 315 320 Ala Pro Asn Asp Pro Gln Arg Glu Asp Leu Asn Ala Val Met Asn Ser 325 330 335 Gly Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Asn Val Gly Leu Ala Val Ala Thr Asn 340 345 350 Pro Gln Leu Thr Glu Trp Lys Phe Leu Pro Pro Ile Leu Ser Ala Asn 355 360 365 Cys Val Asp Asp Gln Thr Glu Arg Pro Gln Ile Tyr Leu Lys Asp Gly 370 375 380 Lys Tyr Tyr Leu Phe Thr Ile Ser His Arg Thr Thr Met Ala Ala Gly 385 390 395 400 Val Asp Gly Pro Asp Gly Val Tyr Gly Phe Val Gly Asn Gly Ile Arg 405 410 415 Ser Asp Phe Leu Pro Leu Asn Gly Gly Ser Gly Leu Val Leu Gly Asn 420 425 430 Pro Thr Asp Phe Ser Ala Pro Ala Gly Ala Pro Tyr Ala Gln Asp Pro 435 440 445 Asn Gln Asn Pro Arg Glu Phe Gln Ser Tyr Ser His Tyr Val Met Pro 450 455 460 Gly Gly Leu Val Glu Ser Phe Ile Asp Ala Ile Gly Ser Arg Arg Gly 465 470 475 480 Gly Thr Leu Ala Pro Thr Val Lys Ile Asn Ile Asn Gly Asp Thr Thr 485 490 495 Val Val Asp Arg Thr Tyr Gly Lys Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Asp 500 505 510 Ile Pro Ala Asn Gln Ser Ala Pro Gly Asn Gly Asn Gly Gln Gly Gly 515 520 525 Asn Ser Gln 530 <210> 39 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 39 aaactaaaat ctaaaagatc tcagactgca acgccaggct tccccg 46 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 40 ggtttcttta ccagactcga gttactggct gttgccgccc tgcccgtttc c 51 <210> 41 <211> 1755 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glucono_opti gene <400> 41 atggctcacg tccgtcgtaa agtcgcaacg ctgaacatgg ctctggcggg tagtctgctg 60 atggtcctgg gtgcccaatc tgctctggcc caaggcaatt tttctcgcca ggaagcggca 120 cgtatggcac atcgtccggg tgttatgccg cgtggcggtc cgctgtttcc gggtcgcagc 180 ctggccggtg tgccgggttt cccgctgccg tctattcata cccagcaagc atatgatccg 240 cagagtgact ttaccgctcg ttggacccgt gccgatgcac tgcagatcaa agcgcactca 300 gacgccaccg ttgcagctgg ccaaaactcg ctgccggcgc agctgacgat gccgaatatt 360 ccggccgatt tcccggtcat caacccggat gtttgggttt gggacacctg gacgctgatt 420 gataagcacg cggaccagtt tagctataat ggttgggaag tgatcttctg cctgaccgca 480 gatccgaacg ctggctatgg ttttgatgac cgtcatgttc acgcccgcat tggctttttc 540 taccgtcgcg ccggtattcc ggcaagccgt cgcccggtca atggcggttg gacgtatggc 600 ggtcacctgt ttccggatgg cgcaagcgcg caggtgtatg caggtcaaac ctacacgaat 660 caggctgaat ggtccggcag ctctcgtctg atgcagattc acggtaacac cgtctcagtg 720 ttttacacgg atgtggcgtt caaccgcgac gcgaatgcca acaatattac cccgccgcaa 780 gcaattatca cccagacgct gggccgtatc catgctgatt ttaaccacgt ttggtttacc 840 ggtttcacgg cacatacccc gctgctgcag ccggatggcg tcctgtatca gaacggtgcg 900 caaaatgaat ttttcaactt tcgtgatccg tttaccttcg aagacccgaa acacccgggc 960 gtgaattaca tggttttcga gggtaacacc gccggccagc gtggtgtggc aaattgcacg 1020 gaagctgatc tgggctttcg cccgaacgac ccgaatgcag aaaccctgca agaagttctg 1080 gatagcggcg cgtattacca gaaagccaac attggtctgg caatcgctac ggactcaacc 1140 ctgtcgaaat ggaagtttct gagcccgctg atttctgcga actgcgtgaa tgatcaaacc 1200 gaacgtccgc aggtttacct gcataacggc aagtactaca tcttcacgat cagccatcgc 1260 accacctttg cggcgggtgt ggatggtccg gatggcgtct atggttttgt gggcgatggt 1320 atccgcagtg acttccagcc gatgaactac ggctccggtc tgaccatggg caatccgacg 1380 gatctgaaca ccgcagctgg tacggatttt gacccgtctc cggaccaaaa tccgcgtgcc 1440 ttccagagtt attcccatta cgttatgccg ggcggtctgg tcgaaagttt tattgatacc 1500 gttgaaaatc gtcgcggcgg taccctggcc ccgacggttc gtgtccgcat cgcccagaat 1560 gcgtccgccg tggatctgcg ttatggcaac ggcggtctgg gcggttacgg tgatattccg 1620 gcaaatcgcg ctgatgtgaa cattgcgggt tttatccaag acctgtttgg ccagccgacc 1680 agtggtctgg ccgctcaagc aagcacgaat aacgctcaag ttctggcaca ggtccgtcaa 1740 tttctgaatc aataa 1755 <210> 42 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glucono_opti gene amino acid sequence <400> 42 Met Ala His Val Arg Arg Lys Val Ala Thr Leu Asn Met Ala Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Met Val Leu Gly Ala Gln Ser Ala Leu Ala Gln Gly 20 25 30 Asn Phe Ser Arg Gln Glu Ala Ala Arg Met Ala His Arg Pro Gly Val 35 40 45 Met Pro Arg Gly Gly Pro Leu Phe Pro Gly Arg Ser Leu Ala Gly Val 50 55 60 Pro Gly Phe Pro Leu Pro Ser Ile His Thr Gln Gln Ala Tyr Asp Pro 65 70 75 80 Gln Ser Asp Phe Thr Ala Arg Trp Thr Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ile 85 90 95 Lys Ala His Ser Asp Ala Thr Val Ala Ala Gly Gln Asn Ser Leu Pro 100 105 110 Ala Gln Leu Thr Met Pro Asn Ile Pro Ala Asp Phe Pro Val Ile Asn 115 120 125 Pro Asp Val Trp Val Trp Asp Thr Trp Thr Leu Ile Asp Lys His Ala 130 135 140 Asp Gln Phe Ser Tyr Asn Gly Trp Glu Val Ile Phe Cys Leu Thr Ala 145 150 155 160 Asp Pro Asn Ala Gly Tyr Gly Phe Asp Asp Arg His Val His Ala Arg 165 170 175 Ile Gly Phe Phe Tyr Arg Arg Ala Gly Ile Pro Ala Ser Arg Arg Pro 180 185 190 Val Asn Gly Gly Trp Thr Tyr Gly Gly His Leu Phe Pro Asp Gly Ala 195 200 205 Ser Ala Gln Val Tyr Ala Gly Gln Thr Tyr Thr Asn Gln Ala Glu Trp 210 215 220 Ser Gly Ser Ser Arg Leu Met Gln Ile His Gly Asn Thr Val Ser Val 225 230 235 240 Phe Tyr Thr Asp Val Ala Phe Asn Arg Asp Ala Asn Ala Asn Asn Ile 245 250 255 Thr Pro Pro Gln Ala Ile Ile Thr Gln Thr Leu Gly Arg Ile His Ala 260 265 270 Asp Phe Asn His Val Trp Phe Thr Gly Phe Thr Ala His Thr Pro Leu 275 280 285 Leu Gln Pro Asp Gly Val Leu Tyr Gln Asn Gly Ala Gln Asn Glu Phe 290 295 300 Phe Asn Phe Arg Asp Pro Phe Thr Phe Glu Asp Pro Lys His Pro Gly 305 310 315 320 Val Asn Tyr Met Val Phe Glu Gly Asn Thr Ala Gly Gln Arg Gly Val 325 330 335 Ala Asn Cys Thr Glu Ala Asp Leu Gly Phe Arg Pro Asn Asp Pro Asn 340 345 350 Ala Glu Thr Leu Gln Glu Val Leu Asp Ser Gly Ala Tyr Tyr Gln Lys 355 360 365 Ala Asn Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Asp Ser Thr Leu Ser Lys Trp 370 375 380 Lys Phe Leu Ser Pro Leu Ile Ser Ala Asn Cys Val Asn Asp Gln Thr 385 390 395 400 Glu Arg Pro Gln Val Tyr Leu His Asn Gly Lys Tyr Tyr Ile Phe Thr 405 410 415 Ile Ser His Arg Thr Thr Phe Ala Ala Gly Val Asp Gly Pro Asp Gly 420 425 430 Val Tyr Gly Phe Val Gly Asp Gly Ile Arg Ser Asp Phe Gln Pro Met 435 440 445 Asn Tyr Gly Ser Gly Leu Thr Met Gly Asn Pro Thr Asp Leu Asn Thr 450 455 460 Ala Ala Gly Thr Asp Phe Asp Pro Ser Pro Asp Gln Asn Pro Arg Ala 465 470 475 480 Phe Gln Ser Tyr Ser His Tyr Val Met Pro Gly Gly Leu Val Glu Ser 485 490 495 Phe Ile Asp Thr Val Glu Asn Arg Arg Gly Gly Thr Leu Ala Pro Thr 500 505 510 Val Arg Val Arg Ile Ala Gln Asn Ala Ser Ala Val Asp Leu Arg Tyr 515 520 525 Gly Asn Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Asp Ile Pro Ala Asn Arg Ala 530 535 540 Asp Val Asn Ile Ala Gly Phe Ile Gln Asp Leu Phe Gly Gln Pro Thr 545 550 555 560 Ser Gly Leu Ala Ala Gln Ala Ser Thr Asn Asn Ala Gln Val Leu Ala 565 570 575 Gln Val Arg Gln Phe Leu Asn Gln 580 <210> 43 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 43 aaactaaaat ctaaaagatc tcaaggcaat ttttctcgcc aggaag 46 <210> 44 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 44 ggtttcttta ccagactcga gttattgatt cagaaattga cggacctgt 49 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 45 tctggtaaag aaaccgctgc tgcgaaattt 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 46 tttagatttt agtttgtcac tatgatcaat 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 47 cgtcgcacaa cgatggcagc aggcgttgac 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 48 gctgatcgtg aacaggtagt acttgccgtc 30 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 49 cgtcgcacca cctttgcggc gggtgtgga 29 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 50 gctgatcgtg aagatgtagt acttgccgtt 30

Claims

배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열과 60% 이상의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 얼라인먼트에서 상기 배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 Ｎ말단으로부터 395번째의 위치에 상당하는 히스티딘(Ｈ)을, 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제.
하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제;
(a)배열번호2로 나타내는 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ)∼ｉｉｉ)으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열；
ｉ)Ｎ말단으로부터 123번째의 류신(Ｌ)을 시스테인(Ｃ)으로 치환하는 아미노산 변이,
ｉｉ)Ｎ말단으로부터 395번째의 히스티딘(Ｈ)을 아르기닌(Ｒ) 또는 리신(Ｋ)으로 치환하는 아미노산 변이,
ｉｉｉ)Ｎ말단으로부터 473번째의 페닐알라닌(Ｆ)을 티로신(Ｙ)으로 치환하는 아미노산 변이,
(b)아미노산 배열(a)에 있어서, 상기 ｉ)~ｉｉｉ)의 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1개 내지 30개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.
제1항 또는 제2항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ.
제4항의 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 ＤＮＡ 또는 제4항의 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체.
제6항에 있어서,
숙주가 대장균인 형질전환체.
제6항의 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비하는 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법.
하기 A~C 중의 어느 하나와 수크로오스를 접촉시키는 공정을 구비하는 케스토오스의 제조방법.
A. 제1항 또는 제2항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제
B. 제6항의 형질전환체, 혹은 제6항에 있어서의 숙주가 대장균인 형질전환체
C. 상기 B의 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물