CN105899661A - 改良型β-呋喃果糖苷酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效地生成蔗果三糖的改良型β‑呋喃果糖苷酶。一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其含有对β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β‑呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：与序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
Description
技术领域
本发明涉及改良型β-呋喃果糖苷酶，尤其涉及能够有效抑制蔗果四糖等副产物的生成、高效大量地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其的氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及使用了它们的蔗果三糖制造方法。
背景技术
β-呋喃果糖苷酶是具有识别蔗糖中的果糖、并将蔗糖水解为果糖和葡萄糖的活性(蔗糖水解活性)的酶。β-呋喃果糖苷酶中还存在如下类型：具有将因水解而生成的果糖转移给蔗糖的活性(果糖转移活性)，从而生成由1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖、即蔗果三糖。
已知的是，蔗果三糖中的1-蔗果三糖是与蔗糖(砂糖)相似的甜味物质，产生砂糖的三分之一程度的甜度但能量仅为砂糖大约一半、即使摄取也不会使血糖值上升、发挥过敏抑制功能(专利文献1)等，因此是有用的寡糖。作为生成1-蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶，例如公开了在来自黑曲霉(Aspergillus niger)的β-呋喃果糖苷酶及其氨基酸序列中导入了氨基酸变异的变异体β-呋喃果糖苷酶(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第4162147号公报
专利文献2:日本专利第3628336号公报
发明内容
发明要解决的课题
在使用β-呋喃果糖苷酶制造蔗果三糖时，通常作为副产物会生成作为四糖的蔗果四糖。蔗果四糖在色谱中难以与蔗果三糖分离，即使利用色谱进行分离纯化工序也容易残留在反应液中。此外，存在于液体中的一定量以上的蔗果四糖在晶析工序中妨碍蔗果三糖的结晶化。由于这些原因，为了高效地制造蔗果三糖，需要减少蔗果四糖的生成。因此，需要一种能够减小蔗果四糖等副产物的生成比例、高效地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶。
本发明是为了解决这样的技术问题而作出的，目的在于，提供能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其的氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及使用了它们的蔗果三糖的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入下述氨基酸变异，从而蔗果四糖等副产物的生成比例显著降低，蔗果三糖的生成比例增加，蔗果三糖的生成量增加；所述β-呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：与来自印度拜叶林克氏菌印度亚种NBRC3744(以下简记为“B.Indica”。)的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)具有60％以上的同源性；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
此外发现，通过对前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶导入下述i)～iii)的氨基酸变异中的至少1种氨基酸变异，从而蔗果四糖等副产物的生成比例显著降低，蔗果三糖的生成比例增加，蔗果三糖的生成量增加，所述i)～iii)为：i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、及iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异。
此外发现，通过对前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶导入下述i)及iii)的氨基酸变异中的至少1种氨基酸变异，从而低聚乳果糖(lactosucrose)的生成比例及低聚乳果糖的生成量增加，所述i)及iii)为：i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异。
因此，基于这些见解完成了下述的各发明。
(1)本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的一个方式为含有对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β-呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
(2)本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的另一方式为含有下述(a)或(b)的氨基酸序列；(a)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自下述i)～iii)中的1或2种以上氨基酸变异的氨基酸序列；i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异，(b)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
(3)本发明的多肽含有(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。
(4)本发明的DNA编码(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶。
(5)本发明的重组载体含有(4)所述的DNA。
(6)本发明的转化体为将(4)所述的DNA或(5)所述的重组载体导入宿主而获得的转化体。
(7)本发明的转化体中，导入有(4)所述的DNA或(5)所述的重组载体的宿主可以是大肠杆菌。
(8)本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有下述工序：由将(6)或(7)所述的转化体培养而得到的培养物，获得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序。
(9)本发明的蔗果三糖的制造方法具有下述工序：使(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶、(6)或(7)所述的转化体或培养(6)或(7)所述的转化体而获得的培养物与蔗糖接触。
发明的效果
根据本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、本发明的转化体、本发明的蔗果三糖的制造方法，能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地制造蔗果三糖。此外，根据本发明的多肽、本发明的DNA、本发明的重组载体、本发明的转化体、本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，能够获得可抑制蔗果四糖的生成比例、高效大量地制造蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶。
附图说明
图1为示出利用导入有pCDF-Indica重组载体(上图)及pCDFDuet-1质粒(下图)的重组大肠杆菌进行蔗果三糖生成反应而得的反应液中所含有的各糖的比率的HPLC色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及蔗果三糖的制造方法进行详细说明。
蔗果三糖通常是果糖结合在蔗糖上而生成的，根据果糖所结合的位置可生成1-蔗果三糖、6-蔗果三糖及新蔗果三糖这3种。即，1-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的，6-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→6)键而生成的，新蔗果三糖是果糖与蔗糖中的葡萄糖单元形成β(2→6)键而生成的。此外，蔗果四糖是果糖与1-蔗果三糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的四糖。
本发明中的“蔗果三糖”是指1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖，包括1-蔗果三糖、6-蔗果三糖及新蔗果三糖。
此外，低聚乳果糖是果糖、葡萄糖及半乳糖结合而成的三糖，化学中以β-D-呋喃果糖基4-O-β-D-吡喃半乳糖基-α-D-吡喃葡糖苷或4G-半乳糖基蔗糖表示。即，其特征在于，其分子结构中具有蔗糖(sucrose)和乳糖(lactose)的部分结构，也称为“乳果寡糖”、“乳果低聚糖”。已知低聚乳果糖可增加肠道内的双歧杆菌、改善粪便性质和通便等，是有用的寡糖。
低聚乳果糖是使β-呋喃果糖苷酶作用于蔗糖等在末端含有果糖残基的糖质及乳糖从而使果糖结合到乳糖上而生成的。在此，作为“在末端含有果糖残基的糖质”，具体可以列举例如蔗糖等在末端含有果糖残基的二糖、蔗果三糖等在末端含有果糖残基的寡糖、在末端含有果糖残基的多糖以及在末端含有果糖残基的糖醇、在末端含有果糖残基的糖苷等。
需要说明的是，在本发明中，“β-呋喃果糖苷酶”有时与“果糖基转移酶”、“蔗糖酶”、“β-D-呋喃果糖苷酶”、“转化酶”、“invertase”或“invertin”互换使用。此外，本发明中的“野生型β-呋喃果糖苷酶”是指含有未使用基因工程方法导入氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶，“改良型β-呋喃果糖苷酶”是指含有对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入了1或2个以上的氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶。
本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的一个方式为含有对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β-呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列，所述氨基酸变异为：将在比对中与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列和其以外的氨基酸序列的同源性可以按照常规方法来确认，例如，可以使用FASTA(http：//www.genome.JP/tools/fasta/)、基本局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool(BLAST)；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)、位点特异性迭代BLAST(Position-Specific Iterated BLAST(PSI-BLAST)；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)等程序来确认。需要说明的是，“同源性”是指一致性，可以与“identity”互换使用。
含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，可以通过在序列号2的氨基酸序列中在与序列号2的氨基酸序列的同源性不小于60％的范围内缺失、置换、插入或附加1个或多个氨基酸而获得。此外，可以按照常规方法根据蛋白质信息资源(Protein InformationResource(PIR))、SWISS-PROT、TrEMBL、蛋白质研究基金会(Protein Research Foundation(PRF))、GenPept(NCBI蛋白质数据库)等氨基酸序列数据库使用FASTA(http：//www.genome.JP/tools/fasta/)、基本局部比对搜索工具(BLAST；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)、位点特异性迭代BLAST(PSI-BLAST；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)等程序进行序列号2的氨基酸序列的同源检索而获得。
含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列可以是来自细菌、酵母、霉菌、植物等任意生物的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。作为含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，具体可以列举例如在序列号2的氨基酸序列中在与序列号2的氨基酸序列的同源性(以下有时称为“规定的同源性”。)不小于60％的范围内缺失、置换、插入或附加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列、来自印度拜叶林克氏菌印度亚种ATCC9039的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：ACB95643.1；规定的同源性99％)、来自新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacenocepacia)的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：CCE47348.1；规定的同源性77％)、来自瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum)STM815的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：ACC75109.1；规定的同源性75％)、来自越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：ERJ38440.1；规定的同源性77％)、来自Burkholderia ambifaria AMMD的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：ACB66635.1；规定的同源性76％)、来自洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)GG4的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：AFQ50734.1；规定的同源性76％)、来自禾伯克霍尔德氏菌(Burkholderia graminis)的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：EDT09014.1；规定的同源性74％)、来自贪铜菌属(Cupriavidus sp.)HPC(L)的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：ESJ23133.1；规定的同源性70％)、来自类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)1106a的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：AFR18711.1；规定的同源性73％)、来自固氮醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)SRT4的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：AAB36606.1；规定的同源性66％)等。
在此，本发明中，“在序列号2的氨基酸序列中在与序列号2的氨基酸序列的同源性不小于60％的范围内缺失、置换、插入或附加1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列”中的缺失、置换、插入或附加的氨基酸个数可以列举例如1～200个、1～180个、1～160个、1～140个、1～120个、1～100个、1～80个、优选1～60个、更优选1～50个、进一步优选1～40个、更进一步优选1～30个。
此外，本发明的“与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列”中，同源性的值可以列举60％以上，还可以列举例如65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上等。作为与“序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列中除了信号序列(与序列号2的第1～28位相当)以外的氨基酸序列(与序列号2的第29～534位相当)”的同源性的值，可以列举例如65％以上、66％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上等。
比对有时也称为“序列比对”、“alignment”，它们的意思相同。在本发明中，比对可以按照常规方法进行，例如，可以使用FASTA(http：//www.genome.JP/tools/fasta/)、基本局部比对搜索工具(BLAST)；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)、位点特异性迭代(PSI-BLAST)；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)、CLUSTALW(http：//www.genome.jp/ja/)、MAFFT(http：//www.genome.jp/ja/)等程序来进行。
其次，本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的另一方式为含有下述(a)或(b)的氨基酸序列，
(a)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自以下的i)～iii)中的1或2种以上氨基酸变异的氨基酸序列，
i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、
ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、
iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异、
(b)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
上述(b)的“缺失、置换、插入或附加1或数个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、置换、插入或附加例如1～30个、1～20个、优选1～15个、更优选1～10个、更进而优选1～5个的任意个数的氨基酸的氨基酸序列。
本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶均具有如下特征：与野生型β-呋喃果糖苷酶相比，蔗果三糖的生成量增加、蔗果四糖等副产物的生成比例显著降低。
此外，本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶含有下述(c)或(d)的氨基酸序列时，具有如下特征：与野生型β-呋喃果糖苷酶相比，低聚乳果糖的生成比例及生成量增加。
(c)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自以下的i)及iii)中的1或2种氨基酸变异的氨基酸序列；
i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、
iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异、
(d)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶可以按照常规方法获得，作为这样的方法，可以列举例如化学合成方法、利用基因重组技术的方法。关于化学合成方法，例如可以基于本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列信息利用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来合成本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶，此外还可以使用各种市售的肽合成机来合成。
此外，关于利用基因重组技术的方法，可以通过使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶在合适的表达体系中表达而获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶。即，将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA导入合适的宿主，获得转化体。或者如后述实施例3及实施例4所示，将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA插入合适的载体而获得重组载体后，将该重组载体导入合适的宿主，获得转化体。然后，对获得的转化体进行培养，使其表达改良型β-呋喃果糖苷酶，从而可以获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶。
在此，本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA可以使用市售的各种DNA合成机来合成，此外还可以以编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)，从而获得。
例如，在获得编码含有导入有氨基酸变异的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA时，可以入后述实施例3及实施例4所示，首先设计编码所导入的氨基酸变异的DNA引物，使用该DNA引物，以编码野生型β-呋喃果糖苷酶或未导入该氨基酸变异的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA为模板进行PCR，从而获得。
此外，编码含有上述(b)的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA还可以通过PCR获得。即，首先设计编码与氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加氨基酸的位置相当的氨基酸序列的DNA引物，使用该DNA引物以编码氨基酸序列(a)的DNA为模板进行PCR，从而可以获得。
在本发明中，可以按照常规方法来确认某种蛋白质是否具有β-呋喃果糖苷酶活性，例如，如后述实施例2(1)[1-3]、实施例2(2)[2-1]〈2-1-3〉及实施例3(1)[1-3]所示，将该蛋白质在含有蔗糖的反应液中孵育、或在含有蔗糖的反应液中培养表达该蛋白质的转化体，然后用高效液相色谱(HPLC)等测定该反应液的蔗果三糖含量。若其结果是蔗果三糖的含量显著多，则可以判断该蛋白质具有β-呋喃果糖苷酶活性。
此外，本发明提供含有改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的多肽。需要说明的是，在本发明的多肽部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的多肽只要含有本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列即可，对其序列长度没有特别限定，可以仅含有本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，也可以含有在本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端附加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列。此外，本发明的多肽可以通过与上述获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的方法同样的方法来获得。
其次，本发明提供编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA。在本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶及多肽相同的或相当的构成，省略重复的说明。
此外，本发明提供含有编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体。需要说明的是，本发明的重组载体中，上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽及DNA相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的重组载体可以通过例如将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA插入载体而获得。DNA向载体中的插入可以按照常规方法进行，例如，可以通过将DNA和线状化的载体的DNA片段连接而进行。在此，作为载体，可以列举例如噬菌体载体、质粒载体、粘粒、噬菌粒等，可以根据宿主、操作性等适当选择。此外，本发明的重组载体中，除了本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA以外还可以含有抗药性标记基因、营养需求标记基因等转化体的选择标记基因，改良型β-呋喃果糖苷酶的表达所需的启动子、转录起始信号、核糖体结合部位、翻译终止信号、转录终止信号等转录调控信号、翻译调控信号等。
此外，本发明还提供转化体。需要说明的是，在本发明的转化体部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA及重组载体相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的转化体可以通过将编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA或含有本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体导入宿主而获得。在此，作为宿主，可以列举例如大肠杆菌、枯草菌等细菌、酵母、霉菌、丝状菌等，可以根据重组载体的种类、操作性等适当选择。DNA、重组载体向宿主的导入(转化)可以按照常规方法进行，例如，在使用质粒将重组载体导入大肠杆菌时，可以在大肠杆菌的感受态细胞中加入重组载体，在冰上静置30分钟，然后放入42℃的水浴中静置45秒后，在冰上静置2分钟，然后加入培养基并在37℃下振荡1小时，从而进行。此外，为了将目标DNA直接导入宿主的染色体，可以使用同源重组法等。
然后，本发明提供改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法。本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有下述工序：由将本发明的转化体培养而获得的培养物获得改良型β-呋喃果糖苷酶。需要说明的是，在本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体及转化体相同的或相当的构成，省略重复的说明。
在由将本发明的转化体培养而获得的培养物获得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序中，可以根据转化体的状况等适当选择获得改良型β-呋喃果糖苷酶的方法。具体而言，可以直接获得培养转化体而获得的培养物作为改良型β-呋喃果糖苷酶，也可以从培养物中纯化改良型β-呋喃果糖苷酶而获得。
作为直接将培养转化体而获得的培养物作为改良型β-呋喃果糖苷酶而获得的方法，可以列举例如：在按照使改良型β-呋喃果糖苷酶在转化体的细胞表面或细胞内部表达的方式设计DNA或重组载体时，将培养物离心分离而回收转化体，直接将其作为改良型β呋喃果糖苷酶而获得的方法；将回收的转化体破碎，将其作为改良型β-呋喃果糖苷酶而获得的方法。
关于从培养物中纯化改良型β-呋喃果糖苷酶的方法，例如，在按照使改良型β-呋喃果糖苷酶分泌到转化体的外部的方式设计DNA或重组载体时，可以将培养物离心分离而回收培养上清，从而对改良型β-呋喃果糖苷酶进行纯化。此外，在使改良型β-呋喃果糖苷酶在转化体的内部表达时，可以将培养物离心分离并回收沉淀下来的转化体，将其在缓冲液中悬浮并进行冻融、超声波处理或磨碎等而将转化体破碎，然后进行离心分离回收上清，从而对改良型β-呋喃果糖苷酶进行纯化。此外，作为纯化方法，可以列举对培养物进行热处理、盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换色谱、亲和层析、疏水色谱、反相色谱、等电点电泳等方法。
此外，本发明提供蔗果三糖的制造方法。本发明的蔗果三糖的制造方法具有下述工序：使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、本发明的转化体或培养本发明的转化体而获得的培养物与蔗糖接触。需要说明的是，在本发明的蔗果三糖的制造方法部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体及改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法相同的或相当的构成，省略重复的说明。
作为使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶和蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，将改良型β-呋喃果糖苷酶添加到含有蔗糖的溶液中，在20℃～60℃下静置20小时左右。此外，作为使本发明的转化体与蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，在宿主为大肠杆菌时，将本发明的转化体添加到含有蔗糖的溶液中，在50℃振荡培养数天。
此外，作为使培养本发明的转化体而获得的培养物与蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，将培养本发明的转化体而获得的培养物添加到含有蔗糖的溶液中，在20℃～60℃下静置或振荡20小时左右。在此，本发明的培养物可以进行破碎、磨碎、在缓冲液中悬浮、冻融、超声波处理、离心分离、热处理、盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换色谱、亲和层析、疏水色谱、反相色谱、等电点电泳等任意处理，也可以不进行处理。
最后，本发明提供低聚乳果糖的制造方法。本发明的低聚乳果糖的制造方法具有下述工序：使下述(I)的改良型β-呋喃果糖苷酶、(II)的转化体或(III)的培养物与在末端含有果糖残基的糖质及乳糖接触，
(I)含有下述(c)或(d)的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶
(c)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自以下的i)及iii)中的1或2种氨基酸变异的氨基酸序列，
i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、
iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异、
(d)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列、
(II)将上述(I)的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、或含有该DNA的重组载体导入宿主而获得的转化体、
(III)培养上述(II)的转化体而获得的培养物。
需要说明的是，在本发明的低聚乳果糖的制造方法部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及蔗果三糖的制造方法相同的或相当的构成，省略重复的说明。
作为使(I)的改良型β-呋喃果糖苷酶与在末端含有果糖残基的糖质及乳糖接触的方法，可以列举下述方法：例如，将(I)的改良型β-呋喃果糖苷酶添加到含有在末端含有果糖残基的糖质及乳糖的溶液中，在20℃～60℃下静置20小时左右。此外，作为使(II)的转化体与在末端含有果糖残基的糖质及乳糖接触的方法，可以列举下述方法：例如，在宿主为大肠杆菌时，将本发明的转化体添加到含有在末端含有果糖残基的糖质及乳糖的溶液中，在50℃下振荡培养数天。
此外，作为使(III)的培养物与在末端含有果糖残基的糖质及乳糖接触的方法，可以列举下述方法：例如，将(III)的培养物添加到含有在末端含有果糖残基的糖质及乳糖的溶液中，在20℃～60℃下静置或振荡20小时左右。
在本发明的蔗果三糖的制造方法、低聚乳果糖的制造方法中，只要不损害本发明的蔗果三糖的制造方法、低聚乳果糖的制造方法的特征，则也可以含有其它工序，例如，可以含有利用色谱进行的蔗果三糖的分离工序、煎糖等结晶化工序、干燥工序、洗涤工序、过滤工序、杀菌工序、添加食品添加剂的工序等。
以下基于各实施例对本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法、蔗果三糖的制造方法及低聚乳果糖的制造方法进行说明。需要说明的是，本发明的技术范围不受这些实施例所示的特征限定。
实施例
＜实施例1＞来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的碱基序列的确定
对印度拜叶林克氏菌印度亚种NBRC3744(以下简记为“B.Indica”。)的β-呋喃果糖苷酶进行克隆。具体而言，首先，按照常规方法提取B.Indica的基因组DNA。然后，设计下述序列号3及序列号4的引物。然后，在下述条件下进行聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction；PCR)，从而扩增来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA。此外，对来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA按照常规方法测定了全长碱基序列。将来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的全长碱基序列示于序列号1，此外，将其所编码的来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示于序列号2。
《来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：B.Indica的基因组DNA
正向引物：5’-atggcaagtcgatcgtttaatgtttgtatac-3’(序列号3)
反向引物：5’-tttaccagactcgagttactggccgttcgtgac-3’(序列号4)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下10秒、60℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，30个循环。
然后，参考印度拜叶林克氏菌印度亚种ATCC9039(基因组DNA；GenBank：CP001016.1)的编码β-呋喃果糖苷酶的DNA的碱基序列，使用SignalP4.1server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号序列。结果获知，在来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)中，信号序列相当于第1～28位。
＜实施例2＞β-呋喃果糖苷酶表达体系的构建
(1)大肠杆菌菌体内表达体系
[1-1]重组载体的构建
首先，在下述条件下进行PCR，从而扩增来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA。
《来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：B.Indica的基因组DNA
正向引物：5’-ccgcgcggcagccatggttacccgataccgactccgcattcgggacaagcctatgatcc-3’(序列号5)
反向引物：5’-gtggtggtgctcgagttactggccgttcgtgacaccatggccattaccttggccaagcgcgggaagat-3’(序列号6)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下10秒、60℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，30个循环。
然后，在下述条件下进行PCR，从而扩增pET28a质粒的DNA。
《pET28a质粒的DNA扩增用PCR的条件》
模板：pET28a质粒(Merck公司)
正向引物：5’-ctcgagcaccaccaccaccaccactga-3’(序列号7)
反向引物：5’-atggctgccgcgcggcaccaggccgct-3’(序列号8)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下10秒、60℃下20秒及68℃下6分钟为1个循环，30个循环。
将扩增出的来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA片段和pET28a质粒的DNA片段用In-Fusion HD Cloning Kit(宝生物(Takara Bio)公司)连接，从而在pET28a质粒中插入来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA，将其作为pET28a-indica重组载体。
[1-2]转化及转化体的培养和回收
将pET28a-indica重组载体导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(COSMO BIO公司)，获得作为转化体的重组大肠杆菌。将其在37℃平板培养20小时后，拾取重组大肠杆菌的克隆并接种到M9 SEED培养基1mL中，在30℃、220rpm下振荡培养18小时。然后，将培养物中的10μL在M9 Main培养基2mL中传代培养，在25℃、220rpm下振荡培养24小时。然后将培养物在3500rpm下离心分离10分钟，从而回收重组大肠杆菌。M9 SEED培养基及M9 Main培养基的组成如下所示。
M9 SEED培养基(共100mL)；水72mL、5×M9盐20mL、20％酪蛋白氨基酸5mL、20％D-葡萄糖2mL、2mg/mL胸腺嘧啶1mL、50mM CaCl2 0.2mL、2.5M MgCl240μL、100mg/mL FeSO4 28μL、25mg/mL卡那霉素盐120μL
M9 Main培养基(共100mL)；水67mL、5×M9盐20mL、20％酪蛋白氨基酸5mL、2mg/mL胸腺嘧啶1mL、50mM CaCl2 0.2mL、100mg/mL FeSO4 28μL、Overnight ExpressAutoinduction System 1(O.N.E.；Merck公司)Sol.1 2mL、O.N.E.Sol.2 5mL、O.N.E.Sol.3100μL、25mg/mL卡那霉素盐120μL
[1-3]β-呋喃果糖苷酶活性的确认
在本实施例2(1)[1-2]的重组大肠杆菌中加入BugBuster(Novagen公司)0.5mL，在37℃静置30分钟，从而将菌体破碎、提取蛋白质。然后在12000rpm下离心分离30分钟，回收上清，将其作为粗β-呋喃果糖苷酶液。然后，调制下述组成的蔗果三糖生成反应液，在37℃或50℃静置22小时，从而进行蔗果三糖的生成反应。
《蔗果三糖生成反应液的组成》
20(w/w)％蔗糖水溶液：450μL
0.2M磷酸缓冲液：25μL
粗β-呋喃果糖苷酶液：25μL
然后，将蔗果三糖生成反应液在下述条件下进行HPLC，对蔗果三糖生成反应液中所含有的各糖(果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖及其它糖)的比例以及蔗果三糖及蔗果四糖的量进行确认。关于各糖的比例，以百分率形式算出各峰的面积相对于检测到的全部峰的面积总和的比例。此外，蔗果三糖及蔗果四糖的量是将蔗果三糖生成反应液的蔗糖质量乘以蔗果三糖及蔗果四糖各自的比例而算出的。
《HPLC的条件》
柱：Cosmosil Sugar-D 4.6×150mm
流动相：A：H2O、B：75％乙腈水溶液(0～6分钟、8～11分钟)、50％乙腈水溶液(6～8分钟)
流速：1.5mL/分钟
注入量：2.5μL
温度：25℃
检测：电雾式检测器(CAD；日本Dionex公司)、范围：500pA
由其结果可知：蔗果三糖生成反应液中含有的蔗果三糖在检测限以下或极微量，因此基本没有生成蔗果三糖。该结果表明，β-呋喃果糖苷酶的大肠杆菌菌体内表达体系不适合于蔗果三糖的生成。
(2)大肠杆菌细胞表面表达体系
[2-1]利用PgsA锚定蛋白进行的细胞表面呈递(presentation)
〈2-1-1〉重组载体的构建
在下述条件下进行PCR，从而扩增编码枯草芽孢杆菌(IAM1026、ATCC9466)的PgsA锚定蛋白(GenBank：AB016245.1)的DNA。将获得的PCR产物按照常规方法用限制酶NdeI及BglII消化，将其作为PgsA-DNA片段。
《编码PgsA锚定蛋白的DNA扩增用PCR的条件》
模板：枯草芽孢杆菌(IAM1026、ATCC9466)的基因组DNA
正向引物(下划线表示NdeI位点)：5’-aaacatatgaaaaaagaactgagctttcatg-3’(序列号9)
反向引物(下划线表示BglII位点)：5’-aaaagatcttttagattttagtttgtcactatg-3’(序列号10)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下10秒、60℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，30个循环。
此外，对PgsA-DNA片段，按照常规方法确认了碱基序列。将确认的编码PgsA锚定蛋白的DNA的碱基序列示于序列号11、将其所编码的PgsA锚定蛋白的氨基酸序列示于序列号12。
然后，在下述条件下进行PCR，扩增来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA，按照常规方法用限制酶BamHI及XhoI消化，将其作为来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶DNA片段。
《来自B.Indica的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：B.Indica的基因组DNA
正向引物(下划线表示BamHI位点)：5’-aaaggatcctcgggttacccgataccgactccgcattcgggaca-3’(序列号13)
反向引物(下划线表示XhoI位点)：5’-cccctcgagttactggccgttcgtgacaccatggccattaac-3’(序列号14)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下10秒、60℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，20个循环。
然后，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝生物公司)，按照所附的说明书在pCDFDuet-1质粒(Merck公司)的NdeI位点及XhoI位点中插入PgsA-DNA片段及来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶DNA片段，将其作为pCDF-Indica重组载体。
〈2-1-2〉转化及转化体的培养和回收
将本实施例2(2)[2-1]〈2-1-1〉的pCDF-Indica重组载体、及作为对照的pCDFDuet-1质粒通过本实施例2(1)[1-2]中记载述的方法导入大肠杆菌，对获得的重组大肠杆菌进行培养和回收。但是，M9 SEED培养基设为0.5mL，来代替1mL；在M9 SEED培养基中的培养时间设为20小时，来代替18小时。此外，抗生素使用了“50mg/mL链霉素硫酸盐100μL”，来代替“25mg/mL卡那霉素盐120μL”。
〈2-1-3〉β-呋喃果糖苷酶活性的确认
使用本实施例2(2)[2-1]〈2-1-2〉的重组大肠杆菌调制下述组成的蔗果三糖生成反应液，在30℃、220rpm下振荡20小时，从而进行蔗果三糖生成反应。然后，在3500rpm下离心分离10分钟，回收上清。在回收的上清中加入50％乙腈而稀释为100倍后，在本实施例2(1)[1-3]的条件下进行HPLC。作为其结果的HPLC色谱图如图1所示。
《蔗果三糖生成反应液的组成》
20(w/w)％蔗糖水溶液：430μL
0.2M磷酸缓冲液：50μL
重组大肠杆菌：全部
如图1的下侧的图所示，在使用导入了pCDFDuet-1质粒的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中，没有确认到蔗果三糖。与此相对地，如该图的上侧的图所示，在使用导入了pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中，确认到了蔗果三糖。该结果表明，若使β-呋喃果糖苷酶呈递到大肠杆菌的细胞表面，则可以使用该大肠杆菌来生成蔗果三糖。
[2-2]利用CapA锚定蛋白进行的细胞表面呈递
〈2-2-1〉重组载体的构建
对于PgsA锚定蛋白，使用基本局部比对搜索工具(BLAST)进行检索，获得了与PgsA锚定蛋白的同源性为55％的巨大芽孢杆菌DSM319株的CapA锚定蛋白。对于CapA锚定蛋白，设计以大肠杆菌的最适密码子编码的碱基序列，将其作为capA_opti基因。将capA_opti基因的碱基序列示于序列号15、将其所编码的氨基酸序列示于序列号16。
然后，人工合成capA_opti基因的DNA，以其为模板在下述条件下进行PCR，从而扩增编码CapA锚定蛋白的DNA。将获得的PCR产物作为capA_opti-DNA片段。
《CapA序列的DNA扩增用PCR的条件》
模板：人工合成的capA_opti基因的DNA
正向引物：5’-taagaaggagatatacatatgaaagaaaagaaactgaacttccaag-3’(序列号17)
反向引物：5’-cgggtaacccgattgagatctatttgcctgggcttcgttctttttg-3’(序列号18)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以94℃下15秒、58℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，21个循环。
然后，在下述条件下进行反向PCR，扩增编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA，将获得的PCR产物作为改良型β-呋喃果糖苷酶DNA片段。
《编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：实施例3(1)[1-1]的Indica-H395R/F473Y重组载体
正向引物：5’-agatctcaatcgggttacccgataccgac-3’(序列号19)
反向引物：5’-catatgtatatctccttcttatacttaac-3’(序列号20)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以94℃下15秒及68℃下6分钟为1个循环，35个循环。
然后，将capA_opti基因DNA片段和β-呋喃果糖苷酶DNA片段用In-Fusion HDCloning Kit(宝生物公司)连接，从而获得插入有编码CapA锚定蛋白的DNA来代替编码PgsA锚定蛋白的DNA的Indica-H395R/F473Y重组载体，将其作为Indica-CapA-H395R/F473Y重组载体。
〈2-2-2〉转化及转化体的培养和回收
将本实施例2(2)[2-2]〈2-2-1〉的Indica-CapA-H395R/F473Y重组载体、及作为对照的实施例3(1)[1-1]的Indica-H395R/F473Y重组载体通过本实施例2(1)[1-2]中记载的方法导入大肠杆菌，对获得的重组大肠杆菌进行培养，由2mL的培养物中回收菌体。
〈2-2-3〉β-呋喃果糖苷酶活性的确认
使用本实施例2(2)[2-2]〈2-2-2〉的重组大肠杆菌，调制下述组成的蔗果三糖生成反应液。将其在50℃、200rpm下振荡24小时，从而进行蔗果三糖生成反应。在反应后的蔗果三糖生成反应液100μL中加入超纯水900μL而稀释为10倍后，加入离子交换树脂(AmberliteMB-4)并搅拌30秒～1分钟。然后，在14000×g下离心分离5分钟并回收上清。将其按照下述条件进行HPLC，利用本实施例2(1)[1-3]中记载的方法算出各糖的比例及蔗果三糖的量。其结果如以下的表1所示。表1中，n.d.表示检测限以下。
《蔗果三糖生成反应液的组成》
60(w/w)％蔗糖溶液(在0.04M磷酸缓冲液(pH7)中溶解有60(w/w)％的蔗糖的溶液)：500μL
重组大肠杆菌：全部
《HPLC的条件》
柱：TSKgel Amide-80 4.6×250mm
流动相：70％乙腈水溶液
流速：1.0mL/分钟
注入量：20μL
温度：70℃
检测：差示折射率检测器(RID；安捷伦科技公司)
[表1]
如表1所示，在导入了Indica-CapA-H395R/F473Y重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中，与导入了Indica-H395R/F473Y重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液同样地，也生成了蔗果三糖，且蔗果四糖的量为检测限以下。该结果表明，使用PgsA锚定蛋白、CapA锚定蛋白等将β-呋喃果糖苷酶呈递到大肠杆菌的细胞表面时，可以使用该大肠杆菌高效地生成蔗果三糖。
＜实施例3＞改良型β-呋喃果糖苷酶的制作和评价
(1)改良型β-呋喃果糖苷酶的制作
制作含有导入有氨基酸变异(以下将各氨基酸变异简记为“L123C”、“H395R”、“H395K”及“F473Y”。)的氨基酸序列的一重变异体、二重变异体及三重变异体的β-呋喃果糖苷酶，将这些作为改良型β-呋喃果糖苷酶，所述“L123C”、“H395R”、“H395K”及“F473Y”分别为：在来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)中，将N末端起的第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)、将第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)、将第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的变异。具体步骤如以下所示。
[1-1]重组载体的构建
首先，在下述条件下进行PCR，扩增编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA。
《编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：如表2所示
正向引物及反向引物：如表2所示
PCR用酶：KOD-Plus-NEO(东洋纺公司)
反应条件：以95℃下1分、95℃下10秒、68℃下20秒及68℃下3.5分钟为1个循环，15个循环。
[表2]
然后，在PCR产物中加入限制酶DpnI，在37℃消化1小时后进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶切开并纯化。在其中加入Ligation high(东洋纺公司)及T4多核苷酸激酶(东洋纺公司)在16℃静置1小时而进行连接反应，由此构建重组载体。
对于获得的一重变异体的重组载体，将插入有编码分别导入了L123C、H395R及F473Y的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体分别作为Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体及Indica-F473Y重组载体。
同样地，对于二重变异体的重组载体，将插入有编码分别导入了H395R及L123C、H395R及F473Y、以及F473Y及L123C的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体，作为Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体及Indica-F473Y/L123C重组载体。
此外，对于三重变异体的重组载体，将插入有编码导入了L123C、H395R及F473Y的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体作为Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体。
[1-2]转化及转化体的培养和回收
将本实施例3(1)[1-1]的重组载体通过实施例2(1)[1-2]中记载的方法导入到E.coli JM109感受态细胞中，并回收重组大肠杆菌。然后，从重组大肠杆菌中回收重组载体，将其导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(COSMO BIO公司)，获得作为转化体的重组大肠杆菌。将其在37℃平板培养20小时后，拾取重组大肠杆菌的克隆并接种到M9 SEED培养基0.5mL中，在30℃、800rpm下振荡培养20小时。然后，将培养物中的5μL在M9 Main培养基2mL中传代培养，在25℃、800rpm下振荡培养23小时。然后，将培养物在3500rpm下离心分离10分钟，从而回收重组大肠杆菌。
(2)改良型β-呋喃果糖苷酶的评价
[2-1]蔗果三糖生成活性的确认
使用本实施例3(1)[1-2]的重组大肠杆菌、及作为对照的导入有实施例2(2)[2-1]〈2-1-2〉的pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌，通过实施例2(2)[2-2]〈2-2-3〉中记载的方法进行蔗果三糖生成反应，对蔗果三糖生成反应液进行HPLC。其结果如表3所示。表3中，n.d.表示检测限以下。
[表3]
如表3所示，关于蔗果三糖的量，在导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中为39.7mg，与此相对地，在导入有Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体、Indica-H395K重组载体、Indica-F473Y重组载体、Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体、Indica-F473Y/L123C重组载体及Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为44.5mg、163.5mg、105.3mg、89.9mg、175.5mg、184.3mg、120.5mg及218.8mg。
此外，关于蔗果三糖的比例，在导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中为10.25％，与此相对地，在导入有Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体、Indica-H395K重组载体、Indica-F473Y重组载体、Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体、Indica-F473Y/L123C重组载体及Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为11.50％、42.26％、27.20％、23.23％、45.34％、47.63％、31.13％及56.54％。
此外，关于蔗果四糖的比例，在导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中为5.11％，与此相对地，在导入有Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体、Indica-H395K重组载体、Indica-F473Y重组载体、Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体、Indica-F473Y/L123C重组载体及Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为3.99％、n.d.、1.95％、3.42％、n.d.、n.d.、1.32％及0.07％。
进而，关于其它糖的比例，在导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中为9.02％，与此相对地，在导入有Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体、Indica-H395K重组载体、Indica-F473Y重组载体、Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体、Indica-F473Y/L123C重组载体及Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为3.52％、2.41％、3.28％、8.37％、0.32％、2.95％、1.68％及1.51％。
即，导入有Indica-L123C重组载体、Indica-H395R重组载体、Indica-H395K重组载体、Indica-F473Y重组载体、Indica-H395R/L123C重组载体、Indica-H395R/F473Y重组载体、Indica-F473Y/L123C重组载体及Indica-H395R/F473Y/L123C重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液，与导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液相比，蔗果三糖的量增加且蔗果四糖的比例及其它糖的比例都下降，蔗果三糖的比例增加。由此可知，利用含有导入有L123C、H395R、H395K及F473Y中的至少一种氨基酸变异的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶进行的蔗果三糖生成反应，与利用野生型β-呋喃果糖苷酶进行的蔗果三糖生成反应相比，蔗果四糖等副产物的比例显著降低，蔗果三糖的比例提高，结果是蔗果三糖的量增加。
这些结果表明，通过对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)导入将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)、将第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)、将第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异中的至少一种氨基酸变异，从而能够获得可抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶。
[2-2]低聚乳果糖生成活性的确认
使用导入有本实施例3(1)[1-2]的Indica-L123C重组载体及Indica-F473Y重组载体的重组大肠杆菌、以及作为对照的导入有实施例2(2)[2-1]〈2-1-2〉的pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌，调制下述组成的低聚乳果糖生成反应液。
但是，重组大肠杆菌使用从0.5mL的培养物回收的全部菌。此外，从培养物回收重组大肠杆菌是在4℃、15000×g下将培养物离心分离10分钟而进行的。
《低聚乳果糖生成反应液的组成》
蔗糖/乳糖溶液(在0.05M磷酸缓冲液(pH6.0)中溶解有蔗糖22(w/w)％、乳糖18(w/w)％的溶液)；350μL
重组大肠杆菌；全部
将其在55℃、220rpm下振荡6小时，从而进行低聚乳果糖生成反应。在反应后的低聚乳果糖生成反应液50μL中加入超纯水450μL及乙腈500μL稀释后，在35℃下加热10分钟。然后，在25℃、15000×g下离心分离10分钟并回收上清，用过滤器过滤。将其根据下述的条件进行HPLC，通过实施例2(1)[1-3]中记载的方法算出各糖的比例及低聚乳果糖的量。其结果如表4所示。表4中，n.d.表示检测限以下。
《HPLC的条件》
柱：TSKgel Amide-80 4.6×250mm
流动相：70％乙腈水溶液
流速：1.0mL/分钟
注入量：20μL
温度：35℃
检测：差示折射率检测器(RID；昭和电工公司)
[表4]
如表4所示，关于低聚乳果糖的量，导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液中为29.4mg，与此相对地，导入有Indica-L123C重组载体及Indica-F473Y重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液中分别为54.8mg及45.6mg。此外，关于低聚乳果糖的比例，导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液中为17.8％，与此相对地，导入有Indica-L123C重组载体及Indica-F473Y重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液中分别为33.2％及27.6％。
即，导入有Indica-L123C重组载体及Indica-F473Y重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液与导入有pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的低聚乳果糖生成反应液相比，低聚乳果糖的量及低聚乳果糖的比例显著增加。由此可知，利用含有导入有L123C及F473Y中的至少一种氨基酸变异的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶进行的低聚乳果糖生成反应，与利用野生型β-呋喃果糖苷酶进行的低聚乳果糖生成反应相比，低聚乳果糖的比例及低聚乳果糖的量增加。
这些结果表明，通过对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)导入将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)、将第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异中的至少一种氨基酸变异，从而能够获得可高效大量地生成低聚乳果糖的β-呋喃果糖苷酶。
＜实施例4＞与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶同源的β-呋喃果糖苷酶的改良型β-呋喃果糖苷酶的制作和评价
(1)比对
分别获得下述(i)即含有与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶具有75％的同源性的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶、和下述(ii)即含有与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶具有66％的同源性的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶。需要说明的是，与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列除去信号序列(相当于序列号2的第1～28位)后的氨基酸序列(相当于序列号2的第29～534位)的同源性如括号内所示。
(i)75％的同源性(除信号序列以外的同源性：76％)：瘤状伯克霍尔德菌STM815(以下简记为“Burk”。)的β-呋喃果糖苷酶(GenBank：ACC75109.1)
(ii)66％的同源性(除信号序列以外的同源性：65％)：固氮醋杆菌SRT4(以下简记为“Glucono”。)的β-呋喃果糖苷酶(GenBank：AAB36606.1)
然后，用ClustalW法(http：//www.genome.jp/tools/clustalw/)将来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)与(i)及(ii)进行比对。由结果可知：来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列中的N末端起第395位的组氨酸(H)在(i)中相当于N末端起第393位的组氨酸(H)、在(ii)中相当于N末端起第419位的组氨酸(H)。
(2)重组载体的构建
[2-1]插入有编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体的构建
按照下述的条件进行PCR，扩增来自Burk的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA，将获得的PCR产物作为Burk野生型DNA片段。将来自Burk的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的碱基序列示于序列号37、将其所编码的来自Burk的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示于序列号38。
《来自Burk的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：Burk的基因组DNA
正向引物：5’-aaactaaaatctaaaagatctcagactgcaacgccaggcttccccg-3’(序列号39)
反向引物：5’-ggtttctttaccagactcgagttactggctgttgccgccctgcccgtttcc-3’(序列号40)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以94℃下15秒、58℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，21个循环。
此外，对于Glucono的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(GenBank：AAB36606.1)，设计用大肠杆菌的最适密码子编码的碱基序列，将其作为Glucono_opti基因。将Glucono_opti基因的碱基序列示于序列号41、将其所编码的氨基酸序列示于序列号42。
然后，人工合成Glucono_opti基因的DNA，以其为模板在下述条件下进行PCR，从而扩增来自Glucono的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA，将获得的PCR产物作为Glucono野生型DNA片段。
《来自Glucono的编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：人工合成的Glucono_opti基因的DNA
正向引物：5’-aaactaaaatctaaaagatctcaaggcaatttttctcgccaggaag-3’(序列号43)
反向引物：5’-ggtttctttaccagactcgagttattgattcagaaattgacggacctgt-3’(序列号44)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
反应条件：以94℃下15秒、58℃下20秒及68℃下2分钟为1个循环，21个循环。
然后，在下述条件下进行PCR，从而扩增插入有编码PgsA锚定蛋白的DNA的pCDFDuet-1质粒的DNA，将获得的PCR产物作为pCDF-PgsA-DNA片段。
《插入有编码PgsA锚定蛋白的DNA的pCDFDuet-1的DNA扩增用PCR的条件》
模板：实施例2(2)[2-1]〈2-1-1〉的pCDF-Indica重组载体
正向引物：5’-tctggtaaagaaaccgctgctgcgaaattt-3’(序列号45)
反向引物：5’-tttagattttagtttgtcactatgatcaat-3’(序列号46)
使用In-Fusion HD Cloning Kit(宝生物公司)，将Burk野生型DNA片段和pCDF-PgsA-DNA片段连接、将Glucono野生型DNA片段和pCDF-PgsA-DNA片段连接，从而获得重组载体，将前者作为pCDF-Burk重组载体，将后者作为pCDF-Glucono重组载体。
[2-2]插入有编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体的构建
通过实施例3(1)[1-1]的方法，制作插入有编码改良型β-呋喃果糖苷酶(一重变异体)的DNA的重组载体，所述改良型β-呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：在来自Burk的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列中将从N末端起第393位的组氨酸残基置换为精氨酸(R)的氨基酸变异的氨基酸序列、在来自Glucono的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列中将从N末端起第419位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)的氨基酸变异的氨基酸序列(以下将上述氨基酸变异简记为“Burk-H393R”及“Glucono-H419R”。)。其中，PCR的模板及引物使用了表5所述的模板和引物。
对于所获得的一重变异体的重组载体，将插入有编码含有分别导入了Burk-H393R及Glucono-H419R的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体，分别作为Burk-H393R重组载体及Glucono-H419R重组载体。
[表5]
(3)β-呋喃果糖苷酶活性的确认
将本实施例4(2)[2-1]的pCDF-Burk重组载体及pCDF-Glucono重组载体、以及本实施例4(2)[2-2]的Burk-H393R重组载体及Glucono-H419R重组载体通过实施例3(1)[1-2]的方法导入大肠杆菌，对获得的重组大肠杆菌进行培养，从2mL的培养物中回收菌体。然后，使用这些重组大肠杆菌通过实施例2(2)[2-2]〈2-2-3〉的方法测定蔗果三糖生成量及蔗果四糖生成量。其结果如表6所示。需要说明的是，为了进行比较，在表6的下两行中示出了表3所示的结果中的导入有pCDF-Indica重组载体及Indica-H395R重组载体的重组大肠杆菌的结果。表6中，n.d.表示检测限以下。
[表6]
如表6所示，关于蔗果三糖的量，在导入有pCDF-Burk重组载体、pCDF-Glucono重组载体及pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为57.6mg、56.8mg及39.7mg，与此相对地，在导入有Burk-H393R重组载体、Glucono-H419R重组载体及Indica-H395R重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为106.4mg、60.3mg及163.5mg，均是增加的。
此外，关于蔗果三糖的比例，在导入有pCDF-Burk重组载体、pCDF-Glucono重组载体及pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为14.87％、14.67％及10.25％，与此相对地，在导入有Burk-H393R重组载体、Glucono-H419R重组载体及Indica-H395R重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为27.49％、15.59％及42.26％，均是增加的。
此外，关于蔗果四糖的比例，在导入有pCDF-Burk重组载体、pCDF-Glucono重组载体及pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为4.53％、5.03％及5.11％，与此相对地，在导入有Burk-H393R重组载体、Glucono-H419R重组载体及Indica-H395R重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为n.d.、0.23％及n.d.，均是降低的。
进而，关于其它糖的比例，在导入有pCDF-Burk重组载体、pCDF-Glucono重组载体及pCDF-Indica重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为3.26％、4.46％及9.02％，与此相对地，在导入有Burk-H393R重组载体、Glucono-H419R重组载体及Indica-H395R重组载体的重组大肠杆菌的蔗果三糖生成反应液中分别为0.82％、0.99％及2.41％，均是降低的。
即，可以获知：利用含有导入有Burk-H393R、Glucono-H419R或H395R的氨基酸序列的改良型β-呋喃果糖苷酶进行的蔗果三糖生成反应与利用未导入这些氨基酸变异的野生型β-呋喃果糖苷酶进行的蔗果三糖生成反应相比，蔗果三糖的量增加且蔗果四糖的比例及其它糖的比例均降低，蔗果三糖的比例增加。
这些结果表明，通过对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入下述氨基酸变异，能够获得可抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶，其中，所述β-呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与来自B.Indica的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
Claims (9)
1.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其含有对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β-呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
2.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其含有下述(a)或(b)的氨基酸序列；
(a)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自下述i)～iii)中的1或2种以上氨基酸变异的氨基酸序列；
i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、
ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、
iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异，
(b)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
3.一种多肽，其含有权利要求1或2所述的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。
4.一种DNA，其编码权利要求1或2所述的改良型β-呋喃果糖苷酶。
5.一种重组载体，其含有权利要求4所述的DNA。
6.一种转化体，其是将权利要求4所述的DNA或权利要求5所述的重组载体导入宿主而获得的。
7.根据权利要求6所述的转化体，其宿主为大肠杆菌。
8.一种改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，其具有下述工序：由将权利要求6或权利要求7所述的转化体培养而得到的培养物，获得改良型β-呋喃果糖苷酶。
9.一种蔗果三糖的制造方法，其具有下述工序：使蔗糖与权利要求1或权利要求2所述的改良型β-呋喃果糖苷酶、权利要求6或权利要求7所述的转化体或者培养权利要求6或权利要求7所述的转化体而获得的培养物接触。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1726655A1 (en) * | 2004-03-04 | 2006-11-29 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Beta fructofuranosidase mutant |
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|---|---|---|---|---|
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| KR20060060389A (ko) * | 2004-11-30 | 2006-06-05 | 주식회사 마크로젠 | 자이모모나스 모빌리스 ｚｍ4의 게놈 서열 및 에탄올생산에 관여하는 신규 유전자 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DENIZOT F等: "Beta-D-fructofuranosyl transferase", 《GENEBANK》 * |
| HOMANN A等: "Insights into polymer versus oligosaccharide synthesis: mutagenesis and mechanistic studies of a novel levansucrase from Bacillus megaterium.", 《THE BIOCHEMICAL JOURNAL》 * |
| VISNAPUU T等: "Levansucrases from Pseudomonas syringae pv. tomato and P. chlororaphis subsp. aurantiaca: substrate specificity, polymerizing properties and usage of different acceptors for fructosylation.", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| 张欣英: "Bacillus megaterium NCIB 8508 产果糖基转移酶及低聚果糖的初步研究", 《中国生物制品学杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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