WO2015041318A1 - 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 - Google Patents

免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 Download PDF

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spg
complex
antigen
virus
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石井　健
康司 小檜山
大貴 青枝
文彦 武下
粕谷　裕司
貴子 丹羽
小泉　誠
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独立行政法人医薬基盤研究所
第一三共株式会社
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide-containing complex having immunostimulatory activity and use thereof. Specifically, the present invention relates to a complex containing CpG oligodeoxynucleotide (ODN) and ⁇ -glucan having immunostimulatory activity, and a pharmaceutical use thereof.
  • ODN CpG oligodeoxynucleotide
  • CpG ODNs CpG oligonucleotides
  • TLR9 Toll-like receptor 9
  • DCs dendritic cells
  • IFNs type I interferons
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • Non-patent Document 6 There are at least four types of CpG ODNs with different skeletal sequences and immunostimulatory properties (Non-patent Document 6).
  • D-type (also called A-type) CpGNODNs typically contain one palindromic CpG motif with a phosphodiester (PO) backbone and a phosphorothioate (PS) poly G tail, and plasmacytoid DCs (pDCs) Is activated to produce a large amount of IFN- ⁇ , but cannot induce pDC maturation or B cell activation (Non-patent Documents 7 and 8).
  • the other three types of ODN consist of a PS skeleton.
  • K-type (also called B-type) CpGNODN typically contains multiple CpG motifs in a non-palindrome structure that strongly activates B cells to produce IL-6 and activates pDCs
  • IFN- ⁇ is hardly produced (Non-patent Documents 8 and 9).
  • C-type and P-type CpG ODNs contain one and two palindromic CpG sequences, both of which activate B cells like K type and like D type
  • pDCs can be activated
  • C-type CpG ODN induces IFN- ⁇ production weaker than P-type CpG ODN (Non-patent Documents 10-12).
  • Patent Document 1 describes many excellent K-type CpG ODNs.
  • D-type and P-type CpG ODN is a Hoogsteen base pair that forms a parallel four-stranded structure called G-tetrads, and a Watson-Crick base pair between a cis palindrome and a trans palindrome site, These are required for strong IFN- ⁇ production by pDCs (Non-patent Documents 12-14).
  • Such higher-order structures appear to be necessary for localization to early endosomes and TLR9-mediated signaling, but these are affected by product polymorphism and precipitation, thus preventing its clinical application (Non-patent document 15).
  • K-type and C-type CpGNODN are generally available as human immunotherapeutic agents and vaccine adjuvants (Non-patent Documents 16 and 17).
  • K-type CpG ODN enhances the immunogenicity of vaccines targeting infectious diseases and cancer in human clinical trials (Non-patent Documents 6 and 16), but for optimal adjuvant effect, antigen and K-type CpG Chemical and physical linkage between ODN is required.
  • Schizophyllum (SPG), a soluble ⁇ -1,3-glucan derived from Schizophyllum commune, has been approved in Japan for the last 30 years as a radiation therapy stimulant in patients with cervical cancer. Patent Document 18). Similarly, Lentinan (LNT), a soluble ⁇ -1,3-glucan from Shiitake mushroom, was approved in 1985 and used in combination with fluoropyrimidines for patients with inoperable and recurrent gastric cancer. (Non-Patent Documents 19 and 20). ⁇ -1,3-glucan has been shown to form a complex of triple-helical structure with polydeoxyadenylic acid (dA) (Non-patent Document 21).
  • dA polydeoxyadenylic acid
  • Patent Documents 2 to 4 disclose the use of a water-soluble complex of ⁇ -1,3-glucan containing schizophyllan and a nucleic acid (gene) as a gene carrier. These documents describe that the antisense action of a gene and the resistance action to a nucleolytic enzyme (nuclease) are enhanced by forming the complex.
  • Patent Document 5 by using a polysaccharide having ⁇ -1,3-linkage as a carrier (transfection agent), a CpG sequence is contained, and a phosphodiester bond is substituted with a phosphorothioate bond or a phosphorodithioate bond. It is disclosed that the action of immunostimulatory oligonucleotides is enhanced.
  • Patent Document 6 describes an immunostimulatory complex comprising an immunostimulatory oligonucleotide and a ⁇ -1,3-glucan having a long ⁇ -1,6-glucoside-binding side chain. Has been.
  • Non-patent Document 24 In recent years, it has been shown that when poly (dA) having a phosphorothioate bond is linked to CpG ODN, the complex formation is increased to almost 100% (Non-patent Document 24). However, no thorough study has been done to identify the optimal humanized CpG sequence and optimize the factors to obtain the “all-in-one” activity of the four types of CpGNODN.
  • Patent Document 8 discloses a method for producing an antigen / CpG oligonucleotide / ⁇ -1,3-glucan ternary complex.
  • CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. 16 Klinman, D.M. Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nature reviews. Immunology 4, 249-258 (2004). Vollmer, J. & Krieg, A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009). Krug, A., et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha / beta in plasmacytoid dendritic cells. European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an immunostimulant having a stronger activity than a conventional CpG-SPG complex.
  • the present inventors have identified a novel complex containing K3 (SEQ ID NO: 2), which is a K-type CpGNODN having a poly (dA) tail at the 3 ′ end, and K3-SPG. did. This formed higher order nanoparticles that could be completely solubilized. Similarly, the present inventors also succeeded in producing a novel complex K3-LNT containing the K-type CpG ODN and lentinan (LNT).
  • K3-SPG and K3-LNT do not have the D-type CpG ODN sequence, they activate the immunostimulatory activity unique to K-type CpG ODN (for example, B cells (preferably human B cells)) IL-6 production activity) and immunostimulatory activity peculiar to D-type CpG ODN (for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells to produce IFN- ⁇ ).
  • K3-LNT and K3-SPG have strong vaccine adjuvant activity, and when immunized with antigen, both antigen-specific humoral immunity and cellular immunity are induced, and in fact RSV virus Or it showed a very strong infection protection effect against influenza virus. Further studies were made based on these findings, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • the humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide is 10 nucleotides or more in length and has the formula:
  • N 1 , N 2 , N 3 , N 4 , N 5 and N 6 can be any nucleotide
  • the oligodeoxynucleotide according to [1] or [2], wherein the humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • [4] The oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [3], wherein a part or all of the phosphodiester bond of the oligodeoxynucleotide is substituted with a phosphorothioate bond.
  • [5] The oligodeoxynucleotide according to [4], wherein all of the phosphodiester bonds of the oligodeoxynucleotide are substituted with phosphorothioate bonds.
  • [6] The oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [5], wherein the polydeoxyadenylic acid has a length of 20 to 60 nucleotides.
  • a complex comprising the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] and ⁇ -1,3-glucan.
  • a complex comprising the oligodeoxynucleotide described in (i) below and the ⁇ -1,3-glucan described in (ii).
  • a pharmaceutical composition comprising the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12].
  • the pharmaceutical composition according to [15] wherein the viral infection is an RS virus or influenza virus infection.
  • a type I and / or type II interferon production inducer comprising the complex according to any one of [7] to [12].
  • [18] An immunostimulant comprising the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12]. [19] The immunostimulant of [18], which is a vaccine adjuvant. [20] A viral infection, cancer, allergic disease, intracellular, comprising the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12] A prophylactic or therapeutic agent for parasitic protozoa or bacterial infections. [21] The preventive or therapeutic agent according to [20], wherein the viral infection is an RS virus or influenza virus infection.
  • [22] Use of the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12] for the production of a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating viral infection, cancer, allergic disease, intracellular parasitic protozoa, or bacterial infection.
  • the viral infection is an RS virus or influenza virus infection.
  • a method for treating or preventing a disease in the warm-blooded animal [26] The method according to [25], wherein the disease is a viral infection, cancer, allergic disease, intracellular parasitic protozoa or bacterial infection. [27] The method according to [26], wherein the viral infection is an RS virus or influenza virus infection. [28] The method according to any one of [25] to [27], wherein the warm-blooded animal is a human. [29] An administration of a pharmacologically effective amount of the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12] to a warm-blooded animal.
  • a method for inducing a protective immune response in the warm-blooded animal [30] The oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] for use in the treatment or prevention of viral infection, cancer, allergic disease, intracellular parasitic protozoa or bacterial infection, or [ 7] to [12]. [31] The oligodeoxynucleotide or complex according to [30], wherein the viral infection is RS virus or influenza virus infection. [32] (a) the oligodeoxynucleotide according to any one of [1] to [6] or the complex according to any one of [7] to [12], and (b) A pharmaceutical composition comprising an antigen.
  • composition according to [32] which induces an immune response against the antigen.
  • an oligodeoxynucleotide having excellent immunostimulatory activity and a complex containing the same are provided.
  • the complex of the present invention has both an immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN and an immunostimulatory activity peculiar to D-type CpG ODN.
  • the complex of the present invention has a strong vaccine adjuvant activity, and when the complex of the present invention is immunized with an antigen, both the antigen-specific humoral immunity and cellular immunity are stimulated. Strong anti-infective effect. Therefore, the complex of the present invention is useful as an immunostimulant or vaccine adjuvant.
  • FIG. 1 shows pan-IFN- ⁇ production of PBMCs.
  • Figure 2 shows cytokine profiles produced from human PBMCs when stimulated with K3, K3-dA40 or K3-SPG.
  • the scanning electron microscope image of K3-SPG is shown.
  • the particle sizes of K3-SPG, SPG and D35 analyzed by dynamic light scattering are shown.
  • Figure 3 shows pan-IFN- ⁇ , IFN- ⁇ 2, and IFN- ⁇ production of PBMCs induced by K3, K3-SPG or D35 stimulation.
  • FIG. 6 shows co-localization of K3-SPG to K-type CpG ODN-containing endosomes.
  • the scale bar indicates 10 ⁇ m. This result is representative of at least two independent trials.
  • FIG. 3 shows co-localization of K3-SPG to D-type CpG ODN-containing endosomes. The scale bar indicates 10 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows IFN ⁇ production induced by restimulation with antigen of splenocytes of mice immunized with OVA alone, OVA + K3, or OVA + K3-SPG.
  • the percentage of OVA-specific CD8 T cells induced by immunization with OVA alone, OVA + K3, or OVA + K3-SPG is shown. * p ⁇ 0.05 (Mann-Whitney U test).
  • FIG. 2 shows in vivo OVA-specific CTL activity induced by immunization with OVA alone, OVA + K3, OVA + K3-dA40 or OVA + K3-SPG. * p ⁇ 0.05 (Mann-Whitney U test). The peptide vaccine adjuvant effect of K3-SPG is shown. The dose-dependent adjuvant effect of K3-SPG is shown. The antigen-specific serum antibody titers of mice immunized with OVA alone, OVA + K3, or OVA + K3-SPG are shown. The OVA dose at the time of immunization is shown above each graph. * p ⁇ 0.05 (Mann-Whitney U test). FIG.
  • FIG. 6 shows IFN ⁇ production induced by restimulation with antigen of splenocytes of mice immunized with OVA alone, OVA + K3, or OVA + K3-SPG.
  • OVA dose at the time of immunization is shown above each graph. Shows binding of SPG to empty (vector), Dectin-1 or Dectin-2 transfectants. Shows binding of K3 or K3-SPG to empty (vector), Dectin-1 or Dectin-2 transfectants.
  • Fig. 3 shows Zymosan Depleted stimulation-induced TNF- ⁇ production of C57BL / 6J mice or Dectin-1 deficient mouse splenocytes.
  • FIG. 3 shows SPG-stimulated TNF- ⁇ production of C57BL / 6J mice or Dectin-1 deficient mouse splenocytes.
  • the effect of Zymosan Depleted on CpG ODN stimulation-induced IFN- ⁇ production in C57BL / 6J mice or Dectin-1 deficient mouse splenocytes is shown. * p ⁇ 0.05 (t-test).
  • the effect of SPG on CpGpODN stimulation-induced IFN- ⁇ production in C57BL / 6J mouse splenocytes is shown.
  • Figure 3 shows that cytokine production induced by K3-SPG is dependent on TLR9.
  • FIG. 6 shows IFN- ⁇ production induced by restimulation with antigen of spleen cells of Dectin-1 +/ ⁇ or Dectin-1-/ ⁇ mice immunized with OVA + K3-SPG.
  • FIG. 33 shows the result of analyzing the co-localization of OVA with MARCO + cells or Siglec-1 + cells in FIG. 33 by Volocity. * p ⁇ 0.05 (t-test).
  • FIG. 36 shows the result of analyzing the colocalization of K3 or K3-SPG with MARCO + cells in FIG. 35 by Volocity. * p ⁇ 0.05 (t-test). The protocol for the depletion test with clodronate liposomes (upper panel), antigen-specific antibody titer in serum (lower left), and antigen-stimulated cytokine production are shown. * p ⁇ 0.05 (t-test).
  • FIG. 6 shows CD40 expression in various DCs of C57BL / 6J or Tlr9 ⁇ / ⁇ mice administered with K3 or K3-SPG.
  • the antigen-specific antibody titer in serum in mice immunized with SV, WIV or SV + K3-SPG is shown.
  • a time-dependent change in body weight (left) and a survival rate curve (right) when immunized with SV, WIV or SV + K3-SPG and challenged with influenza virus A / P / R8 (H1N1) are shown.
  • 2 shows the time course of antigen-specific serum antibody titers in cynomolgus monkey serum immunized with SV + 3K3 or SV + K3-SPG.
  • FIG. 6 shows cytokine production specifically induced by RSV F antigen stimulation in mice vaccinated with K3 or K3-LNT or K3-SPG supplemented RSV F subunit vaccine.
  • the protection effect of RSV infection is shown in cotton rats inoculated with a K3 or K3-LNT or K3-SPG-added RSV F subunit vaccine.
  • the present invention provides an oligodeoxynucleotide (hereinafter referred to as the oligodeoxynucleotide of the present invention) containing K-type CpG oligodeoxynucleotide and polydeoxyadenylic acid (dA).
  • the oligodeoxynucleotides of the present invention include those in which phosphodiester bonds are modified (for example, some or all of the phosphodiester bonds are replaced by phosphorothioate bonds).
  • the oligodeoxynucleotides of the present invention include pharmaceutically acceptable salts.
  • oligodeoxynucleotide and ODN are synonymous.
  • humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN) and “humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN) residue” are synonymous with or without the term “residue” at the end. Yes, used interchangeably.
  • polydeoxyadenylic acid and polydeoxyadenosine acid (residue) are synonymous.
  • CpG ODN humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide
  • CpG ODN CpG oligodeoxynucleotide
  • K type also called B type
  • D type also called A type
  • C type and P type which have different skeletal sequences and immunostimulatory properties (Advanced drug delivery reviews 61 , 195-204 (2009)).
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention contains K-type CpG ODN.
  • K-type CpG ODN contains multiple unmethylated CpG motifs, typically non-palindromic, and activates B cells to produce IL-6, but plasmacytoid dendritic cells (pDCs) It is a CpG ODN having structural and functional properties that hardly induce IFN- ⁇ production.
  • An unmethylated CpG motif refers to a short nucleotide sequence comprising at least one cytosine (C) -guanine (G) sequence, wherein the cytosine 5-position in the cytosine-guanine sequence is not methylated.
  • CpG means unmethylated CpG unless otherwise specified.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention contains K-type CpG ODN to activate the immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN (for example, B cells (preferably human B cells) to activate IL-6). Activity).
  • K-type CpG ODN to activate the immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN
  • B cells preferably human B cells
  • IL-6 IL-6
  • Numerous humanized K-type CpG ODNs are known in the art (Journal of immunology 166,2-22372-2377 (2001); Journal of immunology 164, 944-953 (2000); US 8, 030, 2852B2) .
  • the K-type CpG ODN contained in the oligodeoxynucleotide of the present invention is preferably humanized.
  • “Humanized” means having agonist activity against human TLR9. Therefore, the oligodeoxynucleotide of the present invention containing humanized K-type CpG ODN has an immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ODN (for example, the activity of activating human B cells to produce IL-6)
  • the K-type CpG ODN preferably used in the present invention has a length of 10 nucleotides or more and has the formula:
  • N 1 , N 2 , N 3 , N 4 , N 5 and N 6 can be any nucleotide
  • the K-type CpG ODN of the present invention is 10 nucleotides or more in length and comprises a nucleotide sequence of the above formula.
  • the central 4-base CpG motif (TCpGW) may be contained in 10 nucleotides and does not necessarily need to be located between N 3 and N 4 in the above formula.
  • N 1 , N 2 , N 3 , N 4 , N 5 and N 6 may be any nucleotide
  • a combination of at least one of N 4 and N 5 , and N 5 and N 6 (preferably one) may be a CpG motif having 2 bases.
  • any two consecutive bases in the central 4 bases (4th to 7th bases) are CpG motifs, The other two bases can be any nucleotide.
  • the K-type CpG ODN used more preferably in the present invention contains a non-palindrome structure containing one or more CpG motifs. Further preferably used K-type CpG ODN has a non-palindrome structure containing one or more CpG motifs.
  • Humanized K-type CpG ODN is generally characterized by a 4-base CpG motif consisting of TCGA or TCGT. In many cases, two or three CpG motifs of 4 bases are contained in one humanized K-type CpG ODN. Therefore, in a preferred embodiment, the K-type CpG ODN contained in the oligodeoxynucleotide of the present invention has a 4-base CpG motif consisting of at least 1, more preferably 2 or more, more preferably 2 or 3, TCGA or TCGT. Including. When the K-type CpG ODN has 2 or 3 4-base CpG motifs, these 4-base CpG motifs may be the same or different. However, there is no particular limitation as long as it has agonist activity against human TLR9.
  • the K-type CpG ODN contained in the oligodeoxynucleotide of the present invention more preferably comprises the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the length of K-type CpG ODN is particularly limited as long as the oligodeoxynucleotide of the present invention has immunostimulatory activity (for example, the activity of activating B cells (preferably human B cells) to produce IL-6). Although not preferred, it is preferably no more than 100 nucleotides long (eg, 10-75 nucleotides long).
  • the length of K-type CpG ODN is more preferably 50 nucleotides or less (for example, 10-40 nucleotides).
  • the length of K-type CpG ODN is more preferably 30 nucleotides or less (eg, 10-25 nucleotides).
  • the length of K-type CpG ODN is most preferably 12-25 nucleotides in length.
  • the length of polydeoxyadenylic acid (dA) is particularly limited as long as it is long enough to form a triple helical structure with a ⁇ -1,3-glucan (preferably lentinan or schizophyllan) chain
  • a ⁇ -1,3-glucan preferably lentinan or schizophyllan
  • Poly dA forms a stable triple helix structure with ⁇ -1,3-glucan the longer it is, so there is theoretically no upper limit, but if it is too long, the length during the synthesis of oligodeoxynucleotides will vary.
  • the length of poly dA is preferably 20 to 60 nucleotides in length (specifically, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 or 60 nucleotides long), more preferably 30-50 nucleotides long (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41) , 42, 43, 44, 45, 46, 46,
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention has an activity of forming a triple helical structure with two schizophyllan chains.
  • polydeoxyadenylic acid may be expressed as “poly (dA)” or “poly (dA)”.
  • One molecule of the oligodeoxynucleotide of the present invention may contain a plurality of K-type CpG ODN and / or poly dA, but preferably one K-type CpG ODN and poly dA one by one, Most preferably, each of K-type CpGNODN and poly dA consists of one by one.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention is characterized in that poly dA is arranged on the 3 ′ side of K-type CpG ODN.
  • the complex of the present invention (described in detail below) has immunostimulatory activity specific to D-type CpG ODN in addition to the immunostimulatory activity unique to K-type CpG ODN.
  • the K-type CpG ODN and the poly dA may be directly linked by a covalent bond or may be linked via a spacer sequence.
  • spacer sequence is meant a nucleotide sequence comprising one or more nucleotides inserted between two adjacent components.
  • the length of the spacer sequence is such that the complex of the present invention has an immunostimulatory activity (preferably an activity to activate B cells to produce IL-6 and an activity to activate dendritic cells to produce IFN- ⁇ ).
  • it is usually 1 to 10 nucleotides in length, preferably 1 to 5 nucleotides in length, more preferably 1 to 3 nucleotides in length.
  • K-type CpG ODN and poly dA are linked by a direct covalent bond.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention may have an additional nucleotide sequence at its 5 'end and / or 3' end in addition to K-type CpG ODN, poly dA and an optional spacer sequence.
  • the length of the additional nucleotide sequence indicates that the complex of the present invention has an immunostimulatory activity (preferably an activity that activates B cells to produce IL-6, and a dendritic cell that produces IFN- ⁇ . However, it is usually 1 to 10 nucleotides in length, preferably 1 to 5 nucleotides in length, more preferably 1 to 3 nucleotides in length.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention does not contain such additional nucleotide sequences at the 5 'end and / or the 3' end. That is, the oligodeoxynucleotide of the present invention preferably comprises K-type CpGpODN, poly dA and an optional spacer sequence, and more preferably comprises K-type CpG ODN and poly dA.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention consists of K-type CpG ODN (specifically, for example, an oligodeoxynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1) and poly dA, and K-type CpG ODN Is located at the 5 ′ end of the oligodeoxynucleotide and poly dA is located at the 3 ′ end.
  • the oligodeoxynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a length of 20 to 60 nucleotides (more preferably 30 to 50 nucleotides (30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotides long, most preferably 30-45 nucleotides long (30, 31, 32) , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, and 45 nucleotides long)), which is an oligodeoxynucleotide, for example, SEQ ID NO: 2 or 9 It is an oligodeoxynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by ⁇ 12.
  • the total length of the oligodeoxynucleotide of the present invention is usually 30 to 200 nucleotides, preferably 35 to 100 nucleotides, more preferably 40 to 80 nucleotides (specifically, 40, 41, 42, 43, 44, 45).
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention may be appropriately modified so as to be resistant to in vivo degradation (eg, degradation by exo or endonuclease).
  • the modification comprises a phosphorothioate modification or a phosphorodithioate modification. That is, part or all of the phosphodiester bond in the oligodeoxynucleotide of the present invention is substituted by a phosphorothioate bond or a phosphorodithioate bond.
  • the oligodeoxynucleotide of the invention comprises a modification of a phosphodiester bond, more preferably the modification of a phosphodiester bond is non-phosphorothioate linkage (ie, as described in WO 95/26204).
  • One of the bridging oxygen atoms is replaced by a sulfur atom). That is, part or all of the phosphodiester bond in the oligodeoxynucleotide of the present invention is replaced by a phosphorothioate bond.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention preferably contains a modification by phosphorothioate bond or phosphorodithioate bond in K-type CpG ODN, more preferably all of the phosphodiester bonds of K-type CpG ODN are Substituted with a phosphorothioate linkage.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention preferably contains a phosphorothioate bond or a phosphorodithioate bond in poly dA, and more preferably, all of the phosphodiester bond of poly dA is substituted with a phosphorothioate bond. Is done.
  • oligodeoxynucleotides including humanized K-type CpG oligodeoxynucleotides and polydeoxyadenylates of the invention, are replaced with phosphorothioate linkages.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention is 20 to 60 nucleotides long (more preferably 30 to 50 nucleotides long (30,30)) at the 3 ′ end of a humanized K-type CpG oligodeoxynucleotide (eg, SEQ ID NO: 1).
  • the phosphorothioate bond in the oligodeoxynucleotide of the present invention, not only the resistance to degradation but also the immunostimulatory activity (for example, the activity of activating B cells to produce IL-6), and CpG- ⁇ -1 Therefore, a high yield of 3-glucan complex is expected.
  • the phosphorothioate bond is synonymous with the phosphorothioate skeleton
  • the phosphate diester bond is synonymous with the phosphate skeleton.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention includes all pharmaceutically acceptable salts, esters, or salts of such esters of the above oligodeoxynucleotide.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the oligodeoxynucleotide of the present invention are preferably alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, aluminum Metal salts such as salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts; inorganic salts such as ammonium salts, t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl esters Salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N, N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine Salt, piperazine salt Amine salts such as
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention may be in any form of single strand, double strand, and triple strand, but is preferably single strand.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention is preferably isolated. “Isolated” means that an operation to remove factors other than the target component has been performed, and that the naturally occurring state has been removed.
  • the purity of the “isolated oligodeoxynucleotide” (percentage of the desired oligodeoxynucleotide weight in the total weight of the evaluation object) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, More preferably, it is 99% or more.
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention has excellent immunostimulatory activity (for example, the activity of activating B cells (preferably human B cells) to produce IL-6), and thus is useful as an immunostimulator or the like. . Furthermore, since the oligodeoxynucleotide of the present invention has the property of forming a triple helical structure with two ⁇ -1,3-glucans (preferably lentinan, schizophyllan, or scleroglucan), Useful for the preparation of complexes.
  • the present invention provides a complex containing the oligodeoxynucleotide of the present invention and ⁇ -1,3-glucan (hereinafter referred to as the complex of the present invention).
  • the oligodeoxynucleotide of the present invention described above contains K-type CpG ODN, it alone activates an immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN (for example, B cells (preferably human B cells) to activate IL). -6), and the immunostimulatory activity peculiar to D-type CpG ODN (for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells to produce IFN- ⁇ ) is poor.
  • K-type CpG ODN for example, B cells (preferably human B cells) to activate IL.
  • D-type CpG ODN for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells to produce IFN- ⁇
  • ⁇ -1,3-glucan preferably lentinan or schizophyllan
  • Immunostimulatory activity for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells to produce IFN- ⁇
  • the complex of the present invention has an immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN (for example, an activity that activates B cells (preferably human B cells) to produce IL-6) and D-type CpG ODN.
  • Specific immunostimulatory activity for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells (preferably human plasmacytoid dendritic cells) to produce IFN- ⁇ ).
  • ⁇ -1,3-glucan examples include lentinan, schizophyllan, scleroglucan, curdlan, parkan, glyphoran, laminaran and the like.
  • ⁇ -1,3-glucan preferably contains a large amount of 1,6-glucopyranoside branches (side chain ratio 33 to 40%), such as lentinan, schizophyllan or scleroglucan. More preferably, it is lentinan or schizophyllan, and most preferably lentinan.
  • Lentinan is a known ⁇ -1,3-1,6-glucan derived from shiitake mushroom, has a molecular formula of (C 6 H 10 O 5 ) n, and a molecular weight of about 300 to 700,000. It hardly dissolves in water, methanol, ethanol (95), or acetone, but dissolves in polar organic solvents such as DMSO and aqueous sodium hydroxide.
  • Lentinan has an effect of enhancing activated macrophages, killer T cells, natural killer cells and antibody-dependent macrophage-mediated cytotoxicity (ADMC) activity (Hamuro, J., et al .: Immunology, 39, 551-559, 1980, Hamuro, J., et al .: Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980, Herlyn, D., et al .: Gann, 76, 37-42, 1985).
  • ADMC antibody-dependent macrophage-mediated cytotoxicity
  • Schizophyllan is a known soluble ⁇ -glucan derived from Shirohirotake.
  • SPG consists of a ⁇ - (1 ⁇ 3) -D-glucan main chain and one ⁇ - (1 ⁇ 6) -D-glucosyl side chain for each three glucoses (Tabata, K., Ito , W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A., “Carbohydr. Res.”, 1981, 89, 1, p.121-135).
  • SPG has been used for more than 20 years as a clinical drug for intramuscular injection of immunity enhancement for gynecological cancers (Shimizu, Zhao Chen, Hagumi, Masumasa, “Biotherapy”, 1990, 4, p.1390 Hasegawa, “Oncology” and Chemotherapy ”, 1992, 8, p.225), in-vivo safety has been confirmed (Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,“ J. Am. Chem. Soc. ”, 1998, 120, p.6909).
  • complex refers to a product obtained by association of a plurality of molecules through non-covalent or covalent bonds such as electrostatic bonds, van der Waals bonds, hydrogen bonds, and hydrophobic interactions. Means.
  • the complex of the present invention preferably has a triple helical structure.
  • two of the three strands forming the triple helix structure are ⁇ -1,3-glucan chains, and one is the polydeoxyadenylic acid in the oligodeoxynucleotide of the present invention. Is a chain.
  • the complex may partially include a portion that does not form a triple helical structure.
  • composition ratio of oligodeoxynucleotide and ⁇ -1,3-glucan in the complex of the present invention depends on the chain length of polydeoxyadenylic acid in the oligodeoxynucleotide, the length of ⁇ -1,3-glucan, etc. Can change. For example, when the ⁇ -1,3-glucan chain and the polydeoxyadenylic acid chain have the same length, two ⁇ -1,3-glucan chains and one oligodeoxynucleotide of the present invention are used. Can associate to form a triple helix structure.
  • a plurality of oligodeoxy groups of the present invention can be used for two ⁇ -1,3-glucan chains.
  • Nucleotides can associate through polydeoxyadenylate to form a triple helix structure (see FIG. 1).
  • the complex of the present invention is a complex containing humanized K-type CpG ODN and ⁇ -1,3-glucan (eg, lentinan, schizophyllan, scleroglucan, curdlan, perchiman, glyphoran, laminaran), preferably Is a complex composed of humanized K-type CpG ODN and ⁇ -1,3-glucan (eg, lentinan, schizophyllan, scleroglucan).
  • humanized K-type CpG ODN and ⁇ -1,3-glucan eg, lentinan, schizophyllan, scleroglucan
  • the oligodeoxynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a length of 20 to 60 nucleotides (specifically, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 or 60 nucleotides in length) and oligodeoxynucleotides in which all of the phosphodiester bonds are replaced with phosphorothioate bonds, and ⁇ -1, A complex (eg, K3-dA20-60-LNT, K3-dA20-60-SPG) composed of 3-glucan (eg, lentinan, schizophyllan), more preferably from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a complex eg, K3-dA20-60-LNT, K
  • nucleotides on the 3 'side of the oligodeoxynucleotide (specifically 30, 3031, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotides long) binds, and all of the phosphodiester bonds are replaced with phosphorothioate bonds
  • ⁇ -1,3-glucan which originally exists as a triple helix structure in nature, is converted into an aprotic organic polar solvent (dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile, acetone, etc.) or an alkaline aqueous solution (sodium hydroxide, potassium hydroxide).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • acetonitrile acetone
  • alkaline aqueous solution sodium hydroxide, potassium hydroxide
  • the solution of the single-stranded ⁇ -1,3-glucan thus obtained and the oligodeoxynucleotide solution of the present invention aqueous solution, buffer solution having a pH near neutral, or acidic buffer solution, preferably Aqueous solution or a buffered aqueous solution having a pH near neutral
  • the complex of the present invention is formed by the two ⁇ -1,3-glucan chains and the poly dA chain in the oligodeoxynucleotide forming a triple helical structure.
  • the complex By performing purification by size exclusion chromatography, ultrafiltration, dialysis and the like on the produced complex, oligodeoxynucleotides not formed in the complex can be removed. Further, the resulting complex can be purified by anion exchange chromatography to remove ⁇ -1,3-glucan from which the complex has not been formed. By the above method, the complex can be appropriately purified.
  • the complex of the present invention can be formed by measuring, for example, conformational change by CD (circular dichroism) spectrum, UV absorption shift by size exclusion chromatography, gel electrophoresis, microchip electrophoresis, capillary electrophoresis. Although it can confirm, it is not restricted to this.
  • CD circular dichroism
  • the mixing ratio of the oligodeoxynucleotide of the present invention and ⁇ -1,3-glucan can be appropriately set in consideration of the length of the poly dA chain and the like, but usually the molar ratio (SPG / ODN) is 0.02 to 2.0, preferably 0.1 to 0.5. In a further embodiment, the molar ratio ( ⁇ -1,3-glucan (such as LNT) / ODN) is for example 0.005-1.0, preferably 0.020-0.25.
  • LNT is dissolved in 0.05 to 2N, preferably 0.1 to 1.5N alkaline aqueous solution (for example, 0.25N sodium hydroxide aqueous solution) and left at 1 ° C to 40 ° C for 10 hours to 4 days (for example, Allow to stand overnight at room temperature) to prepare a single stranded LNT aqueous solution (eg 50 mg / ml LNT aqueous solution).
  • alkaline aqueous solution for example, 0.25N sodium hydroxide aqueous solution
  • the LNT aqueous solution and a separately prepared CpG aqueous solution are mixed at a molar ratio (LNT / ODN) of 0.005 to 1.0, and then the LNT aqueous solution is mixed with an acidic buffered aqueous solution (for example, NaH 2 PO 4 ) To neutralize and maintain at 1-40 ° C. for 6 hours to 4 days (eg, overnight at 4 ° C.) to complete the complexation.
  • an LNT aqueous solution may be added and mixed at the end for the complexation. Complex formation can be confirmed, for example, by using size exclusion chromatography and monitoring the absorption of CpG ODN toward high molecular weights at 240-280 nm (eg, 260 nm).
  • the composite of the present invention takes the form of bowl-like particles.
  • the particle size is the same as the particle size of ⁇ -1,3-glucan (eg, schizophyllan) used as a material and forms a natural triple-helical structure.
  • the average particle size is usually 10-100 nm, preferably Is 20-50 nm.
  • the particle diameter can be measured by a dynamic light scattering method at 80 ° C. using a Malvern® Instruments® Zeta® Sizer after dissolving the complex in water.
  • the complex of the present invention is preferably isolated.
  • the purity of the “isolated complex” (percentage of the target complex weight in the total weight of the object to be evaluated) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably Is over 99%.
  • the complex of the present invention has excellent immunostimulatory activity, and in particular, activates the immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN (for example, activates B cells (preferably human B cells) to produce IL-6) And the immunostimulatory activity unique to D-type CpG ODN (for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells (preferably human plasmacytoid dendritic cells) to produce IFN- ⁇ ) Therefore, it is useful as an immunostimulator.
  • K-type CpG ODN for example, activates B cells (preferably human B cells) to produce IL-6
  • D-type CpG ODN for example, the activity of activating plasmacytoid dendritic cells (preferably human plasmacytoid dendritic cells) to produce IFN- ⁇
  • a complex containing K-type CpG ODN for example, SEQ ID NO: 2, 11, 12
  • LNT K3-LNT
  • K-type CpG ODN for example, SEQ ID NO: 2
  • K3-SPG SPG
  • Inflammatory response-inducing ability pan-IFN-a, IL-6, etc.
  • serum antigen-specific IgG antibody titer total IgG, IgG2c, etc.
  • antigen-specific in virus-inoculated individuals Has cytokine-producing ability (IFN- ⁇ , IL2, etc.) and infection-protecting effect against viruses.
  • K3-LNT also has the ability to enhance the production of Th2-type cytokines (IL-13 etc.) in virus-inoculated individuals. Therefore, it is useful as a novel vaccine adjuvant candidate.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the oligodeoxynucleotide of the present invention or the complex of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by formulating the oligodeoxynucleotide of the present invention or the complex of the present invention according to conventional means.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may further contain an antigen.
  • Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving or suspending the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention in a sterile aqueous solvent usually used for injection.
  • the aqueous solvent for injection include distilled water; physiological saline; phosphate buffer, carbonate buffer, Tris buffer, acetate buffer, and other buffer solutions.
  • the pH of such an aqueous solvent is 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a powder formulation of the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention can also be prepared by subjecting the suspension of the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention to a treatment such as vacuum drying or freeze drying.
  • the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention can be stored in a powder state, and can be used by dispersing the powder with an aqueous solvent for injection at the time of use.
  • the content of the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention in the pharmaceutical composition is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 1 to 99% by weight, more preferably about 10 to 90% by weight of the whole pharmaceutical composition. About%.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention alone as an active ingredient, and contains the oligodeoxynucleotide or complex of the present invention in combination with other active ingredients. It may be.
  • the oligodeoxynucleotide and complex of the present invention have excellent immunostimulatory activity
  • the oligodeoxynucleotide, complex and pharmaceutical composition of the present invention can be used as an immunostimulator.
  • a mammal a primate such as a human, a rodent such as a mouse
  • an immune reaction in the mammal can be induced.
  • the complex of the present invention has the activity characteristics of D-type CpG ODN and stimulates peripheral blood mononuclear cells to give type I interferons (Pan-IFN- ⁇ , IFN- ⁇ 2, etc.) and type II interferons ( Since both IFN- ⁇ ) are produced in large quantities, they are useful as type I interferon production inducers, type II interferon production inducers, type I and type II interferon production inducers. Since it induces the production of both type I and type II interferons, the complex of the present invention and the pharmaceutical composition containing the same can prevent or prevent diseases in which one or both of type I and type II interferons are effective. Useful for treatment.
  • diseases for which type I interferon is effective include viral infections (for example, hepatitis C virus (HCV), herpes virus, papilloma virus, RS virus, influenza virus, etc.), cancer and the like.
  • diseases for which type II interferon is effective include allergic diseases, infectious diseases such as intracellular parasitic protozoa (Leishmania, etc.) and bacteria (Listeria, Mycobacterium tuberculosis, etc.).
  • HCV hepatitis C virus
  • RS virus herpes virus
  • papilloma virus papilloma virus
  • RS virus papilloma virus
  • influenza virus hepatitis virus
  • cancer and the like examples include allergic diseases, infectious diseases such as intracellular parasitic protozoa (Leishmania, etc.) and bacteria (Listeria, Mycobacterium tuberculosis, etc.).
  • infectious diseases such as intracellular parasitic protozoa (Leishmania, etc.) and bacteria (Listeria, Mycobacterium tub
  • the oligodeoxynucleotide and complex of the present invention has potent vaccine adjuvant activity, and when the oligodeoxynucleotide and complex of the present invention are administered together with an antigen to a mammal, An immune response against the antigen can be strongly induced. Therefore, the present invention also provides a composition for inducing an immune response against the antigen, comprising (a) the oligodeoxynucleotide of the present invention or the complex of the present invention, and (b) the antigen. .
  • the complex of the present invention strongly induces both a humoral immune response (antigen-specific antibody production) and a cellular immune response (antigen-specific CTL induction) to an antigen.
  • the oligodeoxynucleotides, conjugates, and pharmaceutical compositions of the present invention are useful as vaccine adjuvants.
  • an adjuvant is an auxiliary agent that promotes an immune response, and means a substance that nonspecifically enhances the immune response to an antigen when administered to a living body together with the antigen.
  • Antigens are antigenic for mammals to be administered (primates such as humans, rodents such as mice), and antibodies or cytotoxic T lymphocytes (CTL, CD8 + T cells)
  • the substance is not particularly limited as long as it can be recognized as an antigen. Any substance (protein, peptide, nucleic acid, lipid, carbohydrate, and modified substance of the substance (for example, deletion of one or more amino acids) is used. , Substitutions, and / or additions (hereinafter referred to as mutations, etc.) can be used as antigens such as antigens derived from pathogens such as protozoa, fungi, bacteria, viruses, cancer, or specific Antigens associated with the disease can also be used.
  • antigen A is derived from pathogen X
  • antigen A is included in pathogen X as a constituent factor.
  • antigen A is a polypeptide
  • it means that the amino acid sequence of the polypeptide is present in the amino acid sequence of the protein encoded in the genome of pathogen X.
  • pathogen-derived antigen examples include the pathogen itself or a part thereof, an inactivated or attenuated pathogen itself or a part thereof, or a modified form in which a mutation or the like is introduced.
  • the composition for inducing an immune response against an antigen comprising (a) the oligodeoxynucleotide of the present invention or the complex of the present invention, and (b) the antigen derived from the pathogen, prevents or treats the pathogen Useful for.
  • the complex of the present invention strongly induces both a humoral immune response (antigen-specific antibody production) to an antigen and a cellular immune response (antigen-specific CTL induction). Therefore, antigens derived from intracellular infectious pathogens (viruses, protozoa, fungi, bacteria, etc.) known to be recognized by cytotoxic T lymphocytes, and antigens related to cancerous cells (for example, Tumor antigens) and the like are preferably used as the antigen.
  • intracellular infectious virus RS virus, influenza virus, parainfluenza virus, hepatitis C virus (HCV), hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), Ebola virus, Cytomegalovirus, adenovirus, poliovirus, Japanese encephalitis virus, measles virus, mumps virus, rubella virus, rabies virus, yellow fever virus, varicella-zoster virus, hantavirus, dengue virus, norovirus, rotavirus, parvovirus, coronavirus , Distemper virus, adult T cell leukemia virus (HTLV-1), human immunodeficiency virus (HIV), herpes virus, papilloma virus and the like.
  • intracellular infectious bacteria include mycoplasma.
  • intracellular infectious protozoa include malaria parasites and schistosomes.
  • the intracellular infectious agent is preferably a virus (specifically, RS virus or influenza virus).
  • antigens associated with cancerous cells include proteins, sugar chains, peptides that are specifically expressed in cancerous cells, and mutants (deletions, substitutions, and / or additions) of the above substances, or modifications thereof. Is mentioned.
  • the virus is a virus that causes an acute viral infection in which both type I and type II interferons are effective (eg, RS virus, influenza virus).
  • a composition for inducing an immune response to the antigen comprising (a) an oligodeoxynucleotide of the present invention or a complex of the present invention, and (b) an antigen derived from a cormorant pathogen or cancer.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • the complex of the present invention can strongly induce both humoral immune reaction (antigen-specific antibody production) and cellular immune reaction (antigen-specific CTL induction) against an antigen. It is also possible to use either surface antigens or internal antigens of cancer cells, and it is also desirable to use a mixture of surface antigens and internal antigens.
  • a composition for inducing an immune response to the antigen comprising (a) the oligodeoxynucleotide of the present invention or the complex of the present invention, and (b) the antigen is prepared according to the pharmaceutical composition of the present invention. can do.
  • K3-dA40 SEQ ID NO: 2
  • K3-dA35 SEQ ID NO: 12
  • K3-dA30 SEQ ID NO: 11
  • K3-dA25 SEQ ID NO: 10
  • K3-dA20 SEQ ID NO: 9
  • This oligodeoxynucleotide is prepared using the conventional solid-phase phosphoramidite method (Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press). Synthesized.
  • Table 3 shows the molecular weight of CpG ODN shown in Table 2 and the retention time when analyzed by reverse-phase HPLC under the following conditions (column: Waters, X-Bridge C18 2.5 ⁇ m, 4.6 x 75 mm, A solution: 100 mM hexafluoroisopropanol, 8 mM triethylamine, B solution: methanol, B%: 5% ⁇ 30% (20 min, linear gradient); 60 ° C;
  • Ovalbumin was purchased from Seikagaku Corporation. DQ-OVA, Alexa488-OVA, CFSE, and Lipofectamine® 2000 were purchased from Invitrogen. Hoechst33258, zymozan and curdlan were purchased from SIGMA. Zymosan-Depleted was purchased from Invivogen. Clodronate liposomes were purchased from FormuMax. Influenza split product vaccine, formalin inactivated whole virus (WIV), and purified influenza virus (H1N1) were prepared as previously described (Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010) ).
  • K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA40 (SEQ ID NO: 2 )
  • K3-dA20 (SEQ ID NO: 9), K3-dA25 (SEQ ID NO: 10), K3-dA30 (SEQ ID NO: 11), K3-dA35 (SEQ ID NO: 12), K3-dA40 (SEQ ID NO: 2 )
  • Table 4 Were mixed at the ratios shown in Table 4, followed by the addition of 330 mM NaH 2 PO 4 in the same volume as the added LNT and maintained at 4 ° C. overnight to complete the complexation.
  • PBMCs Preparation and stimulation of human PBMCs ( Figures 2, 3, 6, 7) PBMCs were obtained from three healthy adult male volunteers (aged 30-40). All studies using human PBMCs were approved by the Institutional Review Board of the National Institute of Pharmaceutical Sciences. PBMCs were prepared using Ficoll and then seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / ml. PBMCs were maintained in complete RPMI (RPMI 1640 supplemented with 10% FCS, penicillin, and streptomycin).
  • PBMCs PBMCs, K3 (0.24, 0.74, 2.2, 6.6, 20 ⁇ g / mL), K3-dA40, K3-SPG (K3-dA40 complex), dA40-K3, SPG-K3 (dA40-K3 complex) , D35, CpG21798, CpG21889, CpG2395, or M362 for 24 hours.
  • the supernatant was subjected to ELISA for pan-IFN- ⁇ (Mabtech), IL-6 (R & D), and Milliplex (Millipore).
  • Electron microscope analysis Prior to staining, the sample was dropped onto a formvar-carbon coated grip. For negative staining, a 2% uranium acetate (pH 4.0) droplet was placed on the grip and allowed to air dry. The grip was observed on an electron microscope (Hitachi H-7650) at a magnification of 40,000 times.
  • Spleen cell and dendritic cell culture (FIGS. 8 and 9) Mouse spleens were collected from 6-week-old C57BL / 6J mice, Tlr9-deficient mice, and Dectin-1 deficient mice. After spleen cells were suspended, red blood cells (RBCs) were lysed with ACK lysis buffer and the cells were maintained in complete RPMI. Cells were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / mL. Bone marrow derived DCs were generated by culturing mouse bone marrow derived cells with human Flt3L (Peprotech) (100 ng / mL) for 7 days.
  • RBCs red blood cells
  • ACK lysis buffer ACK lysis buffer
  • Cells were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • Bone marrow derived DCs were generated by culturing mouse bone marrow derived cells with human Flt3L (Peprotech) (
  • BMDMs were generated by culturing with mouse M-CSF (Peprotech) (20 ng / mL) for 7 days. These cells were maintained in complete RPMI.
  • BMDMs at 5 x 10 7 cells / mL, Alexa 488-K3 (1 ⁇ M) and Alexa 647-K3-SPG (1 ⁇ M), or Alexa 488-D35 (1 ⁇ M) and Alexa 647-K3-SPG (1 ⁇ M) for 3 hours.
  • the nuclei were visualized by staining the cells with Hoechst33258 for 30 minutes, then the cells were fixed and analyzed using a fluorescence microscope.
  • OVA 0.1, 1, 10, or 100 ⁇ g
  • OVA (0.37, 1.1, 3.3, or 10 ⁇ g) and K3 538 pmol
  • OVA (0.37, 1.1, 3.3, or 10 ⁇ g) and K3-dA40 538 pmol
  • OVA (0.37, 1.1, 3.3, or 10 ⁇ g) and K3-SPG (538 pmol) was administered on day 0 and day 10.
  • OVA257-264 (OVA257): SIINFEKL (10 ⁇ g / mL); OVA323-339 (OVA323): ISQAVHAAHAEINEAGR (10 ⁇ g / mL); Total OVA protein (OVA) (10 ⁇ g / mL); NP260-283 (NP260): ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 ⁇ g / mL); or split vaccine (10 ⁇ g / mL) For 24 or 48 hours. The supernatant was subjected to ELISA for mouse IFN- ⁇ (FIGS. 11, 15b, 17, 26, 28b, 30, 43b).
  • splenocytes were analyzed using H-2Kb OVA tetramer (MBL), anti-CD8 ⁇ (KT15), anti-TCR ⁇ (H57-597), anti-CD62L (MEL-14), and anti-CD44 (IM7) antibodies, and 7- Stained with AAD.
  • MBL H-2Kb OVA tetramer
  • KT15 anti-CD8 ⁇
  • TCR ⁇ H57-597
  • MEL-14 anti-CD62L
  • IM7 anti-CD44
  • OVA257 (10 ⁇ g); OVA257 and K3 (10 ⁇ g); OVA257 and K3-dA40 (10 ⁇ g); or OVA257 and K3-SPG (10 ⁇ g) Immunized with. Seven days after immunization, splenocytes were prepared and stained with H-2Kb OVA tetramer, anti-CD8 ⁇ , anti-TCR ⁇ , anti-CD62L and anti-CD44 antibodies. The number of OVA tetramers + CD44 + CD8 ⁇ + TCR ⁇ + cells was analyzed by FACS (FIG. 14 left).
  • the prepared splenocytes were restimulated in vitro with OVA257 (10 ⁇ g / mL) and Golgi Plug for 4 hours.
  • Cells anti IFN-gamma, stained with anti-CD8a, and anti-CD3e antibodies were measured IFN- ⁇ + CD8 ⁇ + CD3e + cell number with FACS (FIG. 14 right).
  • HEK293 was transfected with empty, Dectin-1 or Dectin-2 expression plasmids using Lipofectamine 2000. Forty-eight hours after transfection, cells were treated with FITC-SPG (0.5 ⁇ M), Alexa 488-labeled K3-dA40 (0.5 ⁇ M), or Alexa 488-labeled K3-SPG (0.5 ⁇ M) at 37 ° C, 60 ° C. Treated for minutes. After the treatment, the cells were collected, and SPG or CpG ODN positive cells were analyzed by FACS.
  • splenocytes from C57BL / 6J mice or Dectin-1 deficient mice were Zymosan-Depleted (100, 33.3, or 11.1 ⁇ g / mL) in the presence or absence of D35 (1 ⁇ M). Or stimulated with SPG (100, 33.3, or 11.1 ⁇ g / mL) for 24 hours.
  • the supernatant was subjected to ELISA for IFN- ⁇ (PBL), IL-6 (R & D), IL-12 p40 (R & D), IL-12 p70 (R & D), and Bioplex (BIO-RAD).
  • iLNs were incubated with collagenase D (1 mg / mL) and DNase I (0.1 mg / mL) at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the prepared cells were incubated with anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD8 ⁇ (56-6.7), and anti-CD11c antibodies to separate different DC populations. Intracellular uptake of OVA and CpG ODNs was analyzed by FACS.
  • Clodronate liposome injection ( Figure 37) Clodronate liposomes were administered to the base of the tail of 6-week-old C57BL / 6J mice either 5 days or 2 days before immunization. On day 0, mice were immunized at the ridge with OVA and K3-SPG. On day 8, blood and spleen were collected and serum antibody titer and T cell response were measured by ELISA.
  • K3 (10 ⁇ g) or K3-SPG (10 ⁇ g) was administered to the base of the tail of C57BL / 6J mice or Tlr9-deficient mice. 24 hours after administration, iLNs were prepared as described above. Cells were incubated with anti-CD11c, anti-mPDCA-1 (JF05-1C2.4.1), anti-CD8 ⁇ , and anti-CD40 (3/23) antibodies and analyzed by FACS.
  • Cynomolgus monkey vaccine model ( Figures 41 and 42) Into the cynomolgus monkey subcutaneously, Influenza split vaccine (5 ⁇ g) and K3 (5 nmol); or split vaccine and K3-SPG (5 nmol) was administered on day 0 and day 14. Blood samples were taken at -2, 2, 4, 6, 8, and 110 weeks and serum antibody titers were measured by ELISA.
  • K3-SPG cage-like nano-sized particles acquire two characteristics of K-type and D-type CpG ODN.
  • better conjugation efficiency between CpG ODN and SPG requires additional sequence of the PS backbone of poly dA40 at the 5 ′ end or 3 ′ end through a denaturation-restoration procedure ( Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)).
  • the present inventors examined the influence on the immunostimulation of the 5 ′ end and 3 ′ end of CpG ODN.
  • 5'-K3-dA40-3 'complexed with SPG activates human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and produces large amounts of IFN- ⁇ This was not the case with 5′-dA40-K3-3 ′ (FIGS. 2 and 3).
  • K3, K3-dA40 and dA40-K3 can activate human PBMCs to produce other cytokines such as IL-6, but not IFN- ⁇ (FIG. 2, FIG. 3).
  • K3-SPG had a ⁇ -like structure and was consistent with that seen in previous reports (Bae, A.H., et al., Carbohydrate research 339, 251-258 (2004)) ( Figure 4). It is recognized as a soluble monomeric nanoparticle with an average diameter of 30 nm, equivalent to SPG itself, and smaller than D-type CpG ODN (D35) (Fig. 5) (Klein, DC et al ., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, LT, et al., Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)).
  • K3-SPG forms nanoparticles
  • the immunostimulatory activity of K3-SPG was compared with C, D and P-type CpG-ODN.
  • PBMCs stimulated with K3-SPG produced large amounts of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ , but much lower than that induced by D35 (Figure 6), P-type and C-type CpG-ODN ( Figure 7) IFN- ⁇ was produced upon stimulation with concentration. Since these IFNs are known to be D-type specific cytokines (Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M.
  • K3-SPG impairs K-type characteristics This suggests that the characteristics of D-type CpG-ODN were acquired.
  • the present inventors analyzed the subcellular localization of K3-SPG in bone marrow-derived macrophages.
  • K3-SPG like C-type CpG ODN (Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999-2008 (2006)), is not only an endosome containing K-type CpG ODN, Co-localized with endosomes containing type CpG ODN (Figs.
  • K3-SPG may have transmitted endosome-mediated innate immune signal system by K-type and D-type CpG ODN It was.
  • K3-SPG is an excellent vaccine adjuvant that induces a strong CTL response to protein antigens without conjugation.
  • K3-SPG has a significantly higher humoral immune response (FIG. 10) and more potent than that induced by K3.
  • tetramer assay revealed that K3-SPG induced more OVA-specific CD8T cells (FIG. 12).
  • SPG is a soluble Dectin-1 ligand, but not a Dectin-1 agonist.
  • Dectin-1 has been shown to be a receptor for ⁇ -glucans such as zymozan (Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004)), so SPG and K3-SPG
  • the role of Dectin-1 in cell uptake and subsequent activation by SPG and K3-SPG was investigated. Using flow cytometry, we found that uptake of SPG or K3-SPG increased in vitro in HEK293 cells expressing Dectin-1, but not in Dectin-2 or control vectors, regardless of the presence of ODN. (FIGS. 18 and 19).
  • Cytokine production by zymosan and curdlan was independent of Dectin-1.
  • Zymosan-Depleted inhibited IFN- ⁇ induced by CpG ODN, but this inhibition was mitigated by Dectin-1 deficiency (FIG. 22).
  • SPG did not inhibit IFN- ⁇ induced by CpG ODN (FIG. 23).
  • K3-SPG The adjuvant effect of K3-SPG depends on TLR9 and partially depends on Dectin-1. Since K3-SPG is a complex of CpG ODN and ⁇ -glucan, TLR9 (Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000)) and Dectin-1 (Saijo, S., et al. al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)) was investigated using receptor knockout mice. When spleen cells and Flt3-ligand-induced bone marrow-derived DCs (FL-DCs) from Tlr9-deficient mice and Dectin-1-deficient mice were stimulated with K3-SPG, cytokine production was completely TLR9-dependent.
  • FL-DCs Flt3-ligand-induced bone marrow-derived DCs
  • MARCO + macrophages in the draining lymph nodes preferentially capture K3-SPG along with antigen, but not Siglec-1 + macrophages. Since K3-SPG provides a strong adjuvant effect in vivo through immunization with a simple antigen mixture, we hypothesized that cells that capture both antigen and K3-SPG play an important role in mediating the adjuvant effect .
  • a fluorescence microscope and a two-photon microscope were used. Within 1 hour after injection at the base of the tail, antigen and adjuvant reached the draining lymph nodes (iLNs) (FIGS. 32, 33, 35).
  • K3-SPG migrated to the CD3e + T cell region and colocalized with DQ-OVA.
  • K3-SPG targets and potently activates antigen-bearing DC populations in vivo.
  • Our findings suggest that most of the nanoparticulate K3-SPG is taken up by MARCO + macrophages in iLNs after injection, but the adjuvant effect is controlled by DCs.
  • antigen and adjuvant uptake by the DC population was analyzed by flow cytometry.
  • K3-SPG is a powerful adjuvant for influenza vaccines in mouse and non-human primate models.
  • the adjuvant effect of K3-SPG was investigated in mice and non-human primates using a more clinically relevant influenza vaccination model. Mice were immunized with ether-treated hemagglutinin antigen-enriched virion-free split vaccine (SV) and the indicated adjuvant, and K3-SPG showed a better adjuvant effect than K3 when comparing antibody and T cell responses ( (Figure 43).
  • K3-SPG functions as a potent adjuvant for protein or protein-based vaccines in a mouse model.
  • This knowledge was extended to a non-human primate model using cynomolgus monkeys.
  • 3 cynomolgus monkeys in each group were immunized with SV along with K3 or K3-SPG.
  • Serum antibody titers were monitored over 8 weeks.
  • SV and K3-SPG induced significantly higher antibody titers 2 weeks after immunization, which remained high for at least another 6 weeks (FIG. 41).
  • Two years after immunization (110 weeks) the K3-SPG group showed higher antibody titers than the K3 group (FIGS. 42 and 43).
  • K3-SPG is an excellent vaccine adjuvant in non-human primate models.
  • pan-IFN-a and IL-6 production was greater in K3-SPG, a complex of K3 and SPG, and in K3-LNT, a complex of K3 and LNT, compared to K3 alone.
  • K3-SPG a complex of K3 and SPG
  • K3-LNT a complex of K3 and LNT
  • the ability to produce inflammatory cytokines induced by K3-LNTs with different dA tail lengths (dA30, dA35, dA40) may be almost equivalent.
  • K3-SPG and K3-LNT to produce inflammatory cytokines suggested that K3-LNT may have a higher ability to induce pan-IFN-a production than K3-SPG.
  • K3-SPG and K3-LNT were found to be equivalent.
  • Serum RSV F antigen-specific IgG antibody titer in mice vaccinated with K3-LNT and K3-SPG complex-added RSV F subunit vaccine RSV per mouse in the ridge of 7-week-old C57BL / 6 mice F antigen 0.5 ⁇ g and various adjuvants (K3 alone (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT complex (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) and K3 -SPG complex (K3-dA40-SPG), 10 ⁇ g of phosphate alum) was immunized twice at 2-week intervals.
  • RSV F antigen-specific Total IgG induction was enhanced by the addition of adjuvant as compared to the RSV F antigen alone inoculated group (F), and K3 alone (F + K3-dA30, F + K3-dA35, F + K3-dA40), K3-LNT (F + K3-dA30-LNT, F + K3-dA35-LNT, F + K3-dA40-LNT) and K3-SPG complex (F + K3- It was suggested that the adjuvant effect of dA40-SPG) and alum phosphate (F + Alum) may be equivalent.
  • RSV F antigen-specific cytokine production ability in mice vaccinated with K3-LNT and K3-SPG complex-added RSV F subunit vaccine RSV F antigen per mouse at the ridge of 7-week-old C57BL / 6 mice 0.5 ⁇ g and various adjuvants (K3 alone (K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40), K3-LNT (K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT) and K3-SPG complex 10 ⁇ g (K3-dA40-SPG), phosphate alum) was immunized twice at 2-week intervals.
  • spleen cells were prepared. Spleen cells seeded in a 96-well culture plate were stimulated with MHC class I-restricted epitope peptide, MHC class II-restricted epitope peptide of RSV F antigen, and vaccine antigen protein, respectively, and cultured for 24 hours or 48 hours. The ability to produce RSV F antigen-specific cytokines was evaluated using a culture supernatant as a sample and a cytokine ELISA method.
  • cytokines three types were evaluated: IFN-g, a Th1-type cytokine, IL-2 produced from activated T cells, and IL-13, a Th2-type cytokine.
  • IFN-g IFN-g
  • Th1-type cytokine IL-2 produced from activated T cells
  • IL-13 a Th2-type cytokine.
  • the enhancement effect of RSV F antigen-specific IFN-g production induction and IL-2 production induction is K3-LNT (F + K3-dA30-LNT, F + K3-dA35- LNT, F + K3-dA40-LNT) and K3-SPG (F + K3-dA40-SPG) may be equivalent.
  • Synagis (palivizumab) administration group Synagis 2.5 mg / kg was intramuscularly administered one day before the attack infection, and the infection protective ability was evaluated in the same manner as described above.
  • Neutralizing antibody titer was examined using serum obtained by collecting blood from rat jugular vein under anesthesia immediately before challenge infection. The result of the viral load in the lung is shown on the left of FIG. 47, and the result of the neutralizing antibody titer is shown on the right. From the results of intrapulmonary viral load, about 10 5 pfu / lung viral load was observed in the PBS-administered group, whereas the average value was obtained in the group administered FV-Alum phosphate-added RSV F vaccine (F + Alum).
  • the viral load was about 100 times lower.
  • K3-SPG-added vaccine administration group F + K3-dA40-SPG
  • infection defense induction ability was recognized.
  • K3-LNT supplemented vaccine group F + K3-dA35-LNT, F + K3-dA40-LNT
  • the possibility of being a novel vaccine adjuvant candidate that contributes to the ability to protect against infection was suggested.
  • blood neutralizing activity equivalent to that of Synagis was observed in the vaccine-administered group (F + Alum).
  • K3-SPG addition vaccine administration group F + K3-dA40-SPG
  • neutralizing antibodies were hardly induced in 3 out of 4 animals, so the infection protection effect contributed by K3-SPG was moderate.
  • the mechanism was considered to be independent of Japanese antibodies.
  • K3-LNT administration group F + K3-dA35-LNT, F + K3-dA40-LNT
  • a higher neutralizing antibody was observed compared to K3-SPG. It was suggested that may have characteristics different from K3-SPG, for example, Th2 response enhancing ability.
  • an oligodeoxynucleotide having excellent immunostimulatory activity and a complex containing the same are provided.
  • the complex of the present invention has both an immunostimulatory activity peculiar to K-type CpG ODN and an immunostimulatory activity peculiar to D-type CpG ODN.
  • K3-SPG and K3-LNT have a strong vaccine adjuvant activity, and when immunized with K3-SPG or K3-LNT together with an antigen, both antigen-specific humoral immunity and cellular immunity are exhibited. stimulate. Therefore, the complex of the present invention is useful in the pharmaceutical field as an immunostimulant or vaccine adjuvant.

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Abstract

　本発明は、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、該ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3'側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。また、本発明は、前記オリゴデオキシヌクレオチド及びβ－1,3－グルカンを含有する複合体を提供する。

Description

免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途
　本発明は、免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途に関する。詳細には、本発明は、免疫賦活活性を有するCpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）及びβ－グルカンを含有する複合体及びその医薬用途に関する。
　CpGオリゴヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活性のCpGモチーフを含有する、短い（約20塩基対）、一本鎖の合成DNA断片であって、Toll様受容体９（TLR9）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（DCｓ）及びB細胞を活性化して、I型インターフェロン（IFNｓ）及び炎症性サイトカインを産生させ（非特許文献１、２）、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）反応を含む、Th1型の液性及び細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（非特許文献３、４）。そこで、CpG ODNは、感染症、癌、喘息及び花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（非特許文献２、５）。
　骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、少なくとも4つの型のCpG ODNがある（非特許文献６）。D型（A型とも呼ばれる）CpG ODNは、典型的には、ホスホジエステル（PO）骨格及びホスホロチオエート（PS）ポリGテイルと共に1つの回文構造のCpGモチーフを含み、形質細胞様DCs（pDCs）を活性化して大量のIFN-αを産生させるが、pDC成熟化やB細胞活性化を誘導できない（非特許文献７、８）。他の３つの型のODNは、PS骨格からなる。K型（B型とも呼ばれる）CpG ODNは、典型的には、非回文構造の、複数のCpGモチーフを含有し、B細胞を強力に活性化してIL-6を産生させ、pDCsを活性化して成熟化させるが、ほとんどIFN－αを産生しない（非特許文献８、９）。近年、開発されたC型及びP型のCpG ODNはそれぞれ1つ及び2つの回文構造CpG配列を含有しており、双方ともK型の様にB細胞を活性化させ、D型の様にpDCsを活性化させることができるが、P型CpG ODNと比較して、C型CpG ODNは、IFN-α産生をより弱く誘導する（非特許文献１０－１２）。特許文献１に、多数の優れたK型 CpG ODNが記載されている。
　D型及びP型CpG ODNは、G-tetradsと呼ばれる平行4本鎖構造を形成するフーグスティーン塩基対、及びシス回文構造部位とトランス回文構造部位との間のワトソン－クリック塩基対、という高次構造をそれぞれ形成することが示されており、これらはpDCsによる強力なIFN-α産生に必要である（非特許文献１２－１４）。このような高次構造は初期エンドソームへの局在化やTLR9を介する情報伝達に必要であるようだが、これらは産物の多型性及び沈殿の影響を受け、その結果その臨床応用を妨げている（非特許文献１５）。従って、K型及びC型CpG ODNのみが、ヒト用の免疫療法剤及びワクチンアジュバントとして一般的に利用可能である（非特許文献１６及び１７）。K型CpG ODNは、ヒト臨床試験において、感染症及び癌を標的とするワクチンの免疫原性を高めるが（非特許文献６、１６）、最適なアジュバント効果のためには、抗原とK型CpG ODNとの間の化学的及び物理的連結が必要である。これらの結果は、４つの型（K、D、P、及びC）のCpG ODNには長所及び短所があることを示しており、アグリゲーションすることなく、B細胞及びpDCsの両方を活性化する「オール・イン・ワン」CpG ODNの開発が期待されている。
　スエヒロタケ（Schizophyllum commune）由来の可溶性β－1,3－グルカンであるシゾフィラン（SPG）は、子宮頸癌患者における放射線療法の賦活薬として日本においてここ３０年に亘り認可されている医薬である（非特許文献１８）。同様に、シイタケ由来の可溶性β－1,3－グルカンであるレンチナン（LNT）は、１９８５年に承認された医薬であり、手術不能および再発胃癌患者に対しフルオロピリミジン系薬剤との併用で使用されている（非特許文献１９、２０）。β－1,3－グルカンは、ポリデオキシアデニル酸（dA）と三重螺旋構造の複合体を形成することが示されている（非特許文献２１）。
　特許文献２～４には、シゾフィランを含むβ－1,3－グルカンと核酸（遺伝子）との水溶性複合体の遺伝子キャリアとしての使用が開示されている。これらの文献には、該複合体を形成することにより、遺伝子のアンチセンス作用及び核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）への耐性作用が高められることが記載されている。
　特許文献５には、β－1,3－結合を有する多糖類をキャリアー（トランスフェクション剤）として用いることにより、CpG配列を含み、リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの作用が高められることが開示されている。
　特許文献６には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、長鎖のβ－1,6－グルコシド結合側鎖を有するβ－1,3－グルカンとからなることを特徴とする免疫刺激性複合体が記載されている。
　本発明者らは、以前、SPGと複合体化した、５’末端にリン酸ジエステル結合を有するポリ(ｄA)を連結させたマウス及びヒト化したCpG ODNが、サイトカイン産生を増強し、インフルエンザワクチンアジュバントやTh2細胞関連疾患の予防または治療剤として作用することを示した（非特許文献２２、２３、特許文献７）。K型及びD型のそれぞれのCpGの5’末端にポリ（dA）を付加し、SPGと複合体を形成すると、それぞれK型及びD型の特性を維持しつつ、その活性が増強された。しかしながら、より効果的で、費用効率が高い、前臨床及び臨床開発へ向けて、CpG-SPG複合体の高収率を達成することが困難であった。近年、CpG ODNにホスホロチオエート結合を有するポリ(ｄA)を連結すると、複合体形成がほとんど１００％にまで上昇することが示された（非特許文献２４）。しかしながら、最適なヒト化CpG配列を同定し、４つの型のCpG ODNの「オール・イン・ワン」活性を得るための因子を最適化するための綿密な試験はなされていない。
　特許文献８には、抗原／CpGオリゴヌクレオチド／β－1,3－グルカン系の三元複合体の製造方法が開示されている。
US 8,030,285 B2 WO 01/034207 A1 WO 02/072152 A1 特開2004-107272号公報 WO 2004/100965 A1 特開2007-70307号公報 特開2008-100919号公報 特開2010-174107号公報
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　本発明が解決しようとする課題は、従前のCpG-SPG複合体よりも強力な活性を有する免疫賦活剤を提供することである。
　本発明者らは鋭意検討を行ったところ、3’末端にポリ（dA）テイルを有するK型CpG ODNであるK3（配列番号２）及びSPGを含む新規の複合体、即ちK3-SPGを同定した。これは、完全に可溶化することのできる、高次ナノ粒子を形成した。同様に、本発明者らは前記K型CpG ODN及びレンチナン(LNT)を含む新規の複合体K3-LNTの作製にも成功した。K3-SPG, K3-LNTはD型CpG ODN配列を有していないにも係わらず、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）とを併せ持っていた。更に、K3-LNT、及びK3-SPGは強力なワクチンアジュバント活性を有しており、抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導し、実際、RSVウイルス又はインフルエンザウイルスに対し非常に強い感染防御効果を示した。これらの知見に基づいて更に検討を進め、本発明を完成した。
　即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
［２］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、且つ式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、WはA又はTであり、N1、N2、N3、N4、N5及びN6はいかなるヌクレオチドであってもよい）
で表されるヌクレオチド配列を含む、［１］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［３］ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる、［１］又は［２］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［４］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合で置換されている、［１］～［３］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［５］オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、［４］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［６］ポリデオキシアデニル酸の長さが、20～60ヌクレオチド長である、［１］～［５］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ－1, 3－グルカンを含有する複合体。
［８］β－1, 3－グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである［７］に記載の複合体。
［９］β－1, 3－グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである［８］に記載の複合体。
［１０］下記（i）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び（ii）に記載のβ－1, 3－グルカンからなる複合体。
（i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20～60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
（ii）レンチナン又はシゾフィラン
［１１］三重螺旋構造状のものである、［７］～［１０］のいずれかに記載の複合体。
［１２］B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、［７］～［１１］のいずれかに記載の複合体。
［１３］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
［１４］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］ウイルス感染症の予防又は治療のための、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び／又はII型インターフェロン産生誘導剤。
［１８］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
［１９］ワクチンアジュバントである、［１８］の免疫賦活剤。
［２０］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
［２１］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である［２０］に記載の予防又は治療剤。
［２２］医薬組成物の製造のための、［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体の使用。
［２３］医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、［２２］に記載の使用。
［２４］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［２３］に記載の使用。
［２５］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
［２６］疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、［２５］に記載の方法。
［２７］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［２６］に記載の方法。
［２８］温血動物がヒトである、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
［３０］ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体。
［３１］ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、［３０］に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
［３２］(a)［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは［７］～［１２］のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。
［３３］該抗原に対する免疫反応を誘導するための、［３２］に記載の組成物。
［３４］抗原が病原体由来の抗原である、［３３］に記載の組成物。
［３５］病原体の感染症の予防又は治療用である、［３４］に記載の組成物。
［３６］病原体がウイルスである、［３５］に記載の組成物。
［３７］ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、［３６］に記載の組成物。
　本発明により、優れた免疫賦活活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。特に、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、本発明の複合体は強力なワクチンアジュバント活性を有しており、本発明の複合体を抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激し、非常に強い感染防御効果を示す。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして有用である。
CpG ODNとLNT又はSPGの複合体化の方法を示す。 PBMCsのpan-IFN-α産生を示す。 K3、K3-dA40又はK3-SPGで刺激した際にヒトPBMCsから産生されるサイトカインプロファイルを示す。 K3-SPGの走査電子顕微鏡像を示す。 動的光散乱により解析した、K3-SPG、SPG及びD35の粒子サイズを示す。 K3、K3-SPG 又はD35刺激により誘導された、PBMCsのpan-IFN-α、IFN-α2、及びIFN-γ産生を示す。 K3、K3-dA40、K3-SPG、CpG21798（P型CpG ODN）、CpG21889（P）、CpG2395（C）又はM362（C）刺激（0.74、2.2、6.6又は20 μg/ml）により誘導された、ヒトPBMCsのpan-IFN-α及びIL-6産生を示す。 K3-SPGのK型CpG ODN含有エンドソームへの共局在を示す。スケールバーは10μmを示す。この結果は、少なくとも２回の独立した試験における代表的なものである。 K3-SPGのD型CpG ODN含有エンドソームへの共局在を示す。スケールバーは10μmを示す。 OVA単独、OVA+K3、又はOVA+K3-SPGにより免疫したマウスの抗原特異的血清抗体価を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 OVA単独、OVA+K3、又はOVA+K3-SPGにより免疫したマウスの脾細胞の、抗原での再刺激により誘導されたIFNγ産生を示す。 OVA単独、OVA+K3、又はOVA+K3-SPGでの免疫により誘導されたOVA特異的CD8T細胞の割合を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 OVA単独、OVA+K3、OVA+K3-dA40又はOVA+K3-SPGでの免疫により誘導された、インビボOVA特異的CTL活性を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 K3-SPGのペプチドワクチンアジュバント効果を示す。 K3-SPGの用量依存的アジュバント効果を示す。 OVA単独、OVA+K3、又はOVA+K3-SPGにより免疫したマウスの抗原特異的血清抗体価を示す。免疫接種時のOVA用量を各グラフの上に示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 OVA単独、OVA+K3、又はOVA+K3-SPGにより免疫したマウスの脾細胞の、抗原での再刺激により誘導されたIFNγ産生を示す。免疫接種時のOVA用量を各グラフの上に示す。 空（vector）、Dectin-1、又はDectin-2トランスフェクタントへのSPGの結合を示す。 空（vector）、Dectin-1、又はDectin-2トランスフェクタントへのK3又はK3-SPGの結合を示す。 C57BL/6Jマウス又はDectin-1欠損マウス脾細胞の、Zymosan Depleted刺激誘導TNF-α産生を示す。 C57BL/6Jマウス又はDectin-1欠損マウス脾細胞の、SPG刺激誘導TNF-α産生を示す。 C57BL/6Jマウス又はDectin-1欠損マウス脾細胞の、CpG ODN刺激誘導IFN-α産生に対するZymosan Depletedの効果を示す。*p < 0.05 (t-test)。 C57BL/6Jマウス脾細胞の、CpG ODN刺激誘導IFN-α産生に対するSPGの効果を示す。 K3-SPGにより誘導されるサイトカイン産生がTLR9に依存することを示す。a) FL-DCsのIFN-α産生、b) 脾細胞のIL-6及びIL-12 p40産生、c) FL-DCsのIFN-α産生、d) 脾細胞のIL-6及びIL-12 p40産生。 OVA+K3-SPGで免疫したTlr9+/+又はTlr9-/-マウスの抗原特異的血清抗体価を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 OVA+K3-SPGで免疫したTlr9+/+又はTlr9-/-マウスの脾細胞の、抗原での再刺激により誘導されたIFN-γ産生を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 Tlr9+/+又はTlr9-/-マウスをOVA+K3-SPGで免疫することにより誘導されたOVA特異的CD8T細胞の割合を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 K3-SPGのアジュバント効果がDectin-1に依存しないことを示す。a)　血清中の抗原特異的抗体力価。b) 抗原再刺激による脾細胞のIFN-γ産生。c) インビボにて誘導される抗原特異的CD8T細胞の割合。 OVA+K3-SPGで免疫したDectin-1+/-又はDectin-1-/-マウスの抗原特異的血清抗体価を示す。 OVA+K3-SPGで免疫したDectin-1+/-又はDectin-1-/-マウスの脾細胞の、抗原での再刺激により誘導されたIFN-γ産生を示す。 Dectin-1+/-又はDectin-1-/-マウスをOVA+K3-SPGで免疫することにより誘導されたOVA特異的CD8T細胞の割合を示す。*p < 0.05 (Mann-Whitney U test)。 Alexa 488-K3-SPG投与１時間後の、iLNs表面上へのK3-SPGの局在を示す。 DQ-OVA投与１時間後の、iLNs中の、OVA、MARCO＋細胞、及びSiglec-1+細胞の局在を示す。 図33におけるOVAのMARCO+細胞又はSiglec-1+細胞との共局在をVolocityで解析した結果を示す。*p < 0.05 (t-test)。 Alexa 488-K3又はAlexa 488-K3-SPG投与１時間後のiLNs中の、K3、K3-SPG、及びMARCO＋細胞の局在を示す。 図35におけるK3又はK3-SPGのMARCO+細胞との共局在をVolocityで解析した結果を示す。*p < 0.05 (t-test)。 クロドロネートリポソームによる枯渇化試験のプロトコール（上パネル）、血清中抗原特異的抗体力価（左下）、及び抗原刺激サイトカイン産生を示す。*p <0.05 (t-test)。 K3又はK3-SPGを投与したC57BL/6J又はTlr9-/- マウスの各種DCｓにおけるCD40発現を示す。 SV、WIV又はSV+K3-SPGで免疫したマウスにおける血清中抗原特異的抗体力価を示す。 SV、WIV又はSV+K3-SPGで免疫感作後に、インフルエンザウイルス A/P/R8(H1N1)で負荷した際の、体重の経時変化（左）及び生存率カーブ（右）を示す。 SV+ K3又はSV+K3-SPGで免疫感作したカニクイザル血清中の抗原特異的血清抗体力価の経時変化を示す。*p < 0.05 (t-test)。 SV+ K3又はSV+K3-SPGで免疫感作したカニクイザル血清中の抗原特異的血清抗体力価を示す（110週目）。 K3とK3-SPGとの間のワクチンアジュバント効果の比較。 K3、K3-LNT又はK3-SPGによるpan-IFN-a産生とIL-6産生を示す。 K3、K3-LNT又はK3-SPG添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価を示す。 K3又はK3-LNT又はK3-SPG添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原刺激により特異的に誘導されるサイトカイン産生を示す。 K3又はK3-LNT又はK3-SPG添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したコットンラットにおける、RSV感染防御効果を示す。
１．オリゴデオキシヌクレオチド
　本発明は、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸（dA）を含む、オリゴデオキシヌクレオチド（以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。）を提供するものである。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾（例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換）されているものを含む。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
　なお、本明細書においてオリゴデオキシヌクレオチドとODNは同義である。また、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」と、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、交換可能に用いられる。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸（残基）は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
　CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）は、免疫賦活性の非メチル化CpGモチーフを含有する一本鎖DNAであり、TLR9のアゴニストである。CpG ODNには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、K型（B型とも呼ばれる）、D型（A型とも呼ばれる）、C型及びP型の４つの型がある（Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009)）。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、これらのうちK型CpG ODNを含む。
　K型CpG ODNは、典型的には非回文構造の、複数の非メチル化CpGモチーフを含有し、B細胞を活性化してIL-6を産生させるが、形質細胞様樹状細胞（pDCs）のIFN-α産生をほとんど誘導しないという構造的及び機能的特性を有するCpG ODNである。非メチル化CpGモチーフとは少なくとも１つのシトシン（C）－グアニン（G）配列を含む短いヌクレオチド配列であって、該シトシン－グアニン配列におけるシトシンの５位がメチル化されていないものを差す。なお、以下の説明において、CpGとは、特にことわらなり限り非メチル化CpGを意味する。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODNを含むことにより、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する。当該技術分野において多数のヒト化K型CpG ODNが知られている（Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001)；Journal of immunology 164, 944-953 (2000)；US 8, 030, 285 B2）。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、好ましくはヒト化されている。「ヒト化」とは、ヒトTLR9に対するアゴニスト活性を有することを意味する。従って、ヒト化K型CpG ODNを含む本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒトに対してK型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、ヒトB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する。
　本発明において好適に用いられるK型CpG ODNは、10ヌクレオチド以上の長さであり、且つ式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、WはA又はTであり、N1、N2、N3、N4、N5及びN6はいかなるヌクレオチドであってもよい）
で表されるヌクレオチド配列を含む。
　一態様において、本発明のK型CpG ODNは10ヌクレオチド以上の長さであり、上記式のヌクレオチド配列を含む。但し、上記式中、中央の４塩基のCpGモチーフ（TCpGW）は10ヌクレオチド中に含まれていれば良く、必ずしも上記式中、N3及びN4の間に位置する必要はない。また、上記式中、N1、N2、N3、N4、N5及びN6はいかなるヌクレオチドであっても良く、N1及びN2、N2及びN3、N3及びN4、N4及びN5、並びにN5及びN6の少なくともいずれか一つ（好ましくは一つ）の組み合わせは２塩基のCpGモチーフであっても良い。前記４塩基のCpGモチーフがN3及びN4の間に位置しない場合、上記式中、中央の４塩基（４～７番目の塩基）中の連続するいずれかの２塩基がCpGモチーフであり、他の２つの塩基はいかなるヌクレオチドであっても良い。
　本発明においてより好適に用いられるK型CpG ODNは１つまたは複数のCpGモチーフを含む非回文構造を含有する。更に好適に用いられるK型CpG ODNは１つまたは複数のCpGモチーフを含む非回文構造からなる。
　ヒト化K型CpG ODNは、一般的に、TCGA又はTCGTからなる４塩基のCpGモチーフを特徴とする。また、多くのケースにおいて、一つのヒト化K型CpG ODN中にこの４塩基のCpGモチーフが２又は３個含まれる。従って、好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、少なくとも１個、より好ましくは２以上、更に好ましくは２又は３個、TCGA又はTCGTからなる４塩基のCpGモチーフを含む。該K型CpG ODNが２又は３個の４塩基のCpGモチーフを有する場合、これらの４塩基のCpGモチーフは同一であっても異なっていてもよい。ただし、ヒトTLR9に対するアゴニスト活性を有する限り、特に限定されない。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む。
　K型CpG ODNの長さは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、好ましくは100ヌクレオチド長以下（例えば、10-75ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、より好ましくは50ヌクレオチド長以下（例えば、10-40ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、更に好ましくは30ヌクレオチド長以下（例えば、10-25ヌクレオチド長）である。K型CpG ODNの長さは、最も好ましくは、12-25ヌクレオチド長である。
　ポリデオキシアデニル酸（dA）の長さは、β－1,3－グルカン（好ましくは、レンチナン、又はシゾフィラン）鎖とともに三重螺旋構造を形成するのに十分な長さであれば特に限定されるものではないが、安定な三重螺旋構造を形成する観点からは、通常20ヌクレオチド長以上、好ましくは40ヌクレオチド長以上、より好ましくは60ヌクレオチド長以上である。ポリdAは、長ければ長いほどβ－1,3－グルカンと安定な三重螺旋構造を形成するので、理論的には上限はないが、長すぎると、オリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さにバラつきが生じる原因となるので、通常、100ヌクレオチド長以下、好ましくは80以下である。一方、前記安定な三重螺旋構造の形成に加え、単位量のβ－1,3－グルカンあたりに結合する本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量を増大させ、且つオリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さのばらつきの回避、複合化効率の観点からは、ポリdAの長さは、好ましくは、20～60ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長 ）、より好ましくは、30～50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30～45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長）である。特に、30ヌクレオチド長以上の場合、良好な複合化効率を示す。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリdAを含むことにより、2本のシゾフィラン鎖とともに三重螺旋構造を形成する活性を有する。なお、ポリデオキシアデニル酸を「ポリ（dA）」又は「poly(dA)」と表記することもある。
　１分子の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、複数個のK型CpG ODN及び／又はポリdAが含まれていてもよいが、好ましくは、K型CpG ODN及ポリdAが１つずつ含まれ、最も好ましくは、K型CpG ODN及ポリdAが１つずつからなる。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリdAがK型CpG ODNの3’側に配置されていることを特徴とする。この配置により、本発明の複合体（詳細は下に述べる）が、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性に加えて、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性を有することとなる。
　K型CpG ODNとポリdAとは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、２つの近接した構成要素の間に挿入される１以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を意味する。スペーサー配列の長さは、本発明の複合体が、免疫賦活活性（好ましくはB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常１～１０ヌクレオチド長、好ましくは１～５ヌクレオチド長、より好ましくは１～３ヌクレオチド長である。最も好ましくは、K型CpG ODNとポリdAとが、直接共有結合により連結される。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODN、ポリdA及び任意的なスペーサー配列に加え、その5’末端及び／又は3’末端に付加的なヌクレオチド配列を有していてもよい。該付加的なヌクレオチド配列の長さは、本発明の複合体が免疫賦活活性（好ましくはB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常１～１０ヌクレオチド長、好ましくは１～５ヌクレオチド長、より好ましくは１～３ヌクレオチド長である。
　好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、このような5’末端及び／又は3’末端の付加的なヌクレオチド配列を含まない。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、K型CpG ODN、ポリdA及び任意的なスペーサー配列からなり、更に好ましくは、K型CpG ODN及びポリdAからなる。
　最も好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODN(具体的には、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチド)及びポリdAからなり、K型CpG ODNが該オリゴデオキシヌクレオチドの5’末端に、ポリdAが3’末端に、それぞれ位置する。具体的には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’末端に20～60ヌクレオチド長（より好ましくは、30～50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30～45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長））のポリdAが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであり、例えば、配列番号２、又は９～１２で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドである。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの全長は、通常30～200ヌクレオチド長、好ましくは35～100ヌクレオチド長、より好ましくは40～80ヌクレオチド長（具体的には、40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 又は80ヌクレオチド長）、より好ましくは、50～70ヌクレオチド長（具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70ヌクレオチド長）、最も好ましくは、50～65ヌクレオチド長（具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65ヌクレオチド長）である。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、インビボにおける分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよい。好ましくは、該改変はホスホロチオエート修飾又はホスホロジチオエート修飾を含む。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合により置換されている。
　好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の修飾を含み、より好ましくは、リン酸ジエステル結合の修飾は、ホスホロチオエート結合（即ち、WO 95/26204に記載されているように、非架橋酸素原子のうちの１つが、硫黄原子に置換される）である。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合により置換されている。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、K型CpG ODNにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合による修飾を含み、より好ましくは、該K型CpG ODNのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、ポリdAにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含み、より好ましくは、該ポリdAのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。更に好ましくは、本発明のヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含むオリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。最も好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（例、配列番号１）の3’末端に20～60ヌクレオチド長（より好ましくは、30～50ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）、最も好ましくは、30～45ヌクレオチド長（30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長））のポリdAが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであって、当該オリゴデオキシヌクレオチドに含まれる全てのリン酸ジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されている。ホスホロチオエート結合により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、分解に対する抵抗性のみならず、免疫賦活活性（例えば、B細胞を活性化させてIL-6を産生させる活性）の増強、及びCpG-β-1,3-グルカン複合体の高収率が期待されるからである。なお、本明細書におけるホスホロチオエート結合はホスホロチオエート骨格と、リン酸ジエステル結合はリン酸骨格と同義である。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、上記オリゴデオキシヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類を含む。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリ－ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ－ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれの形態でもよいが、好ましくは１本鎖である。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたオリゴデオキシヌクレオチド」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とするオリゴデオキシヌクレオチド重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、優れた免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を有するので、免疫賦活剤等として有用である。更に、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、2本のβ－1,3－グルカン（好ましくは、レンチナン、シゾフィラン、又はスクレログルカン）とともに三重螺旋構造を形成する性質を有するので、下記の本発明の複合体の調製に有用である。
２．複合体
　本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ－1,3－グルカンを含有する複合体（以下、本発明の複合体と称する。）を提供するものである。
　上述の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、K型CpG ODNを含むので、それ単独では、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）を発揮し、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）に乏しい。しかしながら、驚くべきことに、β－1,3－グルカン（好ましくは、レンチナン、又はシゾフィラン）と複合体を形成することにより、D型CpG ODNの配列を要することなく、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性）を獲得する。即ち、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してIFN-αを産生させる活性）の両方を有する。
　本発明で用いられるβ－1,3－グルカンとしては、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β－1,3－グルカンは、好ましくは、レンチナン、シゾフィランまたはスクレログルカンのように、１，６－グルコピラノシド分枝を多く含有する（側鎖率３３～４０％）β－1,3－グルカンであり、より好ましくはレンチナン、又はシゾフィランであり、最も好ましくはレンチナンである。
　レンチナン（LNT）は、シイタケ由来の公知のβ－1,3－1,6－グルカンであり、分子式は(C6H10O5)n、分子量は約30～70万である。水、メタノール、エタノール（95）、又はアセトンにはほとんど溶けないが、極性有機溶媒であるDMSOや水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。
　レンチナンは活性化マクロファージ、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞及び抗体依存性マクロファージ仲介性細胞障害作用(ADMC)活性の増強作用を有する（Hamuro, J., et al.：Immunology, 39, 551-559, 1980、Hamuro, J., et al.：Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980、 Herlyn, D., et al.：Gann, 76, 37-42, 1985）。動物実験においては同系腫瘍及び自家腫瘍に対して化学療法剤との併用投与により腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。また、レンチナンの単独投与によっても腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。臨床試験においては手術不能又は再発胃癌患者に対して、テガフール経口投与との併用により生存期間の延長が認められ（医薬品インタビューフォーム「レンチナン静注用1mg「味の素」」）、本邦で承認されている。レンチナンの単独投与による効果は現在のところ確認されていない。
　シゾフィラン（SPG）は、スエヒロタケ由来の公知の可溶性β－グルカンである。SPGは、β－（1→3）－D－グルカンの主鎖と、各3個のグルコース当り１個のβ－（1→6）－D－グルコシル側鎖からなる（Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A.,「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（清水, 陳, 荷見, 増淵，「Biotherapy」, 1990, 4, p.1390長谷川，「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p.225）、生体内での安全性が確認されている（Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909）。
　本明細書において「複合体」とは、複数の分子が、静電結合、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合又は共有結合を介して会合することにより得られる産物を意味する。
　本発明の複合体は、好ましくは、三重螺旋構造状である。好ましい態様において、当該三重螺旋構造を形成する３本の鎖のうち、２本はβ－1,3－グルカン鎖であり、１本は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖である。なお、当該複合体は一部に、三重螺旋構造を形成していない部分を含んでいても良い。
　本発明の複合体における、オリゴデオキシヌクレオチドとβ－1,3－グルカンの組成比は、オリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖長、及びβ－1,3－グルカンの長さ等に応じて、変化しうる。例えば、β－1,3－グルカン鎖と、ポリデオキシアデニル酸の鎖の長さが同等の場合には、２本のβ－1,3－グルカン鎖と、１本の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが会合し、三重螺旋構造を形成し得る。一般的には、β－1,3－グルカン鎖に対して、ポリデオキシアデニル酸の鎖長は短いので、２本のβ－1,3－グルカン鎖に対して、複数の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸を介して会合し、三重螺旋構造を形成し得る（図１参照）。
　本発明の複合体は、ヒト化K型CpG ODN及びβ－1,3－グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン）を含有する複合体であり、好ましくは、ヒト化K型CpG ODN及びβ－1,3－グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン）からなる複合体である。より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20～60ヌクレオチド長（具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ－1,3－グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、K3-dA20～60-LNT、K3-dA20～60-SPG）であり、更に好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30～50ヌクレオチド長（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ－1,3－グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、K3-dA30～50-LNT、K3-dA30～50-SPG）であり、最も好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30～45ヌクレオチド長（具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ－1,3－グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（K3-dA30～45-LNT、K3-dA30～45-SPG）である。
　本発明の複合体の調製方法に関しては、非特許文献21～24や、特開2008-100919号公報に記載された条件と同様に行うことができる。すなわち、本来は、天然で三重螺旋構造として存在するβ－1,3－グルカンを非プロトン性有機極性溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等）またはアルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等）に溶解して一本鎖に解く。このようにして得られた一本鎖のβ－1,3－グルカンの溶液と本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの溶液（水溶液、中性付近のpHの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のpHの緩衝水溶液）とを混合し、必要に応じて再度pHを中性付近に調整後、適当時間保持する、例えば、5℃で一夜保持する。その結果、２本のβ－1,3－グルカン鎖と該オリゴデオキシヌクレオチド中のポリdA鎖が三重螺旋構造を形成することにより、本発明の複合体が形成される。生成した複合体に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製、限外濾過、透析等を行うことにより、複合体未形成のオリゴデオキシヌクレオチドを除くことができる。また、生成した複合体に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、複合体未形成のβ－1,3－グルカンを除くことができる。上記の方法により、複合体を適宜精製することができる。
　本発明の複合体の形成は、例えばＣＤ（円偏光二色性）スペクトルによるコンフォメーション変化、サイズ排除クロマトグラフィーによるUV吸収シフト、ゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動、キャピラリー電気泳動を測定することにより確認することができるが、これに限らない。
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ－1,3－グルカンとの混合比は、ポリdA鎖の長さ等を考慮して適宜設定することができるが、通常モル比（SPG/ODN）が0.02～2.0、好ましくは0.1～0.5である。更なる態様において、モル比（β－1,3－グルカン(LNT等)/ODN）が例えば0.005～1.0、好ましくは0.020～0.25である。
　本発明の複合体の調製方法についてCpG-ODNとLNT複合体を例に説明する。LNTを０．０５～２Ｎ、好ましくは０．１～１．５Ｎのアルカリ水溶液（例えば、0.25Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）に溶解させ、1℃～40℃で10時間～4日間放置し（例えば、室温で一晩放置する）、一本鎖のLNT水溶液（例えば、50mg/mlのLNT水溶液）を調製する。前記LNT水溶液と別途調製したCpG水溶液（例えば、100μMの CpG水溶液）をモル比（LNT/ODN）0.005～1.0で混合し、続いて、前記LNT水溶液に酸性の緩衝水溶液（例えば、NaH2PO4）を加えて中和し、1～40℃で6時間～4日間（例えば、4℃で一晩）維持することで複合化を完了させる。なお、前記複合化のためにLNT水溶液を最後に加え混合しても良い。複合体の形成は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、CpG ODNの高分子量側へのシフトを240～280nm（例えば、260nm）における吸収をモニタリングすることによって確認することができる。
　一態様において、本発明の複合体は、竿状の粒子の形態を呈する。粒子径は、材料として用いるβ－1,3－グルカン（例、シゾフィラン）が天然で三重螺旋構造を呈することにより形成する粒子の径と同等であり、通常平均粒子径が10-100 nm、好ましくは20-50 nmである。該粒子径は、複合体を水に溶解し、Malvern Instruments Zeta Sizerを用いて80℃の条件で動的光散乱法により計測することができる。
　本発明の複合体は、好ましくは単離されている。「単離された複合体」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とする複合体重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上である。
　本発明の複合体は、優れた免疫賦活活性を有し、特に、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、B細胞（好ましくは、ヒトB細胞）を活性化してIL-6を産生させる活性）と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してIFN-αを産生させる活性）の両方を有するので、免疫賦活剤等として有用である。例えば、K型CpG ODN（例えば、配列番号２、１１、１２）とLNTを含む複合体（K3-LNT）及びK型CpG ODN（例えば、配列番号２）とSPGを含む複合体（K3-SPG）は、炎症応答誘導能（pan-IFN-a、IL-6等）、ウイルス接種個体における血清中抗原特異的IgG抗体価（Total IgG, IgG2c等）の増強作用、ウイルス接種個体における抗原特異的サイトカイン産生能（IFN-γ,IL2等）、ウイルスに対する感染防御効果を有する。K3-LNTについてはウイルス接種個体においてTh2型サイトカイン（IL-13等）の産生増強能も有する。従って、新規ワクチンアジュバント候補として有用である。
３．医薬組成物
　本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のpHは5～10が挙げられ、好ましくは6～8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
　また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の粉末製剤を調製することもできる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
　医薬組成物中の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1～100重量%、好ましくは約1～99重量%、さらに好ましくは約10～90重量%程度である。
　本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を単独で含有していてもよく、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を他の有効成分と組み合わせて含有していてもよい。
４．医薬用途
　本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、D型CpG ODNの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン（Pan-IFN-α、IFN-α２等）及びII型インターフェロン（IFN-γ）の両方を大量に産生させるので、I型インターフェロン産生誘導剤、II型インターフェロン産生誘導剤、I型及びII型インターフェロン産生誘導剤として有用である。I型及びII型インターフェロンの両方の産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型及びII型インターフェロンのいずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが有効な疾患としては、ウイルス感染症（例えば、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等）、癌等を挙げることが出来る。II型インターフェロンが有効な疾患としては、アレルギー疾患、細胞内寄生性の原虫（リーシュマニア等）や細菌（リステリア、結核菌等）等の感染症等を挙げることが出来る。RSウイルスやインフルエンザウイルスを含む急性ウイルス感染症に対しては、I型インターフェロン及びII型インターフェロン共に、ウイルス排除に関する免疫応答を高めるので、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、急性ウイルス感染症に対する有効性が期待できる。
　また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体、特に、本発明の複合体は、強力なワクチンアジュバント活性を有し、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体を、抗原と共に、哺乳動物へ投与すると、該抗原に対する免疫反応を強力に誘導することが出来る。したがって、本発明は、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物をも提供するものである。特に、本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）と細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導する。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体、及び医薬組成物、特に本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、ワクチンアジュバントとして有用である。
　本明細書において、アジュバントとは免疫応答を促す補助剤のことであり、抗原とともに生体に投与されたとき、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質を意味する。
　抗原としては、投与対象の哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）にとって抗原性を有しており、抗体又は細胞傷害性Tリンパ球（CTL, CD8+T細胞）が抗原として認識し得る限り、特に限定されるものではなく、抗原となるあらゆる物質（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質、ならびに前記物質の修飾体（例えば、一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加等（以下、変異等）を導入した修飾体など）を用いることができる。抗原としては、原虫、真菌、細菌、ウイルスなどの病原体由来の抗原、癌、または特定の疾患に関係する抗原も用いられ得る。
　本明細書において、「抗原Aが、病原体Xに由来する」とは、抗原Aが、当該病原体Xに構成因子として含まれることを意味する。例えば、抗原Aがポリペプチドである場合、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、病原体Xのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸配列中に存在することを意味する。
　病原体由来の抗原としては、病原体そのもの又はその一部、不活化又は弱毒化した病原体そのもの又はその一部、あるいはそれらの変異等を導入した修飾体等が挙げられる。
　抗原として病原体由来の抗原を用いると、当該抗原に対する免疫反応が惹起され、該抗原を含む病原体を免疫学的に生体外へ排除する仕組みが構築される。従って、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 病原体由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、当該病原体の予防又は治療のために有用である。
　本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）とともに、細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導する。従って、細胞傷害性Tリンパ球により認識されることが知られている細胞内感染性の病原体（ウイルス、原虫、真菌、細菌等）由来の抗原や、癌化した細胞に関連した抗原（例えば、腫瘍抗原）等が抗原として好適に用いられる。
　細胞内感染性ウイルスとしては、特に限定されないが、RSウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス（HCV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンパーウイルス、成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-1）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス等が挙げられる。細胞内感染性バクテリアとしては、マイコプラズマ等が挙げられる。細胞内感染性原虫としては、マラリア原虫、住血吸虫等が挙げられる。細胞内感染性病原体は好ましくはウイルス（具体的には、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス等）である。
　癌化した細胞に関連した抗原としては、癌化した細胞において特異的に発現する蛋白質、糖鎖、ペプチド、ならびに前記物質の変異体（欠失、置換、及び／又は付加）又はその修飾体などが挙げられる。
　本発明の複合体は、I型及びII型インターフェロンの両方を強力に誘導するので、一態様において、ウイルスとして、I型インターフェロン及びII型インターフェロンの両方が有効な急性ウイルス感染症を引き起こすウイルス（例、RSウイルス、インフルエンザウイルス）が選択される。
　例えば、(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b) 病原体や癌由来の抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物を、当該病原体感染症や癌の患者、当該病原体感染症や癌に罹患する可能性のあるヒトに投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を抗原特異的に活性化させ、該抗原特異的な抗体産生を誘導し、即ち、温血動物（好ましくは、ヒト）の防御免疫反応を誘導することにより、該感染症や癌を予防・治療することが出来る。即ち、該組成物は、上記感染症、癌等の疾患の予防又は治療のためのワクチンとして有用である。
　また、本発明の複合体は、抗原に対する液性免疫反応（抗原特異的抗体産生）と細胞性免疫反応（抗原特異的CTL誘導）の両方を強力に誘導することができるので、抗原として、病原体や癌細胞の表面抗原と内部抗原のいずれを用いることも可能であり、表面抗原と内部抗原とを混合して用いることも、また望ましい。
　(a) 本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体、及び(b)抗原を含む、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、上記本発明の医薬組成物に準じて調製することができる。
　本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［方法］
動物及び試薬
　Tlr9欠損マウス及びDectin-1欠損マウスの作成については、以前に記載した（Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)）。C57BL/6Jマウスは、日本クレアから購入した。
全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実施した。以下のCpG ODNsは、（株）ジーンデザインで合成された（下線はホスホロチオエート結合を示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　特に、上記K3-dA40（配列番号２）に加え、K3-dA35（配列番号１２）、K3-dA30（配列番号１１）、K3-dA25（配列番号１０）及び、K3-dA20（配列番号９）の合成（表２）について記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（上記配列中のsは、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されていることを示す。）
　本オリゴデオキシヌクレオチドは、常法である固相ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 3. Chemical synthesis (1990) ed. G. Michael Blackburn and Michael J. Gait. Oxford University Press）を用いて合成した。
　表３に表２記載のCpG ODNの分子量、及び、以下の条件で逆相HPLCで分析した場合の保持時間を示す（カラム:Waters, X-Bridge C18 2.5μm, 4.6 x 75 mm、A溶液：100 mM ヘキサフルオロイソプロパノール、8 mM トリエチルアミン、B溶液：メタノール、B%:5%→30%（20 min， linear gradient）;60℃;1 ml/min;260 nm）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　オブアルブミン（OVA）は、生化学工業（株）から購入した。DQ-OVA、Alexa488-OVA、CFSE、及びLipofectamine 2000はInvitrogenから購入した。Hoechst33258、ザイモザン及びカードランは、SIGMAから購入した。Zymosan-DepletedはInvivogenから購入した。クロドロネートリポソームはFormuMaxから購入した。インフルエンザスプリットプロダクトワクチン、ホルマリン不活化全ウイルス（WIV）、及び精製インフルエンザウイルス（H1N1）は、以前に記載したように調製した（Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)）。
CpG ODNとSPGとの複合体化（図1）
　7.22 mgのK3-dA40を水(3.7mL)に溶解した。SPG（三井製糖） 15 mgを0.25 N NaOH (1 mL)に溶解した。1 mLの330 mM NaH2PO4をDNA溶液に加え、次にSPG溶液をDNA/NaH2PO4溶液に加え、4℃にて一晩維持することにより複合体化を完了した。モル比（MSPG/MDNA）は、0.27に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置（SHIMADZU：MultiNA）によって確認した。
CpG ODNとLNTとの複合体化（図１）
　レンチナン（LNT：味の素株式会社、ロット番号：2D8X1）を50mg/mlとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。各種CpG ODN（表２，３）は100mMとなるように、注射用水に溶解した。LNT水溶液と各種CpG水溶液（K3-dA20（配列番号９）、K3-dA25（配列番号１０）、K3-dA30（配列番号１１）、K3-dA35（配列番号１２）、K3-dA40（配列番号２））を表４に示す比率で混合し、続いて、添加したLNTと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩維持することにより複合体化を完了した。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、CpG ODNの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した（System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GF7M-HQ (Shodex) 2本連結、Flow rate:0.8mL/min、Buffer: 10mM EDTA PBS, pH7.4、Temperature:40°C）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
ヒトPBMCsの調製及び刺激（図２、３、６、７）
　PBMCsは、３人の健康な成人男性ボランティア（30～40 歳）から得た。ヒトPBMCsを用いる全ての試験は、医薬基盤研究所の施設内治験審査委員会により認可された。Ficollを用いてPBMCsを調製後、1 x 107 個/mlの濃度で播いた。PBMCsを、コンプリートRPMI（10% FCS、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたRPMI 1640）中で維持した。PBMCsを、K3 (0.24、0.74、2.2、6.6、20 μg/mL) 、K3-dA40、K3-SPG （K3-dA40の複合体）、dA40-K3、SPG-K3（dA40-K3の複合体）、D35、CpG21798、CpG21889、CpG2395、又はM362で24時間刺激した。上清をpan-IFN-α (Mabtech)、IL-6 (R&D)、及びMilliplex (Millipore)用のELISAに付した。
電子顕微鏡解析（図4）
　染色する前に、試料をホルムバール－カーボンコートグリップ上に滴下した。陰性染色のため、2% 酢酸ウラニウム(pH 4.0)の液滴をグリップ上に載せ、風乾させた。グリップを電子顕微鏡(Hitachi H-7650)上で40,000倍の拡大率にて観察した。
動的光散乱（図5）
　水溶液中の平均ナノ粒子サイズを、80℃にて、Malvern Instruments Zeta Sizer上で動的光散乱法を用いて測定した。
脾細胞及び樹状細胞培養　（図８、９）
　6週齢C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、及びDectin-1欠損マウスから、マウス脾臓を採取した。脾細胞を懸濁後、ACK溶解緩衝液で赤血球(RBCs)を溶解し、細胞をコンプリートRPMI中で維持した。細胞を1 x 107cells/mLの濃度で播いた。マウス骨髄由来細胞を、ヒトFlt3L (Peprotech) (100 ng/mL)と共に７日間培養することにより、骨髄由来DCｓを作成した。細胞を1 x 107cells/mLの濃度で播いた。マウスM-CSF (Peprotech) (20 ng/mL)と共に７日間培養することによりBMDMsを作成した。これらの細胞は、コンプリートRPMI中で維持した。
細胞内分布（図８、９）
　BMDMsを5 x 107 cells/mLで播き、Alexa 488-K3 (1 μM) 及びAlexa 647-K3-SPG (1 μM)、又はAlexa 488-D35 (1 μM) 及びAlexa 647-K3-SPG (1 μM)により３時間刺激した。細胞をHoechst33258で30分染色することにより核を可視化し、次に細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて解析した。
免疫接種
　6週齢のC57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、及びDectin-1欠損マウスの尾の付け根に、
OVA (0.1、1、10、又は100 μg)；
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3（538 pmol)；
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3-dA40 (538 pmol)；又は
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3-SPG (538 pmol)
を、0日目及び10日目に投与した。他の試験においては、6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
スプリットワクチン（0.1 μg）単独；
スプリットワクチン及びK3 (538 pmol)；又は
スプリットワクチン及びK3-SPG (538 pmol)
を、0日目及び10日目に投与した。17日目に採血し、抗原特異的血清抗体力価をELISAにより測定した（図10、15a、16、25、28a、29、43a）。17日目にマウス脾臓を採取し、脾細胞を上述の方法で調製した。細胞を
OVA257-264 (OVA257)：SIINFEKL (10 μg/mL)；
OVA323-339 (OVA323)：ISQAVHAAHAEINEAGR (10 μg/mL)；
全OVAタンパク質 (OVA) (10 μg/mL)；
NP260-283 (NP260)：ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 μg/mL)；又は
スプリットワクチン (10 μg/mL)
により24又は48時間再刺激した。上清を、マウスIFN-γのためのELISAに付した（図11、15b、17、26、28b、30、43b）。テトラマーアッセイのため、脾細胞をH-2Kb OVAテトラマー (MBL)、抗CD8α (KT15)、抗TCRβ(H57-597)、抗CD62L (MEL-14)、及び抗CD44 (IM7)抗体、並びに7-AADで染色した。OVAテトラマー+ CD44+CD8α+ TCRβ+細胞数をFACSにより測定した（図12、15c、27、28c、31）。
インビトロCTLアッセイ（図13）
　6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
OVA (100 μg)；
OVA及びK3 (3.3 μg)；
OVA及びK3-dA40 (3.3 μg)；又は
OVA及びK3-SPG (3.3 μg)
を、0日目に投与した。免疫接種後7日目に、ナイーブC57BL/6J脾細胞を、異なる濃度のCFSE（5又は0.5 μM）により、10分間、37℃にて標識した。染色した高濃度の細胞をOVA257 (10 μg/mL)で90分間、37℃にてパルスした。培地で2回洗浄後、標識した細胞を混合し、静脈内投与により免疫したマウスへ移入した。移入から24時間後、脾細胞を採取し、CFSEで標識した細胞の割合をFACSにて測定した。
ペプチド免疫接種
　C57BL/6Jマウスを、
OVA257 (10 μg)；
OVA257及びK3 (10 μg)；
OVA257及びK3-dA40 (10 μg)；又は
OVA257及びK3-SPG (10 μg)
で免疫した。免疫から７日後に、脾細胞を調製し、H-2Kb OVAテトラマー、抗CD8α、抗TCRβ、抗CD62L、及び抗CD44抗体で染色した。OVAテトラマー+ CD44+ CD8α+ TCRβ+細胞数をFACSにより解析した（図14左）。調製した脾細胞をインビトロにてOVA257 (10 μg/mL)及びGolgi Plugにより４時間、再刺激した。細胞を抗IFN-γ、抗CD8α、及び抗CD3e抗体で染色し、IFN-γ+ CD8α+ CD3e+細胞数をFACSにて測定した（図14右）。
トランスフェクション及びDectin-1結合アッセイ（図18、19）
　HEK293を、Lipofectamine 2000を用いて、空、Dectin-1、又はDectin-2発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、細胞を、FITC-SPG (0.5 μM)、Alexa 488-labeled K3-dA40 (0.5 μM)、又はAlexa 488-labeled K3-SPG (0.5 μM)で、37℃にて、60分間処理した。処理後、細胞を集め、SPG又はCpG ODN陽性細胞をFACSにより解析した。
免疫細胞の刺激（図20、21、22、23、24）
　C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、又はDectin-1欠損マウスからの脾細胞及びFL-DCsをK3-SPG (0.014、0.03、0.04、0.08、0.12、0.25、0.37、0.74、1.1、2.2、3.3、6.7、10、又は20 μg/mL)、ザイモザン (3.7、11.1、33.3、又は100 μg/mL)、カードラン、Zymosan-Depleted、又は SPGで24時間刺激した。他の試験においては、C57BL/6Jマウス又はDectin-1欠損マウスからの脾細胞を、D35 (1 μM)の存在下又は非存在下で、Zymosan-Depleted (100、33.3、又は11.1 μg/mL)又はSPG (100、33.3、又は11.1 μg/mL)で、24時間刺激した。上清をIFN-α(PBL)、IL-6 (R&D)、IL-12 p40 (R&D)、IL-12 p70 (R&D)、及びBioplex (BIO-RAD)のためのELISAに付した。
免疫組織化学（図32）
　C57BL/6Jマウスの付け根に、
DQ-OVA (10 μg)；
Alexa 488-K3-SPG (10 μg)；
Alexa 647-K3-SPG (10 μg)；又は
DQ-OVA及びAlexa647-K3-SPG (10 μg)
を投与した。iLNsを採取後、クリオスタットを用いて凍結切片を調製した。凍結切片を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、抗Siglec-1 (MOMA-1)、抗MARCO(ED31)、抗CD3e (145-2C11)、又は抗CD11c (N418)抗体とインキュベートした。画像化の結果をImageJにより解析した。
二光子顕微鏡（図33、35）
　C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、又はDectin-1欠損マウスの尾の付け根に、DQ-OVA (10 μg)、Alexa 488-K3 (10 μg)、又はAlexa 488-K3-SPG (10 μg)を投与した。iLN採取の30分前に、マウスの尾の付け根にPE-抗MARCO抗体、又はPE-抗Siglec-1抗体を投与した。抗原及びアジュバントの投与後1時間に、iLNsを採取し、二光子顕微鏡(Olympus)による画像解析に付した。ピアソン相関を、Volocity共局在解析を用いて計算した。
抗原及びアジュバント投与後の生体内分布（図34、36）
　C57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
Alexa 647-K3 (538 pmol)、
Alexa 647-K3-SPG (538 pmol)、
Alexa 488-OVA (10 μg)、
Alexa 488-OVA及びK3 (10 μg)、
Alexa 488-OVA及びK3-SPG (10 μg),
DQ-OVA (10 μg)、
DQ-OVA及びAlexa 647-K3 (538 pmol)、又は
DQ-OVA及びAlexa 647-K3-SPG (538 pmol) 
を投与した。投与の24時間後に、iLNsを採取した。単一細胞懸濁液を調製するため、iLNsをコラゲナーゼD (1 mg/mL)及びDNase I (0.1 mg/mL)と37℃にて30分間インキュベートした。調製した細胞を抗B220 (RA3-6B2)、抗CD8α (56-6.7)、及び抗CD11c抗体とインキュベートし、異なるDC集団を分離した。OVA及びCpG ODNsの細胞内取込みをFACSにより解析した。
クロドロネートリポソーム注入（図37）
　免疫接種の5日又は2日前のいずれかに、6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、クロドロネートリポソームを投与した。0日目に、OVA及びK3-SPGにより、マウスを尾根部にて免疫した。8日目に血液及び脾臓を採取し、血清抗体力価及びT細胞反応をELISAにより測定した。
生体内におけるDC活性化の検討（図38）
　C57BL/6Jマウス又はTlr9欠損マウスの尾の付け根に、K3 (10 μg)又はK3-SPG (10 μg)を投与した。投与から24時間後に、iLNsを上述の方法で調製した。細胞を抗CD11c、抗mPDCA-1 (JF05-1C2.4.1)、抗CD8α、及び抗CD40 (3/23) 抗体とインキュベートし、FACSにて解析した。
インフルエンザウイルスに対する感染防御応答の検討
　6週齢のC57BL/6Jマウスに、
スプリットワクチン(0.1 μg)；
スプリットワクチン及びK3-SPG (10 μg)；又は
WIV(0.2 μg)
を、0日目及び14日目に投与した。免疫接種から2週間後に、血清抗体力価をELISAにより測定し（図39）、マウスに2.3 x 103 pfu (10 LD50)のインフルエンザウイルス A/PR/8/34を鼻腔内へ接種した。接種後20日間に亘り、マウスの体重及び死亡率をモニターした（図40）。
カニクイザルのワクチンモデル（図41、42）
　カニクイザルの皮下へ、
インフルエンザスプリットワクチン(5 μg)及びK3 (5 nmol);又は
スプリットワクチン及びK3-SPG (5 nmol)
を、0日目及び14日目に投与した。血液試料を、-2、2、4、6、8及び110週目に採取し、血清抗体力価をELISAにより測定した。
統計学的解析
　群間の統計学的有意性(P < 0.05)は、Student’s t-test又はMann-Whitney U testを用
いて決定した。
［結果］
１）K3-SPGの竿状ナノサイズ粒子は、K型及びD型CpG ODNの２つの特性を獲得する。
　図1に示すように、CpG ODNとSPGとの間のよりよい複合体化効率には、変性－復元手順を通して、５’末端又は３’末端においてポリdA40のPS骨格の追加的配列を要する（Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011)）。ヒト化CpG ODNによる複合体形成の最適化の過程で、本発明者らは、CpG ODNの５’末端及び３’末端の免疫賦活性への影響を調べた。複合体化効率は同等であるにもかかわらず、SPGと複合体化した5’-K3-dA40-3’は、ヒト末梢血単核球（PBMCs）を活性化し、多量のIFN-αを産生させたが、5’-dA40-K3-3’では、そうではなかった(図2、図3)。K3、K3-dA40及びdA40-K3は、ヒトPBMCsを活性化してIL-6のような他のサイトカインを産生させることができるが、IFN-αは産生させることが出来なかった(図2、図3)。これらの結果は、新規のTLR9アゴニストとしては、3’-CpGよりも、5’-CpGの方がより望ましいことを示す。
　K3-SPGの定性及び定量を、走査型電子顕微鏡（SEM）及び動的光散乱（DLS）により実施した。K3-SPGは、竿様の構造を有し、以前の報告（Bae, A.H., et al., Carbohydrate research 339, 251-258 (2004)）において見られたものと一致した(図4)。それは、30 nmの平均径を有する可溶性の単量体ナノ粒子のように認められ、SPG自体と同等であり、D型CpG ODN (D35)よりも小さかった（図5）（Klein, D.C. et al., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010); Costa, L.T., et al., Biochemical and biophysical research communications 313, 1065-1072 (2004)）。
　K3-SPGがナノ粒子を形成することを考慮し、K3-SPGの免疫賦活活性を、C、D及びP型CpG ODNと比較した。K3-SPGで刺激されたPBMCsは大量のIFN-α及びIFN-γを産生したが、D35(図6)、P型及びC型 CpG ODN（図7）により誘導されるそれよりも、かなり低い濃度での刺激においてIFN-αを産生した。これらのIFNｓはD型特異的なサイトカインであることが知られているので（Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. et al., Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002)）、これらの結果は、K3-SPGが、K型の特性を損なうことなく、D型CpG ODNの特性を獲得したことを示唆する。K型及びD型CpG ODNの二重機能を理解するため、本発明者らは、骨髄由来マクロファージにおけるK3-SPGの細胞内局在を解析した。K3-SPGは、C型CpG ODNのように（Guiducci, C., et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999-2008 (2006)）、K型CpG ODNを含有するエンドソームのみならず、D型CpG ODNを含有するエンドソームとも共局在したことから(図8、図9)、K3-SPGが、K型及びD型CpG ODNにより、エンドソーム媒介自然免疫シグナル系を伝達した可能性が示唆された。これらの結果は、K3-SPGが、ナノサイズ化した、高次で、且つ完全に可溶化した粒子を形成し、この「オール・イン・ワン」K3-SPGが、他の型のCpG ODN及び従来知られているCpG-SPG複合体よりも強力な活性を示し、これらとは異なる特性を示すことが強く示唆された。
２）K3-SPGは、抱合することなくタンパク質抗原に対する強力なCTL反応を誘導する、卓越したワクチンアジュバントである。
　本発明者らは、マウス免疫化モデルにおける、K3、K3-dA40、及びK3-SPGのアジュバント効果を比較した。野生型マウスを、OVA単独で、或いは各K3由来アジュバントと共にOVAで免疫すると、K3-SPGが、K3により誘導されるものよりも、有意に高い液性免疫反応(図10)、及びより強力なT細胞反応(図11)を誘導した。注目すべきは、K3-SPGによって、より多数のOVA特異的CD8T細胞が誘導されることが、テトラマーアッセイにより明らかになった(図12)。共有結合を何らすることなく共投与したタンパク質抗原に対するきわめて強力なインビボCTL活性も認められた(図13)。このK3-SPGによる強力なCTL誘導は、ペプチドワクチン接種によっても再現され(図14)、用量依存的であった（図15）。K3-SPGの抗原節約活性は極めて強く、同等の抗体及びCD4T細胞反応は１００倍量のOVA抗原を用いることにより達成された(図16、17)。これらの結果は、K3-SPGが、K3単独よりも、卓越したアジュバントであることを明確に示す。
３）SPGは可溶性のDectin-1リガンドであるが、Dectin-1アゴニストではない。
　Dectin-1は、ザイモザンのようなβグルカンの受容体であることが示されているので（Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004)）、SPG及びK3-SPGの細胞取込、及びそれに引き続くSPG及びK3-SPGによる活性化におけるDectin-1の役割について調べた。フローサイトメトリーを用いて、Dectin-1を発現するHEK293細胞において、ODNの存在に係わらず、インビトロにおけるSPG又はK3-SPGの取り込みが上昇したが、Dectin-2やコントロールベクターでは上昇しないことを見出した(図18、19)。最近、可溶型のβ－グルカンはDectin-1シグナリングを活性化しないことが報告された（Goodridge, H.S., et al., Nature 472, 471-475 (2011)）。更に、Dectin-1シグナリングは、サイトカインシグナル抑制因子１(SOCS1)誘導を介して、TLR9媒介サイトカイン産生を抑制する（Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012)）。そこで、SPGのアゴニスト活性を調べた。脾臓細胞をZymosan-Depletedで刺激すると、用量依存的及びDectin-1依存的なTNF-α及び他のサイトカインの産生が認められたが(図20)、SPG刺激では認められなかった(図21)。ザイモザンおよびカードランによるサイトカイン産生は、Dectin-1非依存的であった。Zymosan-Depletedは、CpG ODNにより誘導されたIFN-αを阻害したが、この阻害はDectin-1欠損により軽減された(図22)。対照的に、SPGはCpG ODNにより誘導されたIFN-αを阻害しなかった(図23)。これらの結果は、SPGはDectin-1のリガンドであるがアゴニストではないこと；従ってSPGはTLR9媒介IFN-α産生を妨げないことを示す。
４）K3-SPGのアジュバント効果はTLR9に依存し、Dectin-1に部分的に依存する。
　K3-SPGは、CpG ODNとβ－グルカンの複合体であるので、TLR9（Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000)）及びDectin-1（Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007)）の役割を、受容体ノックアウトマウスを用いて調べた。Tlr9欠損マウス及びDectin-1欠損マウスからの脾細胞及びFlt3リガンド誘導骨髄由来DCs (FL-DCs)をK3-SPGで刺激すると、サイトカイン産生は完全にTLR9依存的であったが、Dectin-1については、そうではなかった(図24)。インビトロの結果と一致して、K3-SPG及びOVAによるTlr9欠損マウスの免疫の結果、液性反応及びT細胞反応が減弱した(図25-27)。OVA 及び10μgのK3-SPG でマウスを免疫すると、Dectin-1欠損マウスは、野生型マウスと同等の免疫反応を示した(図28)。Dectin-1欠損マウスをOVA及び1μgのK3-SPGで免疫すると、抗体産生及びT細胞からのサイトカイン産生については有意な変化は認められないが(図29、図30)、テトラマーアッセイにおいて減弱したCD8 T細胞反応を示した(図31)。これらの結果は、K3-SPGのアジュバント効果はTLR9シグナリングに依存することを示唆する。SPG及びK3-SPGはDectin-1シグナリングを刺激しないが、K3-SPGの効果は、インビボにおいて、なお部分的にDectin-1に依存する。
５）流入領域リンパ節におけるMARCO+マクロファージは、抗原と共にK3-SPGを優先的に捕捉するが、Siglec-1+マクロファージは捕捉しない。
　K3-SPGは、単純な抗原混合物の免疫接種を通じて、インビボにおいて強力なアジュバント効果をもたらすので、抗原及びK3-SPGの両方を捕捉する細胞が、アジュバント効果の媒介において重要な役割を果たすと仮定した。蛍光標識OVA及びK3-SPGのインビボ分布を調べるため、蛍光顕微鏡及び二光子顕微鏡を用いた。尾の付け根に注入後１時間以内に、抗原及びアジュバントは流入領域リンパ節(iLNs)に到達した(図32、33、35)。２４時間後、いくらかのK3-SPGがCD3e+ T細胞領域に移動し、DQ-OVAと共局在した。K3-SPG及びDQ-OVAの両方を含有する、iLNのT細胞領域におけるこれらの細胞は、CD11c+DCsであった。
　興味深いことに、蛍光シグナルの大部分はiLNの表面上に留まったままであった(図32)。このことから、LN表面上に分布することが知られている２つの型のマクロファージである、Siglec-1 (CD169又はMOMA-1とも呼ばれる)+マクロファージ（嚢下洞マクロファージとしても知られる）及びMARCO+ マクロファージ（Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012)）に焦点をあてることにした。通常の蛍光顕微鏡を用いた組織学的解析では、全iLN表面を適切に見ることが出来なかった；更に、これらのマクロファージはフローサイトメトリー解析により単離することが困難であった（Aoshi, T., et al., European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. & Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012)）。そこで、二光子顕微鏡イメージング解析を用いて抗原及びK3-SPGの分布をエクソビボで明らかにした。抗MARCO抗体及び抗Siglec-1抗体の投与後、特異的マクロファージが可視化された。投与後１時間にてiLN表面を二光子顕微鏡でモニターすると、OVA及びK3-SPGがMARCO+マクロファージと共局在していたが、Siglec-1+マクロファージとはしていなかった(図33、35)。以前の報告において、免疫複合体及び不活化インフルエンザウイルスがSiglec-1+マクロファージにより捕捉され、液性免疫反応を誘導することが示唆されている（Gonzalez, S.F., et al., Nature immunology 11, 427-434 (2010); Suzuki, K. et al., The Journal of experimental medicine 206, 1485-1493 (2009)）。Volocityの共局在解析による確認の結果、分布パターンはMARCO+マクロファージのそれと完全に一致しており、Siglec-1+マクロファージとは共局在しなかった(図34、36)。対照的に、K3は、K3-SPGと比較すると、MARCO+領域とSiglec-1+領域の間に拡散的に分布していた(図35、36)。また、Tlr9欠損マウス及びDectin-1欠損マウスの両方とも、K3-SPGと同等の局在を示した。K3-SPGのアジュバント効果に対するこれらのマクロファージの貢献を調べるため、尾の付け根にクロドロネートリポソームを注入した後のマクロファージ及びDCsの異なる回復カイネティクスを試験した。注入後、２日目までにマクロファージは完全に枯渇した。これらの細胞は、少なくとも１週間では回復しなかったが、DCsは、以前報告されているように（Aoshi, T., et al., Immunity 29, 476-486 (2008)）、５日目までにほとんど回復した。マクロファージ及びDCｓの両方を枯渇させたところ、免疫反応は有意に抑制された(図37; Clo -d2)。マクロファージのみを枯渇させ、DCｓを枯渇させなかった場合、免疫反応は、非処置マウスと同等であった(図37; Clo-d5)。このことは、注入後LNsにおいて、OVA及びK3-SPGの両方ともMARCO+マクロファージにより主に捕捉され、そのマクロファージが適応免疫反応を誘導したことを示唆する。言い換えると、K3-SPGのアジュバント効果はDC集団に大きく依存した。
６）K3-SPGは、インビボにおいて、抗原を有するDC集団を標的化し、強力に活性化する。
　本発明者らの知見は、ナノ微粒子K3-SPGの大部分は、注入後にiLNsにおけるMARCO+マクロファージにより取り込まれるが、アジュバント効果はDCsによりコントロールされることを示唆する。そこで、iLNsにおけるDC集団による抗原及びアジュバントの取込に焦点をあてた。投与後２４時間において、DC集団による抗原及びアジュバントの取込をフローサイトメトリーにより解析した。３つのDCサブセット（pDCs、CD8α+ DCs、CD8α- DCs）におけるCpG陽性の頻度はK3-SPG注入後に、K3のときよりも有意に増加した。対照的に、OVA陽性DCの頻度は、K3注入後とK3-SPG注入後とで同等であった。抗原及びアジュバントの両方とも陽性のDCｓに焦点をあてると、K3-SPGにおいてK3よりもかなりの増加が認められた。注入後２４時間において、iLNs におけるpDCs及びCD8α陽性DCsの双方とも、K3-SPGにより強力に活性化されたが、K3によってはされず、これは全体的にTLR9に依存した(図38)。これらの結果から、pDCs及びCD8α+ DCsが、成熟化のための非微粒子K3ではなく、優先的にナノ微粒子K3-SPGを捕捉し、アジュバント効果を発揮することが示された。
７）K3-SPGは、マウス及び非ヒト霊長類モデルにおけるインフルエンザワクチンの強力なアジュバントである。
　K3-SPGのアジュバント効果を、マウス及び非ヒト霊長類において、より臨床的に関連するインフルエンザワクチン接種モデルを用いて調べた。マウスをエーテル処理ヘムアグルチニン抗原濃縮ビリオン不含スプリットワクチン（SV）及び表示したアジュバントで免疫接種し、抗体反応及びT細胞反応を比較すると、K3-SPGは、K3よりも優れたアジュバント効果を示した（図43）。より重要なことに、SVとK3-SPGによる免疫接種により、ビルトインアジュバントとしてウイルスRNAを含有する（Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010)）、全（ビリオン）不活化ワクチン（WIV）（0.2 μg／マウス）を用いたワクチン接種と比較しても、100倍大きな抗体反応が生じた(図39)。SV（0.1 μg／マウス）及びK3-SPGで免疫接種したマウスは、WIVで免疫化したマウスよりも体重の減少が少なかった(図40)。驚くべきことに、WIVワクチン接種マウスでは僅か10％のみ生存をもたらす用量において、K3-SPGは、致死的なPR8ウイルス負荷に対して１００％防御をもたらした(図40)。これらの結果は、マウスモデルにおいて、K3-SPGがタンパク質又はタンパク質ベースのワクチンの強力なアジュバントとして機能するとの考えを強力に支持した。この知見を、カニクイザルを用いた非ヒト霊長類モデルに拡張することとした。０日目及び１４日目に、各群３匹のカニクイザルをK3又はK3-SPGと共にSVで免疫接種した。血清抗体力価を８週間に亘ってモニターした。SV及びK3-SPGにより、免疫接種の２週間後に有意に高い抗体力価が誘導され、この力価は少なくとも更に６週間に亘って高いままであった(図41)。免疫接種から２年（110週）後において、K3-SPG群は、K3群よりも高い抗体力価を示した(図42及び43)。まとめると、これらの結果から、K3-SPGが非ヒト霊長類モデルにおいても卓越したワクチンアジュバントであることが示唆された。
８）ヒトPBMCsを用いたK3-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能の検討
　ヒトPBMCs（Lonza社、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517）を用いて、K3（K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40）単独、K3-LNT複合体（K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT）及びK3-SPG複合体（K3-dA40-LNT）のpan-IFN-a（hIFNa）とIL-6（hIL-6）の産生誘導能を評価した。
　結果を図４４に示す。低用量の刺激において、pan-IFN-aとIL-6産生は、K3とSPGとの複合体であるK3-SPG、およびK3とLNTとの複合体であるK3-LNTにおいて、K3単独に比べて高いことが認められた。また、dA tail長（dA30, dA35, dA40）が異なるK3-LNTによって誘導される炎症性サイトカイン産生能は、ほぼ同等である可能性が示唆された。更に、K3-SPGとK3-LNTの炎症性サイトカイン産生能を比較すると、K3-SPGに比べて、K3-LNTによるpan-IFN-a産生誘導能が高い可能性が示唆された。一方、IL-6産生量においては、K3-SPGとK3-LNTは同等であることが認められた。
９）K3-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
　7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント（K3単独（K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40）、K3-LNT複合体（K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT）及びK3-SPG複合体（K3-dA40-SPG）、リン酸アラム）10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から1週後に末梢血の回収と血清の調製を行い、評価試料とした。血清中のRSV Fワクチン抗原に結合する抗体価は、ELISA法を用いて測定した。図４５に示されるとおり、RSV F抗原特異的なTotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群（F）に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3単独（F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40）、K3-LNT（F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT）及びK3-SPG複合体（F+K3-dA40-SPG）とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム（F+Alum）を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群に比べて高いことが認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3単独（F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40）、K3-LNT（F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT）、K3-SPG（F+K3-dA40-SPG）を接種した免疫群では、リン酸アラム（F+Alum）に比べて高い結果が示されており、K3-LNT複合体はK3-SPGと同様のTh1型アジュバントである可能性が示唆された。
１０）K3-LNT及びK3-SPG複合体添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したマウスにおける、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
　7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント（K3単独（K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40）、K3-LNT（K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT）及びK3-SPG複合体（K3-dA40-SPG）、リン酸アラム）10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から1週後に脾臓を回収し、脾臓細胞を調製した。96 well培養プレートに播種した脾臓細胞を、RSV F抗原のMHC class I拘束性エピトープペプチド、MHC class II拘束性エピトープペプチド、ワクチン抗原タンパク質それぞれで刺激し、24時間もしくは48時間、培養した。RSV F抗原特異的サイトカイン産生能は、培養上清を試料とし、サイトカインELISA法を用いて評価した。本検討では、Th1型サイトカインであるIFN-g、活性化T細胞から産生されるIL-2、Th2型サイトカインであるIL-13の3種のサイトカインについて評価した。
　その結果、図４６に示されるとおり、RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、K3-LNT（F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT）とK3-SPG（F+K3-dA40-SPG）で同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント接種群（F+Alum）では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。興味深いことに、K3-LNT接種群（F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA 35-LNT, F+K3-dA 40-LNT）においては、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG接種群（F+K3-dA40-SPG）に比べ、高いIL-13産生増強効果を示した。このことから、K3-LNT複合体は、K3-SPGが有する高いTh1応答増強効果に加え、Th2応答増強能も有することが示唆された。
１１）K3-LNT及びK3-SPG添加RSV Fサブユニットワクチンを接種したコットンラットにおける、RSV感染防御効果
　6～7週齢のコットンラットの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原1 μgと各種アジュバント（K3-LNT（K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT）及びK3-SPG複合体（K3-dA40-SPG）、リン酸アラム）10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から2週後に、RSV血清型A(Long株)をコットンラットに経鼻接種を用いて攻撃感染させ、その3日後に肺内ウイルス量を計測した。Synagis（palivizumab）投与群は、Synagis 2.5 mg /kgを攻撃感染一日前に筋肉内投与し、上記と同様に感染防御能の評価を行った。中和抗体価は、攻撃感染直前に麻酔下でラット頚静脈から採血し、得られた血清を用いて検討を行った。
　図４７の左に肺内ウイルス量の結果を、右に中和抗体価の結果を示す。肺内ウイルス量の結果から、PBS-投与群では約105pfu/lungのウイルス量が認められるのに対し、リン酸アラム添加RSV Fワクチンを投与した群（F+Alum）では、平均値で約100倍もの低いウイルス量に抑えられていた。一方、K3-SPG添加ワクチン投与群（F+K3-dA40-SPG）においても、感染防御誘導能が認められた。最も良好な感染防御効果を示したのは、K3-LNT添加ワクチン群（F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT）であり、リン酸アラムやK3-SPGに比べて、高い感染防御能に寄与する新規ワクチンアジュバント候補である可能性が示唆された。
　中和抗体誘導能においては、リン酸アラム添加ワクチン投与群（F+Alum）において、シナジスと同等の血中中和活性が認められた。一方、K3-SPG添加ワクチン投与群（F+K3-dA40-SPG）においては、4匹中3匹で中和抗体がほとんど誘導されていないことから、K3-SPGが寄与する感染防御効果は中和抗体非依存的な機作によるものと考察された。また、K3-LNT投与群（F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT）においては、K3-SPGに比べて、高い中和抗体が認められていることから、K3-LNTアジュバントはK3-SPGと異なる特性、例えばTh2応答増強能、を有している可能性が示唆された。
　本発明により、優れた免疫賦活活性を有するオリゴデオキシヌクレオチドやこれを含む複合体が提供される。特に、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性と、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、K3-SPG及びK3-LNTは強力なワクチンアジュバント活性を有しており、K3-SPG又はK3-LNTを抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激する。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして医薬分野において有用である。
　本出願は日本で出願された特願２０１３－１９６２０６（出願日：２０１３年９月２０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (37)

  1. 　ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
  2. 　ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、且つ式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、中央のCpGモチーフはメチル化されておらず、WはA又はTであり、N1、N2、N3、N4、N5及びN6はいかなるヌクレオチドであってもよい）；
    で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  3. 　ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  4. 　オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  5. 　オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項４のオリゴデオキシヌクレオチド。
  6. 　ポリデオキシアデニル酸の長さが、20～60ヌクレオチド長である、請求項１～５のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ－1, 3－グルカンを含有する複合体。
  8. 　β－1, 3－グルカンが、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである、請求項７に記載の複合体。
  9. 　β－1, 3－グルカンがレンチナン、シゾフィラン、又はスクレログルカンである、請求項８に記載の複合体。
  10. 　下記（i）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び（ii）に記載のβ－1, 3－グルカンからなる複合体。
    （i）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20～60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合で置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
    （ii）レンチナン又はシゾフィラン
  11. 　三重螺旋構造状のものである、請求項７～１０のいずれかに記載の複合体。
  12. 　B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、請求項７～１１のいずれかに記載の複合体。
  13. 　請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
  14. 　ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　ウイルス感染症の予防又は治療のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 　請求項７～１２のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び／又はII型インターフェロン産生誘導剤。
  18. 　請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
  19. 　ワクチンアジュバントである、請求項１８の免疫賦活剤。
  20. 　［１］～［６］のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
  21. 　ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項２０に記載の予防又は治療剤。
  22. 　医薬組成物の製造のための、請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体の使用。
  23. 　医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、請求項２２に記載の使用。
  24. 　ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項２３に記載の使用。
  25. 　請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
  26. 　疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　ウイルス感染症が、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項２６に記載の方法。
  28. 　温血動物が、ヒトである、請求項２５～２７のいずれかに記載の方法。
  29. 　請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
  30. 　ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体。
  31. 　ウイルス感染症が、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項３０に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
  32. (a)請求項１～６のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項７～１２のいずれかに記載の複合体、及び
    (b) 抗原
    を含む、医薬組成物。
  33. 　該抗原に対する免疫反応を誘導するための、請求項３２に記載の組成物。
  34. 　抗原が病原体由来の抗原である、請求項３３に記載の組成物。
  35. 　病原体の感染症の予防又は治療用である、請求項３４に記載の組成物。
  36. 　病原体がウイルスである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 　ウイルスが、RSウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項３６に記載の組成物。
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