WO2014088326A1 - 포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물 - Google Patents

포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014088326A1
WO2014088326A1 PCT/KR2013/011180 KR2013011180W WO2014088326A1 WO 2014088326 A1 WO2014088326 A1 WO 2014088326A1 KR 2013011180 W KR2013011180 W KR 2013011180W WO 2014088326 A1 WO2014088326 A1 WO 2014088326A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
neurons
brain
group
control group
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/011180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김명화
정재준
구세광
Original Assignee
주식회사 아리바이오
에스케이케미칼 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 아리바이오, 에스케이케미칼 주식회사 filed Critical 주식회사 아리바이오
Priority to US14/649,467 priority Critical patent/US9750743B2/en
Priority to CN201380063366.7A priority patent/CN105025900B/zh
Priority to JP2015546385A priority patent/JP6120985B2/ja
Priority to ES13860159T priority patent/ES2903151T3/es
Priority to EP21209760.4A priority patent/EP3981409A1/en
Priority to EP13860159.6A priority patent/EP2929886B1/en
Publication of WO2014088326A1 publication Critical patent/WO2014088326A1/ko
Priority to US15/663,092 priority patent/US10064865B2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting apoptosis, a dietary supplement, and a method for inhibiting apoptosis of brain neurons comprising a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor.
  • PEDs Phosphodiesterases
  • PDEs Phosphodiesterases
  • PDE 5 is an enzyme that breaks down cGMP to produce 5′-GMP, and thus inhibiting it has been reported to maintain the concentration of cGMP to maintain erection (Boolel, M. et al., Br. J. of Urology, 78, 257-261 (1996)). Accordingly, PDE 5 inhibitors are being used as erectile dysfunction therapeutics.
  • PDE 5 inhibitors are known. Viagra TM (general name: Sildenafil; WO 94/28902) was approved by the US FDA as the first male erectile dysfunction treatment, and also CialisTM (general name: tadalafil; WO 95/19978) and Levitra TM (general name) Valdenafil; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. Emviks TM (general name: Myrodenafil; KR0358083) is also known as a PDE 5 inhibitor. The drugs are known to show excellent therapeutic effects and improve sexual function in about 70% of patients. As another medicinal use of PDE 5 inhibitors, the therapeutic effect of portal hypertension, liver-kidney syndrome, and liver-pulmonary syndrome is known (Korean Patent Publication No. 10-2012-0024807), and the effect of improving the fertility of mammals Also reported (Korean Patent Publication No. 10-2002-0031062).
  • PDE 5 inhibitors sildenafil and vardenafil have been reported to induce caspase-dependent apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells (Marika Sarfati et al., BLOOD, VOLUME 101, NUMBER 1 (2003).
  • PDE 5 inhibitors rather inhibit apoptosis in brain neurons. Specifically, as a result of administering the PDE 5 inhibitor to an animal model in which neuronal apoptosis was induced due to brain injury, apoptosis of brain neurons was significantly suppressed, and neuroprotective effects of neuronal apoptosis were inhibited. By confirming that the decrease in cognition and motor function is improved, the present invention has been completed.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting apoptosis of brain neurons.
  • Another object of the present invention to provide a dietary supplement for inhibiting apoptosis of brain neurons.
  • the present invention provides a composition for inhibiting apoptosis, a dietary supplement, and apoptosis suppression method of brain neurons containing a PDE 5 inhibitor.
  • the PDE 5 inhibitor exhibits neuronal protective action by inhibiting apoptosis of brain neurons.
  • composition of the present invention can prevent, ameliorate and treat cerebral neurological diseases through the inhibition of apoptosis of brain neurons.
  • 1 is a histopathological picture showing the neuronal protective effects (myotrophic, degenerative neurons, Caspase-3 and PARP) of mirdenafil.
  • Figure 2 shows the weight change of the animal model according to the mirodenafil treatment.
  • Figure 3 is a histopathological picture of brain sections showing neuroprotective effects of myrondenafil (brain atrophy, degenerative neurons, Caspase-3 and PARP).
  • Figure 4 shows the weight change of the animal model according to the treatment with mirdenafil.
  • Figure 5 shows the change in the forelimb placement inspection according to the mirodenafil treatment time.
  • Figure 6 shows the change in hindlimb placement inspection according to the treatment with mirdenafil.
  • Figure 8 shows the change of cognitive motor behavior (water maze test) according to the mirodenafil treatment time. Values are expressed as mean ⁇ SD of 8 rats.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising: (i) a pharmaceutically effective amount of a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor; And (ii) provides a pharmaceutical composition for inhibiting apoptosis of brain neurons comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a brain nerve comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor.
  • a composition comprising a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor.
  • the invention comprises administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor It provides a method for improving dysfunction or motor dysfunction.
  • PDE 5 inhibitors rather inhibit apoptosis in brain neurons. Specifically, as a result of administering the PDE 5 inhibitor to an animal model in which neuronal apoptosis was induced by brain injury, apoptosis of brain neurons was significantly inhibited, and neuroprotective effects of neuronal apoptosis were inhibited. It was confirmed that the decrease in cognition and motor function is improved.
  • PDE 5 inhibitor refers to a substance that can selectively or non-selectively inhibit or reduce the catalysis of PDE 5.
  • PDE 5 inhibitors include compounds, peptides, small molecules, antibodies or fragments thereof, and natural extracts.
  • the PDE 5 inhibitor is a compound.
  • the PDE 5 inhibitor is mirodenafil (mirodenafil), sildenafil (sildenafil), vardenafil (vardenafil), tadalafil (tadalafil), udenafil (udenafil), Dasantafil (dasantafil), avanafil; And their pharmaceutically acceptable salts, solvates and hydrates.
  • the PDE 5 inhibitor is mirdenafil, sildenafil, vardenafil or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutically acceptable salts refer to formulations of compounds that do not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and do not impair the biological activity and properties of the compound.
  • the pharmaceutically acceptable salts are prepared by conventional methods well known in the art utilizing pharmaceutically acceptable, substantially non-toxic organic and inorganic acids.
  • the acid is an inorganic acid such as hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid; Sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, capric acid, isobutanoic acid, malonic acid, succinic acid, phthalic acid, gluconic acid, benzoic acid Organic acids such as lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid and the like.
  • Sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, capric acid, iso
  • the compounds of the present invention are reacted with a base to form an ammonium salt;
  • Alkali metal salts such as sodium or potassium salts;
  • Salts such as alkaline earth metal salts such as calcium or magnesium salts;
  • Salts of organic bases such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, tris (hydroxymethyl) methylamine and the like;
  • amino acid salts such as arginine and lysine.
  • the pharmaceutically acceptable salt is mirdenafil hydrochloride, sildenafil citrate or vardenafil hydrochloride.
  • the hydrate is a compound of the present invention or a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by a non-covalent intermolecular force or a compound thereof Means salt.
  • the solvate means a compound of the present invention or a salt thereof that includes a stoichiometric or nonstoichiometric amount of solvent bound by non-covalent intermolecular forces.
  • Preferred solvents therein are volatile, non-toxic and / or solvents suitable for administration to humans.
  • the composition of the present invention comprising the PDE 5 inhibitor as an active ingredient protects neurons by inhibiting apoptosis of brain neurons.
  • neuronal cell includes neurons, nerve support cells, glia, Schumann cells, and the like, which form structures of the central nervous system, the brain, the brain stem, the spinal cord, the junction of the central nervous system and the peripheral nervous system, and the like.
  • protection of nerve cells refers to the action of reducing or ameliorating neuronal insults, or reducing or inhibiting apoptosis of neurons by neuronal insults, or neuronal insults. It means the action of protecting or restoring nerve cells.
  • nerve insult is used herein for a variety of causes (e.g., external factors such as traumatic brain injury, genetic causes, metabolic causes, toxic causes, neurotoxic causes, physiological causes and biochemical causes, etc.) Refers to the damage of nerve cells or nerve tissues that result.
  • causes e.g., external factors such as traumatic brain injury, genetic causes, metabolic causes, toxic causes, neurotoxic causes, physiological causes and biochemical causes, etc.
  • the composition may be applied to the prevention or treatment of cerebral neurological diseases.
  • prevention means reducing the likelihood / risk of a neurological disease in a subject, delaying the occurrence of a neurological disease in a subject, or a combination thereof.
  • treatment refers to inhibiting the development of a cranial nerve disease in a subject, reducing (relieving) symptoms of a cranial nerve disease in a subject, or eliminating a cranial nerve disease in a subject, or Means a combination.
  • the term “improvement” is used herein with the same meaning as the term “treatment”.
  • “Individual" to be prevented or treated with the pharmaceutical composition of the present invention means a human or non-human animal, preferably human.
  • the cerebral neurological disease is a disease selected from the group consisting of neurodegenerative diseases, ischemic stroke, cognitive dysfunction and motor dysfunction.
  • the neurodegenerative diseases that are prevented or treated by the compositions of the present invention include dementia, Huntington's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis.
  • the dementia includes AIDS induced dementia, Lewy body dementia, frontal temporal dementia, multiple infarct dementia, semantic dementia, Alzheimer's dementia and vascular dementia.
  • the cognitive impairment prevented or treated by the composition of the present invention includes memory loss, learning disorders, blindness, forgetfulness, aphasia, execution and delirium.
  • the motor dysfunction prevented or treated by the composition of the present invention includes motor disturbance, paralysis, ataxia, dyskinesia, spasticity and dystonia. do.
  • the movement disorder generally refers to a state in which voluntary movement of the body, for example, movement of the limbs, the torso, the neck, the face, the face, the tongue, and the like is inadequate.
  • the paralysis is a state in which nerves or muscles lose their function without a change in form, and a state in which numbness or inability to move occurs. Such paralysis can be divided into motor paralysis and numb sensation paralysis, the main symptoms of inability to move according to symptoms, and include short, hemiplegic, hemiplegia, and quadriplegia.
  • the ataxia refers to a state in which the mutual cooperation of muscle groups involved in the exercise is not maintained but the smooth movement is impaired even though the muscle strength is normally maintained.
  • the dyskinesia refers to a phenomenon in which voluntary movements are reduced and involuntary movements (ticks or chorea) appear.
  • the stiffness refers to muscle tension that increases in proportion to muscle elongation (elongation) rate due to overexcitation of kidney reflexes.
  • renal reflex refers to a phenomenon in which tension is increased by reflexively contracting the elongated muscle as if the skeletal muscle is elongated continuously.
  • the muscular dystonia is a general term for symptoms such as twisting of a part of the body due to continuous muscle contraction, repetitive movement, or abnormal posture.
  • the composition of the present invention can inhibit apoptosis of brain neurons caused by traumatic brain injury.
  • the compositions of the present invention can be used to ameliorate neurological and cognitive motor behavioral disorders caused by the death of neurons by traumatic brain injury.
  • the phosphodiesterase type 5 activity inhibitor included in the composition of the present invention (i) inhibits the formation of degenerative neurons in brain tissue, or (ii) neurons Inhibit the expression of caspase-3 or PARP (Poly ADP ribose polymerase).
  • the PDE 5 inhibitor may be administered to a subject in need of inhibition of apoptosis of brain neurons at a dose of 0.5-2 mg / kg (see Example 1). Such administration may be once daily.
  • the PDE 5 inhibitor can be administered to the individual at a dose of 1-2 mg / kg.
  • the composition of the present invention may be administered to an individual from 24-72 hours after apoptosis induction of brain neurons.
  • the first administration time of the composition of the present invention is 24 to 168 hours after the induction of apoptosis of brain neurons. In one particular embodiment, the time of first administration of the composition of the invention is 24 to 72 hours after induction of apoptosis of brain neurons.
  • Example 2 When administered as described above, as shown in Example 2 below it can obtain the optimal neuronal protective effect. Such administration may be once daily.
  • apoptosis induction of the brain neurons may be caused by brain injury (eg, ischemic brain injury).
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the invention is administered orally to a subject or non-orally administered to a site other than the head. That is, the composition of the present invention may exhibit the effect intended in the present invention even when it is not directly administered to the brain tissue, body tissue (eg, scalp) surrounding the brain tissue and the region adjacent thereto.
  • the non-oral administration is subcutaneous administration, intravenous administration, intraperitoneal infusion, transdermal administration or intramuscular administration, and in another specific embodiment, subcutaneous administration, intravenous administration or intramuscular administration.
  • the blood-brain barrier (BBB) is the only structure of the central nervous system (CNS) that isolates the brain from systemic blood circulation.
  • BBB effectively protects the brain by preventing many substances (pigments, drugs, toxins, etc.) from circulating in the blood, but on the other hand it is a major obstacle in pharmacological treatment of brain diseases.
  • histopathological evaluation of cerebral tissue after subcutaneous injection of a PDE 5 inhibitor into the subject showed a decrease in cerebral atrophy, a decrease in degenerative neurons by administration of the PDE 5 inhibitor, Inhibition of capase-3 expression and PARP expression, which are apoptosis markers, were confirmed.
  • PDE 5 inhibitors that are not administered directly to the brain region show direct pharmacological effects on brain cells or tissues, ie, direct pharmacological action on the brain through the BBB.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, films, or capsules, and may further include a dispersing agent or a stabilizer.
  • the composition of the present invention may have a film formulation.
  • the film may be referred to as a strip, an orally dissolving film, an orally disintegrating film, or the like, and is dissolved in the oral cavity of the tongue, oral mucosa, and sublingual. It means a formulation to.
  • film formulations have the advantage that they can be taken without water.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising: (i) a phosphodiesterase type 5 activity inhibitor; And (ii) provides a dietary supplement for inhibiting apoptosis (apoptosis) of brain neurons comprising a food supplement acceptable food supplement.
  • the dietary supplement of the present invention includes the PDE 5 inhibitor described above, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the health functional food of the present invention is not particularly limited thereto, but all types of foods such as health functional foods, nutritional supplements, nutrients, pharmafood, health food, nutraceutical, designer food, food additives, Preferably, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages and vitamins Combination agents and the like.
  • the health functional food of the present invention includes not only PDE 5 inhibitors as active ingredients, but also components commonly added in food production, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings, and flavoring agents.
  • examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.
  • natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • the food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), dietary ingredients, flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof. , Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the food of the present invention is very useful for inhibiting apoptosis of brain neurons, and for preventing and treating cerebral neurological diseases.
  • Myrodenafil (mirodenafil 2HCl; SK Chemical Life Science Business, Korea) was used for the experiment.
  • Myrodenafil is a white powder that dissolves well in saline.
  • Mirdenafil was stored in a refrigerator at 4 ° C. to protect it from light and moisture.
  • Myrodenafil was dissolved in physiological saline at 0.5, 1 and 2 mg / ml, and then administered subcutaneously at a dose of 1 ml per kg to the dorsal skin of rats once a day for 24 days from 24 hours after the procedure.
  • Each control group received the same amount of saline instead of mirdenafil.
  • Citrate buffer antigen recovery pretreatment was performed according to the method disclosed in 41: 1599-604 (1993). Briefly, preheat a bath containing a staining dish containing 10 mM citrate buffer (pH 6.0) to 95-100 ° C., dip the slide into the staining dish, loosen the lid on the dish and incubate for 20 minutes, After placing the dyeing dish at room temperature, the slides were cooled for 20 hours. After epitope recovery, the sections were immunostained according to the following steps:
  • each section was treated at 4 ° C with primary anti-cleaved caspase-3 (Asp175) polyclonal antibody, dilution 1: 400; Anti-cleaved PARP (Asp214) rat specific antibody, dilution 1: 100. After incubation overnight, washing with 0.01 M PBS for 3 minutes;
  • Histomorphometry Neurons filled with at least 10% immunoreactivity against Caspase-3 and PARP (Poly ADP ribose polymerase) were considered immunoreactive. The number of Caspase-3 and PARP immunoreactive cells present in mm2 of the ipsilateral periphery of the cerebral cortex was measured using an image analysis program.
  • Rats were sacrificed 29 days after the neuronal cell killing treatment.
  • the brain is removed and washed with PBS (pH 7.4), followed by continuous 6 in the range of 2 to 14 mm from the frontal brain pole using a brain stainless steel coronal matrix (Harvard, USA).
  • the dog was divided into coronal sections (2 mm thick).
  • the brain sections prepared using the stainless steel head matrix were fixed in 10% NBF (without TTC staining).
  • H & E (hematoxylin and eosin) staining was performed for histopathological examination of cerebral cortex. Under H & E staining, histomorphometry was used to calculate the number of cerebral atrophic% and degenerative neurons (appearing as eosinophils). We did not provide histopathologists with information about group ubiquity for analysis.
  • Tissue morphology measurement The percent atrophy of the ipsilateral cerebral cortex compared to the intact contralateral hemisphere of the prepared tissue staining sample was calculated according to the following equation. In addition, the number of degenerative neurons per unit area (mm 2 ) was measured.
  • Brain atrophy formation (area of contralateral cerebral cortex-area of ipsilateral cerebral cortex) / contralateral cerebral cortex area X 100
  • Body weight gain during 29 days after neuronal cell death (weight after 29 days of neuronal cell death-body weight every day of neuronal cell death)
  • Limb Placement Examination Forelimb and hindlimb placement were assessed independently. To examine the forelimb placement, grasp the torso while freeing the forefoot of the rat, slowly move it to the edge of the table top, stop the short touch of the rat whisker (for visually induced placement), and touch the rat whisker (mouse induced placement). Light) in front of the forefoot to the edge of the table top (for tactile induced placement) and pushed the forefoot to the edge of the table with increased pressure (for high water soluble induced placement). Hind limb placement was also evaluated according to the above method. Each limb's response to visual, whisker, tactile, and hypersoluble stimuli was scored according to the following criteria (12 points in the forelimb test and 6 points in the hindlimb test for the maximum nerve defect and 0 for normal behavior). do):
  • Body swing test The test animal was held about 2 cm from the tip of the tail and increased by 1 inch above the table surface. The swing was recorded each time the rat moved more than 10 ° from the vertical axis and then returned to the vertical position. A total of 30 revolutions per animal was counted. After inducing neuronal cell death in the right hemisphere, the experimental animals tended to rotate toward the opposite brain (left), so the recovery rate was measured and the percentage of rotation to the right was recorded along with the score record of the intact animal.
  • a water test J Neurosci Methods. 11: 47-60 (1984) was performed. After 14 and 28 days after induction of neuronal cell death, the cells were carried out three times at 10 minute intervals in a dark colored tank (150 cm diameter X 50 cm height) filled with water at a temperature of 22.0 ⁇ 1.0 ° C. A 15 ⁇ 30 cm underwater platform (2 mm below the water surface) was placed in the northwest quadrant of the tank. The release point was always south of the tank. The experimental animals were obtained while facing the tank wall and released. The swimming route of the experimental animals in each run was recorded using a camera tracking system (Smart junior, PanLab, Spain) and the distance (m) and time (seconds) traveled to reach the escape platform were calculated. It was.
  • a camera tracking system Smart junior, PanLab, Spain
  • Percent change compared to neuronal cell death control [((Data of mirdenafil treatment group-Data of neuronal cell death control group) / Data of neuronal cell death control group) X 100]
  • the neuronal cell death control group showed significant atrophy of the right cerebral hemisphere injured compared to the sham control group and degenerative neurons, caspase-3 and PARP immune responses in the cerebral cortex per unit area (mm2). An increase in the number of cells was confirmed. On the other hand, in the 0.5 mg / kg group of mirodenafil, significant decreases in the number of degenerative neurons, caspase-3, and PARP immune cells in the cerebral cortex were observed. There was a significant inhibition of cerebral cortical atrophy in the group of mirodenafil 1 and 2 mg / kg compared to the control group (p ⁇ 0.01), and the number of degenerative neurons, caspase-3 and PARP immune cells in the cerebral cortex was also significantly decreased. (P ⁇ 0.01; Table 2 and FIG. 1).
  • the degree of atrophy of the right cerebral hemisphere, which is the injury site was -8.70, -46.42 and -53.31%, respectively, compared to the control group.
  • the number of degenerative neurons per unit area in the right cerebral cortex of the damaged area was -44.47, -73.46 and -76.54%, respectively, compared to the control group.
  • the number of caspase-3 immune-responsive neurons per unit area in the right cerebral cortex of the damaged area was -33.43, -76.44 and -77.96%, respectively, compared to the control group.
  • PDE 5 inhibitors such as mirdenafil exhibit neuroprotective activity through inhibition of brain neuronal cell death.
  • the forelimb placement test scores were -3.61, -10.34, -12.82, -11.11, and -12.90% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of injury induction, respectively, compared to the control group. The change was shown.
  • the forelimb placement test scores were -18.07, -29.89, -32.05, -41.67, and -56.45% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of injury induction, respectively, compared to the control group. It was.
  • the forelimb placement test scores were -25.30, -34.48, -39.74, -43.06, and -58.06% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of injury-induced changes, respectively, compared to the control group. It was.
  • the hind limb placement test scores were -6.98, -8.57, -9.68, -13.33, and -11.11% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of injury induction compared to the control group, respectively. The change was shown.
  • the hind limb placement test scores were -18.80, -28.57, -32.26, -43.33, and -59.26% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of injury induction compared to the control group, respectively. Indicated.
  • the hind limb placement test scores showed changes of -23.26, -34.29, -41.94, -46.67 and -59.26% after 3, 7, 14, 21 and 28 days of injury induction, compared to the control group. Indicated.
  • the number and ratio of body swings to the right side were 16.67, 9.09, 44.83, 50.00, and 44.19% after 3, 7, 14, 21, and 28 days of inducing injury, respectively, compared to the control group. Change.
  • the number and percentage of body swings to the right in the myrodenafil 1 mg / kg group showed a change of 50.00, 40.91, 100.00, 102.78 and 167.44% after 3, 7, 14, 21 and 28 days of injury, respectively, compared to the control group. It was.
  • the distance from the tank to the platform in the water labyrinth compared to the control group was -7.93,-in the second and third trials 14 days after the injury and 28 days after the injury. 9.42, -9.80, -14.02 and -17.56% were changed, and the travel time to the platform was -10.47, -18.37, -11.45, -22.23 and -29.16%, respectively.
  • the distance from the tank to the platform in the water labyrinth compared to the control group was -11.07, -19.20,-in the second and third trials 14 days after the injury and 28 days after the injury. 13.80, -28.51 and -47.33% change, and the travel time to the platform was -12.52, -24.82, -16.98, -31.11 and -44.46%, respectively.
  • the distance from the tank to the platform in the water labyrinth compared to the control group was -12.54, -20.37,-in the second and third trials 14 days after the injury and 28 days after the injury. 14.01, -29.65 and -44.14%, and the travel time to the platform was -12.06, -25.90, -17.06, -31.28 and -45.32%, respectively.
  • Myrodenafil (mirodenafil 2HCl; SK Chemical Life Science Business, Korea) was used for the experiment.
  • Myrodenafil is a white powder that dissolves well in saline.
  • Mirdenafil was stored in a refrigerator at 4 ° C. to protect it from light and moisture.
  • Myrodenafil was dissolved in physiological saline at a concentration of 1 mg / ml, and then administered subcutaneously at a dose of 1 ml per kg to the dorsal skin once a day for 14 days from 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the same amount of saline instead of mirdenafil was administered subcutaneously for 24 to 20 days after the procedure.
  • Citrate buffer antigen recovery pretreatment was performed according to the method disclosed in 41: 1599-604 (1993). Briefly, preheat a bath containing a staining dish containing 10 mM citrate buffer (pH 6.0) to 95-100 ° C., dip the slide into the staining dish, loosen the lid on the dish and incubate for 20 minutes, After placing the staining plate at room temperature, the slides were cooled for 20 minutes. After epitope recovery, fragments were immunostained using the avidin-biotin complex (ABC) method for caspase-3 and PARP.
  • ABS avidin-biotin complex
  • Rats were sacrificed 29 days after the neuronal cell killing treatment.
  • the brain is removed and washed with PBS (pH 7.4), followed by continuous 6 in the range of 2 to 14 mm from the frontal brain pole using a brain stainless steel coronal matrix (Harvard, USA).
  • the dog was divided into coronal sections (2 mm thick).
  • the prepared sixth cerebral sections were fixed directly to 10% NBF.
  • paraffin was embedded, cut in cross sections, and subjected to H & E staining for histopathological examination of cerebral cortex. Under H & E staining, histomorphometry was used to calculate the number of cerebral atrophic% and degenerative neurons (appearing as eosinophils). We did not provide histopathologists with information about group ubiquity for analysis.
  • Tissue morphology measurement The percent atrophy of the ipsilateral cerebral cortex compared to the intact contralateral hemisphere of the prepared tissue stain sample was calculated according to Equation 4 below. In addition, the number of degenerative neurons per unit area (mm2) was measured.
  • Brain atrophy formation (area of contralateral cerebral cortex-area of ipsilateral cerebral cortex) / contralateral cerebral cortex area X 100 (%)
  • Body weights were measured one day before the induction of neuronal death, on the day of induction and on days 1, 7, 14, 21, 28 and 29 post-induction. In order to reduce the difference between animals, the weight gain and continuous administration of test substance after neuronal cell death was calculated according to Equation 5 below.
  • Body weight gain during 29 days after neuronal cell death (weight after 29 days of neuronal cell death-body weight every day of neuronal cell death)
  • Limb Placement Examination Forelimb and hindlimb placement were assessed independently. To examine the forelimb placement, grasp the torso while freeing the forefoot of the rat, slowly move it to the edge of the table top, stop the short touch of the rat whisker (for visually induced placement), and touch the rat whisker (mouse induced placement). Light) in front of the forefoot to the edge of the table top (for tactile induced placement) and pushed the forefoot to the edge of the table with increased pressure (for high water soluble induced placement). Hind limb placement was also evaluated according to the above method. Each limb's response to visual, whisker, tactile, and hypersoluble stimuli was scored according to the following criteria (12 points in the forelimb test and 6 points in the hindlimb test for the maximum nerve defect and 0 for normal behavior). do):
  • Body swing test The test animal was held about 2 cm from the tip of the tail and increased by 1 inch above the table surface. The swing was recorded each time the rat moved more than 10 ° from the vertical axis and then returned to the vertical position. A total of 30 revolutions per animal was counted. After inducing neuronal cell death in the right hemisphere, the experimental animals tended to rotate toward the opposite brain (left), so the recovery rate was measured and the percentage of rotation to the right was recorded along with the score record of the intact animal.
  • a water test J Neurosci Methods. 11: 47-60 (1984) was performed. After 14 and 28 days after induction of neuronal cell death, the cells were carried out three times at 10 minute intervals in a dark colored tank (150 cm diameter X 50 cm height) filled with water at a temperature of 22.0 ⁇ 1.0 ° C. A 15 ⁇ 30 cm underwater platform (2 mm below the water surface) was placed in the northwest quadrant of the tank. The release point was always south of the tank. The experimental animals were obtained while facing the tank wall and released. The swimming route of the experimental animals in each run was recorded using a camera tracking system (Smart junior, PanLab, Spain) and the distance (m) and time (seconds) traveled to reach the escape platform were calculated. It was.
  • a camera tracking system Smart junior, PanLab, Spain
  • % change compared to sham control [((Data of neuronal cell death control-data of sham control) / data of sham control) X 100]
  • Percent change compared to neuronal cell death control [((Data of mirdenafil treatment group-Data of neuronal cell death control group) / Data of neuronal cell death control group) X 100]
  • a decrease in the number of -3 and PARP immune-responsive cells was also observed, and in the experimental group treated with mirodenafil 1 mg / kg from 168 hours after the procedure, significant (p ⁇ 0.05) inhibition of atrophy of cerebral hemispheres and degeneration in cerebral cortex were observed.
  • a decrease in the number of neurons and PARP immune response cells was confirmed, and a significant reduction in caspase-3 immune response cells was also confirmed (Table 9 and FIG. 3).
  • the degree of atrophy of the right cerebral hemisphere, the induced site was changed to 1581.66% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but from 24, 72 and 168 hours after the procedure (induced neuronal cell death through right cerebral hemisphere injury).
  • the experimental group administered with mirodenafil 1 mg / kg showed -60.71, -26.37 and -12.31% change compared to the neuronal cell death control group, respectively.
  • the number of degenerative neurons per unit area in the induced cerebral cortex was 1625.83% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / kg of mirdenafil was administered 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the experimental group showed -70.64, -45.90 and -15.40% changes compared to the neuronal cell death control group, respectively.
  • the number of caspase-3 immunoreactive neurons per unit area in the induced cerebral cortex was 1360.00% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / of mirdenafil after 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the experimental group administered kg showed changes of -57.29, -40.63 and -15.57%, respectively, compared to the neuronal cell death control group.
  • the number of PARP immunoreactive neurons per unit area in the induced cerebral cortex was 983.59% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / kg of mirdenafil after 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the experimental group administered showed changes of -53.92, -39.72 and -15.68%, respectively, compared to the neuronal cell death control group.
  • PDE 5 inhibitors such as mirdenafil exhibit neuroprotective activity through inhibition of brain neuronal cell death.
  • the forelimb placement test score showed a change of 800.00% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but in the experimental group administered with mirodenafil 1 mg / kg from 24, 72 and 168 hours after the procedure, Compared to the cell death control group, the changes were -57.41, -29.63, and -11.11%, respectively.
  • the hind limb placement test score after 28 days of treatment showed a change of 1050.00% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but in the experimental group administered myrodenafil 1 mg / kg from 24, 72 and 168 hours after the procedure, Compared to the apoptosis control group, the changes were -65.22, -39.13, and -17.39%, respectively.
  • the number and ratio of body swings to the right surgical site after 28 days showed a change of -59.35% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / of mirdenafil from 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the experimental group administered kg showed changes of 82.00, 48.00 and 14.00%, respectively, compared to the neuronal cell death control group.
  • the distance and time from the tank to the evacuation platform was significantly reduced with each run, while the neuronal cell death control group moved to a significant (p ⁇ 0.01) platform compared to the sham control group.
  • the increase of was recognized 28 days after the procedure, the shortening of the moving distance and time according to the number of times was also significantly suppressed.
  • the reduction in the distance and time to the significant (p ⁇ 0.01 or p ⁇ 0.05) platform compared to the neuronal cell death control group was 2 days after the procedure. Although all were recognized in each run, in the experimental group administered 1 mg / kg of mirdenafil from 168 hours after the procedure, no significant change in distance and time to the platform compared to the neuronal cell death control group was observed (FIG. 8).
  • the average distance traveled from the tank to the platform after 28 days of treatment showed a change of 85.74% in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / kg of mirdenafil after 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • the experimental group administered showed changes of -26.45, -16.05 and -6.42%, respectively, compared to the neuronal cell death control group.
  • the mean migration time from the water maze tank to the platform showed a 79.67% change in the neuronal cell death control group compared to the sham control group, but 1 mg / kg of mirdenafil was administered 24, 72 and 168 hours after the procedure.
  • One experimental group showed changes of -24.49, -17.33 and -5.36%, respectively, compared to the neuronal cell death control group.
  • the results of this experiment showed that significant neuronal weight loss, neurological and cognitive motor behavioral impairment due to neuronal cell death due to brain injury, ie increased limb placement test score, decreased number and ratio of body swing to the right, and avoidance platform. Increasing the movement distance and time of the rats and suppressing the reduction of the movement distance and the time due to the repetitive implementation were confirmed. Histopathological specimen induced atrophy of the right cerebral hemisphere, degenerative neurons per unit area in the cerebral cortex, caspase-3 and PARP positive. An increase in the number of neurons has resulted.
  • Limb placement test is a typical neurological motor behavior test that grades the placement of the cell and the Fuji, and the higher the grade, the more severe the neurological motor behavior.
  • the body swing test is a frequently used neurological motor behavior test. In the normal animal, the body swing to the left and the right is approximately 5: 5, whereas in the animal with ischemic brain injury, the body swing to the injury site is significantly reduced. (Roof et al., 2001; Menniti et al., 2009).
  • the water maze test is the most commonly used cognitive motor behavior test, and in the case of cognitive behavioral disorders, the distance and time to the avoiding platform is significantly extended, and the distance and time decrease, especially when repeated. Is significantly suppressed.
  • Caspase-3 and PARP are representative apoptosis markers (Nunez et al., 1998; Barrett et al., 2001), and an increase in these caspase-3 and PARP in the cerebral cortex indicates an increase in brain damage by apoptosis.
  • the increase in the number of cerebral cortical caspase-3 and PARP immune-responsive cells was significantly inhibited in the experimental group administered with mirdenafil from 24, 72 and 168 hours after the procedure. Therefore, when starting from 24-168 hours after brain injury, PDE 5 inhibitors were observed to show some neuroprotective effect at the periphery of brain injury, but the neuroprotective effect was observed to be lowered later in the administration.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물, 건강기능식품 및 아폽토시스 억제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, PDE 5 저해제는 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제함으로써 신경세포 보호 작용을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 뇌신경질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물
본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스(apoptosis) 억제용 조성물, 건강기능식품 및 아폽토시스 억제방법 에 관한 것이다.
포스포디에스테라제(phosphodiesterase, PED)는 세포에서 사이클릭 AMP 및/또는 사이클릭 GMP를 각각 5-AMP 및 5-GMP로 가수분해 시키는 것을 촉매하는 효소이며, 이로써 이들은 cAMP 또는 cGMP 수준의 세포성 조절에 중요하다. PDE는 지금까지 모두 11종이 알려져 있다(Nature, 674-682(2002)). 상기 PDE 중에서 PDE 5는 cGMP를 분해하여 5'-GMP를 생성하는 효소이므로, 이를 저해하면 cGMP의 농도를 유지하여 발기가 지속되는 것으로 보고되었다(Boolel, M. et al., Br. J. of Urology, 78, 257-261(1996)). 이에 따라, PDE 5 저해제는 발기부전 치료제로서 사용되고 있다.
이와 같은 PDE 5 저해제는 많은 화합물들이 알려져 있다. 비아그라TM(일반명 : 실데나필; WO 94/28902)가 미국 FDA에 의해서 최초의 남성용 발기부전 치료제로 승인되었으며, 또한 시알리스TM(일반명 : 타달라필; WO 95/19978) 및 레비트라TM(일반명: 발데나필; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters)가 허가되었다. PDE 5 저해제로서 엠빅스TM(일반명: 미로데나필; KR0358083) 역시 알려져 있다. 상기 약제들은 우수한 치료효과를 보여 환자의 약 70%에서 성기능을 개선하는 것으로 알려져 있다. PDE 5 저해제의 다른 의약용도로서 문맥성 고혈압, 간-신장 증후군, 간-폐 증후군에 대한 치료효과가 알려져 있으며(한국공개특허 제10-2012-0024807호), 포유동물의 생식능력을 개선시키는 효과 역시 보고되었다(한국공개특허 제10-2002-0031062호).
또한, PDE 5 저해제인 실데나필 및 바르데나필이 B-만성 림프구성 백혈병 세포(B-chronic lymphocytic leukemia cells)의 caspase-의존적 아폽토시스를 유도한다는 사실이 보고된바 있다(Marika Sarfati et al., BLOOD, VOLUME 101, NUMBER 1(2003)).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 PDE 5 저해제에 대한 연구를 하던 중, PDE 5 저해제가 뇌 신경세포에서는 오히려 아폽토시스를 억제함을 발견하였다. 구체적으로, 뇌 손상으로 신경세포의 아폽토시스가 유발된 동물모델에 PDE 5 저해제를 투여한 결과, 뇌 신경세포의 아폽토시스가 현저히 억제되었으며, 신경세포의 아폽토시스 억제를 통한 신경세포 보호 효과를 통하여 동물모델의 인지 및 운동기능의 저하가 개선됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 PDE 5 저해제를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물, 건강기능식품 및 아폽토시스 억제방법을 제공한다.
(ii) 본 발명에 따르면, PDE 5 저해제는 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제함으로써 신경세포 보호 작용을 나타낸다.
(iii) 본 발명의 조성물은 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제를 통하여 뇌신경질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있다.
도 1은 미로데나필의 신경세포 보호 효과(뇌 위축성, 퇴행성 뉴런, Caspase-3 및 PARP)를 보여주는 조직병리학적 사진이다.
A: Sham 대조군,
B: 신경세포 사멸 대조군,
C: 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군,
D: 미로데나필 1 mg/kg 투여군,
E: 미로데나필 2 mg/kg 투여군,
스케일 바 = 100 μm,
화살표는 근위부 중대뇌동맥을 나타낸다.
도 2는 미로데나필 처리에 따른 동물모델의 체중변화를 보여준다.
도 3은 미로데나필의 신경세포 보호 효과(뇌 위축성, 퇴행성 뉴런, Caspase-3 및 PARP)를 보여주는 뇌 절편의 조직병리학적 사진이다.
A: Sham 대조군,
B: 신경세포 사멸 대조군,
C: 시술 후 24시간부터 미로데나필 1 mg/kg 투여한 실험군,
D: 시술 후 72시간부터 미로데나필 1 mg/kg 투여한 실험군,
E: 시술 후 168시간부터 미로데나필 1 mg/kg 투여한 실험군,
스케일 바 = 100 μm,
화살표는 신경세포 사멸 시술(대뇌 손상)의 동측면을 나타낸다.
도 4는 미로데나필 처리시기에 따른 동물모델의 체중변화를 보여준다.
도 5는 미로데나필 처리시기에 따른 앞다리 배치 검수의 변화를 보여준다.
LSD 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 ap<0.01,
LSD 테스트에 의한 신경세포 사멸 대조군과 비교하여 bp<0.01,
MW 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 cp<0.01.
도 6은 미로데나필 처리시기에 따른 뒷다리 배치 검수의 변화를 보여준다.
LSD 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05,
LSD 테스트에 의한 신경세포 사멸 대조군과 비교하여 cp<0.01,
MW 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 dp<0.01.
도 7은 미로데나필 처리시기에 따른 보디 스윙의 변화를 보여준다. 값은 8마리 랫트의 mean±SD로 표현하였다.
LSD 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 ap<0.01,
LSD 테스트에 의한 신경세포 사멸 대조군과 비교하여 bp<0.01.
도 8은 미로데나필 처리시기에 따른 인지적 운동 행동(물미로 검사)의 변화를 보여준다. 값은 8마리 랫트의 mean±SD로 표현하였다.
LSD 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05,
LSD 테스트에 의한 신경세포 사멸 대조군과 비교하여 cp<0.01, dp<0.05,
LSD 테스트에 의한 sham 대조군과 비교하여 ep<0.01,
LSD 테스트에 의한 신경세포 사멸 대조군과 비교하여 fp<0.01 및 gp<0.05.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제의 약제학적 유효량; 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제를 포함하는 조성물을 유효량으로 이를 필요로 하는 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제를 포함하는 조성물을 유효량으로 이를 필요로 하는 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 인지기능장애 또는 운동기능장애를 개선시키는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 PDE 5 저해제에 대한 연구를 하던 중, PDE 5 저해제가 뇌 신경세포에서는 오히려 아폽토시스를 억제함을 발견하였다. 구체적으로, 뇌 손상으로 신경세포의 아폽토시스가 유발된 동물모델에 PDE 5 저해제를 투여한 결과, 뇌 신경세포의 아폽토시스가 현저히 억제되었으며, 신경세포의 아폽토시스 억제를 통한 신경세포 보호 효과를 통하여 동물모델의 인지 및 운동기능의 저하가 개선됨을 확인하였다.
본 명세서에서 용어, “포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제”또는 “PDE 5 저해제”는 PDE 5의 촉매작용을 선택적으로 또는 비선택적으로 억제 또는 감소시킬 수 있는 물질을 의미한다. 상기 PDE 5 저해제는 화합물, 펩타이드, 소분자, 항체 또는 이의 단편, 및 천연 추출물을 포함한다.
하나의 특정예에서, 상기 PDE 5 저해제는 화합물이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 PDE 5 저해제는 미로데나필(mirodenafil), 실데나필(sildenafil), 바르데나필(vardenafil), 타달라필(tadalafil), 유데나필(udenafil), 다산타필(dasantafil), 아바나필(avanafil); 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 특정예에서, 상기 PDE 5 저해제는 미로데나필, 실데나필, 바르데나필 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염이다.
상기 약제학적으로 허용되는 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용 가능한, 실질적으로 비독성인 유기산 및 무기산을 이용하는 당 업계에 잘 알려진 통상의 방법으로 제조된다. 상기 산은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산; 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기산을 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜 암모니움 염; 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염; 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염; 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염; 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성할 수도 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 약제학적으로 허용되는 염은 미로데나필 염산염, 실데나필 구연산염 또는 바르데나필 염산염이다.
상기 수화물(hydrate)은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.
상기 용매화물(solvate)은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.
하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 상기 PDE 5 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제하여 신경세포를 보호한다. 본 명세서에서 용어, “신경세포”는 중추 신경계, 뇌, 뇌간, 척수, 중추 신경계와 말초 신경계의 접합부분 등의 구조를 이루는 뉴런, 신경지지 세포, 글리아, 슈만 세포 등을 포함한다. 본 명세서에서 용어, "신경 세포의 보호"는 신경성 인설트(nervous insult)를 경감 또는 개선(amelioration)하는 작용, 또는 신경성 인설트에 의한 신경세포의 아폽토시스를 경감 또는 억제하는 작용, 또는 신경성 인설트를 입은 신경 세포의 보호 또는 회복시키는 작용을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 용어, "신경성 인설트"는 다양한 원인(예: 외상성 뇌손상과 같은 외부요인, 유전적 원인, 대사성 원인, 독성 원인, 신경 독성 원인, 생리적 원인 및 생화학적 원인 등)에 의해 초래되는 신경 세포 또는 신경 조직의 손상을 의미한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 조성물은 뇌신경질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다. 본 명세서에서 용어, “예방”은 개체(subject)에서 뇌신경질환의 가능성/위험을 감소시키거나, 개체에서 뇌신경질환의 발생을 지연시키거나, 또는 이들의 조합을 의미한다. 본 명세서에서 용어, “치료”는 개체에서 발생된 뇌신경질환의 발전을 억제시키거나, 개체에서 발생된 뇌신경질환의 증상을 감소(완화)시키거나, 개체에서 발생된 뇌신경질환을 제거하거나, 또는 이들의 조합을 의미한다. 본 명세서에서 용어 “개선”은 용어 “치료”와 동일한 의미로서 사용된다. 본 발명의 약제학적 조성물로 예방 또는 치료되는 “개체”는 인간 또는 인간 이외의 동물을 의미하며, 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 뇌신경질환은 신경 퇴행성 질환, 허혈성 뇌졸중, 인지기능장애 및 운동기능장애로 구성된 군으로부터 선택된 질환이다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 상기 신경 퇴행성 질환은 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한다. 상기 치매는 AIDS 유발 치매, 루이소체 치매, 전두측두엽성 치매, 다발성 경색성 치매, 의미치매, 알츠하이머성 치매 및 혈관성 치매를 포함한다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 상기 인지기능장애는 기억력 감퇴, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 및 섬망을 포함한다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 상기 운동기능장애는 운동장애(motor disturbance), 마비, 운동실조(ataxia), 이상운동증(dyskinesia), 경직(spasticity) 및 근육긴장이상(dystonia)을 포함한다. 상기 운동장애는 일반적으로 몸의 수의적(隨意的) 운동, 예를 들면 사지, 몸통, 목, 얼굴, 안면, 혀 등을 움직이는 운동이 자의로 잘 안 되는 상태를 의미한다. 상기 마비는 신경이나 근육이 형태의 변화 없이 기능을 잃어버리는 상태로서, 감각이 없어지거나 움직일 수 없는 상태를 의미한다. 이러한 마비는 증상에 따라 움직일 수 없는 상태를 주 증상으로 하는 운동 마비와 감각이 없어지는 감각 마비로 나눌 수 있으며, 단마비, 편마비, 대마비 및 사지마비를 포함한다.
상기 운동실조는 근력이 정상적으로 유지되고 있음에도 불구하고 운동에 관여하는 근군(筋群)의 상호협조가 유지되지 않고 원활한 운동에 장애를 받고 있는 상태를 의미한다. 상기 이상운동증은 수의적인 움직임이 감소되고 불수의적인 움직임(틱이나 무도증 등)이 나타나는 현상을 의미한다. 상기 경직은 신장 반사의 과흥분으로 인한 근육 신장(늘림) 속도에 비례하여 증가하는 근육 긴장을 의미한다. 여기서 신장 반사란 골격근을 지속적으로 신장할 때 그 신장에 저항하듯 신장된 근육에 반사적으로 수축이 일어나 긴장이 고조되는 현상을 말한다. 상기 근육긴장이상은 지속적인 근육 수축에 의해 신체의 일부가 꼬이거나 반복적인 운동이나 비정상적인 자세를 보이는 등의 증상들을 총칭하는 의미이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 야기된 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 외상성 뇌손상에 의한 신경세포의 사멸에 의하여 야기되는 신경학적 및 인지적 운동행동 장애를 개선하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 (i) 뇌 조직에서 퇴행성 뉴런(degenerative neuron)의 형성을 억제하거나, 또는 (ii) 신경세포에서 caspase-3 또는 PARP(Poly ADP ribose polymerase)의 발현을 억제한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 PDE 5 저해제는 뇌 신경세포의 아폽토시스의 억제가 필요한 개체(subject)에게 0.5-2 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다(실시에 1 참조). 이러한 투여는 하루에 1회 이루어질 수 있다.
하나의 특정예에서, 상기 PDE 5 저해제는 개체에게 1-2 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 뇌 신경세포의 아폽토시스 유발 24-72시간 후부터 개체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물의 최초 투여 시기는 뇌 신경세포의 아폽토시스 유발 후 24 내지 168시간이다. 하나의 특정예에서, 본 발명의 조성물의 최초 투여 시기는 뇌 신경세포의 아폽토시스 유발 후 24 내지 72시간이다.
상기와 같이 투여하는 경우, 하기 실시예 2에 나타난 바와 같이 최적의 신경세포 보호효과를 얻을 수 있다. 이러한 투여는 하루에 1회 이루어질 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 뇌 신경세포의 아폽토시스 유발은 뇌손상(예컨대, 허혈성 뇌손상)에 의하여 야기될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상(subject)에게 경구투여 되거나, 또는 두부(head) 이외의 부위로 비-경구투여 된다. 즉, 본 발명의 조성물은 뇌 조직, 뇌 조직을 감싸고 있는 신체조직(예컨대, 두피) 및 이와 인접한 부위로 직접 투여되지 않는 경우에도 본 발명에서 의도한 효과를 나타낼 수 있다. 하나의 특정예에서, 상기 비-경구투여는 피하 투여, 정맥 내 투여, 복강 주입, 경피 투여 또는 근육 내 투여이고, 다른 특정예에서는 피하 투여, 정맥 내 투여 또는 근육 내 투여이다. 이와 관련하여, 뇌혈관장벽(blood-brain barrier, BBB)은 전신 혈액 순환으로부터 뇌를 격리시키는 중추신경계(CNS)의 유일한 구조이다. BBB는 혈액 내에서 순환하는 많은 물질(색소, 약물, 톡신 등)이 뇌에 접근하는 것을 방지하여 뇌를 효과적으로 보호하지만, 다른 한편으로는 뇌 질환의 약리학적 치료에 있어서 주요 장애가 된다. 그러나, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, PDE 5 저해제를 개체에게 등부 피하 주사한 후 대뇌조직에 대한 조직병리학적 평가를 실시한 결과, PDE 5 저해제 투여에 의한 대뇌 위축의 감소, 퇴행성 뉴런의 감소, 아폽토시스 마커인 capase-3 발현 억제 및 PARP 발현 억제를 확인하였다. 이러한 결과는, 뇌 부위로 직접 투여되지 않은 PDE 5 저해제가 뇌 세포 또는 조직에 직접적인 약리효과를 나타내어, 즉 BBB를 통과하여 뇌에 직접적인 약리작용을 나타내는 것으로 볼 수 있다. 이러한 결과는 일반적으로 약물이 BBB를 통과하기 어렵다는 점 및 이에 따라 뇌 조직에서 직접적인 약리효과를 나타내기 어렵다는 당업계에 주지된 사실을 고려하여 볼 때 놀라운 결과이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 필름 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제가 경구투여 되는 경우 본 발명의 조성물은 필름 제형을 가질 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 필름은 스트립(strip), 구강용해필름(orally dissolving film), 구강붕해필름(orally disintegrating film) 등으로 명명될 수 있으며, 혀 위, 구강점막, 설하 등 구강 내에 붙여 녹여 복용하는 제형을 의미한다. 이러한 필름 제형은 물 없이 복용 가능하다는 장점이 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제; 및 (ii) 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스(apoptosis) 억제용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 상술한 PDE 5 저해제를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 유효성분으로서 PDE 5 저해제뿐만 아니라, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 뇌 신경세포의 아폽토시스 억제, 및 뇌신경질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. PDE 5 저해제의 신경원(neuron) 보호효과
실험재료 및 실험방법
1. 실험동물의 준비
6주령의 100마리의 건강한 수컷 스프래그-돌리 랫트(체중 180-200g; SLC, 일본)를 100일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 20-25℃의 온도 및 50-55%의 습도로 우리 당 5마리의 랫트를 사육하였다. 암주기는 12hr:12hr로 하였고, 물과 음식(표준 설치류 먹이, 삼양, 한국)은 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다. 모든 동물은 실험동물 자원기관, 생명과학 위원회, 미국 국립 연구회의(1996)에 근거한 대구 한의대학교의 실험동물의 사육 및 사용 지침에 따라 다루었다. 구체적인 실험그룹은 하기와 같았다:
표 1
Figure PCTKR2013011180-appb-T000001
2. 시험물질의 준비 및 투여
미로데나필(mirodenafil 2HCl; SK Chemical Life Science Business, 한국)을 실험에 사용하였다. 미로데나필은 흰색 파우더로서 식염수에 잘 용해된다. 미로데나필을 빛과 습기로부터 보호하기 위하여 4℃의 냉장고에서 보관하였다. 미로데나필을 생리식염수에 0.5, 1 및 2 mg/㎖로 용해시킨 다음, 시술 24시간 후부터 28일 동안 하루 1회 랫트의 등부 피부에 kg 당 1㎖의 용량으로 피하투여 하였다. 각 대조군에는 미로데나필 대신 동량의 식염수를 투여하였다.
3. 신경세포 사멸(apoptosis) 동물모델의 제조
하기의 방법으로 실험동물의 대뇌 우반구에 손상을 가하여 신경세포의 사멸을 유도하였다. 구체적으로, 70% N2O와 28.5% O2가스에 2% 또는 3% 이소플루란을 혼합한 마취가스로 전신마취를 시킨 후 수술대에 고정하고, 안와와 외이도 사이에 가로로 우측 두부 피부를 절개하여 측두근을 노출시킨 후 안면신경과 안와골에 손상 없이 절제하여 측두골의 일부를 노출시켰다. 이후, 치과용 드릴을 이용한 측두하 절제술(subtemporal craniectomy)을 통하여 근위부 중대뇌동맥(proximal MCA)을 노출시켰다. 이후, 후삭 근처에서 대뇌 정맥 직하에서 마이크로바이폴라 응고법(microbipolar coagulation)을 실시하여, 근위부 중대뇌동맥을 영구적으로 폐쇄하였다. 흡입전신마취 후 직장온도계와 열 패드를 이용하여 체온을 일정하게 유지시켰으며, 전체적인 사망률은 5% 이하로 관찰되었다. Sham 대조군은 상기와 동일한 방법으로 근위부 중대뇌동맥을 노출시킨 다음 마이크로바이폴라 응고법을 실시하지 않고 창강을 폐쇄하였다.
4. 면역조직화학적 평가
대뇌 파리핀 조각(section)의 탈파라핀 후, 문헌 Shi SR et al., J Histochem Cytochem. 41:1599-604(1993)에 개시된 방법에 따라 시트레이트 버퍼 항원(epitope) 회수 전처리를 수행하였다. 간략히 설명하면, 10 mM 시트레이트 버퍼(pH 6.0)를 함유하는 염색 접시가 담긴 수조를 95-100℃로 예열하고, 슬라이드를 염색 접시에 담그고 접시 위에 뚜껑을 느슨하게 올려놓은 다음 20분 동안 인큐베이션하고, 염색 접시를 상온에 놓은 후 슬라이드를 20동안 식혔다. 에피토프 회수 후, 각 부분들을 하기 단계에 따라 면역염색 하였다:
각 부분들을 메탄올 및 0.3% H2O2와 함께 30분 동안 상온에서 인큐베이션하고, 3분 동안 0.01M PBS에서 세척(pH 7.2);
항습챔버에서 각 부분들을 정상 말 혈청 차단제(Vector Lab. Inc. 미국; 희석 1:100)와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 3분 동안 0.01M PBS로 세척;
항습챔버에서 각 부분들을 1차 항-혈청(Anti-cleaved caspase-3 (Asp175) polyclonal antibody, 희석 1:400; Anti-cleaved PARP (Asp214) rat specific antibody, 희석 1:100)과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 3분 동안 0.01M PBS로 세척;
항습챔버에서 각 부분들을 비오틴화 유니버셜 2차 항체(Vector Lab. Inc. 미국; 희석 1:50)와 함께 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 3분 동안 0.01M PBS로 세척;
항습챔버에서 각 부분들을 ABC 시약(Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab. 희석 1:50)과 함께 1시간 동안 상온에서 인큐베이션 후, 3분 동안 0.01M PBS로 세척;
각 부분들을 페록시다아제 기질 키트(Vector Lab.)에서 상온에서 5분간 인큐베이션 후, 3분 동안 0.01M PBS에서 세척;
Mayer's 헤마톡시린 용액으로 대비염색 후, 흐르는 물에서 30분 동안 세척;
95% 에탄올로 2분간, 100% 에탄올로 3분간 탈수 후, 자일렌으로 2회 투명화 작업; 및
영구 봉입제(permanent mounting medium)로 커버슬립 후, 광학현미경으로 관찰(니콘, 일본).
조직형태계측: Caspase-3 및 PARP(Poly ADP ribose polymerase)에 대하여 10% 이상의 면역반응성으로 채워진 신경세포들을 면역반응성으로 간주하였다. 동측성 손상 주변부위 대뇌피질의 mm2 중에 존재하는 Caspase-3 및 PARP 면역반응성 세포의 수를 이미지 분석프로그램을 사용하여 측정하였다.
5. 조직병리학적 평가
상기 신경세포 사멸 처치 29일 후에 랫트를 희생시켰다. 뇌를 제거하고 PBS(pH 7.4)로 세척한 다음, 뇌 스테인리스스틸 두부 매트릭스(brain stainless steel coronal matrix; Harvard, 미국)를 이용하여 전두극(frontal brain pole)으로부터 2 내지 14 mm 범위로 연속적인 6개의 관상단면(두께 2 mm)으로 나누었다. 스테인리스 스틸 두부 매트릭스를 이용하여 제조된 뇌 부분을 10% NBF에 고정시켰다(TTC 염색하지 않음). 이후, 대뇌피질의 조직병리학적 검사를 위하여 H&E (hematoxylin and eosin) 염색을 실시하였다. H&E 염색 하에서, 조직형태 계측(Histomorphometry)을 통하여 대뇌피질의 위축성 %(cerebral atrophic %) 및 퇴행성 뉴런(degenerative neurons; 호산구로 보이는)의 수를 계산하였다. 분석을 위하여 조직병리학자들에게 그룹의 편재에 대한 정보를 제공하지 않았다.
조직형태계측: 제조한 조직염색표본의 온전한 대측성(contralateral) 반구와 비교하여 동측성(ipsilateral) 대뇌피질의 위축 %를 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 또한, 단위면적당(mm2) 퇴행성 뉴런의 수를 측정하였다.
[수학식 1]
뇌 위축 형성 = (대측성 대뇌피질의 면적 - 동측성 대뇌피질의 면적)/대측성 대뇌피질 면적 X 100
6. 체중 측정
신경세포 사멸 유발 하루 전, 유발 당일 및 유발 후 1, 7, 14, 21, 28 및 29일에 체중을 측정하였다. 각 동물간의 차이를 줄이기 위하여 유발 후 체중 증가량과 연속적인 시험물질의 투여를 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
신경세포 사멸 유발 후 29일 동안의 체중 증가량 = (신경세포 사멸 유발 29일 후의 체중 - 신경세포 사멸 유발 각일의 체중)
7. 감각운동 기능 평가(sensorimotor function assessment) - 신경학적 운동행동 검사
감각운동 기능을 사지 배치 검사(limb placing test; de Ryck M et al., Stroke. 20:1383-90(1989)) 및 보디 스윙 검사(body swing; Borlongan and Sanberg, J Neurosci. 15:5372-8(1995))에 의하여 평가하였다. 기준을 얻기 위하여 검사를 신경세포 사멸 유발 하루 전에 수행한 후 유발 후 1, 3, 7, 14, 21 및 28일째에 수행하였다. 행동 검사는 약물투여 전에 완료하였다. 평가를 담당하는 조사관에게는 실험물질 처리에 대한 정보를 제공하지 않았다.
사지 배치 검사: 앞다리 및 뒷다리 배치를 독립적으로 평가하였다. 앞다리 배치 검사를 위하여, 랫트의 앞발을 자유롭게 하면서 몸통을 잡고 천천히 테이블 상단의 가장자리로 이동시키고, 랫트 수염의 짧은 터치를 멈추고(시각 유도된 배치를 위함), 랫트 수염을 터치하고(수염 유도된 배치를 위함), 상기 테이블 상단의 가장자리까지 앞발의 앞에 빛을 비추고(촉각 유도된 배치를 위함), 증가된 압력으로 테이블 가장자리로 앞발을 밀었다(고유수용성 유도된 배치를 위함). 뒷다리 배치 역시 상기 방법에 따라 평가하였다. 시각, 수염, 촉각 및 고유수용성 자극에 대한 각 사지의 반응을 하기 기준에 따라 점수화 하였다(앞다리 테스트에서 총 12점 및 뒷다리 테스트에서 6점은 최대 신경결손을 의미하고, 0점은 정상 행동을 의미한다):
정상 행동 = 0점;
한쪽 발로 한 행동(performance with unilateral limb) = 1점;
지연(2초) 및/또는 불완전 행동 = 2점;
행동 없음 = 3점.
보디 스윙 검사: 꼬리 끝으로부터 약 2cm 위치에서 실험동물을 잡고, 테이블 표면의 위로 1인치씩 증가시켰다. 랫트가 머리를 수직축으로부터 10°이상 움직인 다음 다시 수직자세로 돌아올 때마다 회전(swing)을 기록하였다. 동물 당 총 30번의 회전을 카운트하였다. 우반구에 신경세포 사멸을 유발시킨 후에, 실험동물은 반대편 뇌(왼쪽)쪽으로 회전하는 경향이 있으므로 회복율 측정으로 오른쪽으로의 회전 수 및 퍼센트를 온전한 동물의 점수기록과 함께 기록하였다.
8. 인지적 운동 행동 평가(cognitive motor behavior assessment)
인지 검사를 위하여 물미로 검사(J Neurosci Methods. 11:47-60(1984))를 실시하였다. 신경세포 사멸 유발 14일 및 28일 후, 22.0±1.0℃ 온도의 물이 채워진 어두운 색상의 탱크(지름 150 cm X 높이 50 cm)에서 10분 간격으로 3회 실시하였다. 15 X 30 cm 수중 플랫폼(물 표면으로부터 2 mm 아래)을 수조의 북서쪽 사분면(northwest quadrant)에 배치하였다. 릴리즈 포인트(release point)는 항상 수조의 남쪽으로 하였다. 실험동물을 수조의 벽을 마주보도록 하면서 입수시킨 다음 릴리즈 하였다. 각 실시에서의 실험동물의 수영경로를 카메라 트랙킹 시스템(Smart junior, PanLab, 스페인)을 사용하여 기록하였으며, 회피 플랫폼(escape platform)에 도달하기까지 이동한 거리(m) 및 시간(초)을 계산하였다.
9. 통계분석
모든 데이터는 10마리 랫트의 mean ± standard deviation(S.D.)으로 표현하였다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-significant differences (LSD) multi-comparison test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14K, SPSS Inc., USA; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다. 또한, 시험물질의 효율에 대한 이해를 위하여 신경세포 사멸 대조군과 미로데나필 처리 실험군간의 변화를 하기 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
신경세포 사멸 대조군과 비교한 퍼센트 변화(%) = [((미로데나필 처리 그룹의 데이터 - 신경세포 사멸 대조군의 데이터) / 신경세포 사멸 대조군의 데이터) X 100]
실험결과
1. PDE 5 저해제의 신경세포 사멸 억제 효과
손상된 뇌 조직 주변부위의 병리학적 표본에서, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 손상부위인 우측 대뇌반구의 유의성 있는 현저한 위축과 단위 면적당(mm2) 대뇌피질 내 퇴행성 뉴런, caspase-3 및 PARP 면역반응 세포의 수적 증가가 확인되었다. 반면, 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 유의성 있는 대뇌피질 내 퇴생성 뉴런, caspase-3 및 PARP 면역반응 세포의 수적 감소가 각각 확인되었다. 미로데나필 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 유의성 있는 대뇌피질 위축 억제가 확인되었으며(p<0.01), 대뇌피질 내 퇴행성 뉴런, caspase-3 및 PARP 면역반응 세포의 수 역시 유의성 있는 감소를 나타내었다(p<0.01; 표 2 및 도 1).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 2
Figure WO-DOC-FIGURE-160
구체적으로, 미로데나필 0.5, 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 손상부위인 우측 대뇌반구의 위축 정도가 대조군에 비해 각각 -8.70, -46.42 및 -53.31%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 0.5, 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 손상부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 퇴행성 뉴런의 수가 대조군에 비해 각각 -44.47, -73.46 및 -76.54%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 0.5, 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 손상부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 caspase-3 면역반응 뉴런의 수가 대조군에 비해 각각 -33.43, -76.44 및 -77.96%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 0.5, 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 손상부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 PARP 면역반응 뉴런의 수가 대조군에 비해 각각 -37.58, -76.74 및 -78.32%의 변화를 나타내었다.
상기의 결과를 통하여 미로데나필과 같은 PDE 5 억제제가 뇌 신경세포의 사멸 억제를 통하여 신경세포 보호 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2. 신경세포 사멸 억제를 통한 신경세포 보호효과를 나타내는 PDE 5 저해제가 미치는 신경학적 및 인지적 운동행동 장애의 개선 효과
(1) 체중 변화
신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는 체중의 감소가 시술 14일 후부터 관찰되기 시작하였으며(p<0.01 또는 p<0.05), 실험기간 동안의 증체량 역시 유의성 있는 감소를 나타내었다(p<0.01). 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 증체량의 증가가 미로데나필 1 및 2 mg/kg 투여군에서 각각 관찰되었고(p<0.01), 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서도 대조군에 비해 현저한 증체량의 증가가 관찰되었다(표 3 및 도 2). 신경세포 사멸(대뇌 우반구 손상) 유발 후 29일 동안의 증체량은 미로데나필 0.5, 1 및 2 mg/kg 투여군에서 대조군에 비해 각각 45.53, 218.52 및 155.74%의 변화를 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 3
Figure WO-DOC-FIGURE-171
(2) 감각운동 기능에 미치는 영향 분석
<앞다리 배치 평가>
신경세포 손상(대뇌 우반구 손상) 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는 앞다리 배치 검사 점수의 증가가 시술 24시간 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 관찰되었다(p<0.01). 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 손상 유발 14일 후에 신경세포 손상 대조군에 비해 유의성 있는 앞다리 배치 검사 점수의 감소가 관찰되었으며(p<0.05), 미로데나필 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 각각 손상 유발 3일 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 대조군에 비해 유의성 있는 앞다리 배치 검사 점수의 감소가 관찰되었다(p<0.01; 표 4).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 4
Figure WO-DOC-FIGURE-176
구체적으로, 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 앞다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 -3.61, -10.34, -12.82, -11.11 및 -12.90%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 1 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 앞다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후 각각 -18.07, -29.89, -32.05, -41.67 및 -56.45%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 2 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 앞다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후 각각 -25.30, -34.48, -39.74, -43.06 및 -58.06%의 변화를 나타내었다.
<뒷다리 배치 평가>
신경세포 손상 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는 뒷다리 배치 검사 점수의 증가가 손상 유발 24시간 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 관찰되었다(p<0.01). 미로데나필 1 및 2 mg/kg 투여군에서는 각각 손상 유발 3일 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 대조군에 비해 유의성 있는 뒷다리 배치 검사 점수의 감소가 인정되었다(p<0.01 또는 p<0.05; 표 5).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 5
Figure WO-DOC-FIGURE-184
구체적으로, 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 뒷다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 -6.98, -8.57, -9.68, -13.33 및 -11.11%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 1 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 뒷다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 -18.80, -28.57, -32.26, -43.33 및 -59.26%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 2 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 뒷다리 배치 검사 점수가 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 -23.26, -34.29, -41.94, -46.67 및 -59.26%의 변화를 나타내었다.
<보디 스윙 평가>
신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 감소가 손상 유발 24시간 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 관찰되었다(p<0.01). 미로데나필 0.5 및 1 mg/kg 투여군에서는 각각 대조군에 비해 유의성 있는 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 증가가 손상 유발 14일 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 관찰되었으며(p<0.01 또는 p<0.05), 미로데나필 2 mg/kg 투여군에서는 손상 유발 3일 후부터 실험 전 기간에 걸쳐 대조군에 비해 유의성 있는 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 증가가 관찰되었다(p<0.01 또는 p<0.05; 표 6).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 6
Figure WO-DOC-FIGURE-192
구체적으로, 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율이 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 16.67, 9.09, 44.83, 50.00 및 44.19%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 1 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율이 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 50.00, 40.91, 100.00, 102.78 및 167.44%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 2 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율이 손상 유발 3, 7, 14, 21 및 28일 후, 각각 66.67, 45.45, 106.90, 144.44 및 158.14%의 변화를 나타내었다.
(3) 인지적 운동 행동에 미치는 영향 분석
Sham 대조군에서는 물미로 탱크 내에서 회피 플랫폼까지의 이동거리 및 시간이 실시를 반복할 때 마다 현저히 감소되었으나, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는 플랫폼까지 움직인 거리 및 시간의 증가가 손상 유발 14일 및 28후에 각각 관찰되었으며(p<0.01), 실시횟수에 따른 이동거리 및 시간의 단축 역시 현저히 억제되었다. 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 유의성 있는 플랫폼까지의 이동거리 감소가 손상 유발 14일 후 2회째 실시 및 시술 28일 후 모든 실시에서 각각 확인되었으며(p<0.01 또는 p<0.05), 플랫폼까지의 이동시간의 유의성 있는 감소가 손상 유발 14일 후 1회째 실시를 제외한 모든 실시에서 각각 확인되었다(p<0.01또는 p<0.05). 또한, 미로데나필 1 및 2 mg/kg 투여군에서도 각각 손상 유발 14 및 28일 후 플랫폼까지의 이동거리 및 시간의 유의성 있는 감소가 손상 유발 14일 후 1회째 실시를 제외한 모든 실시에서 확인되었다(p<0.01 또는 p<0.05; 표 7).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 7
Figure WO-DOC-FIGURE-200
구체적으로, 미로데나필 0.5 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 물미로 탱크 내에서 플랫폼까지의 이동거리가 손상 유발 14일 후의 2, 3회째 실시 및 손상 유발 28일 후의 모든 실시에서 각각 -7.93, -9.42, -9.80, -14.02 및 -17.56%의 변화를 나타내었으며, 플랫폼까지의 이동시간은 각각 -10.47, -18.37, -11.45, -22.23 및 -29.16%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 1 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 물미로 탱크 내에서 플랫폼까지의 이동거리가 손상 유발 14일 후의 2, 3회째 실시 및 손상 유발 28일 후의 모든 실시에서 각각 -11.07, -19.20, -13.80, -28.51 및 -47.33%의 변화를 나타내었고, 플랫폼까지의 이동시간은 각각 -12.52, -24.82, -16.98, -31.11 및 -44.46%의 변화를 나타내었다.
미로데나필 2 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비해 물미로 탱크 내에서 플랫폼까지의 이동거리가 손상 유발 14일 후의 2, 3회째 실시 및 손상 유발 28일 후의 모든 실시에서 각각 -12.54, -20.37, -14.01, -29.65 및 -44.14%의 변화를 나타내었으며, 플랫폼까지의 이동시간은 각각 -12.06, -25.90, -17.06, -31.28 및 -45.32%의 변화를 나타내었다.
실시예 2. PDE 5 저해제의 신경원(neuron) 보호효과 - 투여시기 분석
실험재료 및 실험방법
1. 실험동물의 준비
6주령의 100마리의 건강한 수컷 스프래그-돌리 랫트(체중 170-190g; SLC, 일본)를 16일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 20-25℃의 온도 및 50-55%의 습도로 우리 당 5마리의 랫트를 사육하였다. 암주기는 12hr:12hr로 하였고, 물과 음식(표준 설치류 먹이, 삼양, 한국)은 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다. 모든 동물은 실험동물 자원기관, 생명과학 위원회, 미국 국립 연구회의(1996)에 근거한 대구 한의대학교의 실험동물의 사육 및 사용 지침에 따라 다루었다. 구체적인 실험그룹은 하기와 같았다:
표 8
Figure PCTKR2013011180-appb-T000008
2. 시험물질의 준비 및 투여
미로데나필(mirodenafil 2HCl; SK Chemical Life Science Business, 한국)을 실험에 사용하였다. 미로데나필은 흰색 파우더로서 식염수에 잘 용해된다. 미로데나필을 빛과 습기로부터 보호하기 위하여 4℃의 냉장고에서 보관하였다. 미로데나필을 생리식염수에 1 mg/㎖의 농도로 용해시킨 다음, 시술 후 24, 72 및 168시간부터 14일 동안 하루에 한번 등부 피부에 kg 당 1 ㎖의 용량으로 피하투여 하였다. sham 대조군 및 신경세포 사멸 대조군에는 미로데나필 대신 동량의 식염수를 시술 후 24시간부터 20일간 피하투여 하였다.
3. 신경세포 사멸(apoptosis) 동물모델의 제조
하기의 방법으로 실험동물의 대뇌 우반구에 손상을 가하여 신경세포의 사멸을 유도하였다. 구체적으로, 70% N2O와 28.5% O2가스에 1.5% 이소플루란을 혼합한 마취가스로 전신마취를 시킨 후 수술대에 고정하고, 안와와 외이도 사이에 가로로 우측 두부 피부를 절개하여 측두근을 노출시킨 후 안면신경과 안와골에 손상 없이 절제하여 측두골의 일부를 노출시켰다. 이후, 치과용 드릴을 이용한 측두하 절제술(subtemporal craniectomy)을 통하여 근위부 중대뇌동맥(proximal MCA)을 노출시켰다. 이후, 후삭 근처에서 대뇌 정맥 직하에서 마이크로바이폴라 응고법(microbipolar coagulation)을 실시하여, 근위부 중대뇌동맥을 영구적으로 폐쇄하였다. 흡입전신마취 후 직장온도계와 열 패드를 이용하여 체온을 일정하게 유지시켰으며, 전체적인 사망률은 5% 이하로 관찰되었다. Sham 대조군은 상기와 동일한 방법으로 근위부 중대뇌동맥을 노출시킨 다음 마이크로바이폴라 응고법을 실시하지 않고 창강을 폐쇄하였다.
4. 면역조직화학적 평가
대뇌 파리핀 절편의 탈파라핀 후, 문헌 Shi SR et al., J Histochem Cytochem. 41:1599-604(1993)에 개시된 방법에 따라 시트레이트 버퍼 항원(epitope) 회수 전처리를 수행하였다. 간략히 설명하면, 10 mM 시트레이트 버퍼(pH 6.0)를 함유하는 염색 접시가 담긴 수조를 95-100℃로 예열하고, 슬라이드를 염색 접시에 담그고 접시 위에 뚜껑을 느슨하게 올려놓은 다음 20분 동안 인큐베이션하고, 염색 접시를 상온에 놓은 후 슬라이드를 20분 동안 식혔다. 에피토프 회수 후, caspase-3 및 PARP에 대한 아비딘-비오틴 복합체(avidin-biotin complex, ABC) 법을 이용하여 절편들을 면역염색 하였다. 간략히 설명하면, 메탄올 및 0.3% H2O2에서 30분간 인큐베이션 하여 내생의 페록시다아제 활성을 억제하고, 정상 말 혈청 차단제(Vector Lab., Burlingame, CA, USA. 1:100 희석)를 사용하여 면역글로불린의 비-특이적 결합을 차단하였다. 1차 항혈청을 4℃의 온도에서 하룻밤 동안 처리하고, 비오틴화 유니버셜 2차 항체(Vector Lab., 1:50 희석) 및 ABC 시약(Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab., 1:50 희석)을 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 끝으로, 상온에서 3분간 페록시다아제 기질 키트(Vector Lab.)와 반응시켰다. 각 단계 중간에 모든 절편을 0.01M PBS로 세 번 세척하였다. caspase-3 및 PARP에 대하여 10% 이상의 면역반응성(밀도)으로 채워진 신경세포들을 양성으로 판단하였고, 동측성 손상 주변부위 대뇌피질의 mm2 중에 분산되어 있는 caspase-3 및 PARP 면역반응성 세포의 수를 이미지 분석 프로그램을 사용하여 측정하였다(Lee et al., 2010; Song et al., 2012). 분석을 위하여 조직병리학자들에게 그룹의 편재에 대한 정보를 제공하지 않았다.
5. 조직병리학적 평가
상기 신경세포 사멸 처치 29일 후에 랫트를 희생시켰다. 뇌를 제거하고 PBS(pH 7.4)로 세척한 다음, 뇌 스테인리스스틸 두부 매트릭스(brain stainless steel coronal matrix; Harvard, 미국)를 이용하여 전두극(frontal brain pole)으로부터 2 내지 14 mm 범위로 연속적인 6개의 관상단면(두께 2 mm)으로 나누었다. 제조된 6번째 대뇌 부분을 10% NBF에 직접 고정시켰다. 이후, 파라핀에 포매하고, 횡단면으로 절단한 다음 대뇌피질의 조직병리학적 검사를 위하여 H&E 염색을 실시하였다. H&E 염색 하에서, 조직형태 계측(Histomorphometry)을 통하여 대뇌피질의 위축성 %(cerebral atrophic %) 및 퇴행성 뉴런(degenerative neurons; 호산구로 보이는)의 수를 계산하였다. 분석을 위하여 조직병리학자들에게 그룹의 편재에 대한 정보를 제공하지 않았다.
조직형태계측: 제조한 조직염색표본의 온전한 대측성(contralateral) 반구와 비교하여 동측성(ipsilateral) 대뇌피질의 위축 %를 하기 수학식 4에 따라 계산하였다. 또한, 단위면적당(mm2) 퇴행성 뉴런의 수를 측정하였다.
[수학식 4]
뇌 위축 형성 = (대측성 대뇌피질의 면적 - 동측성 대뇌피질의 면적)/대측성 대뇌피질 면적 X 100(%)
6. 체중 측정
신경세포 사멸 유발 하루 전, 유발 당일 및 유발 후 1, 7, 14, 21, 28 및 29일에 체중을 측정하였다. 각 동물간의 차이를 줄이기 위하여 신경세포 사멸 유발 후 체중 증가량과 연속적인 시험물질의 투여를 하기 수학식 5에 따라 계산하였다.
[수학식 5]
신경세포 사멸 유발 후 29일 동안의 체중 증가량 = (신경세포 사멸 유발 29일 후의 체중 - 신경세포 사멸 유발 각일의 체중)
7. 감각운동 기능 평가(sensorimotor function assessment) - 신경학적 운동행동 검사
감각운동 기능을 사지 배치 검사(limb placing test; de Ryck M et al., Stroke. 20:1383-90(1989)) 및 보디 스윙 검사(body swing; Borlongan and Sanberg, J Neurosci. 15:5372-8(1995))에 의하여 평가하였다. 검사는 신경세포 사멸 유발 후 1 및 28일째에 수행하였다. 평가를 담당하는 조사관에게는 실험물질 처리에 대한 정보를 제공하지 않았다.
사지 배치 검사: 앞다리 및 뒷다리 배치를 독립적으로 평가하였다. 앞다리 배치 검사를 위하여, 랫트의 앞발을 자유롭게 하면서 몸통을 잡고 천천히 테이블 상단의 가장자리로 이동시키고, 랫트 수염의 짧은 터치를 멈추고(시각 유도된 배치를 위함), 랫트 수염을 터치하고(수염 유도된 배치를 위함), 상기 테이블 상단의 가장자리까지 앞발의 앞에 빛을 비추고(촉각 유도된 배치를 위함), 증가된 압력으로 테이블 가장자리로 앞발을 밀었다(고유수용성 유도된 배치를 위함). 뒷다리 배치 역시 상기 방법에 따라 평가하였다. 시각, 수염, 촉각 및 고유수용성 자극에 대한 각 사지의 반응을 하기 기준에 따라 점수화 하였다(앞다리 테스트에서 총 12점 및 뒷다리 테스트에서 6점은 최대 신경결손을 의미하고, 0점은 정상 행동을 의미한다):
정상 행동 = 0점;
한쪽 발로 한 행동(performance with unilateral limb) = 1점;
지연(2초) 및/또는 불완전 행동 = 2점;
행동 없음 = 3점.
보디 스윙 검사: 꼬리 끝으로부터 약 2cm 위치에서 실험동물을 잡고, 테이블 표면의 위로 1인치씩 증가시켰다. 랫트가 머리를 수직축으로부터 10°이상 움직인 다음 다시 수직자세로 돌아올 때마다 회전(swing)을 기록하였다. 동물 당 총 30번의 회전을 카운트하였다. 우반구에 신경세포 사멸을 유발시킨 후에, 실험동물은 반대편 뇌(왼쪽)쪽으로 회전하는 경향이 있으므로 회복율 측정으로 오른쪽으로의 회전 수 및 퍼센트를 온전한 동물의 점수기록과 함께 기록하였다.
8. 인지적 운동 행동 평가(cognitive motor behavior assessment)
인지 검사를 위하여 물미로 검사(J Neurosci Methods. 11:47-60(1984))를 실시하였다. 신경세포 사멸 유발 14일 및 28일 후, 22.0±1.0℃ 온도의 물이 채워진 어두운 색상의 탱크(지름 150 cm X 높이 50 cm)에서 10분 간격으로 3회 실시하였다. 15 X 30 cm 수중 플랫폼(물 표면으로부터 2 mm 아래)을 수조의 북서쪽 사분면(northwest quadrant)에 배치하였다. 릴리즈 포인트(release point)는 항상 수조의 남쪽으로 하였다. 실험동물을 수조의 벽을 마주보도록 하면서 입수시킨 다음 릴리즈 하였다. 각 실시에서의 실험동물의 수영경로를 카메라 트랙킹 시스템(Smart junior, PanLab, 스페인)을 사용하여 기록하였으며, 회피 플랫폼(escape platform)에 도달하기까지 이동한 거리(m) 및 시간(초)을 계산하였다.
9. 통계분석
모든 데이터는 10마리 랫트의 mean ± standard deviation(S.D.)으로 표현하였다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-significant differences (LSD) multi-comparison test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14K, SPSS Inc., USA; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다. 또한, 시험물질의 효율에 대한 이해를 위하여 신경세포 사멸 대조군과 미로데나필 처리 실험군간의 변화를 각각 하기 수학식 6 및 7에 따라 계산하였다.
[수학식 6]
sham 대조군과 비교한 퍼센트 변화(%) = [((신경세포 사멸 대조군의 데이터 - sham 대조군의 데이터) / sham 대조군의 데이터) X 100]
[수학식 7]
신경세포 사멸 대조군과 비교한 퍼센트 변화(%) = [((미로데나필 처리 그룹의 데이터 - 신경세포 사멸 대조군의 데이터) / 신경세포 사멸 대조군의 데이터) X 100]
실험결과
1. PDE 5 저해제의 신경세포 사멸 억제 효과
손상된 뇌 조직 주변부위의 병리학적 표본에서, 신경세포 사멸 대조군에서는 유발부위인 우측 대뇌반구의 유의성 있는(p<0.01) 현저한 위축과 단위 면적당 (mm2) 대뇌피질 내 변성 신경원, caspase-3 및 PARP 면역 반응세포의 수적 증가가 확인되었다. 반면, 시술 24 및 72 시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 각각 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 대뇌 반구의 위축 억제가 확인되었으며, 대뇌피질 내 변성 신경원, caspase-3 및 PARP 면역 반응세포의 수적 감소 역시 관찰되었고, 시술 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서도 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.05) 대뇌 반구의 위축 억제, 대뇌피질 내 변성신경원 및 PARP 면역 반응세포의 수적 감소가 확인되었으며, caspase-3 면역반응세포 역시 현저한 감소가 확인되었다(표 9 및 도 3).
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 9
Figure WO-DOC-FIGURE-258
구체적으로, 유발부위인 우측 대뇌반구의 위축정도는, 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 1581.66%의 변화를 나타내었으나, 시술(대뇌 우반구 손상을 통한 신경세포 사멸 유발) 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg 을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -60.71, -26.37 및 -12.31%의 변화를 나타내었다.
유발부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 변성 신경원의 수는, 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 1625.83%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168 시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -70.64, -45.90 및 -15.40%의 변화를 나타내었다.
유발부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 caspase-3 면역반응 신경원의 수는, 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 1360.00%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg 을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -57.29, -40.63 및 -15.57%의 변화를 나타내었다.
유발부위인 우측 대뇌피질에서 단위 면적당 PARP 면역반응 신경원의 수는, 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 983.59%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -53.92, -39.72 및 -15.68%의 변화를 나타내었다.
상기의 결과를 통하여 미로데나필과 같은 PDE 5 억제제가 뇌 신경세포의 사멸 억제를 통하여 신경세포 보호 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2. 신경세포 사멸 억제를 통한 신경세포 보호효과를 나타내는 PDE 5 저해제가 미치는 신경학적 및 인지적 운동행동 장애의 개선 효과
(1) 체중 변화
신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 시술 7일 후부터 관찰되기 시작하여, 실험기간 동안의 증체량 역시 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다. 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서 각각 시술 28 및 29일에 인정되어, 실험기간 동안의 증체량 역시 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 증가를 나타내었다. 한편, 시술 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았다(표 10 및 도 4). 시술 후 29일 동안의 증체량은 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 -48.49%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 43.24, 33.78 및 11.04%의 변화를 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 15.04.2014]　
표 10
Figure WO-DOC-FIGURE-268
(2) 감각운동 기능에 미치는 영향 분석
<앞다리 배치 평가>
시술 24 시간 후 앞다리 배치 검사에서 최고점(score 12)을 보이는 랫트만 선정하여 사용하였으며, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 앞다리 배치 검사 점수의 증가가 시술 28일 후에도 확인되었다. 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 앞다리 배치 검사 점수의 감소가 시술 28일 후 각각 인정되었으나, 시술 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 앞다리 배치 검사 점수의 변화는 인정되지 않았다(도 5).
구체적으로, 시술 28일 후 앞다리 배치 검사 점수는 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 800.00%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -57.41, -29.63 및 -11.11%의 변화를 나타내었다.
<뒷다리 배치 평가>
시술 24 시간 후 뒷다리 배치 검사에서 최고점(score 6)을 나타내는 랫트만 선정하여 사용하였으며, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 뒷다리 배치 검사 점수의 증가가 시술 28일 후에도 인정되었으나, 시술 24 및 72 시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 뒷다리 배치 검사 점수의 감소가 각각 인정되었다. 시술 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 뒷다리 배치 검사 점수의 변화는 인정되지 않았다(도 6).
구체적으로, 시술 28일 후 뒷다리 배치 검사 점수는 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 1050.00%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -65.22, -39.13 및 -17.39%의 변화를 나타내었다.
<보디 스윙 평가>
시술 24 시간 후 우측 수술부위 쪽으로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 감소가 일정한(1-4회; 3.33-13.33%) 랫트만 선정하여 사용하였으며, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 우측 수술부위로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 감소가 시술 28일 후에도 인정되었다. 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 우측 수술부위로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 증가가 각각 인정되었으나, 시술 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 보디 스윙 횟수 및 비율의 변화는 인정되지 않았다(도 7).
구체적으로, 시술 28일 후 우측 수술부위 쪽으로의 보디 스윙 횟수 및 비율은 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 -59.35%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 82.00, 48.00 및 14.00%의 변화를 나타내었다.
(3) 인지적 운동 행동에 미치는 영향 분석 - 물미로 검사
Sham 대조군에서는 물미로 탱크 내에서 회피 플랫폼까지의 이동거리 및 시간이 실시를 반복할 때 마다 현저히 감소되었으나, 신경세포 사멸 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 플랫폼까지 움직인 거리 및 시간의 증가가 시술 28일 후에 각각 인정되었으며, 실시횟수에 따른 이동거리 및 시간의 단축 역시 현저히 억제되었다. 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg 을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 플랫폼까지의 이동거리 및 시간의 감소가 시술 2 일 후, 모든 실시에서 각각 인정되었으나, 시술 168 시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 플랫폼까지의 이동거리 및 시간의 변화는 인정되지 않았다(도 8).
구체적으로, 시술 28일 후 물미로 탱크 내에서 플랫폼까지의 평균 이동거리는 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 85.74% 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -26.45, -16.05 및 -6.42%의 변화를 나타내었다.
시술 28일 후 물미로 탱크 내에서 플랫폼까지의 평균 이동시간은 신경세포 사멸 대조군에서 sham 대조군에 비해 79.67%의 변화를 나타내었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 각각 -24.49, -17.33 및 -5.36%의 변화를 나타내었다.
3. 검토
본 실험의 결과, 뇌 손상에 의한 신경세포 사멸에 의해 현저한 체중 감소, 신경학적 및 인지적 운동행동 장애소견, 즉 사지 배치 검사 점수의 증가, 우측으로의 보디 스윙 횟수 및 비율의 감소, 회피 플랫폼까지의 이동거리 및 시간의 증가와 반복적 실시에 따른 이동거리 및 시간의 단축의 억제가 인정되었으며, 조직병리학적 표본에서 유발 우측 대뇌반구의 위축, 대뇌피질 내 단위 면적당 변성 신경원, caspase-3 및 PARP 양성 신경원의 수적 증가가 초래되었다.
이러한 뇌 손상에 의한 체중 감소, 신경학적 및 인지적 운동행동 장애 및 뇌손상 주변부위 대뇌 피질 신경원의 변성 소견은 시술 24 및 72시간부터 미로데나필 1 mg/kg의 투여에 의해 각각 현저히 억제되었으며, 시술 168시간 후부터 14일간 미로데나필 1 mg/kg을 투여한 실험군에서도 신경세포 사멸 대조군에 비해 현저한 뇌 손상 주변부위 대뇌피질 신경원의 변성 및 이폽토시스(apoptosis) 억제 소견이 인정되었다. 따라서, 미로데나필을 뇌 손상(신경세포 사멸) 24-72시간 후부터 투여를 개시할 경우, 허혈성 뇌 손상에 따른 신경학적 및 인지적 운동행동 장애 개선 효과가 나타나는 것으로 판단된다.
허혈성 뇌손상이 진행됨에 따라, 인지 및 운동장애가 초래되고, 결과적으로 현저한 체중 저하가 수반된다[Garcia et al., 1986; Scholler et al., 2004; Wang et al., 2012]. 본 실험의 결과에서도 뇌손상 7일 후부터 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 모든 수술군에서 인정되었으며, 실험기간 동안의 증체량 역시 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다. 반면, 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 시경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중 및 증체량의 증가가 각각 인정되었으나, 수술 168시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 대조군에 비해 유의성 있는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았다. 이러한 결과는 뇌손상 24-72시간 후부터 투여를 시작해야, PDE 5 저해제가 인지 및 행동장애에 의한 체중 감소를 의미 있게 억제하는 직접적인 증거로 판단된다.
사지 배치 검사는 대표적인 신경학적 운동행동 검사로 전지 및 후지의 배치 이상을 등급화하여, 등급이 높을수록 심한 신경학적 운동행동 이상을 나타낸다. 또한, 보디 스윙 검사 역시 빈번히 사용되는 신경학적 운동행동 검사로, 정상동물에서는 좌우측으로의 보디 스윙이 대략적으로 5:5 인 반면, 허혈성 뇌손상이 있는 동물에서는 손상 부위로의 보디 스윙이 현저히 감소된다(Roof et al., 2001; Menniti et al., 2009). 또한, 물미로 검사는 가장 일반적으로 사용되는 인지적 운동행동 검사로, 인지행동 장애가 있는 경우, 회피 플랫폼으로의 이동거리 및 시간이 현저히 연장되며, 특히 실시를 반복할 경우에도 이들 거리 및 시간의 감소가 현저히 억제된다.
본 실험의 결과, 시술 24 및 72시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 사지 배치, 보디 스윙 및 물미로 검사에서 뇌손상에 의해 초래되는 신경학적 및 인지적 운동행동 이상 소견이 현저히 억제되었으나, 시술 168시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 신경세포 사멸 대조군에 비해 유의성 있는 신경학적 및 인지적 운동행동 이상 소견의 변화는 인정되지않았다. 이러한 결과는 뇌손상24-72 시간 후부터 투여를 개시할 경우, PDE 5 저해제가 허혈성 뇌손상에서 인지 및 운동기능을 회복시키는 직접적인 증거로 판단된다.
본 실험의 결과, 허혈성 뇌손상에 의해 초래된 뇌손상 주변부위에 현저한 대뇌피질의 위축이 초래되었으나, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 각각 뇌손상 주변부위에 대뇌피질의 위축 소견이 유의성 있게(p<0.01) 억제되었으며, 대뇌피질에서 단위 면적당 변성 신경원의 증가 역시 유의성 있게(p<0.01) 억제하였다.
Caspase-3 및 PARP는 대표적인 아폽토시스 마커로 (Nunez et al., 1998; Barrett et al., 2001), 대뇌피질에서 이들 caspase-3 및 PARP의 증가는 아폽토시스에 의한 뇌손상의 증가를 의미한다. 본 실험의 결과, 시술 24, 72 및 168시간 후부터 미로데나필을 투여한 실험군에서는 각각 뇌손상에 의한 대뇌피질 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 증가가 현저히 억제되었다. 따라서, 뇌손상 24-168 시간 후부터 투여를 시작할 경우, PDE 5 저해제는 뇌손상 주변부위에서 어느 정도의 신경보호 효과를 나타내는 것으로 관찰되었으나, 신경보호 효과는 투여 시작시기가 늦을수록 낮아지는 것으로 관찰되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. (i) 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제의 약제학적 유효량; 및
    (ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스(apoptosis) 억제용 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 미로데나필(mirodenafil), 실데나필(sildenafil), 바르데나필(vardenafil), 타달라필(tadalafil), 유데나필(udenafil), 다산타필(dasantafil), 아바나필(avanafil); 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 염은 미로데나필 염산염, 실데나필 구연산염 또는 바르데나필 염산염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌신경질환의 예방 또는 치료를 위한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 뇌신경질환은 신경 퇴행성 질환, 허혈성 뇌졸중, 인지기능장애 및 운동기능장애로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경성 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 인지기능장애는 기억력 감퇴, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 또는 섬망인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 운동기능장애는 운동장애(motor disturbance), 마비, 운동실조(ataxia), 이상운동증(dyskinesia), 경직(spasticity) 또는 근육긴장이상(dystonia)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 신경세포의 아폽토시스는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 야기된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 뇌 조직에서 퇴행성 뉴런(degenerative neuron)의 형성을 억제하거나, 또는 신경세포에서 caspase-3 또는 PARP(Poly ADP ribose polymerase)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 인간에게 경구투여 되거나, 또는 두부(head) 이외의 부위로 비-경구투여 되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제의 경구투시, 상기 조성물은 필름 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. (i) 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제; 및
    (ii) 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스(apoptosis) 억제용 건강기능식품.
  14. 포스포디에스테라제 타입 5(phosphodiesterase type 5) 활성 저해제를 포함하는 조성물을 유효량으로 이를 필요로 하는 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌 신경세포의 아폽토시스를 억제하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 개체는 뇌신경질환 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 뇌신경질환은 신경 퇴행성 질환, 허혈성 뇌졸중, 인지기능장애 및 운동기능장애로 구성된 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 치매, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 신경성 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 인지기능장애는 기억력 감퇴, 학습장애, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 또는 섬망인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 운동기능장애는 운동장애(motor disturbance), 마비, 운동실조(ataxia), 이상운동증(dyskinesia), 경직(spasticity) 또는 근육긴장이상(dystonia)인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 신경세포의 아폽토시스는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 야기된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 14 항에 있어서, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 뇌 조직에서 퇴행성 뉴런(degenerative neuron)의 형성을 억제하거나, 또는 신경세포에서 caspase-3 또는 PARP(Poly ADP ribose polymerase)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 인간에게 경구투여 되거나, 또는 두부(head) 이외의 부위로 비-경구투여 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 조성물의 경구투여 시 조성물은 필름 제형인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2013/011180 2012-12-04 2013-12-04 포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물 WO2014088326A1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/649,467 US9750743B2 (en) 2012-12-04 2013-12-04 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells
CN201380063366.7A CN105025900B (zh) 2012-12-04 2013-12-04 包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物
JP2015546385A JP6120985B2 (ja) 2012-12-04 2013-12-04 ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤を含む神経細胞のアポトーシス抑制用組成物
ES13860159T ES2903151T3 (es) 2012-12-04 2013-12-04 Composición que comprende inhibidor de fosfodiesterasa tipo 5 para inhibir la apoptosis de células nerviosas
EP21209760.4A EP3981409A1 (en) 2012-12-04 2013-12-04 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells
EP13860159.6A EP2929886B1 (en) 2012-12-04 2013-12-04 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells
US15/663,092 US10064865B2 (en) 2012-12-04 2017-07-28 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120139594 2012-12-04
KR10-2012-0139594 2012-12-04

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/649,467 A-371-Of-International US9750743B2 (en) 2012-12-04 2013-12-04 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells
US15/663,092 Continuation US10064865B2 (en) 2012-12-04 2017-07-28 Composition comprising phosphodiesterase type 5 inhibitor for inhibiting apoptosis of nerve cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014088326A1 true WO2014088326A1 (ko) 2014-06-12

Family

ID=50883692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/011180 WO2014088326A1 (ko) 2012-12-04 2013-12-04 포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9750743B2 (ko)
EP (2) EP2929886B1 (ko)
JP (1) JP6120985B2 (ko)
KR (1) KR102146673B1 (ko)
CN (2) CN109498628A (ko)
ES (1) ES2903151T3 (ko)
WO (1) WO2014088326A1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102271305B1 (ko) * 2020-05-21 2021-06-30 주식회사 아리바이오 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102272907B1 (ko) * 2020-11-05 2021-07-05 주식회사 아리바이오 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102272910B1 (ko) * 2021-01-28 2021-07-06 주식회사 아리바이오 당뇨병을 동반한 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102311224B1 (ko) * 2021-04-23 2021-10-13 주식회사 아리바이오 Pde5 억제제와 글루코코르티코이드 수용체 길항제 병용투여를 통한 치매 예방 및 치료용 조성물

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210132740A (ko) * 2019-03-24 2021-11-04 주식회사 아리바이오 아밀로이드 베타 형성을 줄이기 위한 방법 및 이를 위한 조성물
JP7399284B2 (ja) * 2019-11-14 2023-12-15 スンチョンヒャン ユニバーシティ インダストリー アカデミー コーポレーション ファウンデーション 脳卒中または脳卒中による後遺症治療のためのシルデナフィル及びｒｏｃｋ阻害剤の用途
KR102336700B1 (ko) * 2019-11-14 2021-12-06 순천향대학교 산학협력단 실데나필 및 rock 저해제를 포함하는 뇌졸중으로 인한 불안 장애의 치료용 약학적 조성물
KR102303154B1 (ko) * 2019-11-14 2021-09-15 순천향대학교 산학협력단 실데나필 및 rock 저해제를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물
KR102336697B1 (ko) * 2019-11-14 2021-12-06 순천향대학교 산학협력단 실데나필 및 rock 저해제를 포함하는 뇌졸중으로 인한 운동 기능 손실의 치료용 약학적 조성물
KR102336701B1 (ko) * 2019-11-14 2021-12-06 순천향대학교 산학협력단 실데나필 및 rock 저해제를 포함하는 뇌졸중으로 인한 인지 기능 저하의 치료용 약학적 조성물
CN111249281B (zh) * 2020-03-26 2020-11-24 徐州医科大学 Trpml1特异性小分子抑制剂ml-si3的新用途
KR20220009806A (ko) * 2020-07-16 2022-01-25 제이투에이치바이오텍 (주) 이중 억제제 화합물 및 이들의 의약 용도
WO2023248206A1 (en) * 2022-06-24 2023-12-28 Aribio Co., Ltd. Compositions and methods for preventing and treating neurodegenerative diseases
WO2024003784A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Aribio Co., Ltd. Composition for preventing and treating neurodegenerative diseases
WO2024003787A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-04 Aribio Co., Ltd. Compositions and methods for preventing and treating neurodegenerative diseases with diabetes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028902A1 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Pfizer Limited Pyrazolopyrimidinones for the treatment of impotence
WO1995019978A1 (en) 1994-01-21 1995-07-27 Laboratoires Glaxo Wellcome S.A. Tetracyclic derivatives, process of preparation and use
KR20020031062A (ko) 2000-10-20 2002-04-26 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 포유동물의 생식능력을 개선시키기 위한 ｐｄｅ ｖ억제제의 용도
KR100358083B1 (ko) 2000-02-17 2002-10-25 에스케이케미칼주식회사 피롤로피리미디논 유도체와 이의 제조방법, 그리고 이의용도
KR20060031614A (ko) * 2003-06-06 2006-04-12 우니베르지타트스클리니쿰 프라이부르크 문맥성 고혈압의 예방 및/또는 치료

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA46166C2 (uk) 1997-11-12 2002-05-15 Баєр Акцієнгезельшафт 2-фенілзаміщені імідазотриазинони як інгібітори фосфодіестерази, спосіб їх одержання та лікарський засіб на їх основі
WO2001032170A1 (en) * 1999-09-13 2001-05-10 Swope David M Composition and method for decreasing neurologic symptomatology
JP4469063B2 (ja) 2000-06-08 2010-05-26 東レ・ダウコーニング株式会社 アルミナ粉末用表面処理剤
CA2449163C (en) * 2001-05-09 2010-07-13 Bayer Healthcare Ag New use of 2-phenyl-substituted imidazotriazinones
JP4533590B2 (ja) * 2003-02-28 2010-09-01 ファイザー株式会社 脊髄損傷患者における疼痛又は痙性軽減用医薬組成物
DE102005001989A1 (de) * 2005-01-15 2006-07-20 Bayer Healthcare Ag Intravenöse Formulierungen von PDE-Inhibitoren
WO2006091542A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Cedars-Sinai Medical Center Use of sildenafil, vardenafil and other 5-phosphodiesterase inhibitors to enhance permeability of the abnormal blood-brain barrier
RS58965B1 (sr) * 2009-01-26 2019-08-30 Univ Pennsylvania Inhibitori arginaze i postupci upotrebe
EP2535049A1 (en) * 2011-06-17 2012-12-19 Proyecto de Biomedicina Cima, S.L. Tadalafil for the treatment of dementia

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028902A1 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Pfizer Limited Pyrazolopyrimidinones for the treatment of impotence
WO1995019978A1 (en) 1994-01-21 1995-07-27 Laboratoires Glaxo Wellcome S.A. Tetracyclic derivatives, process of preparation and use
KR100358083B1 (ko) 2000-02-17 2002-10-25 에스케이케미칼주식회사 피롤로피리미디논 유도체와 이의 제조방법, 그리고 이의용도
KR20020031062A (ko) 2000-10-20 2002-04-26 디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이 포유동물의 생식능력을 개선시키기 위한 ｐｄｅ ｖ억제제의 용도
KR20060031614A (ko) * 2003-06-06 2006-04-12 우니베르지타트스클리니쿰 프라이부르크 문맥성 고혈압의 예방 및/또는 치료
KR20120024807A (ko) 2003-06-06 2012-03-14 우니베르지타트스클리니쿰 프라이부르크 문맥성 고혈압의 예방 및/또는 치료

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Guide for the Care and Use of Laboratory Animals by Institute of Laboratory Animal Resources", 1996, NATIONAL RESEARCH COUNCIL
"Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", 1996, NATIONAL RESEARCH COUNCIL
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995
BOESS, FRANK G. ET AL.: "Inhibition of phosphodiesterase 2 increases neuronal cGMP, synaptic plasticity and memory performance", NEUROPHARMACOLOGY, vol. 47, 2004, pages 1081 - 1092, XP004650292 *
BOOLEL, M. ET AL., BR. J. OF UROLOGY, vol. 78, 1996, pages 257 - 261
BORLONGAN; SANBERG, J NEUROSCI., vol. 15, 1995, pages 5372 - 8
CARETTI, ANNA ET AL.: "Phosphodiesterase-5 inhibition abolishes neuron apoptosis induced by chronic hypoxia independently of hypoxia-inducible factor- 1 alpha signaling", EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, vol. 233, no. 10, 2008, pages 1222 - 1230, XP008177085 *
CHEN, JUN ET AL.: "Induction of caspase-3-like protease may mediate delayed neuronal death in the hippocampus after transient cerebral ischemia", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 18, no. 13, 1998, pages 4914 - 4928, XP055204616 *
DE RYCK M ET AL., STROKE, vol. 20, 1989, pages 1383 - 90
J NEUROSCI METHODS, vol. 11, 1984, pages 47 - 60
LEVENE A, CLIN OTALAR, vol. 6, 1981, pages 145 - 51
LEVENE A, CLIN OTALARY, vol. 6, 1981, pages 145 - 51
LUDBROOK, CLIN EXP PHARMACOL PHYSIOL, vol. 24, 1997, pages 294 - 6
MARIKA SARFATI ET AL., BLOOD, vol. 101, no. 1, 2003
NATURE, 2002, pages 674 - 682
RYCK M ET AL., STROKE, vol. 20, 1989, pages 1383 - 90
SHI SR ET AL., J HISTOCHEM CYTOCHEM., vol. 41, 1993, pages 1599 - 604

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102271305B1 (ko) * 2020-05-21 2021-06-30 주식회사 아리바이오 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102272907B1 (ko) * 2020-11-05 2021-07-05 주식회사 아리바이오 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102272910B1 (ko) * 2021-01-28 2021-07-06 주식회사 아리바이오 당뇨병을 동반한 치매 예방 및 치료용 조성물
KR102311224B1 (ko) * 2021-04-23 2021-10-13 주식회사 아리바이오 Pde5 억제제와 글루코코르티코이드 수용체 길항제 병용투여를 통한 치매 예방 및 치료용 조성물
WO2022225378A1 (ko) * 2021-04-23 2022-10-27 주식회사 아리바이오 Pde5 억제제와 글루코코르티코이드 수용체 길항제 병용투여를 통한 치매 예방 및 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016502561A (ja) 2016-01-28
EP3981409A1 (en) 2022-04-13
KR20140072819A (ko) 2014-06-13
JP6120985B2 (ja) 2017-04-26
EP2929886A4 (en) 2015-10-14
US9750743B2 (en) 2017-09-05
CN109498628A (zh) 2019-03-22
EP2929886B1 (en) 2021-11-24
ES2903151T3 (es) 2022-03-31
KR102146673B1 (ko) 2020-08-21
EP2929886A1 (en) 2015-10-14
US20150297599A1 (en) 2015-10-22
US10064865B2 (en) 2018-09-04
US20170326145A1 (en) 2017-11-16
CN105025900B (zh) 2018-11-02
CN105025900A (zh) 2015-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014088326A1 (ko) 포스포디에스테라제 타입 5 저해제를 포함하는 신경세포의 아폽토시스 억제용 조성물
WO2015023142A1 (ko) 플라본-6-c-글루코스 유도체를 유효성분으로 함유하는 신경정신질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물
WO2012124888A2 (en) Composition comprising the extract of herbal combination for preventing or treating diabetic peripheral neuropathy
WO2013147419A1 (en) A composition comprising the compound isolated from chrysanthemum indicum for treating or preventing cerebrovascular system involved anxiety and the use thereof
WO2014058160A1 (ko) 미리세틴을 유효성분으로 포함하는 운동수행능력 증강용 또는 피로회복용 조성물
WO2013172525A1 (ko) 어류 안구의 파쇄물 또는 추출물을 함유하는 화장료, 약학 및 식품 조성물
WO2022005201A1 (ko) 티로신을 유효성분으로 함유하는 단백질 내 티로신의 니트로화에 의한 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2010011111A4 (ko) 뎁손을 유효성분으로 함유하는 노화조절용 및/또는 수명연장용 조성물
WO2020106048A1 (ko) 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2016006947A1 (ko) 환삼덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019022482A2 (ko) 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2016111523A2 (ko) HNF4-α 길항제 및 이의 용도
WO2022163971A1 (ko) 콜린에스터라제 억제제 및 항산화제를 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 복합 조성물
WO2021033995A1 (ko) 초과 추출물을 함유하는 근육 감소 관련 질병의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
WO2016175589A2 (ko) 혼합 생약 추출물을 함유하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2020055186A1 (ko) If1 을 유효성분으로 함유하는 비만 또는 근감소증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2015111971A1 (ko) Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019245347A2 (ko) 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2020256397A1 (ko) 감초 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2021054510A1 (ko) 셀레노사마필린 a를 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 및 치료용 조성물
WO2014051398A1 (ko) 아세카이니드 또는 이의 유도체를 포함하는 근력약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2014163402A1 (ko) 인삼 열매 추출물을 함유하는 여성 건강 및 삶의 질 개선용 조성물
WO2020122392A1 (ko) 조타로리무스를 유효성분으로 함유하는 세포노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2019172566A1 (ko) 이오논을 유효성분으로 함유하는 항스트레스제, 항우울제 또는 항불안제 조성물
WO2024181780A1 (ko) 다이페닐 에터 유도체를 유효성분으로 포함하는, 말초신경병증의 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201380063366.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13860159

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015546385

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14649467

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013860159

Country of ref document: EP