WO2013190867A1 - 膵液成分含有試料の調製方法、及び膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キット - Google Patents

膵液成分含有試料の調製方法、及び膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キット Download PDF

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pancreatic juice
protease inhibitor
room temperature
sample
juice component
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PCT/JP2013/055828
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理惠 片岡
奈緒 守屋
博美 佐貫
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オリンパス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K15/00—Anti-oxidant compositions; Compositions inhibiting chemical change
    • C09K15/04—Anti-oxidant compositions; Compositions inhibiting chemical change containing organic compounds
    • C09K15/28—Anti-oxidant compositions; Compositions inhibiting chemical change containing organic compounds containing nitrogen, oxygen and sulfur
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney

Definitions

  • the present invention includes a method for preparing a preservation sample capable of stably storing S100P contained in pancreatic juice at room temperature until it is used for examination, and a pancreatic juice component suitable for the method.
  • the present invention relates to a kit for storing a biological sample at room temperature.
  • Body fluid is an important biological sample for knowing the state of an organ.
  • pancreatic juice is an important biological sample that contributes to early detection of pancreatic cancer, which is difficult to detect at an early stage and has a very poor prognosis. Cytodiagnosis, bicarbonate measurement, bacterial testing, and testing for markers such as proteins and nucleic acids Etc. are used. In recent years, research for analyzing proteins in pancreatic juice, for example, searching for new markers for pancreatic-related diseases such as pancreatic cancer has been actively conducted.
  • S100P which is a member of the S100 protein family and is a receptor for advanced glycation end product (receptor for advanced glycation endproducts: RAGE), has been confirmed to be expressed in a large number of pancreatic cancers, and is associated with the proliferation and invasion of pancreatic cancer It is reported to be involved.
  • Non-Patent Document 1 reports that S100P is useful as an early carcinogenic marker for pancreas, and that S100P concentration analysis in pancreatic juice is useful for distinguishing between tumor and chronic pancreatitis.
  • Non-Patent Document 2 reports that S100P expression was not observed in normal pancreatic duct epithelium, but S100P expression was observed in all specimens in intraductal papillary mucinous tumor cells. That is, S100P is useful as a marker for pancreatic cancer, and is expected to contribute to early detection of pancreatic cancer, diagnosis of progression, etc. by measuring the amount of S100P in pancreatic juice.
  • pancreatic juice is a digestive juice, it contains various digestive enzymes. These digestive enzymes exist in an inactive state in the pancreas, but are known to be activated after excretion into the duodenum.
  • the digestive enzyme in pancreatic juice undergoes a cascade reaction of degradation by small intestinal enterokinase secreted from duodenal epithelial cells. It is known that trypsinogen contained in pancreatic juice is activated by small intestinal enterokinase to become trypsin, and this trypsin is triggered to activate various digestive enzymes (proteases) such as chymotrypsinogen and proesterase. .
  • pancreatic juice and duodenal juice collected from living organisms are stored frozen until they are subjected to S100P examination, so that the degradation / denaturation of S100P during the storage period is suppressed to some extent. It seems possible. However, when the S100P test is performed as a clinical test, considering that it is difficult to say that all medical institutions and test institutions have adequate specimen storage facilities, pancreatic juice and duodenal juice collected from living organisms are considered. It is desirable that it can be stored at room temperature as much as possible until it is used for inspection.
  • pancreatic juice or duodenal juice is stored at room temperature
  • the activity of proteases derived from pancreatic juice or duodenal juice can be maintained even at room temperature so that S100P contained in these specimens can be stably stored. Must be sufficiently inhibited.
  • a method for storing a solution containing a biological component at room temperature for example, in performing immunoassay such as enzyme immunoassay and radioimmunoassay in the field of clinical examination, a sample containing an antigen to be measured, As a method for preventing the inactivation of the antigen in the sample and stably storing it in a solution state, there is a method of adding casein or whey protein to the sample (for example, see Patent Document 1). Further, as a method for stably storing body fluid at room temperature, there is also a method in which a target body fluid is immersed in a test tool in which a protease inhibitor is held in a porous material and then dried (for example, Patent Documents). 2).
  • Patent Document 1 Although the method described in Patent Document 1 is effective for a sample with very few contaminants such as protease such as a standard solution used for immunoassay, it is originally a large amount such as pancreatic juice and duodenal juice. The effect cannot be expected much for a sample containing protease.
  • Patent Document 2 preserves a specimen in a dry state, and thus is effective to some extent for substances that are not easily denatured by a drying process, such as peptides, but proteins such as S100P May be affected by the three-dimensional structure by the drying treatment and may be denatured.
  • Patent Document 2 describes many protease inhibitors that can be retained in a porous material, a protease inhibitor optimized to suppress the degradation of S100P in pancreatic juice and duodenal juice The combination of is not disclosed. For this reason, even if pancreatic juice etc. are preserve
  • the present invention relates to a method for preparing a pancreatic juice component-containing sample capable of stably storing S100P at room temperature among proteins in a biological sample containing pancreatic juice components such as pancreatic juice and duodenal juice, and the method. It is an object of the present invention to provide a kit for storing a biological sample containing a suitable pancreatic juice component at room temperature.
  • the present inventors combined a biological sample containing a pancreatic juice component with a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and a specific type of trypsin-like serine protease inhibitor.
  • a biological sample containing a pancreatic juice component with a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and a specific type of trypsin-like serine protease inhibitor.
  • the method for preparing a pancreatic fluid component-containing sample and the kit for preserving a pancreatic fluid component-containing sample of the present invention have the following configurations (1) to (10).
  • the method for preparing a pancreatic fluid component-containing sample according to (1) further comprising a step of storing the pancreatic fluid component-containing sample at room temperature after the step of preparing the pancreatic fluid component-containing sample.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group is PMSF, AEBSF, p-APMSF, 4- (fluorosulfonyl) benzoic acid, 3- (fluorosulfonyl) benzoic acid, 2-aminobenzenesulfonyl fluoride, 3 -Pancreatic fluid of (1) above, selected from the group consisting of aminobenzenesulfonyl fluoride, 4-aminobenzenesulfonyl fluoride, 2-nitrobenzenesulfonyl fluoride, 3-nitrobenzenesulfonyl fluoride, and 4-nitrobenzenesulfonyl fluoride Preparation method of component-containing sample.
  • a kit for preserving a biological sample containing a pancreatic juice component at room temperature comprising at least one protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group; and at least one trypsin-like serine protease inhibitor that is an amino acid chloromethyl ketone. .
  • the kit for room temperature storage according to any one of the above (8) to (10).
  • the method for preparing a pancreatic juice component-containing sample of the present invention enables a biological sample containing a pancreatic juice component to be stably stored at room temperature while sufficiently suppressing the degradation and denaturation of S100P contained in the biological sample.
  • Simple storage samples can be prepared. That is, it is possible to provide a high-quality sample by more stably storing proteins in pancreatic juice that are very easily decomposed, and it can be expected to contribute to acceleration of research on pancreatic cancer.
  • the method for preparing a pancreatic juice component-containing sample of the present invention is expected to be widely applied to clinical examinations.
  • kits for room temperature preservation of a biological sample containing the pancreatic juice component of the present invention a biological sample for S100P examination that can be stored at room temperature can be more easily prepared from pancreatic juice or duodenal fluid collected from the living body. be able to.
  • Pancreatic juice is a bodily fluid drained from the pancreatic duct.
  • a biological sample containing a pancreatic juice component means a sample containing a body fluid containing a component derived from pancreatic juice.
  • the body fluid containing the pancreatic juice-derived component include pancreatic fluid collected directly from the pancreas from a catheter, fluid collected from the duodenum (duodenal fluid), and the like.
  • duodenal fluid also includes bile discharged from the nipple, fluid originally present in the duodenum, blood, and the like.
  • pancreatic juice and duodenal juice can be collected by a conventional method.
  • the method for preparing a pancreatic juice component-containing sample of the present invention includes a biological sample containing a pancreatic juice component even at room temperature.
  • this is a method of preparing so that the decomposition and modification of S100P can be suppressed and can be stably stored. That is, in the preparation method of the present invention, at least one protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and at least one trypsin-like serine protease inhibitor that is an amino acid chloromethyl ketone are added to a biological sample containing a pancreatic juice component. And a step of preparing a pancreatic juice component-containing sample, and if necessary, further comprising a step of storing the sample at room temperature until it is used for detection of S100P.
  • a biological sample containing pancreatic juice components such as pancreatic juice and duodenal juice contains a large amount of protease in addition to the protein to be examined (S100P in the preparation method of the present invention)
  • the biological sample Is stored at room temperature
  • the target protein is degraded and denatured by the effect of protease.
  • the biological sample is stored after being stored at room temperature, even if the biological sample contains the protein immediately after collection from the living body, the protein is not detected in the inspection, and the inspection accuracy is improved. There is a problem of lowering.
  • the activity of the protease derived from the biological sample can be effectively suppressed even in a solution state at room temperature. Stability can be dramatically improved. That is, the pancreatic juice component-containing sample obtained by the preparation method of the present invention has an unprecedented high quality even after storage at room temperature and is suitable for S100P inspection (examination for detecting S100P) that requires high accuracy. Is preferred.
  • a trypsin-like serine protease inhibitor that is at least one protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and an amino acid chloromethyl ketone is added to a biological sample containing a pancreatic juice component.
  • specific trypsin-like serine protease inhibitor is added to prepare a pancreatic juice component-containing sample.
  • proteases in pancreatic juice and duodenal juice by amino acid chloromethyl ketones having an inhibitory activity against trypsin-like serine protease such as TLCK (Na-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone)
  • TLCK Na-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone
  • a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and leupeptin can be obtained by using a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group in combination with a trypsin-like serine protease inhibitor that is an amino acid chloromethyl ketone such as TLCK.
  • a trypsin-like serine protease inhibitor that is an amino acid chloromethyl ketone such as TLCK.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group used in the preparation method of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having a sulfonyl fluoride group and having protease inhibitory activity.
  • a compound having a structure in which a sulfonyl fluoride group is bonded directly or via a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • AEBSF 2- (2-aminoethyl) -Benzenesulfonyl fluoride
  • p-APMSF p-amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride
  • 4- (fluorosulfonyl) benzoic acid CAS number: 455-26-5
  • 3- (fluorosulfonyl) benzoic acid Acid CAS number: 454-95-5
  • 2-aminobenzenesulfonate Rufluoride CAS number: 392-86-9
  • 3-aminobenzenesulfonyl fluoride CAS number: 368-50-3
  • 4-aminobenzenesulfonyl fluoride CAS number: 98-62-4
  • 2- Nitrobenzenesulfonyl fluoride CAS number: 433-98-7
  • 3-nitrobenzenesulfonyl fluoride CAS number:
  • protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group used in the preparation method of the present invention may be used, or two or more types may be used in combination.
  • at least one compound selected from the group consisting of PMSF, AEBSF, and p-APMSF is preferably used, and two or more compounds selected from the group consisting of PMSF, AEBSF, and p-APMSF are used in combination. More preferably, all three types may be used.
  • pancreatic juice contains various proteases having different activities, it can be expected that protease activity in a biological sample is more reliably suppressed by using a mixture of a plurality of protease inhibitors. Furthermore, the protease activity can be expected to be suppressed by combining at a lower concentration than when used alone.
  • the amount of the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group added to the biological sample containing the pancreatic juice component is particularly limited as long as the protease inhibitory effect by the protease inhibitor and the room temperature stability improving effect of S100P are exhibited. However, it can be appropriately adjusted in consideration of the type of biological sample containing pancreatic juice components, the type of protease inhibitor used, and the like. For example, when only PMSF is added as a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group to a biological sample containing a pancreatic juice component, the final concentration should be 1 mM or more, preferably 5 mM or more, more preferably 10 mM or more. Can do.
  • AEBSF is added to a biological sample containing pancreatic juice components so that the final concentration is 4 mM or more, preferably 10 mM or more, more preferably 20 mM or more. can do.
  • AEBSF is added to a biological sample containing pancreatic juice components so that the final concentration is 2 mM or more, preferably 5 mM or more, more preferably 10 mM or more. can do.
  • the trypsin-like serine protease inhibitor used in the preparation method of the present invention is not particularly limited as long as it is an amino acid chloromethyl ketone and is a compound having an inhibitory activity against trypsin-like serine protease typified by trypsin. Absent. In the present invention, it is particularly preferable to use TLCK.
  • the amount of the specific trypsin-like serine protease inhibitor added to the biological sample containing the pancreatic juice component is particularly limited as long as the protease inhibitory effect by the protease inhibitor and the room temperature stability improving effect of S100P are exhibited. However, it can be appropriately adjusted in consideration of the type of biological sample containing the pancreatic juice component, the type of protease inhibitor used, and the like. For example, when only TLCK is added as a specific trypsin-like serine protease inhibitor to a biological sample containing pancreatic juice components, the final concentration is 0.1 mM or more, preferably 1 mM or more, more preferably 5 mM or more, and even more preferably 10 mM or more. Can be added.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and the specific trypsin-like serine protease inhibitor added to a biological sample containing a pancreatic juice component are in a solid form such as powder or granule. It may be a protease inhibitor solution dissolved in an appropriate buffer or the like.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and the specific trypsin-like serine protease inhibitor may be added simultaneously to a biological sample containing pancreatic juice components, and after adding one of them first, It may be added.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and the specific trypsin-like serine protease inhibitor are added simultaneously.
  • protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and the specific trypsin-like serine protease inhibitor may be added to a biological sample containing pancreatic juice components, and other protease inhibitors may be added. Further, it may be added.
  • Other protease inhibitors are not particularly limited as long as they do not impair the room temperature stability improving effect of S100P of the present invention.
  • pancreatitis therapeutic agents such as gabexate mesylate (FOY), camostat mesilate (Foipan), nafamostat mesylate (Futan), urinastatin and the like can also be used.
  • the biological sample containing the pancreatic juice component used in the preparation method of the present invention may be a sample containing a bodily fluid containing a pancreatic juice-derived component, and consists only of a bodily fluid containing a pancreatic juice-derived component. It may be a solution obtained by diluting the body fluid with an appropriate buffer or the like, or may be one obtained by adding various additives to the body fluid or a diluted solution thereof. Examples of the additive include a surfactant, a nucleolytic enzyme inhibitor, a pH adjuster, and a pH indicator.
  • the biological sample containing the pancreatic juice component used in the preparation method of the present invention is preferably a sample containing pancreatic juice or duodenal juice. Specific examples include pancreatic juice, duodenal fluid, pancreatic juice, or a diluted solution of duodenal fluid, or a solution obtained by adding the aforementioned various additives to these.
  • a protease sample having a sulfonyl fluoride group and a trypsin-like serine protease inhibitor which is an amino acid chloromethyl ketone is added to a biological sample containing a pancreatic juice component that has been collected from a living body and stored.
  • the interval from the time when the body fluid containing the pancreatic juice component is collected from the living body to the time when the protease inhibitor is added is shorter, and the pancreatic juice or the duodenal juice immediately after collection from the living body is preferably used. It is particularly preferable to add a protease inhibitor.
  • Biological samples containing pancreatic juice have a very strong action of the contained protease, and protein degradation may proceed immediately after collection, so the time lag until the collected biological sample and the protease inhibitor are mixed is shortened This is because it is preferable.
  • a protease inhibitor and amino acid having a sulfonyl fluoride group in advance in a reservoir (a container-like member for storing collected body fluid) provided in a collection tool for collecting pancreatic juice or duodenal fluid from a living body
  • a trypsin-like serine protease inhibitor which is a chloromethyl ketone
  • pancreatic juice or duodenal juice collected from a living body is immediately mixed with the protease inhibitor in a collection container.
  • a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and an amino acid chloromethyl ketone in advance in the storage container A trypsin-like serine protease inhibitor, which is a kind, is filled.
  • pancreatic juice component-containing sample prepared by the preparation method of the present invention can sufficiently exhibit its effect by being stored at room temperature, but may be cryopreserved or refrigerated.
  • the S100P test performed on the pancreatic juice component-containing sample prepared by the preparation method of the present invention is not particularly limited as long as the test is performed for the purpose of detecting or quantifying S100P.
  • various protein analyzes using ELISA, immunochromatography, two-dimensional electrophoresis, Western blot, mass spectrometry, etc. various nucleic acid analyzes using PCR, RT-PCR, hybridization using probes, etc.
  • S100P can be detected by cell analysis such as counting or cytodiagnosis.
  • the preparation method of the present invention is expected to improve the room temperature stability of pancreatic juice-derived components other than S100P.
  • the pancreatic juice component-containing sample prepared by the preparation method of the present invention can be used as a measurement sample for various examinations of components other than S100P in the pancreatic fluid-containing component sample.
  • the substance to be examined is not particularly limited as long as it is a biological component expected to be contained in pancreatic juice or duodenal juice, and may be a protein or a nucleic acid such as DNA or RNA. It may be a cell.
  • pancreatic juice component-containing sample was subjected to various protein analyzes using ELISA, immunochromatography, two-dimensional electrophoresis, Western blot, mass spectrometry, etc., PCR, RT-PCR, hybridization using probes, etc. It can be used for various nucleic acid analysis, cell analysis such as cell count and cytodiagnosis.
  • the biological sample storage kit containing the pancreatic juice component of the present invention includes at least one protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and the amino acid chloromethyl. It has at least one trypsin-like serine protease inhibitor which is a ketone. A protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group and a specific trypsin-like serine protease inhibitor provided in the storage kit are added to a biological sample containing a pancreatic juice component to be used for detection of S100P. In the meantime, a sample containing pancreatic juice components that can be stored at room temperature can be more easily prepared.
  • the protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group contained in the preservation kit of the present invention may be only one kind or a combination of two or more kinds. In the present invention, it is preferable to use one or more compounds selected from the group consisting of PMSF, AEBSF, and p-APMSF, and it is more preferable to use two or more compounds selected from these compound groups. . Similarly, only one type of trypsin-like serine protease inhibitor contained in the preservation kit of the present invention may be used, or two or more types may be combined. In the present invention, TLCK is preferably used as a trypsin-like serine protease inhibitor.
  • the various protease inhibitors contained in the preservation kit of the present invention may be lyophilized powder, or may be tablets or granules obtained by molding the lyophilized powder together with an appropriate excipient or the like.
  • a protease inhibitor solution dissolved in an appropriate buffer may be used.
  • the storage kit of the present invention may further contain a buffer for diluting the collected body fluid, other protease inhibitors, surfactants, pH adjusters, pH indicators and the like.
  • Various additives such as a surfactant, a pH adjuster, and a pH indicator may be previously dissolved in a dilution buffer.
  • the preservation kit of the present invention comprises a prepared pancreatic juice component-containing sample (a biological sample containing a pancreatic juice component is added with various protease inhibitors contained in the preservation kit of the present invention, and other components as necessary.
  • a cap that can be bonded to the opening of the container that allows a certain amount to be dropped from the container filled with the pancreatic juice component-containing sample.
  • the preservation kit of the present invention may include a preservation container having a reservoir for storing a body fluid such as pancreatic juice or duodenal juice collected from a living body.
  • a body fluid such as pancreatic juice or duodenal juice collected from a living body.
  • the protease inhibitor of the present invention is previously contained in the reservoir. If the storage container is graduated, the amount of biological sample added to the storage container (if the storage container is pre-filled with a protease inhibitor, the biological sample and protease The total amount of inhibitors) can be visually confirmed and thus the final concentration of protease inhibitors can be understood at a glance.
  • a biological sample containing a pancreatic juice component is generally collected transendoscopically. Therefore, as a component of the preservation kit of the present invention, a collection tool for collecting a biological sample containing a pancreatic juice component endoscopically may be included.
  • the collecting tool include a combination of a syringe and a catheter that can be inserted into an endoscope apparatus, and a probe that includes an absorber that can be inserted into an endoscope apparatus at the tip.
  • the catheter that can be inserted into the endoscope apparatus include a sample collection cube described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-5009.
  • These collection tools preferably have a storage part into which the protease inhibitor is dispensed in advance. Moreover, when the said storage part is removable, it can be used also as a storage container.
  • protease inhibitors used were aprotinin (Roche), leupeptin (Roche), PMSF (Roche), AEBSF (Roche), p-APMSF (SIGMA), camostat mesylate (Foipan; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), gabexate mesylate (FOY; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), TLCK (manufactured by SIGMA), and TPCK (manufactured by SIGMA).
  • TPCK is an amino acid chloromethyl ketone that has inhibitory activity against chymotrypsin but does not show inhibitory activity against trypsin.
  • the measurement results of the fluorescence amount of each pancreatin solution are shown in FIG.
  • the amount of fluorescence on the vertical axis represents the amount of casein decomposed, and the value was estimated as the protease activity value.
  • the horizontal axis shows the protease inhibitor added to each pancreatin solution and its final concentration.
  • sample solution 1 no inhibitor
  • sample solution 2 AEBSF
  • sample solution 3 AEBSF + PMSF
  • sample solutions were reacted by incubation at 25 ° C. for 16 hours (room temperature storage). Thereafter, each sample solution was diluted 10-fold with the buffer attached to the CircuLex S100P ELISA Kit (manufactured by Cyclex, catalog number: CY-8060), and S100P was detected using the CircuLex S100P ELISA Kit. went. As a control, S100P was detected in the same manner for sample solution 1 immediately after preparation (that is, before storage at room temperature).
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the S100P concentration
  • the horizontal axis indicates that the sample solution 1 was stored at room temperature (in the figure, “before room temperature”), and after the sample solutions 1 to 3 were stored at room temperature (in the figure, “no inhibitor”, “ AEBSF ”,“ AEBSF + PMSF ”).
  • S100P was almost completely degraded in all pancreatic juice samples.
  • sample solutions 2 and 3 to which a protease inhibitor was added S100P was detected in any pancreatic juice sample, and in particular, in sample solution 3 to which both AEBSF and PMSF were added, the S100P concentration was maintained high. From these results, it became clear that S100P in pancreatic juice is more stable at room temperature by mixing at least one, preferably two or more sulfone compounds having a sulfonyl fluoride group.
  • Example 1 In order to detect S100P originally contained in human pancreatic juice specimens, not artificially added preparations, a sulfone compound having a sulfonyl fluoride group alone is insufficient. Therefore, with the aim of further improving the storage performance of S100P, it was investigated whether the storage stability of S100P is affected by the presence or absence of the combined use of a sulfone compound having a sulfonyl fluoride group and TLCK, which is another sulfone compound. Seven types of human clinical specimens were used.
  • sample solution 1 AEBSF
  • AEBSF final concentration: 4 mM
  • PMSF final concentration: 1 mM
  • sample solution (sample solution 2: AEBSF + PMSF), sample solution (sample solution 3) with AEBSF (final concentration: 4 mM), PMSF (final concentration: 1 mM) and aprotinin (final concentration: 3 ⁇ M) added to each human clinical specimen : AEBSF + PMSF + Aprotinin), sample solution in which AEBSF (final concentration: 4 mM), PMSF (final concentration: 1 mM) and TPCK (final concentration: 1 mM) are added to each human clinical sample (sample solution 4: AEBSF + PMSF + TPCK), AEBSF (final concentration: 4 mM) and PMSF (final concentration: 1 m) ) And TLCK (final concentration: 1 mM) added sample solution (sample solution 5: AEBSF + PMSF + TLCK) was prepared.
  • sample solutions 1 to 5 were prepared from the same human clinical specimens as described above except that cryopreservation was performed instead of room temperature storage, and these sample solutions were prepared in the same manner as in Reference Example 2 with S100P. Was detected.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the vertical axis represents the S100P concentration
  • the horizontal axis represents the sample solutions 1 to 5 for human pancreatic juice specimens 1 to 7 (in the figure, “AEBSF”, “AEBSF + PMSF”, “AEBSF + PMSF + Aprotinin”, “AEBSF + PMSF + TPCK”, “AEBSF + TLCK”) Show.
  • “FT” indicates the result after freezing and without storage at room temperature
  • “25 ° C., 16 h” indicates the result after incubation at 25 ° C. for 16 hours (after storage at room temperature). Show.
  • sample solution 1 to which only AEBSF was added and sample solution 2 to which AEBSF and PMSF were added S100P was detected in all human pancreatic juice specimens, but the amount was much smaller than that in the case of cryopreservation. It was found that most S100P was decomposed and modified during storage at room temperature. In contrast, sample solution 5 to which AEBSF, PMSF, and TLCK were added showed an S100P concentration remaining rate of about 70% or more when cryopreserved in all human pancreatic juice specimens.
  • sample solution 3 in which aprotinin was added to AEBSF and PMSF and sample solution 4 in which TPCK was added to AEBSF and PMSF a high residual rate was not found as in sample solution 5 in which AEBSF, PMSF, and TLCK were added.
  • a protease inhibitor having at least one kind of sulfonyl fluoride group and an amino acid chloromethyl ketone having a trypsin-like serine protease inhibitory activity such as TLCK
  • S100P in pancreatic juice can be obtained at room temperature. It was found that it can be stored very stably.
  • sample solution 1 in which 25 ng / mL S100P (standard) solution was mixed with each of the two human clinical specimens (human pancreatic juice specimens 1 and 2) used in Example 1 and the simulated artificial pancreatic juice
  • Sample solution 1 no inhibitor
  • sample solution 1 added with AEBSF (final concentration: 4 mM)
  • sample solution 2 AEBSF
  • PMSF final concentration
  • sample solution 3 AEBSF + PMSF
  • sample solution 1 added with AEBSF final concentration: 4 mM
  • PMSF final concentration: 1 mM
  • TLCK final concentration: 1 mM
  • Each sample solution was CircuLex S100P ELISA It was prepared using the buffer attached to Kit (manufactured by Cyclex, catalog number: CY-8060). After reacting these sample solutions by incubation at 25 ° C. for 16 hours (after storage at room temperature), S100P was detected in the same manner as in Reference Example 2. As a control, the sample solution 1 prepared in the same manner as described above was cryopreserved in place of room temperature storage, and immediately after that, S100P was detected in the same manner as in Reference Example 2.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the S100P concentration
  • the horizontal axis indicates the sample solutions 1 to 4 for the human pancreatic fluid samples 1 and 2 and the pseudo artificial pancreatic fluid containing S100P (in the figure, “no inhibitor”, “AEBSF”, “AEBSF + PMSF”, “AEBSF + PMSF + TLCK”).
  • “FT” indicates the result after freezing and without storage at room temperature
  • “25 ° C., 16 h” indicates the result after incubation at 25 ° C. for 16 hours (after storage at room temperature). Show.
  • the added S100P was detected in both the human pancreatic juice specimen and the pancreatin solution.
  • S100P by using a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group such as AEBSF and a trypsin-like serine protease inhibitor which is an amino acid chloromethyl ketone such as TLCK is used in combination.
  • AEBSF a protease inhibitor having a sulfonyl fluoride group
  • TLCK a trypsin-like serine protease inhibitor which is an amino acid chloromethyl ketone
  • the preparation method of the present invention and the kit for room temperature storage of the present invention can stably store S100P, particularly proteins in biological samples such as pancreatic juice and duodenal juice, at room temperature, S100P in pancreatic juice It can be used in the field of analyzing cervical cancer, especially in the field of clinical examination for diagnosis and treatment of pancreatic cancer.

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Abstract

本発明は、膵液成分を含む生体試料中のタンパク質のうち、特にＳ１００Ｐを、室温で安定して保存することが可能な膵液成分含有試料を調製する方法、及び当該方法に好適なキットを提供する。本発明においては、膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類と、アミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類とを添加することにより、Ｓ１００Ｐの検出に供されるまで室温で保存される膵液成分含有試料を調製することを特徴とする。

Description

膵液成分含有試料の調製方法、及び膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キット
　本発明は、膵液中に含まれているＳ１００Ｐを、検査に供されるまで室温で安定して保存することが可能な保存用試料を調製する方法、及び当該方法に好適な、膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キットに関する。
　体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。特に膵液は、早期発見が難しく、予後が非常に悪いとされる膵癌の早期発見に資する重要な生体試料であり、細胞診、重炭酸塩測定、細菌検査、タンパク質や核酸等からなるマーカーの検査等に用いられている。また、近年、膵液中のタンパク質を解析する研究、例えば、膵癌等の膵臓関連疾患についての新たなマーカーの探索が盛んに行われている。
　特に、Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーであり、糖化最終産物受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ：ＲＡＧＥ）であるＳ１００Ｐは、非常に多くの膵癌で発現が確認されており、かつ、膵癌の増殖・浸潤に関与していることが報告されている。例えば、非特許文献１には、Ｓ１００Ｐが、膵臓の早期の発癌マーカーとして有用であること、及び膵液中のＳ１００Ｐ濃度解析が、腫瘍と慢性膵炎の識別に有用であることが報告されている。また、非特許文献２には、正常な膵臓導管上皮ではＳ１００Ｐの発現は観察されなかったが、膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞では全検体でＳ１００Ｐの発現が観察されたことが報告されている。すなわち、Ｓ１００Ｐは、膵癌のマーカーとして有用であり、膵液中のＳ１００Ｐ量を測定することにより、膵癌の早期発見や進行度の診断等に資することが期待される。
　一方で、膵液は消化液であるため、様々な消化酵素を含む。これらの消化酵素は、膵臓内においては不活性の状態で存在しているが、十二指腸に排出された後に活性化することが知られている。膵液中の消化酵素は、十二指腸上皮細胞から分泌される小腸エンテロキナーゼによって分解のカスケード反応が進む。小腸エンテロキナーゼによって膵液中に含まれるトリプシノーゲンが活性化されてトリプシンになり、さらにこのトリプシンが引き金となり、キモトリプシノーゲン、プロエステラーゼなど種々の消化酵素（プロテアーゼ）が活性化されることが知られている。これら種々のプロテアーゼの活性化により、膵液中に含まれるタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子は、十二指腸に排出後に分解、変性されてしまう。このため、十二指腸へ排出された膵液を生体試料とし、当該生体試料中のＳ１００Ｐを定量する場合、当該生体試料中のＳ１００Ｐがプロテアーゼの影響を受け、正確に測定できないことが懸念される。そこで、十二指腸に排出された膵液中におけるプロテアーゼの活性をいかに阻害するかが重要となる。
　プロテアーゼの活性は一般的に温度に依存するため、生体から採取された膵液や十二指腸液を、Ｓ１００Ｐの検査に供するまで凍結保存しておくことにより、保存期間中のＳ１００Ｐの分解・変性をある程度抑制可能と考えられる。しかし、Ｓ１００Ｐの検査を臨床検査として実施する場合、全ての医療機関や検査機関において検体の保存設備が充分に整っているとは言い難いことを考慮すれば、生体から採取された膵液や十二指腸液は、検査に供されるまで、なるべく室温で保存可能なことが望ましい。そこで、膵液や十二指腸液を室温で保存した場合にも、これらの検体中に含まれているＳ１００Ｐを安定して保存できるように、室温の溶液状態においても、膵液や十二指腸液由来のプロテアーゼの活性を充分に阻害する必要がある。
　生体成分を含有する溶液を室温で保存する方法としては、例えば、臨床検査の分野において酵素免疫測定法、放射線免疫測定法等の免疫測定を行う際に、測定対象である抗原を含む試料を、溶液の状態で、当該試料中の抗原の失活を防止し安定的に保存する方法として、当該試料にカゼイン又はホエイタンパクを加える方法がある（例えば、特許文献１参照）。また、体液を安定的に室温で保存するための方法として、多孔質材にプロテアーゼ阻害剤を保持させた検査具に、目的の体液を浸漬させた後、乾燥させる方法もある（例えば、特許文献２参照）。
特開平８－５６３４号公報 特開２００３－２７０２３７号公報
オオウチダ（Ohuchida）、他９名、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clinical Cancer Research）、２００６年、第１２巻、第１８号、第５４１１～５４１６ページ。 ナカタ（Nakata）、他９名、ヒューマン・パソロジー（Human Pathology）、２０１０年、第４１巻、第８２４～８３１ページ。
　特許文献１に記載の方法は、免疫測定に用いられる標準溶液等のように、プロテアーゼ等の夾雑物が非常に少ない試料に対しては有効であるものの、膵液や十二指腸液のように元々多量のプロテアーゼを含有する試料に対しては、あまり効果が期待できない。
　また、特許文献２に記載の方法は、乾燥状態で検体を保存するため、検査対象がペプチド等の比較的乾燥処理による変性が生じ難い物質にはある程度有効であるが、Ｓ１００Ｐをはじめとするタンパク質は、乾燥処理によって立体構造に影響を受け、変性するおそれがある。さらに、特許文献２には、多孔質材に保持することが可能なプロテアーゼ阻害剤が多く記載されているものの、膵液や十二指腸液中のＳ１００Ｐの分解を抑制するために最適化されたプロテアーゼ阻害剤の組合せは開示されていない。このため、仮に乾燥処理を省略した態様で特許文献２に記載の方法を適用して膵液等を保存したとしても、充分なＳ１００Ｐの室温保存効果が得られるわけではない。
　本発明は、膵液や十二指腸液等の膵液成分を含む生体試料中のタンパク質のうち、特にＳ１００Ｐを、室温で安定して保存することが可能な膵液成分含有試料を調製する方法、及び当該方法に好適な膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、特定の種類のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤とを組み合わせて添加することにより、試料を室温で保存した場合であっても、当該生体試料中に含まれているＳ１００Ｐを安定して保存可能であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の膵液成分含有試料の調製方法及び膵液成分含有試料の室温保存用キットは、下記（１）～（１０）の構成をとる。
（１）　膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類、及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類を添加して膵液成分含有試料を調製する工程、を有する膵液成分含有試料の調製方法。
（２）前記膵液成分含有試料を調製する工程後、当該膵液成分含有試料を室温で保存する工程を更に有する、前記（１）に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
（３）　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ－ＡＰＭＳＦ、４－(フルオロスルホニル)安息香酸、３－(フルオロスルホニル)安息香酸、２－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４－ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される、前記（１）の膵液成分含有試料の調製方法。
（４）　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種以上の化合物を用いる、前記（１）又は（２）の膵液成分含有試料の調製方法。
（５）　前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫである、前記（１）～（３）のいずれかの膵液成分含有試料の調製方法。
（６）　前記膵液成分含有試料の調製工程において、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ－ＡＰＭＳＦをそれぞれ最終濃度１ｍＭ以上、４ｍＭ以上、２ｍＭ以上添加し、トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤として、ＴＬＣＫを最終濃度０．１ｍＭ以上添加する、前記（１）の膵液成分含有試料の調製方法。
（７）　前記生体試料が、膵液又は十二指腸液である、前記（１）～（５）のいずれか一の膵液成分含有試料の調製方法。
（８）　フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類；アミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類；を含む、膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キット。
（９）　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上の化合物である、前記（８）の室温保存用キット。
（１０）　前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫである、前記（８）又は（９）の室温保存用キット。
（１１）　採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を更に含み、前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤及び前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が予め充填されている、前記（８）～（１０）のいずれか一の室温保存用キット。
　本発明の膵液成分含有試料の調製方法により、膵液成分を含有する生体試料を、当該生体試料中に含まれるＳ１００Ｐの分解・変性を充分に抑制しつつ、室温で安定的に保存することが可能な保存用試料を調製することができる。すなわち、非常に分解されやすい膵液中のタンパク質をより安定的に保存することにより、質の高い試料を提供することが可能となり、ひいては膵癌の研究の加速に寄与することが期待できる。特に、室温で保存可能な試料を調製できるため、本発明の膵液成分含有試料の調製方法は、臨床検査へ広く応用されることも期待される。
　また、本発明の膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キットを用いることにより、生体から採取された膵液や十二指腸液から、室温保存可能なＳ１００Ｐ検査用の生体試料を、より簡便に調製することができる。
ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦの化学式を示した図である。 参考例１において、各パンクレアチン溶液のプロテアーゼ活性（相対値：％）の結果を示した図である。 参考例２において、各試料溶液中のＳ１００Ｐ量の測定結果を示した図である。 実施例１において、各試料溶液中のＳ１００Ｐ量の測定結果を示した図である。 参考例３において、各試料溶液中のＳ１００Ｐ量の測定結果を示した図である。
　膵液とは、膵管から排出される体液である。本発明及び本願明細書において、膵液成分を含有する生体試料とは、膵液由来の成分が含まれている体液を含む試料を意味する。膵液由来成分が含まれている体液としては、膵臓から直接カテーテルから採取された膵液、十二指腸で採取した液（十二指腸液）等が挙げられる。十二指腸液には、膵液に加えて、同じく乳頭部より排出された胆汁や元々十二指腸に存在している液、血液等も含まれている。なお、膵液や十二指腸液は、常法により採取することができる。
＜膵液成分含有試料の調製方法＞
　本発明の膵液成分含有試料の調製方法（以下、「本発明の調製方法」ということがある）は、膵液成分を含有する生体試料を、室温であっても、当該生体試料に含まれている成分のうち、特にＳ１００Ｐの分解・変性を抑制して安定的に保存し得るように調製する方法である。すなわち、本発明の調製方法は、膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類、及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類を添加して膵液成分含有試料を調製する工程を有するものであり、必要に応じて、Ｓ１００Ｐの検出に供されるまで当該試料を室温で保存する工程を更に有することを特徴とする。
　膵液や十二指腸液等の膵液成分を含有する生体試料中には、検査対象であるタンパク質（本発明の調製方法においては、Ｓ１００Ｐ）の他に、多量のプロテアーゼが含まれているため、当該生体試料を室温で保存した場合には、プロテアーゼの影響により、目的のタンパク質が分解・変性してしまう。このため、室温保存後の生体試料について検査を行った場合には、生体から採取直後には当該タンパク質が含まれていた生体試料であっても、検査では当該タンパク質が検出されず、検査精度が低下するという問題がある。これに対して、本発明の調製方法により膵液成分を含有する生体試料を調製することによって、室温の溶液状態であっても、当該生体試料由来のプロテアーゼの活性を効果的に抑制でき、Ｓ１００Ｐの安定性を飛躍的に向上させることができる。すなわち、本発明の調製方法により得られた膵液成分含有試料は、室温保存後であっても従来になく高品質であり、高い精度が要求されるＳ１００Ｐ検査（Ｓ１００Ｐを検出するための検査）に好適である。
　具体的には、本発明の調製方法においては、膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類、及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤（以下、「特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤」ということがある。）を少なくとも１種類を添加して膵液成分含有試料を調製する。フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤、及びトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を併用することにより、室温の溶液中にもかかわらず、Ｓ１００Ｐの分解・変性を効果的に抑制することができる。
　後記参考例１に示すように、ＴＬＣＫ（Ｎ－ａ－トシル-L-リジンクロロメチルケトン）等の、トリプシン様セリンプロテアーゼに対する阻害活性を有するアミノ酸クロロメチルケトン類による、膵液や十二指腸液中のプロテアーゼの活性抑制の効果は、フォイパンやＦＯＹと同程度でしかなく、ロイペプチン等の他の汎用されているプロテアーゼ阻害剤よりもはるかに低い。にもかかわらず、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、ＴＬＣＫ等のアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤とを併用することによって、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とロイペプチン等の他のプロテアーゼ阻害剤とを併用した場合には観察されないような、非常に優れたＳ１００Ｐの室温安定性向上効果が得られた。室温におけるＳ１００Ｐの安定性向上に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤とアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤との併用が特に効果的であるというこの驚くべき知見は、本発明者らによって初めて見出された。
　本発明の調製方法において用いられるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、フッ化スルホニル基を有し、かつプロテアーゼ阻害活性を有する化合物であれば、特に限定されるものではないが、ベンゼン環に直接又は炭素数１～６の炭化水素基を介してフッ化スルホニル基が結合する構造を有する化合物であることが好ましく、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ＡＥＢＳＦ（４－（２－アミノエチル）－ベンゼンスルフォニルフルオライド））、ｐ－ＡＰＭＳＦ（ｐ－アミジノフェニルメタンスルフォニルフオライド塩酸塩）、４－(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５５－２６－５）、３－(フルオロスルホニル)安息香酸（ＣＡＳ番号：４５４－９５－５）、２－アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３９２－８６－９）、３－アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３６８－５０－３）、４－アミノベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：９８－６２－４）、２－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：４３３－９８－７）、３－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９－７８－０）、又は４－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド（ＣＡＳ番号：３４９－９６－２）であることが好ましく、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ－ＡＰＭＳＦであることがより好ましい。図１に、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦの化学式を示す。図１中、点線で囲われた官能基が、フッ化スルホニル基である。
　本発明の調製方法において用いられるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、１種類であってもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。特に、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１の化合物を少なくとも用いることが好ましく、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２以上の化合物を組み合わせて用いることがより好ましく、３種類全てを用いてもよい。膵液には活性の異なる様々なプロテアーゼが含まれているため、複数のプロテアーゼ阻害剤を混合して用いることにより、より確実に生体試料中のプロテアーゼ活性を抑えることが期待できる。さらに単独で使用する場合よりも、低い濃度で組み合わせることによってプロテアーゼ活性を抑えることが期待できる。
　膵液成分を含有する生体試料に添加されるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤の量は、当該プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼ阻害効果及びＳ１００Ｐの室温安定性向上効果が発揮される量であれば特に限定されるものではなく、膵液成分を含有する生体試料の種類、用いるプロテアーゼ阻害剤の種類等を考慮して、適宜調整することができる。例えば、膵液成分を含有する生体試料にフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤としてＰＭＳＦのみを添加する場合、最終濃度が１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上となるように添加することができる。また、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤としてＡＥＢＳＦのみを用いる場合、最終濃度が４ｍＭ以上、好ましくは１０ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上となるように、膵液成分を含有する生体試料にＡＥＢＳＦを添加することができる。フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤としてｐ－ＡＰＭＳＦのみを用いる場合、最終濃度が２ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上となるように、膵液成分を含有する生体試料にＡＥＢＳＦを添加することができる。
　本発明の調製方法において用いられるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤は、アミノ酸クロロメチルケトン類であり、かつトリプシンに代表されるトリプシン様セリンプロテアーゼに対する阻害活性を有する化合物であれば、特に限定されるものではない。本発明においては、特に、ＴＬＣＫを用いることが好ましい。
　膵液成分を含有する生体試料に添加される特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤の量は、当該プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼ阻害効果及びＳ１００Ｐの室温安定性向上効果が発揮される量であれば特に限定されるものではなく、膵液成分を含有する生体試料の種類、用いるプロテアーゼ阻害剤の種類等を考慮して、適宜調整することができる。例えば、膵液成分を含有する生体試料に特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤としてＴＬＣＫのみを添加する場合、最終濃度が０．１ｍＭ以上、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上となるように添加することができる。
　本発明の調製方法においては、膵液成分を含有する生体試料に添加されるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤は、粉末状、顆粒状等の固形状であってもよく、適当なバッファー等に溶解させたプロテアーゼ阻害剤溶液であってもよい。また、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤は、膵液成分を含有する生体試料に同時に添加してもよく、どちらか一方を先に添加した後、他方を添加してもよい。本発明のＳ１００Ｐの室温安定性向上効果を充分に発揮させる点からは、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤は同時に添加されることが好ましい。
　本発明の調製方法においては、膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と前記特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤のみを添加してもよく、その他のプロテアーゼ阻害剤をさらに添加してもよい。その他のプロテアーゼ阻害剤としては、本発明のＳ１００Ｐの室温安定性向上効果を損なわないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、エラスタチナール、抗トロンビン等のペプチド系プロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、トリプシンインヒビター、Ｅｃｏｔｉｎ（Ｅ．ｃｏｌｉ）等が挙げられる。また、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ）、メシル酸カモスタット（フォイパン）、メシル酸ナファモスタット（Ｆｕｔｈａｎ）、ウリナスタチン等の膵炎治療薬を用いることもできる。
　本発明の調製方法に供される膵液成分を含有する生体試料は、膵液由来の成分が含まれている体液を含む試料であればよく、膵液由来成分が含まれている体液のみからなるものであってもよく、当該体液を適当なバッファー等で希釈した液であってもよく、当該体液又はその希釈液に、各種添加剤を添加したものであってもよい。添加剤としては、界面活性剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。本発明の調製方法に供される膵液成分を含有する生体試料としては、膵液又は十二指腸液を含む試料であることが好ましい。具体的には、膵液、十二指腸液、膵液又は十二指腸液の希釈液、若しくはこれらに前述の各種添加剤を添加した液等が挙げられる。
　本発明の調製方法においては、生体から採取された後に保存等された膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を添加してもよいが、生体から膵液成分を含有する体液を採取した時点からこれらのプロテアーゼ阻害剤を添加する時点までの間隔は、短いほうが好ましく、生体から採取直後の膵液又は十二指腸液にこれらのプロテアーゼ阻害剤を添加することが特に好ましい。膵液を含む生体試料は、含有されるプロテアーゼの働きが非常に強く、採取直後からタンパク質の分解が進むことがあるため、採取した生体試料と前記プロテアーゼ阻害剤が混合するまでのタイムラグをより短くすることが好ましいためである。例えば、膵液又は十二指腸液を生体から採取するための採取具に設けられた貯留部（採取された体液を貯留するための容器様部材）内に、予めフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を充填させておくことにより、生体から採取された膵液又は十二指腸液が回収容器内で直ちにプロテアーゼ阻害剤と混合される。また、採取具が貯留部を有さず、採取具に貯留部となる保存用容器を接続する場合には、当該保存用容器内に予めフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を充填させておく。
　本発明の調製方法においては、膵液由来の成分のうち、特にＳ１００Ｐの分解・変性を抑制するために最適なプロテアーゼ阻害剤の組み合わせを用いているため、当該方法により調製された膵液成分含有試料に含まれるＳ１００Ｐは、室温であったとしても、従来になくより安定して保存される。よって、本発明の調製方法により調製された膵液成分含有試料に対してＳ１００Ｐ検査を行うことにより、当該膵液成分含有試料がＳ１００Ｐ検査に供されるまで室温で保存した場合でも、充分な検査精度を得ることができる。なお、本発明の調製方法により調製された膵液成分含有試料は、室温保存されることによりその効果を充分に発揮することができるが、凍結保存や冷蔵保存等がなされてもよい。
　本発明の調製方法により調製された膵液成分含有試料に対して行われるＳ１００Ｐ検査は、Ｓ１００Ｐの検出又は定量を目的としてなされる検査であれば特に限定されるものではない。例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析、細胞数カウントや細胞診のような細胞解析等によって、Ｓ１００Ｐを検出することができる。
　なお、本発明の調製方法は、Ｓ１００Ｐ以外の膵液由来成分についても、室温安定性を向上させていることが期待される。このため、本発明の調製方法により調製された膵液成分含有試料は、膵液含有成分試料中の、Ｓ１００Ｐ以外の成分についての、各種検査のための測定試料としても用いることができる。検査対象となる物質は、膵液又は十二指腸液に含まれていることが期待される生体成分であれば特に限定されるものではなく、タンパク質であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であってもよく、細胞であってもよい。例えば、当該膵液成分含有試料は、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析、細胞数カウントや細胞診のような細胞解析等に用いることができる。
＜膵液成分を含有する生体試料の保存用キット＞
　本発明の膵液成分を含有する生体試料の保存用キット（以下、「本発明の保存用キット」ということがある）は、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類、及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類を有することを特徴とする。当該保存用キットに備えられているフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と特定のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤とを、膵液成分を含有する生体試料に添加することにより、Ｓ１００Ｐの検出に供されるまでの間、室温で保存可能な膵液成分含有試料をより簡便に調製することができる。
　本発明の保存用キットに含まれるフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせていてもよい。本発明においては、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上の化合物を用いることが好ましく、これらの化合物群より選択される２種以上の化合物を用いることがより好ましい。同様に、本発明の保存用キットに含まれるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせていてもよい。本発明においてはトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤として、ＴＬＣＫを用いることが好ましい。
　また、本発明の保存用キットに含まれる各種プロテアーゼ阻害剤は、凍結乾燥粉末であってもよく、凍結乾燥粉末を適当な賦形剤等とともに成型された錠剤又は顆粒剤等であってもよく、適当なバッファーに溶解させたプロテアーゼ阻害剤溶液であってもよい。
　本発明の保存用キットは、さらに、採取された体液を希釈するためのバッファー、その他のプロテアーゼ阻害剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等を含んでいてもよい。界面活性剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等の各種添加剤は、予め希釈用のバッファーに溶解させていてもよい。その他、本発明の保存用キットは、調製された膵液成分含有試料（膵液成分を含有する生体試料に、本発明の保存用キットが含む各種プロテアーゼ阻害剤を添加し、必要に応じてその他の成分を添加したもの）を、当該膵液成分含有試料が充填されている容器から一定量を滴下することを可能とする、当該容器の開口部に結合可能なキャップを含んでいてもよい。
　本発明の保存用キットは、生体から採取された膵液又は十二指腸液等の体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を含んでいてもよい。この場合、本発明のプロテアーゼ阻害剤は、当該貯留部に予め含まれていることが好ましい。当該保存用容器に目盛りが刻まれていた場合には、当該保存用容器に添加された生体試料の量（当該保存容器内に予めプロテアーゼ阻害剤が充填されていた場合には、生体試料とプロテアーゼ阻害剤の合計量）が視覚的に確認することができ、ひいてはプロテアーゼ阻害剤の終濃度を一目で理解することができる。
　また、膵液成分を含む生体試料は、経内視鏡的に採取することが一般的である。そこで、本発明の保存用キットの構成品として、膵液成分を含む生体試料を経内視鏡的に採取する採取具を含めてもよい。当該採取具としては、例えば、内視鏡装置に挿入可能なカテーテルにシリンジを組合せたものや、内視鏡装置に挿入可能な吸収体を先端に備えたプローブ等がある。内視鏡装置に挿入可能なカテーテルとしては、例えば、特開２０１１－５００９号公報に記載されている標本採取キューブ等が挙げられる。これらの採取具としては、前記プロテアーゼ阻害剤を予め分注した貯留部を有していることが好ましい。また、当該貯留部が取り外し可能な場合には、保存容器としても使用することができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　膵液中の消化酵素の中で、その分解カスケードのトリガーとなっている酵素はセリンプロテアーゼであることが知られている。そこでまず、膵液中に含まれているプロテアーゼに対して阻害効果の高いセリンプロテアーゼ阻害剤のスクリーニングを行った。
　具体的には、市販されているプロテアーゼ阻害剤の中から、セリンプロテアーゼをターゲットとし、膵液に対して阻害効果の高い阻害剤を探索した。用いたプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニン（Ｒｏｃｈｅ社製）、ロイペプチン（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ｐ－ＡＰＭＳＦ（ＳＩＧＭＡ社製）、メシル酸カモスタット（フォイパン；和光純薬社製）、メシル酸ガベキサート（ＦＯＹ；和光純薬社製）、ＴＬＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）、ＴＰＣＫ（ＳＩＧＭＡ社製）である。なお、ＴＰＣＫは、キモトリプシンに対する阻害活性を有するが、トリプシンに対する阻害活性を示さないアミノ酸クロロメチルケトン類である。
　膵酵素が活性化した状態で存在するブタの膵臓から製した消化酵素剤である“パンクレアチン”を擬似人工膵液として用い、各プロテアーゼ阻害剤を、最終濃度が製造元による推奨濃度範囲になるよう添加した後、プロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はＥｎｚＣｈｅｃｋ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて測定した。具体的には、各プロテアーゼ阻害剤が添加されたパンクレアチン溶液に、キット添付の蛍光標識されたカゼインを添加し、３７℃で２時間インキュベーションした後、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５ｎｍの蛍光波長で蛍光量を測定した。また、対照として、パンクレアチンに直接蛍光標識されたカゼインを添加した試料溶液（阻害剤なし）についても、同様にプロテアーゼ活性を測定した。
　各パンクレアチン溶液の蛍光量の測定結果を図２に示す。縦軸の蛍光量はカゼインを分解した量を表し、その値をプロテアーゼ活性の値として概算した。横軸は、各パンクレアチン溶液に添加したプロテアーゼ阻害剤及びその最終濃度を示す。この結果、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳ、及びｐ－ＡＰＭＳＦが、その他のプロテアーゼ阻害剤比べて非常に阻害効果が高いことが明らかとなった。これらはいずれもフッ化スルホニル基を有するスルホン系化合物であった。
［参考例２］
　参考例１によって膵液中の消化酵素に対する阻害効果が高いことが明らかとなったスルホン系化合物に着目し、膵癌のマーカータンパク質として知られるＳ１００Ｐ（カルシウム結合タンパク質）の膵液中における室温安定性に対する、各種スルホン系化合物の効果を調べた。すなわち、４種類のヒト臨床検体の膵液を用い、Ｓ１００Ｐの標品タンパク質を添加した後、室温保存前後でＳ１００Ｐ濃度が変化するかどうかを調べた。
　具体的には、まず、２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）溶液を各ヒト臨床検体に混合した試料溶液（試料溶液１：阻害剤なし）と、試料溶液１にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液２：ＡＥＢＳＦ）、試料溶液１にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液３：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ）を調製した。各試料溶液は、ＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ－８０６０）に付属のバッファーを用いて調製した。これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートすることにより反応させた（室温保存）。その後、各試料溶液をＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ－８０６０）に付属のバッファーを用いて１０倍希釈した希釈液に対して、ＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔを用い、Ｓ１００Ｐの検出を行った。対照として、調製直後（すなわち、室温保存前）の試料溶液１についても、同様にして、Ｓ１００Ｐの検出を行った。
　測定結果を図３に示す。縦軸はＳ１００Ｐ濃度を示し、横軸は試料溶液１の室温保存前（図中、「室温保存前」）、並びに試料溶液１～３の室温保存後（図中、「阻害剤なし」、「ＡＥＢＳＦ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ」）を示す。室温保存により、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液１では、いずれの膵液検体もＳ１００Ｐがほとんど分解されていた。これに対し、プロテアーゼ阻害剤を添加した試料溶液２及び３では、いずれの膵液検体でもＳ１００Ｐが検出され、特にＡＥＢＳＦとＰＭＳＦの両方を添加した試料溶液３では、Ｓ１００Ｐ濃度が高く維持されていた。これらの結果から、フッ化スルホニル基を有するスルホン系化合物を少なくとも１種以上、好ましくは２種以上混合することにより、膵液中のＳ１００Ｐが室温でもより安定することが明らかとなった。
［実施例１］
　人工的に添加された標品ではなく、ヒト膵液検体に元々含まれているＳ１００Ｐを検出するためには、フッ化スルホニル基を有するスルホン系化合物のみでは不充分である。そのため、Ｓ１００Ｐのさらなる保存性能の向上を目指し、フッ化スルホニル基を有するスルホン系化合物とその他スルホン系化合物であるＴＬＣＫの併用の有無により、Ｓ１００Ｐの保存安定性が影響を受けるかを調べた。７種類のヒト臨床検体を用いた。
　具体的には、各ヒト臨床検体にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液１：ＡＥＢＳＦ）、各ヒト臨床検体にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液２：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ）、各ヒト臨床検体にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）とアプロチニン（最終濃度：３μＭ）を添加した試料溶液（試料溶液３：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、各ヒト臨床検体にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）とＴＰＣＫ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液４：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＰＣＫ）、各ヒト臨床検体にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）とＴＬＣＫ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液５：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＬＣＫ）を調製した。各試料溶液は、ＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ－８０６０）に付属のバッファーを用いて調製した。これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートすることにより反応させた後（室温保存後）、参考例２と同様にしてＳ１００Ｐの検出を行った。
　また、対照として、室温保存に代えて凍結保存を行った以外は、上記と同様にして同じヒト臨床検体から試料溶液１～５を調製し、これらの試料溶液について参考例２と同様にしてＳ１００Ｐの検出を行った。
　測定結果を図４に示す。縦軸はＳ１００Ｐ濃度を示し、横軸は、ヒト膵液検体１～７についての試料溶液１～５（図中、「ＡＥＢＳＦ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＰＣＫ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＬＣＫ」）を示す。また、図中、「ＦＴ」は、凍結保存後かつ室温保存無しの場合の結果を、「２５℃、１６ｈ」は、２５℃、１６時間インキュベート後（室温保存後）の場合の結果を、それぞれ示す。この結果、凍結保存した試料溶液は、添加したプロテアーゼ阻害剤の種類にかかわらず、全てのヒト膵液検体において、量の多寡はあるもののＳ１００Ｐが検出された。これに対して、ＡＥＢＳＦのみを添加した試料溶液１や、ＡＥＢＳＦとＰＭＳＦを添加した試料溶液２では、全てのヒト膵液検体においてＳ１００Ｐが検出されたものの、凍結保存した場合と比べるとその量は非常に少なく、室温保存中に大部分のＳ１００Ｐが分解・変性されたことがわかった。これに対して、ＡＥＢＳＦとＰＭＳＦとＴＬＣＫを添加した試料溶液５では、全てのヒト膵液検体において、凍結保存した場合の約７０％以上のＳ１００Ｐ濃度の残存率を示した。一方、ＡＥＢＳＦとＰＭＳＦにアプロチニンを添加した試料溶液３やＡＥＢＳＦとＰＭＳＦにＴＰＣＫを添加した試料溶液４では、ＡＥＢＳＦとＰＭＳＦとＴＬＣＫを添加した試料溶液５のような高い残存率は見られなかった。これらの結果から、少なくとも１種類以上のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、ＴＬＣＫ等のトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害活性を有するアミノ酸クロロメチルケトン類を併用することにより、膵液中のＳ１００Ｐを室温でも非常に安定して保存可能であることがわかった。
［参考例３］
　擬似人工膵液中におけるＳ１００Ｐの保存安定性とヒト臨床検体中におけるＳ１００Ｐの保存安定性とに対するプロテアーゼ阻害剤の効果を比較した。Ｓ１００Ｐ含有擬似人工膵液としては、パンクレアチン溶液にＳ１００Ｐ（標品）を２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した溶液を用いた。
　具体的には、まず、２５ｎｇ／ｍＬのＳ１００Ｐ（標品）溶液を、実施例１で用いたヒト臨床検体２種（ヒト膵液検体１及び２）と擬似人工膵液のそれぞれに混合した試料溶液（試料溶液１：阻害剤なし）と、試料溶液１にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液２：ＡＥＢＳＦ）、試料溶液１にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液３：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ）、試料溶液１にＡＥＢＳＦ（最終濃度：４ｍＭ）とＰＭＳＦ（最終濃度：１ｍＭ）とＴＬＣＫ（最終濃度：１ｍＭ）を添加した試料溶液（試料溶液４：ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＬＣＫ）を調製した。各試料溶液は、ＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　
Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ－８０６０）に付属のバッファーを用いて調製した。これらの試料溶液を２５℃、１６時間インキュベートすることにより反応させた後（室温保存後）、参考例２と同様にしてＳ１００Ｐの検出を行った。
　また、対照として、前記と同様にして調製した試料溶液１について、室温保存に代えて凍結保存を行った後、直ちに参考例２と同様にしてＳ１００Ｐの検出を行った。
　測定結果を図５に示す。縦軸はＳ１００Ｐ濃度を示し、横軸は、ヒト膵液検体１、２、及びＳ１００Ｐ含有擬似人工膵液についての試料溶液１～４（図中、「阻害剤なし」、「ＡＥＢＳＦ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ」、「ＡＥＢＳＦ＋ＰＭＳＦ＋ＴＬＣＫ」）を示す。また、図中、「ＦＴ」は、凍結保存後かつ室温保存無しの場合の結果を、「２５℃、１６ｈ」は、２５℃、１６時間インキュベート後（室温保存後）の場合の結果を、それぞれ示す。この結果、凍結保存した試料溶液では、ヒト膵液検体とパンクレアチン溶液のいずれについても、添加したＳ１００Ｐが検出された。一方で、室温保存後の試料溶液については、プロテアーゼ阻害剤の添加の有無や種類にかかわらず、パンクレアチン溶液ではＳ１００Ｐは全く検出されなかった。また、ヒト膵液検体１及び２については、ＡＥＢＳＦ又はＡＥＢＳＦとＰＭＳＦを添加した試料溶液２及び３では、プロテアーゼ阻害剤を添加しなかった試料溶液１よりもＳ１００Ｐの検出量は多く、添加したプロテアーゼ阻害剤により、Ｓ１００Ｐの室温保存安定性に改善がみられた。これに対して、ヒト膵液検体１及び２の両方において、実施例１の結果とは異なり、ＡＥＢＳＦとＰＭＳＦとＴＬＣＫを添加した試料溶液３では、ＴＬＣＫを添加していない試料溶液２又は３に比べてＳ１００Ｐの検出量は明らかに少なかった。これらの結果から、理由は不明であるが、ＡＥＢＳＦ等のフッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤と、ＴＬＣＫ等のアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤とを併用することによるＳ１００Ｐの室温保存安定性効果は、生体から採取された膵液や十二指腸液等の生体試料中に元々含まれていたＳ１００Ｐ（エンドジニアスなＳ１００Ｐ）に対しては発揮されるものの、後から添加したＳ１００Ｐ（エキソジニアスなＳ１００Ｐ）に対しては、当該効果が得られないことがわかった。
　本発明の調製方法及び本発明の室温保存用キットは、膵液や十二指腸液等の生体試料中のタンパク質のうち、特にＳ１００Ｐを室温で安定して保存することが可能であるため、膵液中のＳ１００Ｐを解析する分野、特に膵癌の診断・治療のための臨床検査等の分野において利用が可能である。

Claims (11)

  1. 　膵液成分を含有する生体試料に、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類、及びアミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類を添加して膵液成分含有試料を調製する工程；
    を有する、膵液成分含有試料の調製方法。
  2. 　前記膵液成分含有試料を調製する工程後、当該膵液成分含有試料を室温で保存する工程を更に有する、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  3. 　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、ｐ－ＡＰＭＳＦ、４－(フルオロスルホニル)安息香酸、３－(フルオロスルホニル)安息香酸、２－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、３－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、４－アミノベンゼンスルホニルフルオリド、２－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、３－ニトロベンゼンスルホニルフルオリド、及び４－ニトロベンゼンスルホニルフルオリドからなる群より選択される、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  4. 　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される２種以上の化合物を用いる、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  5. 　前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫである、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  6. 　前記膵液成分含有試料の調製工程において、フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤として、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、又はｐ－ＡＰＭＳＦをそれぞれ、最終濃度１ｍＭ以上、４ｍＭ以上、２ｍＭ以上添加し、トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤として、ＴＬＣＫを最終濃度０．１ｍＭ以上添加する、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  7. 　前記生体試料が、膵液又は十二指腸液である、請求項１に記載の膵液成分含有試料の調製方法。
  8. 　フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類；
    　アミノ酸クロロメチルケトン類であるトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤を少なくとも１種類；
    を含む、膵液成分を含有する生体試料の室温保存用キット。
  9. 　前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤が、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、及びｐ－ＡＰＭＳＦからなる群より選択される１種以上の化合物である、請求項８に記載の室温保存用キット。
  10. 　前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、ＴＬＣＫである、請求項９に記載の室温保存用キット。
  11. 　採取された体液を貯留するための貯留部を備える保存用容器を更に含み、
    　前記貯留部に、前記フッ化スルホニル基を有するプロテアーゼ阻害剤及び前記トリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が予め充填されている、請求項８に記載の室温保存用キット。
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