CN109498628A - 包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物的用途 - Google Patents

包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含5型磷酸二酯酶活性抑制剂的脑神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物的用途。根据本发明，5型磷酸二酯酶抑制剂抑制脑神经细胞的细胞凋亡，来呈现对神经细胞的保护作用。因此，本发明可有用地利用于脑神经疾病的预防、改善及治疗。

Description

包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用组 合物的用途
技术领域
本发明涉及包含5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的脑神经细胞的细胞凋亡(apoptosis)抑制用组合物、保健功能食品及细胞凋亡的抑制方法。
背景技术
磷酸二酯酶(PDE，phosphodiesterase)为对在细胞中分别使用5-腺苷酸及5-鸟苷酸来使环腺苷酸(cAMP，cyclic adenosine monophosphate)和/或环鸟苷酸(cGMP，cyclicguanosine monophosphate)水解的作用进行催化的酶，由此，这些对环腺苷酸或环鸟苷酸水平的细胞性调节重要。众所周知，至今已知的磷酸二酯酶共有11种(Nature，674-682(2002))。据报告，在上述磷酸二酯酶中，5型磷酸二酯酶为分解环鸟苷酸来生成5’-鸟苷酸的酶，因而若抑制上述5型磷酸二酯酶，则维持环鸟苷酸的浓度来持续勃起(Boolel,M.etal.,Br.J.of Urology,78,257-261(1996))。由此，5型磷酸二酯酶抑制剂使用为勃起功能障碍治疗剂。
众所周知，这种5型磷酸二酯酶抑制剂有很多化合物。万艾可(Viagra)TM(通用名：西地那非；WO 94/28902)为美国食品药品监督管理局(FDA)认可的最初男性用勃起功能障碍治疗剂，并且，许可了西力士(Cialis)TM(通用名：他达拉非；WO 95/19978)及艾力达(Levitra)TM(通用名：伐地那非；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters)。众所周知，5型磷酸二酯酶抑制剂还有MvixTM(通用名：米罗那非；KR0358083)。众所周知，如上所述的药剂呈现优秀的治疗效果，来改善约70％的患者的性功能。众所周知，5型磷酸二酯酶抑制剂的其他医药用途有门脉高压症、肝-肾综合症、肝-肺综合症的治疗效果(韩国公开特许第10-2012-0024807号)，据报告，还有改善哺乳动物的生殖能力(韩国公开特许第10-2002-0031062号)的效果。
并且，据报告，作为5型磷酸二酯酶抑制剂的西地那非及伐地那非诱导B-慢性淋巴细胞白血病细胞(B-chronic lymphocytic leukemia cells)的胱天蛋白酶(caspase)-依赖性细胞凋亡(Marika Sarfati et al.,BLOOD,VOLUME 101,NUMBER 1(2003))。
本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
【技术问题】
本发明人在对5型磷酸二酯酶抑制剂进行研究的过程中，发现了5型磷酸二酯酶抑制剂在脑神经细胞中反而抑制细胞凋亡。具体地，将5型磷酸二酯酶抑制剂给药到由脑损伤诱发神经细胞的细胞凋亡的动物模型中，其结果确认到显著抑制了脑神经细胞的细胞凋亡，并通过抑制神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞的效果，改善动物模型的认知及运动功能的降低，从而完成了本发明。
【解决问题的手段】
本发明的目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用药剂学组合物。
本发明的再一目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用保健功能食品。
本发明的另一目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡的抑制方法。
根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。
【发明效果】
归纳本发明的特征及优点如下：
(i)本发明提供包含5型磷酸二酯酶抑制剂的脑神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物、保健功能食品及细胞凋亡的抑制方法。
(ii)根据本发明，5型磷酸二酯酶抑制剂抑制脑神经细胞的细胞凋亡，来呈现对神经细胞的保护作用。
(iii)本发明的组合物可抑制脑神经细胞的细胞凋亡来预防、改善及治疗脑神经疾病。
附图说明
图1为示出米罗那非的神经细胞保护效果(脑萎缩性、退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶)的组织病理学照片。
A：假手术对照(Sham)组
B：神经细胞凋亡对照组
C：0.5mg/kg的米罗那非给药组
D：1mg/kg的米罗那非给药组
E：2mg/kg的米罗那非给药组
比例尺＝100μm
箭头表示近端大脑中动脉。
图2示出借助米罗那非处理的动物模型的体重变化。
图3为示出米罗那非的神经细胞保护效果(脑萎缩性、退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶)的脑切片的组织病理学照片。
A：假手术对照组
B：神经细胞凋亡对照组
C：手术后24小时开始将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组
D：手术后72小时开始将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组
E：手术后168小时开始将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组
比例尺＝100μm
箭头表示神经细胞凋亡手术(大脑损伤)的东侧面。
图4示出米罗那非处理时期的动物模型的体重变化。
图5示出米罗那非处理时期的前肢放置检查的变化。
与基于最小显著差异(LSD)试验的假手术对照组进行比较，ap＜0.01。
与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，bp＜0.01。
与基于MW试验的假手术对照组进行比较，cp＜0.01。
图6示出米罗那非处理时期的后肢放置检查的变化。
与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap＜0.01及bp＜0.05。
与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，cp＜0.01。
与基于MW试验的假手术对照组进行比较，dp＜0.01。
图7示出米罗那非处理时期的身体摇摆的变化。值由8只大鼠的平均值(mean)±标准差(SD)来表示。
与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap＜0.01。
与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，bp＜0.01。
图8示出米罗那非处理时期的认知运动行为(水迷宫检查)的变化。值由8只大鼠的平均值±标准差来表示。
与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap＜0.01及bp＜0.05。
与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，cp＜0.01、dp＜0.05。
与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ep＜0.01。
与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，fp＜0.01及gp＜0.05。
最佳实施方式
根据本发明的一实施方式，本发明提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用药剂学组合物，其包含：(i)5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的药剂学有效剂量；以及(ii)药剂学上接受的载体。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供抑制脑神经细胞的细胞凋亡的方法，上述抑制脑神经细胞的细胞凋亡的方法包括将包含5型磷酸二酯酶(phosphodiesterasetype 5)活性抑制剂的组合物以有效剂量给药到需要上述组合物的个体(subject)的步骤。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供改善认知功能障碍或运动功能障碍的方法，上述改善认知功能障碍或运动功能障碍的方法包括将包含5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的组合物以有效剂量给药到需要上述组合物的个体(subject)的步骤。
本发明人在对5型磷酸二酯酶抑制剂进行研究的过程中，发现了5型磷酸二酯酶抑制剂在脑神经细胞中反而抑制细胞凋亡。具体地，将5型磷酸二酯酶抑制剂给药到由脑损伤诱发神经细胞的细胞凋亡的动物模型中，其结果确认到显著抑制了脑神经细胞的细胞凋亡，并通过抑制神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞的效果，改善动物模型的认知及运动功能的降低。
在本说明书中，术语“5型磷酸二酯酶活性抑制剂”或“5型磷酸二酯酶抑制剂”是指可对5型磷酸二酯酶的催化作用选择性或非选择性地抑制或减少的物质。上述5型磷酸二酯酶抑制剂包含化合物、肽、小分子、抗体或其的片段及天然提取物。
在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制剂为化合物。
根据本发明的一实例，上述5型磷酸二酯酶抑制剂选自由米罗那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)、他达拉非(tadalafil)、乌地那非(udenafil)、达生他非(dasantafil)、阿伐那非(avanafil)以及它们的药剂学上接受的盐、溶剂化物及水合物组成的组中。
在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制剂为米罗那非、西地那非、伐地那非或它们的药剂学上接受的盐。
上述药剂学上接受的盐是指对将化合物进行给药的有机体不诱发严重的刺激，并防止化合物的生物学活性和物性受损的、化合物的剂型。上述药剂学上接受的盐为药剂学上可接受的、以利用实质上非毒性的有机酸及无机酸的该领域中众所周知的通常的方法制备而得的盐。上述酸包含盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲磺酸(methanesulfonicacid)、乙磺酸(ethanesulfonic acid)、对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)等磺酸、酒石酸、甲酸、柠檬酸、醋酸、三氯醋酸(trichloroacetic acid)、三氟醋酸(trifluoroaceticacid)、癸酸、异丁酸、丙二酸、丁二酸、邻苯二甲酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸及水杨酸等有机酸。并且，也可使本发明的化合物和碱发生反应来形成铵盐、钠或钾盐等碱金属盐、钙或镁盐等碱土金属盐等盐、二环己胺(dicyclohexylamine)、N-甲基-D-葡糖胺(N-methyl-D-glucamine)、三(羟甲基)甲胺(tris(hydroxymethyl)methylamine)等有机碱的盐以及精氨酸、赖氨酸等氨基酸盐。
根据本发明的一实例，上述药剂学上接受的盐为米罗那非盐酸盐、西地那非柠檬酸盐或伐地那非盐酸盐。
上述水合物(hydrate)是指包含借助非共价分子间力(non-covalentintermolecular force)结合的化学计量(stoichiometric)或非化学计量(non-stoichiometric)的水的本发明的化合物或它们的盐。
上述溶剂化物(solvate)是指包含借助非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的溶剂的本发明的化合物或它们的盐。与其相关的优选溶剂为挥发性、非毒性和/或适于给药到人的溶剂。
如在以下实施例中所证明，包含上述5型磷酸二酯酶抑制剂作为有效成分的本发明的组合物抑制脑神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞。在本说明书中，术语“神经细胞”包含中枢神经系统、脑、脑干、脊髓、形成中枢神经系统和末梢神经系统的接合部分等的结构的神经元、神经支持细胞、神经胶质及施万细胞等。在本说明书中，术语“神经细胞的保护”是指减轻或改善(amelioration)神经性损伤(nervous insult)的作用、或减轻或抑制由神经性损伤引起的神经细胞的细胞凋亡的作用、或保护或恢复受到神经性损伤的神经细胞的作用。并且，在本说明书中，术语“神经性损伤”是指由多种原因(如外伤性脑损伤之类的外部因素、遗传原因、代谢原因、毒性原因、神经毒性原因、生理原因及生物化学原因等)导致的神经细胞或神经组织的损伤。
根据本发明的一实例，上述组合物可适用于预防或治疗脑神经疾病。在本说明书中，术语“预防”是指在个体(subject)中减少脑神经疾病的可能性/危险、或在个体中延迟脑神经疾病的发生，或它们的组合。在本说明书中，术语“治疗”是指抑制在个体中所发生的脑神经疾病的发展、或减少(缓和)在个体中所发生的脑神经疾病的症状、或去除在个体中所发生的脑神经疾病，或它们的组合。在本说明书中，术语“改善”使用为与术语“治疗”相同的含义。利用本发明的药剂学组合物来预防或治疗的“个体”为人或除了人之外的动物，优选地，指人。
根据本发明的一实例，上述脑神经疾病为选自由神经退行性疾病、缺血性脑卒中、认知功能障碍及运动功能障碍组成的组中的疾病。
利用本发明的组合物来预防或治疗的上述神经退行性疾病包括痴呆症、亨廷顿氏病、帕金森氏病及肌萎缩性侧索硬化症。上述痴呆症为艾滋病(AIDS)诱发痴呆症、路易体痴呆症、额颞叶痴呆症、多发梗塞性痴呆症、语义性痴呆症、阿尔茨海默氏症及血管性痴呆症。
利用本发明的组合物来预防或治疗的上述认知功能障碍包括记忆力减退、学习障碍、失认症、健忘症、失语症、失用症或谵妄症。
利用本发明的组合物来预防或治疗的上述运动功能障碍包括运动障碍(motordisturbance)、麻痹、运动失调(ataxia)、异动症(dyskinesia)、痉挛(spasticity)及肌张力障碍(dystonia)。上述运动障碍通常指身体的随意运动，例如，使四肢、躯干、脖子、脸、颜面、舌头等移动的运动未能随意进行的状态。上述麻痹是指作为神经或肌肉以无形态变化的方式失去功能的状态，失去感觉或无法移动的状态。这种麻痹可根据症状分为将无法移动的状态作为主要症状的运动麻痹和失去感觉的感觉麻痹，包括单瘫、偏瘫、双瘫及四肢瘫。
上述运动失调是指虽然正常地保持筋力，但未保持参与运动的筋组的相互协调，并在顺畅的运动上受到障碍的状态。上述异动症是指减少随意性运动，并呈现非随意性运动(抽搐或舞蹈症等)的现象。上述痉挛是指与由牵张反射的过兴奋引起的肌肉伸长(伸展)速度成正比地增加的肌肉紧张。其中，牵张反射是指当持续伸长骨骼肌时，以对其伸长抵抗的方式对伸长的肌肉反射性地发生收缩来使紧张高潮的现象。上述肌张力障碍是指因持续性地肌肉收缩而导致身体的一部分曲扭或呈现反复性运动或非正常姿势等的症状的总称。
根据本发明的一实例，本发明的组合物可抑制由外伤性脑损伤(traumatic braininjury)引起的脑神经细胞的细胞凋亡。因此，本发明的组合物可用于改善由因外伤性脑损伤而发生的神经细胞的凋亡引起的神经学及认知运动行为障碍。
根据本发明的一实例，包含于本发明的组合物的5型磷酸二酯酶活性抑制剂(i)在脑组织中抑制退行性神经元(degenerative neuron)的形成，或(ii)在神经细胞中抑制胱天蛋白酶-3或聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP，Poly ADP ribose polymerase)的表达。
根据本发明的一实例，上述5型磷酸二酯酶抑制剂能够以0.5-2mg/kg的容量给药到需要抑制脑神经细胞的细胞凋亡的个体(subject)(参照实施例1)。这种给药能够以1天1次的方式实现。
在一个特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制剂能够以1-2mg/kg的容量给药到个体。
根据本发明的一实例，本发明的组合物可从脑神经细胞的细胞凋亡诱发24-72小时之后开始给药到个体。
根据本发明的再一实例，本发明的组合物的最初给药时期为诱发脑神经细胞的细胞凋亡之后24至168小时。在一个特定例中，本发明的组合物的最初给药时期为诱发脑神经细胞的细胞凋亡之后24至72小时。
在以如上方式给药的情况下，如在以下实施例2中所述，可得到最佳的神经细胞保护效果。这种给药能够以1天1次的方式实现。
根据本发明的一实例，上述脑神经细胞的细胞凋亡的诱发可由脑损伤(例如，缺血性脑损伤)引起。
本发明的药剂学组合物能够以口服给药方式或非口服方式给药。
根据本发明的一实例，本发明的药剂学组合物以口服给药方式给药到对象(subject)，或以非口服给药方式给药到除了头部(head)之外的部位。即，本发明的组合物在未直接给药到脑组织、包围脑组织的身体组织(例如，头皮)以及与其相邻的部位的情况下，也可呈现本发明中所意图的效果。在一特定例中，上述以非口服给药方式的给药为皮下给药、静脉内给药、腹腔注入、硬皮给药或肌肉内给药，在另一特定例中为皮下给药、静脉内给药或肌肉内给药。与此相关地，血脑屏障(BBB，blood-brain barrier)为从全身的血液循环中隔离脑的中枢神经系统(CNS)的唯一结构。血脑屏障防止在血液内循环的很多物质(色素、药物、毒素等)接近脑，来有效地保护脑，但在另一方面，在脑疾病的药理学治疗中成为主要的障碍。但是，如以下实施例中所证明，向个体的背部皮下注射5型磷酸二酯酶抑制剂之后，实施大脑组织的组织病理学评价，其结果确认到因将5型磷酸二酯酶抑制剂进行给药而减少大脑萎缩，减少退行性神经元，抑制作为细胞凋亡标记的胱天蛋白酶-3的表达，并抑制聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶的表达。这种结果可视为未直接给药到脑部位的5型磷酸二酯酶抑制剂对脑细胞或组织呈现直接的药理效果，即，通过血脑屏障对脑呈现直接的药理作用。这种结果在考虑通常药物难以通过血脑屏障，并由此在脑组织中难以呈现直接的药理效果的该领域中众所周知的事实时，属于惊人的结果。
包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。适合的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。
本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、薄膜或胶囊剂的形态，还可包含分散剂或稳定剂。
在以口服给药方式将上述5型磷酸二酯酶活性抑制剂进行给药的情况下，本发明的组合物可具有薄膜剂型。在本发明中，上述薄膜可命名为剥离膜(strip)、口腔溶解膜(orally dissolving film)、口腔崩解膜(orally disintegrating film)等，是指贴于舌上、口腔黏膜、舌下等口腔内来以溶解方式服用的剂型。这种薄膜剂型具有无水可服用的优点。
根据本发明的还一实施方式，本发明提供脑神经细胞的细胞凋亡(apoptosis)抑制用保健功能食品，上述脑神经细胞的细胞凋亡抑制用保健功能食品包含：(i)5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5)活性抑制剂；以及(ii)食品学上接受的食品辅助添加剂。
本发明的保健功能食品包含上述的5型磷酸二酯酶抑制剂，因而为了防止本说明书过于复杂，省略它们之间共同的记载内容。
本发明的保健功能食品并不特别局限于此，但可以为保健功能性食品、营养辅助剂、营养剂、药物食品(pharmafood)、保健食品、营养食品(nutraceutical)、特定营养食品、食品添加剂等的所有形态的食品，优选地，可以为包含肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、匹萨、方便面、其他面类、口香糖类、冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、清凉剂、酒精饮料及维生素复合剂。
本发明的保健功能食品不仅包含5型磷酸二酯酶抑制剂，还包含在制备食品时通常所添加的成分作为有效成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。作为上述碳水化合物，例如有作为单糖的葡萄糖、果糖等、作为二塘的麦芽糖、蔗糖、低聚糖等以及作为多糖的糊精、环糊精等的通常的糖及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂可使用天然香味剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等))及合成香味剂(邻苯甲酰磺酰亚胺、阿斯巴甜等)。
除了上述之外，本发明的食品可包含多种营养剂、维生素类、矿物(电解质)、食物成分、合成风味剂及天然风味剂等的风味剂、着色剂及重镇剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇及碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等。若考虑对食品的容易接近性，则本发明的食品非常有用于抑制脑神经细胞的细胞凋亡，并预防及治疗脑神经疾病。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。这种实施例只用于更详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不由这些实施例限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1.5型磷酸二酯酶抑制剂的神经元(neuron)的保护效果】
【实验材料及实验方法】
【1.实验动物的准备】
使6周龄的100只健康的雄性斯普拉格-道利大鼠(体重180-200g；SLC，日本)适应于环境100天之后使用于实验中。以20-25℃的温度及50-55％的湿度每一窝饲养了5只大鼠。将暗周期设定为12hr:12hr，可自由摄取水和食物(标准啮齿目食物、三阳、韩国)。所有动物基于依照实验动物资源机关、生命科学委员会、美国国立研究会(1996)的大邱韩医大学校的实验动物的饲养及使用指南。具体实验组如下：
【表1】
【2.实验物质的准备及给药】
将米罗那非(mirodenafil 2HCl，SK化学生命科学业务(SK Chemical LifeScience Business)，韩国)使用于实验中。米罗那非作为白色粉，易溶于盐水。为了从光和湿气中保护米罗那非，在4℃的冰箱中进行保存。以0.5mg/ml、1mg/ml及2mg/ml使米罗那非溶解于生理盐水中之后，从手术24小时开始，以1天1次的方式向大鼠的背部皮肤以每公斤1ml的容量皮下给药了28天。在各对照组中，将同量的盐水进行给药，来代替米罗那非。
【3.神经细胞凋亡(apoptosis)动物模型的制备】
通过以下方法对实验动物的大脑右半球施加损伤来诱导神经细胞的凋亡。具体地，用在70％的N2O和28.5％的O2气体中混合2％或3％的异氟烷的麻醉气体进行全身麻醉之后固定于手术台，在眼窝和外耳道之间横向切开右侧头部皮肤来使颞肌露出之后，以防止面神经和眼窝骨受损的方式进行切除来露出颞骨的一部分。之后，通过利用牙科用钻子的颞下颅骨切除术(subtemporal craniectomy)露出近端大脑中动脉(proximal MCA)。之后，在嗅束附近的大脑静脉的正下方实施微型双极凝固法(microbipolar coagulation)来永久性地封闭了近端大脑中动脉。吸入并全身麻醉之后，利用直肠温度计和热垫来恒定地保持体温，整体死亡率观察为5％以下。假手术对照组以与上述相同的方法露出近端大脑中动脉之后不实施微型双极凝固法，而封闭了肠腔。
【4.免疫组织化学评价】
在进行大脑石蜡片(section)的脱蜡之后，通过在文献Shi SR et al.,JHistochem Cytochem.41:1599-604(1993)中所公开的方法执行了柠檬酸盐缓冲剂抗原(epitope)的回收预处理。简单地说，将装有包含10mM的柠檬酸盐缓冲剂(pH6.0)的染色盘的水槽预热至95-100℃，并将载玻片浸泡于染色盘，且在盘上以松散的方式放置盖子之后，培养了20分钟。在常温条件下放置染色盘之后，将载玻片冷却了20分钟。表位回收之后按照以下步骤对各部分进行了免疫染色。
在常温条件下，与甲醇及0.3％的H2O2一同将各个部分培养30分钟，并在0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)中清洗3分钟(pH7.2)。
在抗湿腔室中，在常温条件下，与正常马血清阻断剂(Vector Lab.Inc.美国；稀释1:100)一同将各个部分培养1小时，并用0.01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
在抗湿腔室中，在4℃温度下，与第一抗血清(抗劈胱天蛋白酶-3(Asp175)多克隆抗体(Anti-cleaved caspase-3(Asp175)polyclonal antibody))，稀释1:400；抗劈聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(Asp214)大鼠特异性抗体(Anti-cleaved PARP(Asp214)ratspecific antibody)，稀释1:100)一同将各个部分培养一宿之后，用0.01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
在抗湿腔室中，在常温条件下，与生物素化通用第二抗体(Vector Lab.Inc.美国；稀释1:50)一同将各个部分培养1小时之后，用0.01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
在抗湿腔室中，在常温条件下，与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物试剂(Vectastain Elite ABC Kit，Vector Lab.稀释1:50)一同将各个部分培养1小时之后，用0.01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
在过氧化物酶底物试剂盒(Vector Lab.)中，在常温条件下，将各个部分培养5分钟之后，在0.01M的磷酸盐缓冲液中清洗3分钟。
用迈尔氏(Mayer’s)苏木精溶液进行对比染色之后，在流水中清洗30分钟。
用95％的乙醇进行2分钟的脱水、用100％的乙醇进行3分钟的脱水之后，用二甲苯进行2次透明化作业，并
利用永久封固剂(permanent mounting medium)实现盖玻片之后，利用光学显微镜进行观察(尼康，日本)。
组织形态测定：将对胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP，PolyADP ribose polymerase)以10％以上的免疫反应性填满的神经细胞视为免疫反应性。使用图像分析程序来测定了存在于同侧性损伤周边部位的大脑皮质的mm2中的胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应性细胞的数量。
【5.组织病理学评价】
上述神经细胞凋亡处置29天之后，牺牲了大鼠。去除脑部，并用磷酸盐缓冲液(pH7.4)来清洗之后，利用大脑不锈钢冠状矩阵(brain stainless steel coronalmatrix；Harvard，美国)来从额叶极(frontal brain pole)开始以2至14mm的范围分为连续的6个冠状切面(厚度为2mm)。将利用大脑不锈钢冠状矩阵来制备的脑部固定于10％的中性缓冲福尔马林(NBF，neutral buffered formalin)(未进行TTC染色)。之后，为了大脑皮质的组织病理学检查，实施苏木精和伊红(H&E，hematoxylin and eosin)染色。在苏木精和伊红染色条件下，通过组织形态测定术(Histomorphometry)计算了大脑皮质的萎缩性％(cerebral atrophic％)及退行性神经元(degenerative neurons，呈现为嗜酸性粒细胞)的数量。为了分析，未向组织病理学者提供组的编采的信息。
组织形态测定：与制备的组织染色标本的完整的对侧性(contralateral)半球进行比较，并按照以下数学公式1计算了同侧性(ipsilateral)大脑皮质的萎缩％。并且，测定了每单位面积(mm2)的退行性神经元的数量。
【数学公式1】
形成脑萎缩＝(对侧性大脑皮质的面积－同侧性大脑皮质的面积)/对侧性大脑皮质面积×100
【6.体重测定】
诱发神经细胞凋亡1天前、诱发当天及诱发之后1天、7天、14天、21天、28天及29天测定了体重。为了减小各个动物之间的差异，按照以下数学公式2计算了诱发之后体重的增加量和连续性的试验物质的给药。
【数学公式2】
诱发神经细胞凋亡之后29天期间的体重增加量＝(诱发神经细胞凋亡29天之后的体重－神经细胞凋亡诱发各天的体重)
【7.感觉运动功能评价(sensorimotor function assessment)－神经学运动行为检查】
利用肢体放置检查(limb placing test；de Ryck M et al.,Stroke.20:1383-90(1989))及身体摇摆检查(body swing；Borlongan and Sanberg,J Neurosci.15:5372-8(1995))来评价了感觉运动功能。为了取得基准，在诱发神经细胞凋亡1天之前执行检查之后，诱发第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天执行。行为检查在将药物进行给药之前结束。未向负责评价的检查员提供实验物质处理的信息。
肢体放置检查：独立评价了前肢及后肢的放置。为了前肢放置检查，使大鼠的前肢处于自由的状态，抓住躯干慢慢地向桌子上端的边缘移动，停止对大鼠胡须的短的触摸(用于视觉所诱导的放置)，触摸大鼠的胡须(用于胡须所诱导的放置)，直到上述桌子上端的边缘向前肢的前面照射光(用于触觉所诱导的放置)，借助所增加的压力向桌子的边缘伸出前肢(用于本体感受所诱导的放置)。按照上述方法评价了后肢放置。按照以下的基准对视觉、胡须、触觉及本体感受刺激的各个肢体的反应进行了评分化(在前肢试验中总分为12分，在后肢试验中6分意味着最大神经缺损，0分意味着正常行为)。
正常行为＝0分；
单侧肢体表现(performance with unilateral limb)＝1分；
延迟(2秒钟)和/或不完全行为＝2分；
无行为＝3分。
身体摇摆检查：从尾端约2cm的位置抓住实验动物之后，向桌子表面上以1英寸的方式进行增加。每当大鼠将头部从垂直轴移动10°以上之后重新回到垂直姿势时，记录了摇摆(swing)。对每只动物计算了共30次的摇摆。由于向右半球诱发神经细胞凋亡之后，实验动物存在向相反的脑(左侧)侧摇摆的倾向，因而作为恢复率的测定，与完整动物的分数记录一同记录了向右侧的摇摆数及百分比。
【8.认知运动行为评价(cognitive motor behavior assessment)】
为了认知检查，实施了水迷宫检查(J Neurosci Methods.11:47-60(1984))。神经细胞凋亡诱发14天及28天之后，在填满22.0±1.0℃温度的水的暗颜色的罐(直径150cm×高度50cm)中，以隔10分钟的方式实施了3次。将15×30cm的水中平台(从水的表面2mm以下)放置于水槽的西北象限(northwest quadrant)。使释放点(release point)始终朝向水槽的南侧。以与水槽的壁相向的方式使实验动物入水之后进行释放。利用摄像机跟踪系统(Smart junior，PanLab，西班牙)来对各实施中的实验动物的游泳路径进行了记录，并计算了到达逃避平台(escape platform)为止移动的距离(m)及时间(秒钟)。
【9.统计分析】
所有数据都由10只大鼠的平均值±标准差(S.D.)表示。执行了用于服用量不同的组的多重比较检查。利用Levene试验(Levene A,Clin Otalary,1981；6:145-51)来调查了方差齐性(Variance homogeneity)。若Levene试验结果为从方差齐性导出无显著性的偏差的情况下，为了确定组比较的哪一对组显著不同，根据单向方差分析试验(one-way ANOVAtest)之后的最小显著差异(LSD)多重比较试验来分析了得到的数据。并且，在Levene试验中观察到从方差齐性具有显著性的偏差的情况下，执行了非参数比较试验(non-parametric comparison test)及克鲁斯凯-沃里斯试验(Kruskal-Wallis H test)。在克鲁斯凯-沃里斯试验中观察到具有显著性的差异的情况下，为了确定呈现显著不同的差异的特定组对，执行了Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test。统计学分析使用统计产品与服务解决方案(SPSS)(Release 14K,SPSS Inc.,USA；Ludbrook,Clin Exp PharmacolPhysiol,1997；24:294-6)来执行。并且，为了对试验物质的效率的理解，根据以下数学公式3计算了神经细胞凋亡对照组和米罗那非处理实验组之间的变化。
【数学公式3】
与神经细胞凋亡对照组进行比较的百分比变化(％)＝[((米罗那非处理组的数据－神经细胞凋亡对照组的数据)/神经细胞凋亡对照组的数据)×100]
【实验结果】
【1.5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞凋亡抑制效果】
在受损伤的脑组织周边部位的病理学标本中，在神经细胞凋亡对照组中，确认到作为比假手术对照组更损伤的部位的右侧大脑半球的具有显著性的显著萎缩和在每单位面积(mm2)大脑皮质内的退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量增加。相反，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，分别确认到与对照组相比更具有显著性的大脑皮质内的退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量减少。在1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，确认到与对照组相比更具有显著性的大脑皮质的萎缩抑制(p＜0.01)，大脑皮质内的退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量也呈现了具有显著性的减少(p＜0.01；表2及图1)。
【表2】
具体地，在0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑半球的萎缩程度与对照组相比，分别呈现了-8.70％、-46.42％及-53.31％的变化。
在0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的退行性神经元的数量与对照组相比，分别呈现了-44.47％、-73.46％及-76.54％的变化。
在0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的胱天蛋白酶-3免疫反应神经元的数量与对照组相比，分别呈现了-33.43％、-76.44％及-77.96％的变化。
在0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应神经元的数量与对照组相比，分别呈现了-37.58％、-76.74％及-78.32％的变化。
通过上述结果，可以确认到米罗那非之类的5型磷酸二酯酶抑制剂通过抑制脑神经细胞的凋亡呈现神经细胞的保护活性。
【2.抑制神经细胞凋亡来呈现神经细胞的保护效果的5型磷酸二酯酶抑制剂所产生的神经学及认知运动行为障碍的改善效果】
【(1)体重变化】
在神经细胞凋亡对照组中，从手术14天之后开始观察与假手术对照组相比更具有显著性的体重的减少(p＜0.01或p＜0.05)，实验期间内的增体量也呈现了具有显著性的减少(p＜0.01)。在1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中分别观察到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的增体量的增加(p＜0.01)，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中也观察到与对照组相比更显著的增体量的增加(表3及图2)。神经细胞凋亡(大脑右半球损伤)诱发之后29天期间的增体量在0.5mg/kg、1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比分别呈现了45.53％、218.52％及155.74％的变化。
【表3】
【(2)对感觉运动功能产生的影响分析】
【前肢放置评价】
在神经细胞损伤(大脑右半球损伤)对照组中，从手术24小时之后开始在整个实验期间观察到与假手术对照组相比更具有显著性的前肢放置检查分数的增加(p＜0.01)。在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，损伤诱发14天之后观察到与神经细胞损伤对照组相比更具有显著性的前肢放置检查分数的减少(p＜0.05)，在1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，分别从损伤诱发3天之后开始在整个实验期间，观察到与对照组相比更具有显著性的前肢放置检查分数的减少(p＜0.01；表4)。
【表4】
具体地，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，前肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-3.61％、-10.34％、12.82％、-11.11％及-12.90％的变化。
在1mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，前肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-18.07％、-29.89％、-32.05％、-41.67％及-56.45％的变化。
在2mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，前肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-25.30％、-34.48％、-39.74％、-43.06％及-58.06％的变化。
【后肢放置评价】
在神经细胞损伤对照组中，从损伤诱发24小时之后开始在整个实验期间观察到与假手术对照组相比更具有显著性的后肢放置检查分数的增加(p＜0.01)。在1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，分别从损伤诱发3天之后开始在整个实验期间确认到与对照组相比更具有显著性的后肢放置检查分数的减少(p＜0.01或p＜0.05；表5)。
【表5】
具体地，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，后肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-6.98％、-8.57％、-9.68％,-13.33％及-11.11％的变化。
在1mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，后肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-18.80％、-28.57％、-32.26％、-43.33及-59.26％的变化。
在2mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，后肢放置检查分数从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了-23.26％、-34.29％、-41.94％、-46.67％及-59.26％的变化。
【身体摇摆评价】
在神经细胞凋亡对照组中，从损伤诱发24小时之后开始在整个实验期间观察到与假手术对照组相比更具有显著性的向右侧的身体摇摆次数及比率的减少(p＜0.01)。在0.5mg/kg及1mg/kg的米罗那非给药组中，分别从损伤诱发14天之后开始在整个实验期间观察到与对照组相比更具有显著性的向右侧的身体摇摆次数及比率的增加(p＜0.01或p＜0.05)，在2mg/kg的米罗那非给药组中，从损伤诱发3天之后开始在整个实验期间观察到与对照组相比更具有显著性的向右侧的身体摇摆次数及比率的增加(p＜0.01或p＜0.05；表6)。
【表6】
【同侧性向右侧的身体摇摆次数/共30次身体摇摆】
【同侧性向右侧的身体摇摆百分比/共30次身体摇摆】
具体地，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，向右侧的身体摇摆次数及比率从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了16.67％、9.09％、44.83％、50.00％及44.19％的变化。
在1mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，向右侧的身体摇摆次数及比率从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了50.00％、40.91％、100.00％、102.78％及167.44％的变化。
在2mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，向右侧的身体摇摆次数及比率从损伤诱发3天、7天、14天、21天及28天之后分别呈现了66.67％、45.45％、106.90％、144.44％及158.14％的变化。
【(3)对认知运动行为产生的影响分析】
在假手术对照组中，每当反复实施时，从水迷宫罐内到逃避平台的移动距离及时间显著地减少，但在神经细胞凋亡对照组中，损伤诱发14天及28天之后分别观察到与假手术对照组相比更具有显著性的平台为止的移动距离及时间的增加(p＜0.01)，根据实施次数的移动距离及时间的缩短也显著地得到了抑制。在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，损伤诱发14天之后第二次实施及手术28天之后在所有实施中分别确认到与对照组相比更具有显著性的平台为止的移动距离的减少(p＜0.01或p＜0.05)，在除了损伤诱发14天之后第一次实施之外的所有实施中分别确认到平台为止的移动时间的具有显著性的减少(p＜0.01或p＜0.05)。并且，在1mg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，在除了损伤诱发14天之后第一次实施之外的所有实施中分别确认到损伤诱发14天及28天之后平台为止的移动距离及时间的具有显著性的减少(p＜0.01或p＜0.05；表7)。
【表7】
【到达至逃避平台的距离(m)】
【到达至逃避平台的时间(秒钟)】
与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap＜0.01及bp＜0.05
与基于最小显著差异试验的障碍诱发组进行比较，cp＜0.01及dp＜0.05
与基于MW试验的假手术对照组进行比较，ep＜0.01
与基于MW试验的假手术组进行比较，fp＜0.01
具体地，在0.5mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，从水迷宫罐内到平台的移动距离在损伤诱发14天之后的第二次及第三次实施及损伤诱发28天之后的所有实施中分别呈现了-7.93％、-9.42％、-9.80％、-14.02％及-17.56％的变化，平台为止的移动时间分别呈现了-10.47％、-18.37％、-11.45％、-22.23％及-29.16％的变化。
在1mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，从水迷宫罐内到平台的移动距离在损伤诱发14天之后的第二次及第三次实施及损伤诱发28天之后的所有实施中分别呈现了-11.07％、-19.20％、-13.80％、-28.51％及-47.33％的变化，平台为止的移动时间分别呈现了-12.52％、-24.82％、-16.98％、-31.11％及-44.46％的变化。
在2mg/kg的米罗那非给药组中，与对照组相比，从水迷宫罐内到平台的移动距离在损伤诱发14天之后的第二次及第三次实施及损伤诱发28天之后的所有实施中分别呈现了-12.54％、-20.37％、-14.01％、-29.65％及-44.14％的变化，平台为止的移动时间分别呈现了-12.06％、-25.90％、-17.06％、-31.28％及-45.32％的变化。
【实施例2.5型磷酸二酯酶抑制剂的神经元(neuron)保护效果－给药时期分析】
【实验材料及实验方法】
【1.实验动物的准备】
使6周龄的100只健康的雄性斯普拉格-道利大鼠(体重170-190g；SLC，日本)适应于环境16天之后使用于实验中。以20-25℃的温度及50-55％的湿度每一窝饲养了5只大鼠。将暗周期设定为12hr:12hr，可自由摄取水和食物(标准啮齿目食物、三阳、韩国)。所有动物基于依照实验动物资源机关、生命科学委员会、美国国立研究会(1996)的大邱韩医大学校的实验动物的饲养及使用指南。具体实验组如下：
【表8】
【2.实验物质的准备及给药】
将米罗那非(mirodenafil 2HCl，SK化学生命科学业务(SK Chemical LifeScience Business)，韩国)使用于实验中。米罗那非作为白色粉，易溶于盐水。为了从光和湿气中保护米罗那非，在4℃的冰箱中进行保存。以1mg/ml的浓度使米罗那非溶解于生理盐水中之后，从手术24小时、72小时及168小时开始，以1天1次的方式向大鼠的背部皮肤以每公斤1ml的容量皮下给药了14天。在假手术对照组及神经细胞凋亡对照组中，从手术之后24小时开始将同量的盐水皮下给药20天来代替米罗那非。
【3.神经细胞凋亡(apoptosis)动物模型的制备】
通过以下方法对实验动物的大脑右半球施加损伤来诱导神经细胞的凋亡。具体地，用在70％的N2O和28.5％的O2气体中混合1.5％的异氟烷的麻醉气体进行全身麻醉之后固定于手术台，在眼窝和外耳道之间横向切开右侧头部皮肤来使颞肌露出之后，以防止面神经和眼窝骨受损的方式进行切除来露出颞骨的一部分。之后，通过利用牙科用钻子的颞下颅骨切除术(subtemporal craniectomy)露出近端大脑中动脉(proximal MCA)。之后，在嗅束附近的大脑静脉的正下方实施微型双极凝固法(microbipolar coagulation)来永久性地封闭了近端大脑中动脉。吸入并全身麻醉之后，利用直肠温度计和热垫来恒定地保持体温，整体死亡率观察为5％以下。假手术对照组以与上述相同的方法露出近端大脑中动脉之后不实施微型双极凝固法，而封闭了肠腔。
【4.免疫组织化学评价】
在进行大脑石蜡片的脱蜡之后，通过在文献Shi SR et al.,J HistochemCytochem.41:1599-604(1993)中所公开的方法执行了柠檬酸盐缓冲剂抗原(epitope)的回收预处理。简单地说，将装有包含10mM的柠檬酸盐缓冲剂(pH6.0)的染色盘的水槽预热至95-100℃，并将载玻片浸泡于染色盘，且在盘上以松散的方式放置盖子之后，培养了20分钟，在常温条件下放置染色盘之后，将载玻片冷却了20分钟。表位回收之后，利用对胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC，avidin-biotin complex)法来对切片进行了免疫染色。简单地说，在甲醇及0.3％的H2O2中培养30分钟，来抑制内生的过氧化物酶的活性，并使用正常马血清阻断剂(Vector Lab.,Burlingame,CA,USA.1:100稀释)来阻断了免疫球蛋白的非-特异性结合。在4℃温度下，将第一抗血清处理一宿，并在常温条件下，对生物素化通用第二抗体(Vector Lab.,1:50稀释)及亲和素-生物素-过氧化物酶复合物试剂(Vectastain Elite ABC Kit,Vector Lab.,1:50稀释)处理了1小时。最后，在常温条件下，与过氧化物酶底物试剂盒(Vector Lab.)反应3分钟。在各步骤中，用0.01M的磷酸盐缓冲液将所有切片清洗3次。将对胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶以10％以上的免疫反应性(密度)填满的神经细胞判断为阳性，使用图像分析程序来测定了分散于同侧性损伤周边部位的大脑皮质的mm2中的胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应性细胞的数量(Lee et al.,2010；Song etal.,2012)。为了分析，未向组织病理学者提供组的编采的信息。
【5.组织病理学评价】
上述神经细胞凋亡处置29天之后，牺牲了大鼠。去除脑部，并用磷酸盐缓冲液(pH7.4)来清洗之后，利用大脑不锈钢冠状矩阵(brain stainless steel coronalmatrix；Harvard，美国)来从额叶极(frontal brain pole)开始以2至14mm的范围分为连续的6个冠状切面(厚度为2mm)。将制备的第六个大脑部分直接固定于10％的中性缓冲福尔马林(NBF，neutral buffered formalin)。之后，包埋于石蜡，并以横截面切割之后，为了大脑皮质的组织病理学检查，实施苏木精和伊红(H&E)染色。在苏木精和伊红染色条件下，通过组织形态测定术(Histomorphometry)计算了大脑皮质的萎缩性％(cerebral atrophic％)及退行性神经元(degenerative neurons，呈现为嗜酸性粒细胞)的数量。为了分析，未向组织病理学者提供组的编采的信息。
组织形态测定：与制备的组织染色标本的完整的对侧性(contralateral)半球进行比较，并按照以下数学公式4计算了同侧性(ipsilateral)大脑皮质的萎缩％。并且，测定了每单位面积(mm2)的退行性神经元的数量。
【数学公式4】
形成脑萎缩＝(对侧性大脑皮质的面积－同侧性大脑皮质的面积)/对侧性大脑皮质面积×100(％)
【6.体重测定】
诱发神经细胞凋亡1天前、诱发当天及诱发之后1天、7天、14天、21天、28天及29天测定了体重。为了减小各个动物之间的差异，按照以下数学公式5计算了诱发神经细胞凋亡之后体重的增加量和连续性的试验物质的给药。
【数学公式5】
诱发神经细胞凋亡之后29天期间的体重增加量＝(诱发神经细胞凋亡29天之后的体重－神经细胞凋亡诱发各天的体重)
【7.感觉运动功能评价(sensorimotor function assessment)－神经学运动行为检查】
利用肢体放置检查(limb placing test；de Ryck M et al.,Stroke.20:1383-90(1989))及身体摇摆检查(body swing；Borlongan and Sanberg,J Neurosci.15:5372-8(1995))来评价了感觉运动功能。检查在诱发神经细胞凋亡之后第1天及第28天执行。未向负责评价的检查员提供实验物质处理的信息。
肢体放置检查：独立评价了前肢及后肢的放置。为了前肢放置检查，使大鼠的前肢处于自由的状态，抓住躯干慢慢地向桌子上端的边缘移动，停止对大鼠胡须的短的触摸(用于视觉所诱导的放置)，触摸大鼠的胡须(用于胡须所诱导的放置)，直到上述桌子上端的边缘向前肢的前面照射光(用于触觉所诱导的放置)，借助所增加的压力向桌子的边缘伸出前肢(用于本体感受所诱导的放置)。按照上述方法评价了后肢放置。按照以下的基准对视觉、胡须、触觉及本体感受刺激的各个肢体的反应进行了评分化(在前肢试验中总分为12分，在后肢试验中6分意味着最大神经缺损，0分意味着正常行为)。
正常行为＝0分；
单侧肢体表现(performance with unilateral limb)＝1分；
延迟(2秒钟)和/或不完全行为＝2分；
无行为＝3分。
身体摇摆检查：从尾端约2cm的位置抓住实验动物之后，向桌子表面上以1英寸的方式进行增加。每当大鼠将头部从垂直轴移动10°以上之后重新回到垂直姿势时，记录了摇摆(swing)。对每只动物计算了共30次的摇摆。由于向右半球诱发神经细胞凋亡之后，实验动物存在向相反的脑(左侧)侧摇摆的倾向，因而作为恢复率的测定，与完整动物的分数记录一同记录了向右侧的摇摆数及百分比。
【8.认知运动行为评价(cognitive motor behavior assessment)】
为了认知检查，实施了水迷宫检查(J Neurosci Methods.11:47-60(1984))。神经细胞凋亡诱发14天及28天之后，在填满22.0±1.0℃温度的水的暗颜色的罐(直径150cm×高度50cm)中，以隔10分钟的方式实施了3次。将15×30cm的水中平台(从水的表面2mm以下)放置于水槽的西北象限(northwest quadrant)。使释放点(release point)始终朝向水槽的南侧。以与水槽的壁相向的方式使实验动物入水之后进行释放。利用摄像机跟踪系统(Smart junior，PanLab，西班牙)来对各实施中的实验动物的游泳路径进行了记录，并计算了到达逃避平台(escape platform)为止移动的距离(m)及时间(秒钟)。
【9.统计分析】
所有数据都由10只大鼠的平均值±标准差(S.D.)表示。执行了用于服用量不同的组的多重比较检查。利用Levene试验(Levene A,Clin Otalary,1981；6:145-51)来调查了方差齐性(Variance homogeneity)。若Levene试验结果为从方差齐性导出无显著性的偏差的情况下，为了确定组比较的哪一对组显著不同，根据单向方差分析试验(one-way ANOVAtest)之后的最小显著差异(LSD)多重比较试验来分析了得到的数据。并且，在Levene试验中观察到从方差齐性具有显著性的偏差的情况下，执行了非参数比较试验(non-parametric comparison test)及克鲁斯凯-沃里斯试验(Kruskal-Wallis H test)。在克鲁斯凯-沃里斯试验中观察到具有显著性的差异的情况下，为了确定呈现显著不同的差异的特定组对，执行了Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test。统计学分析使用统计产品与服务解决方案(SPSS)(Release 14K,SPSS Inc.,USA；Ludbrook,Clin Exp PharmacolPhysiol,1997；24:294-6)来执行。并且，为了对试验物质的效率的理解，根据以下数学公式6及数学公式7计算了神经细胞凋亡对照组和米罗那非处理实验组之间的变化。
【数学公式6】
与假手术对照组进行比较的百分比变化(％)＝[((神经细胞凋亡对照组的数据－假手术对照组的数据)/假手术对照组的数据)×100]
【数学公式7】
与神经细胞凋亡对照组进行比较的百分比变化(％)＝[((米罗那非处理组的数据－神经细胞凋亡对照组的数据)/神经细胞凋亡对照组的数据)×100]
【实验结果】
【1.5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞凋亡抑制效果】
在受损伤的脑组织周边部位的病理学标本中，在神经细胞凋亡对照组中，确认到作为诱发部位的右侧大脑半球的具有显著性的(p＜0.01)显著萎缩和在每单位面积(mm2)大脑皮质内的变性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量增加。相反，在分别将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，从手术24小时及72小时之后开始确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)大脑半球的萎缩抑制，并观察到大脑皮质内的变性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量减少，手术168小时之后开始，在1mg/kg的米罗那非给药组中，也确认到与对照组相比更具有显著性的(p＜0.05)大脑半球的萎缩抑制、大脑皮质内的变性神经元及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量减少，还确认到胱天蛋白酶-3免疫反应细胞的显著减少(表9及图3)。
【表9】
具体地，作为诱发部位的右侧大脑半球的萎缩程度在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了1581.66％的变化，但手术(通过大脑右半球损伤的神经细胞凋亡的诱发)24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了-60.71％、-26.37％及-12.31％的变化。
在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的变性神经元的数量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了1625.83％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了-70.64％、-45.90％及-15.40％的变化。
在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的胱天蛋白酶-3免疫反应神经元的数量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了1360.00％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了-57.29％、-40.63％及-15.57％的变化。
在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应神经元的数量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了983.59％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了-53.92％、-39.72％及-15.68％的变化。
通过上述结果，可确认到米罗那非之类的5型磷酸二酯酶抑制剂抑制脑神经细胞的凋亡来呈现神经细胞的保护活性。
【2.抑制神经细胞凋亡来呈现神经细胞的保护效果的5型磷酸二酯酶抑制剂所产生的神经学及认知运动行为障碍的改善效果】
【(1)体重变化】
在神经细胞凋亡对照组中，从手术7天之后开始观察与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)体重的减少，实验期间内的增体量也呈现了具有显著性的(p＜0.01)减少。从手术24小时及72小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，分别在手术28天及29天确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)体重的增加，实验期间的增体量也呈现了与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)增加。另一方面，手术168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的体重及增体量的变化(表10及图4)。手术29天期间的增体量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了-48.49％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现了43.24％、33.78％及11.04％的变化。
【表10】
【(2)对感觉运动功能产生的影响分析】
【前肢放置评价】
仅选择使用了手术24小时之后在前肢放置检查中呈现最高点(score 12)的大鼠，在神经细胞凋亡对照组中，在手术28天之后也确认到与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)前肢放置检查分数的增加。手术24小时及72小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，手术28天后分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)前肢放置检查的减少，但手术168小时之后，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的前肢放置检查分数的变化(图5)。
具体地，手术28天之后前肢放置检查分数在神经细胞凋亡对照组中与假手术对照组相比呈现了800.00％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现了-57.41％、-29.63％及-11.11％的变化。
【后肢放置评价】
仅选择使用了手术24小时之后在后肢放置检查中呈现最高点(score 6)的大鼠，在神经细胞凋亡对照组中，在手术28天之后也确认到与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)后肢放置检查分数的增加，但在手术24小时及72小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)后肢放置检查的减少。手术168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的后肢放置检查分数的变化(图6)。
具体地，手术28天之后后肢放置检查分数在神经细胞凋亡对照组中与假手术对照组相比呈现了1050.00％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现了-65.22％、-39.13％及-17.39％的变化。
【身体摇摆评价】
仅选择使用了手术24小时之后向右侧手术部位的身体摇摆次数及比率的减少为规定的(1-4次；3.33-13.33％)大鼠，在神经细胞凋亡对照组中，在手术28天之后也确认到与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)向右侧手术部位的身体摇摆次数及比率的减少。手术24小时及72小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)向右侧手术部位的身体摇摆次数及比率的增加，但手术168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的身体摇摆次数及比率的变化(图7)。
具体地，手术28天之后向右侧手术部位的身体摇摆次数及比率在神经细胞凋亡对照组中与假手术对照组相比呈现了-59.35％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了82.00％、48.00％及14.00％的变化。
【(3)对认知运动行为产生的影响分析－水迷宫检查】
在假手术对照组中，每当反复实施时，从水迷宫罐内到逃避平台的移动距离及时间显著地减少，但在神经细胞凋亡对照组中，手术28天之后分别确认到与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)平台为止的移动距离及时间的增加，根据实施次数的移动距离及时间的缩短也显著地得到了抑制。手术24小时及72小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，在手术2天后在所有实施中分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)平台为止的移动距离及时间的减少，但在手术168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的平台为止的移动距离及时间的变化(图8)。
具体地，手术28天之后，在神经细胞凋亡对照组中，从水迷宫罐内到平台的平均移动距离与假手术对照组相比呈现了85.74％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现了-26.45％、-16.05％及-6.42％的变化。
手术28天之后，在神经细胞凋亡对照组中，从水迷宫罐内到平台的平均移动时间与假手术对照组相比呈现了79.67％的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现了-24.49％、-17.33％及-5.36％的变化。
【3.检讨】
本实验的结果如下：确认到由脑损伤引起的神经细胞凋亡导致的显著的体重减少、神经学及认知运动行为障碍征象，即，肢体放置检查分数的增加、向右侧的身体摇摆次数及比率的减少、逃避平台为止的移动距离及时间的增加和根据反复实施的移动距离及时间的缩短的抑制，并引起了在组织病理学标本中诱发右侧大脑半球的萎缩、大脑皮质内单位面积的变性神经元、胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶阳性神经元的数量增加。
从手术24小时及72小时开始，通过将1mg/kg的米罗那非进行给药，来分别显著地抑制了由这种脑损伤引起的体重减少、神经学及认知运动行为障碍及脑损伤周边部位大脑皮质神经元的变性征象，手术168小时之后开始，在将1mg/kg的米罗那非给药14天的实验组中，也确认到与神经细胞凋亡对照组相比更显著的脑损伤周边部位大脑皮质神经元的变性及细胞凋亡(apoptosis)抑制征象。因此，判断为如下：当脑损伤(神经细胞凋亡)24小时-72小时之后开始将米罗那非进行给药的情况下，呈现由缺血性脑损伤引起的神经学及认知运动行为障碍的改善效果。
缺血性脑损伤的进展导致认知及运动障碍，最终伴随着显著的体重降低[Garciaet al.,1986；Scholler et al.,2004；Wang et al.,2012]。在本实验的结果中，脑损伤7天之后开始，在所有手术组中也确认到与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)体重的减少，实验期间的增体量也呈现了与假手术对照组相比更具有显著性的(p＜0.01)减少。相反，手术24小时及72小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)体重及增体量的增加，但手术168小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与对照组相比更具有显著性的体重及增体量的变化。这种结果判断为只有脑损伤24小时-72小时之后开始给药，5型磷酸二酯酶抑制剂才能有意义地抑制由认知及行动障碍引起的体重减少的直接证据。
肢体放置检查作为代表性的神经学运动行为检查，将前肢及后肢的放置异常进行等级化，等级越高，就表示神经学运动行为异常越严重。并且，身体摇摆检查也作为频繁使用的神经学运动行为检查，在正常动物中，向左右侧的身体摇摆大致为5:5，相反，在具有脑损伤的动物中，显著地减少向损伤部位的身体摇摆(Roof et al.,2001；Menniti et al.,2009)。并且，水迷宫检查作为最普遍使用的认知运动行为检查，在存在认知运动障碍的情况下，显著地延长向逃避平台的移动距离及时间，尤其在反复实施的情况下，也显著地抑制它们的距离及时间的减少。
本实验的结果如下：手术24小时及72小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，在肢体放置、身体摇摆及水迷宫检查中，显著地抑制由脑损伤导致的神经学及认知运动行为异常征象，但手术168小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的神经学及认知运动行为异常征象的变化。这种结果判断为脑损伤24小时及72小时之后开始给药的情况下，5型磷酸二酯酶抑制剂在缺血性脑损伤中恢复认知及运动功能的直接证据。
本实验的结果如下：在由缺血性脑损伤引起的脑损伤周边部位导致了显著的大脑皮质的萎缩，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，分别在脑损伤周边部位显著性(p＜0.01)地抑制了大脑皮质的萎缩征象，在大脑皮质中也显著性(p＜0.01)地抑制了每单位面积的变性神经元的增加。
胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶作为代表性的细胞凋亡标记(Nunezet al.,1998；Barrett et al.,2001)，在大脑皮质中，这些胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶的增加意味着由细胞凋亡引起的脑损伤的增加。本实验的结果如下：手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将米罗那非进行给药的实验组中，分别显著地抑制了由脑损伤引起的大脑皮质胱天蛋白酶-3及聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶免疫反应细胞的数量增加。因此，观察到脑损伤24小时-168小时之后开始给药的情况下，5型磷酸二酯酶抑制剂在脑损伤周边部位呈现了一定程度的神经保护效果，但观察到开始给药时期越晚，神经保护效果越低。
以上，对本发明的特定部分进行了详细说明，就本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种详细说明只属于优选实例，本发明的范围并不局限于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案来定义。

Claims (8)

1.包含下列物质的组合物用于制备药剂学组合物的用途：
(i)药剂学有效剂量的5型磷酸二酯酶抑制剂，其选自伐地那非、乌地那非、达生他非、阿伐那非及其药剂学上接受的盐；以及
(ii)药剂学上接受的载体，
其中所述药剂学组合物用于预防选自下列的脑神经疾病：神经退行性疾病、认知功能障碍及运动功能障碍，
其中所述5型磷酸二酯酶抑制剂的剂量是0.5～2.0mg/kg个体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药剂学上接受的盐为盐酸盐。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述神经退行性疾病为选自下列的神经性疾病：痴呆症、亨廷顿氏病及肌萎缩性侧索硬化症。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述认知功能障碍为记忆力减退、学习障碍、失认症、健忘症、失语症、失用症或谵妄症。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述运动功能障碍为运动障碍、麻痹、运动失调、异动症、痉挛或肌张力障碍。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述5型磷酸二酯酶抑制剂在脑组织中抑制退行性神经元的形成，或在神经细胞中抑制胱天蛋白酶-3或聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶的表达。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述5型磷酸二酯酶抑制剂以口服给药方式给药到人，或以非口服给药方式给药到除了头部之外的部位。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，当上述5型磷酸二酯酶抑制剂以口服给药方式进行给药时，所述组合物为薄膜剂型。
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