WO2017073226A1 - 膵疾患の罹患可能性評価方法 - Google Patents

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博美 佐貫
武山　哲英
章二 徳永
雅夫 田中
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Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the possibility of a subject suffering from pancreatic disease based on the concentration of a pancreatic disease marker in a duodenal juice sample.
  • Patent Document 1 discloses a method for detecting cancer in a subject using the amount of CSRP1 protein in the blood of the subject or the presence or absence of CSRP1 protein as an index.
  • Patent Document 2 also compares the concentration of YKL-40 in body fluids such as blood with a cut-off value adjusted by age, determines the presence or absence of gastrointestinal cancer, the severity, and the choice of treatment method. The method of doing is described.
  • the duodenal juice is a mixed fluid of pancreatic juice discharged from the pancreas, bile discharged from the bile duct, and mucus secreted from the duodenum.
  • the duodenal juice can be collected simply by inserting an endoscope up to the duodenum and sucking in situ, and can be performed with a less invasive and simpler technique than collecting pancreatic juice from the pancreatic duct. For this reason, a pancreatic disease can be test
  • an object of the present invention is to provide a method for more accurately evaluating the morbidity of a pancreatic disease based on the concentration of a pancreatic disease marker in a duodenal juice sample.
  • the present inventors have found that the concentration of pancreatic disease markers in the duodenal juice sample tends to decrease as the age of the subject increases, and completed the present invention. .
  • the method for assessing the possibility of pancreatic disease according to the present invention is the following [1] to [9].
  • [1] (a) measuring a concentration of a pancreatic disease marker in a duodenal fluid sample collected from a subject; (B) evaluating the pancreatic disease morbidity of the subject based on the concentration of the pancreatic disease marker measured in the step (a) and the age of the subject; A method for evaluating the morbidity of a pancreatic disease.
  • a score value is calculated based on the concentration of the pancreatic disease marker and the age of the subject, and the obtained score value is compared with a cutoff value that is uniformly set regardless of the age of the subject.
  • pancreatic disease marker is a marker in which a concentration in a duodenal juice sample collected from a patient suffering from pancreatic disease is higher than a concentration in a duodenal juice sample collected from a subject not suffering from pancreatic disease.
  • the method for evaluating the morbidity of pancreatic disease is a marker in which a concentration in a duodenal juice sample collected from a patient suffering from pancreatic disease is higher than a concentration in a duodenal juice sample collected from a subject not suffering from pancreatic disease.
  • the pancreatic disease marker is a marker in which a concentration in a duodenal juice sample collected from a patient suffering from pancreatic disease is higher than a concentration in a duodenal juice sample collected from a subject not suffering from pancreatic disease
  • a score value is calculated based on the concentration of the pancreatic disease marker and the age of the subject, When the score value is equal to or higher than the cut-off value that is uniformly set regardless of the age of the subject, the subject evaluates that the possibility of developing pancreatic disease is high, and when the score value is less than the cut-off value
  • the method for evaluating the morbidity of pancreatic disease according to [1], wherein the subject is evaluated as having a low possibility of developing pancreatic disease.
  • the pancreatic disease marker is a marker in which a concentration in a duodenal fluid sample collected from a patient suffering from pancreatic disease is higher than a concentration in a duodenal fluid sample collected from a non-affected pancreatic disease,
  • the concentration of the pancreatic disease marker is equal to or higher than a cut-off value set in advance for each age group, it is evaluated that the subject is highly likely to develop pancreatic disease.
  • the method for assessing the morbidity of pancreatic disease according to [1], wherein when the subject is less than a cutoff value set for each age group, the subject is evaluated as having a low possibility of developing pancreatic disease.
  • the method for assessing the susceptibility to pancreatic disease according to the present invention can be used to determine the possibility of afflicting pancreatic disease based on the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample.
  • the evaluation can be performed with high accuracy, particularly with high specificity when an elderly person 65 years or older is the subject.
  • FIG. 1 is an ROC curve created from the common logarithmic value of the S100P concentration of each patient in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of plotting the measured values of S100P concentration for each patient age in Example 1 for the 1a + 1b group (left diagram) and the 0 / I + IIA group (right diagram).
  • FIG. 3 is an ROC curve created from a score value obtained by combining the common logarithm of the S100P concentration and the age of each patient in Example 1.
  • pancreatic disease markers are various biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids, cells and the like contained in pancreatic juice, and are more effective in pancreatic diseases than non-affected individuals of pancreatic diseases.
  • the non-affected person of a pancreatic disease should just be normal, and a pancreas is not restricted to a healthy person but includes the affected person of diseases other than a pancreatic disease.
  • pancreatic diseases include pancreatic cancer, IPMN (intraductal papillary mucinous tumor), MCN (mucinous cystic tumor), SCN (serous cystic tumor), NET (pancreatic endocrine tumor), chronic pancreatitis (CP), Examples include acute pancreatitis.
  • the cut-off value means a value that is divided into a group of affected and unaffected groups of the target pancreatic disease with respect to the concentration of the pancreatic disease marker or a value derived from the concentration.
  • the cut-off value for separating the affected group and the unaffected group of pancreatic diseases can be set experimentally in consideration of the type of pancreatic disease marker, the method for measuring the concentration of pancreatic disease marker, and the like.
  • a method for setting the cut-off value for example, firstly, duodenal fluid collected from a sufficient number of subjects who are known not to suffer from pancreatic disease, and to be found to be affected by the disease.
  • the concentration of a marker for pancreatic disease is measured for duodenal juice collected from a sufficient number of subjects.
  • an ROC curve Receiveiver Operator Characteristic Curve
  • the cutoff value can be set so as to achieve the desired sensitivity and specificity.
  • the cutoff value is preferably set so that the specificity is 80% or more, more preferably set so that the specificity is 85% or more. More preferably, the specificity is set to 90% or more.
  • the pancreatic disease morbidity evaluation method according to the present invention is an indicator of the pancreatic disease marker concentration in the duodenal juice sample as an index. It is a method to evaluate. Specifically, the method includes the following steps (a) and (b).
  • the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample tends to decrease as the subject's age increases in non-pancreatic disease patients. The reason for this is not clear, but it is presumed that the amount of pancreatic juice contained in the duodenal juice itself is reduced as a result of a decrease in the amount of pancreatic juice discharged from the pancreatic duct due to a decrease in pancreatic function.
  • the cut-off value is uniformly set for all age groups due to the relationship between the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample and the age, the accuracy varies for each age group of the subject, and the evaluation accuracy becomes low. That is, when the cut-off value is uniformly set for all age groups, the sensitivity is low in the relatively young age group, but the specificity is low and false positives are increased. On the contrary, in a relatively older age group, the sensitivity is low but the sensitivity is low, and false negatives tend to increase.
  • the evaluation method according to the present invention Based on both the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample and the age of the subject, the subject's likelihood of suffering from pancreatic disease is assessed.
  • the accuracy of evaluation can be improved by correcting the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample with the age of the subject in consideration of the natural decrease due to aging of the pancreatic disease marker concentration.
  • the score value for the sample is calculated based on the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal fluid sample and the age of the subject from whom the sample was collected, and the obtained score value is uniformly set regardless of the age of the subject.
  • the likelihood of the subject suffering from pancreatic disease is assessed by comparison with the cut-off value.
  • Cut-off values for all ages are ROCs generated for a statistically sufficient number of patients with pancreatic disease and a statistically sufficient number of unaffected persons. Based on the curve, the sensitivity and specificity can be set in a desired range.
  • the score value P in which the age is added to the concentration of the pancreatic disease marker is set, for example, so as to compensate for the decrease in the pancreatic disease marker concentration due to aging to the common logarithm of the pancreatic disease marker concentration.
  • the score value P can be set so as to satisfy the relationship of the following formula (1).
  • log [P / (1-P)] a ⁇ log 10 [pancreatic disease marker concentration] + b ⁇ [subject's age] + c
  • a, b, and c are multiple logistics using as an explanatory variable the concentration and age of the pancreatic disease marker in a duodenal juice sample collected from a group with and without pancreatic disease. It is a real number determined by regression analysis. Multiple logistic regression analysis can be performed by conventional methods. Samples for multiple logistic regression analysis performed when setting Equation (1) were collected from a statistically sufficient number of patients with pancreatic disease and a statistically sufficient number of non-affected persons, respectively. It is preferable to use the pancreatic disease marker concentration in the duodenal juice sample.
  • a is 1.5 to 2.2, preferably 1.7 to 1.9
  • b is 0.1 to 0.2, preferably 0.12 to 0.17
  • c is ⁇ 20 to ⁇ 15, the specificity can be adjusted to 80% or more, preferably 90% or more in all age groups.
  • pancreatic disease marker is a marker in which the concentration in a duodenal fluid sample collected from a patient suffering from pancreatic disease is higher than the concentration in a duodenal fluid sample collected from a non-affected pancreatic disease patient
  • the score value P is calculated from the concentration of pancreatic disease marker in the duodenal juice sample and the age based on the formula (1), and the obtained score value P is equal to or more than the cut-off value set uniformly regardless of the age of the subject. In this case, it is evaluated that the subject has a high possibility of developing pancreatic disease, and when the subject is less than the cutoff value, the subject is evaluated to have a low possibility of developing pancreatic disease.
  • step (b) it is possible to use a cut-off value for each subject's age group, which is divided into a group of affected and unaffected groups of the target pancreatic disease.
  • the cut-off value for each age group is set to be lower as the age group is higher.
  • the age group that sets the cut-off value separately may be set equally for each fixed age range, or the age range may be set unevenly. For example, set all ages from 0 years by dividing into 5 or 10 years old age groups, or group under 50 years old and over 70 years old. It is also possible to divide evenly for each width.
  • pancreatic disease marker is a marker in which the concentration in a duodenal fluid sample collected from a patient with pancreatic disease is higher than the concentration in a duodenal fluid sample collected from a non-pancreatic disease patient
  • concentration of the disease marker is equal to or higher than the cutoff value set for each age group in advance
  • the subject evaluates that the subject is likely to develop pancreatic disease, and the cutoff value set for each age group If it is less than that, it is evaluated that the subject is unlikely to develop pancreatic disease.
  • the pancreatic disease marker used as an index in the evaluation method according to the present invention is a biomolecule whose concentration in the pancreatic juice is significantly higher in patients suffering from pancreatic disease than in non-affected individuals of pancreatic disease.
  • the pancreatic disease marker is preferably a biomolecule that is not easily affected by digestive enzymes contained in duodenal juice, such as glycoproteins and enzymes.
  • pancreatic disease markers used as an index in the evaluation method according to the present invention include S100 protein (S100P), NGAL, MIC-1, CEA, CA19-9 (for example, see Non-Patent Document 1), MUC-1 (KL- 6) (see, for example, Patent Document 4), MMP2 (Matrix Metalloproteinase-2) (see, for example, Non-Patent Document 2), MMP7 (Matrix Metalloproteinase-7), and the like.
  • S100 protein S100 protein
  • NGAL NGAL
  • MIC-1 MIC-1
  • CEA CA19-9
  • MUC-1 KL- 6
  • MMP2 Microx Metalloproteinase-2
  • MMP7 Microtrix Metalloproteinase-7
  • a substance such as S100P, NGAL, MIC-1, CEA and the like that has a significantly higher concentration in pancreatic juice than a non-affected person in a subject suffering from a pancreatic disease to be
  • S100P is particularly preferred. For example, since S100P increases secretion from pancreatic cancer cells, by using S100P as a marker for pancreatic disease, the possibility of suffering from pancreatic cancer, which is difficult to detect early and has a very poor prognosis, is evaluated with high reliability. Can contribute to the early detection of pancreatic cancer.
  • the duodenal fluid sample used in the evaluation method according to the present invention may be the duodenal fluid itself collected from the subject, and various additives, buffers, etc. are added to the collected duodenal fluid. It may be a thing.
  • the additive include a reagent for suppressing decomposition and denaturation of components in a duodenal fluid sample such as a surfactant, a protease inhibitor, a nucleolytic enzyme inhibitor, and a pH adjuster.
  • a buffer used for preparing a reaction solution for detecting a protein or nucleic acid such as phosphate physiological saline (PBS) or HEPES buffer, can be used. Additives or the like may be added to a container containing duodenal juice collected from a living body, or may be previously placed in a container and the duodenal juice collected directly in the container.
  • PBS phosphate physiological saline
  • Additives or the like may be added to a container containing duodenal juice collected
  • Duodenal juice can be collected from subjects by conventional methods.
  • duodenal fluid can be collected by suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • suction means such as a syringe or vacuum pump connected to an endoscopic catheter.
  • the endoscope is inserted from the oral cavity to the duodenum, and the duodenal fluid present in the second and third portions of the duodenum is sucked and collected using a catheter inserted through the forceps channel.
  • the duodenal juice stored in the intestinal tract of the duodenum may be collected following the endoscopic examination (upper endoscopy) of the stomach and duodenum as a so-called stomach camera.
  • the duodenal fluid sample used in step (a) may be a sample immediately after being collected from a subject, may be a sample after storage at room temperature, refrigerated or frozen, and is obtained by lyophilization treatment. The obtained frozen powder may be used.
  • the duodenal fluid sample may be subjected to step (a) after separating and removing solids such as cells by centrifugation or the like.
  • the method for measuring the concentration of the pancreatic disease marker in the duodenal juice sample is not particularly limited as long as it is a measurement method capable of quantitatively or semi-quantitatively detecting the pancreatic disease marker in the sample. Absent. For example, by various protein analyzes using ELISA, immunochromatography, two-dimensional electrophoresis, Western blot, mass spectrometry, etc., various nucleic acid analyzes using PCR, RT-PCR, hybridization using probes, etc. Various pancreatic disease markers can be detected quantitatively or semi-quantitatively. In addition, by using various analyzers such as an automatic biochemical analyzer, pancreatic disease markers can be quantitatively or semi-quantitatively detected from a large number of duodenal juice samples. These methods can be performed by a conventional method.
  • Example 1 Among patients in two medical facilities, men and women whose S100P concentration is over the detection limit (over 0), over the age of 50, and there is no disease in the pancreas or the stage of pancreatic cancer is 0, I, or IIA A total of 71 subjects were subjected to statistical analysis on the S100P concentration in the duodenal juice sample and the presence or absence of pancreatic cancer. It should be noted that patients younger than 50 years were excluded from this experiment because the probability of suffering from pancreatic cancer was very low. There were 296 patients whose S100P concentration was above the detection limit (greater than 0), of which 254 were over 50 years old and 42 were under 50 years old.
  • pancreatic cancer stage IIA patients included a group of patients with no pancreatic disease and no family history of pancreatic cancer (group 1a), a group of patients with no pancreatic disease but a family history of pancreatic cancer (group 1b), and early stage of pancreatic cancer (stage) 0 and stage I) patients (group 0 / I) and pancreatic cancer stage IIA patients (group IIA).
  • the S100P concentration (pg / mL) in the duodenal juice sample collected from each patient was measured using a CircuLex S100P ELISA Kit (manufactured by Cyclex, catalog number: CY-8060). Cut the measured value of S100P concentration to discriminate between patient group without pancreatic disease (total of group 1a and 1b; group 1a + 1b) and pancreatic cancer patient group (total of group 0 / I and IIA; group 0 / I + IIA) In order to obtain an off value, an ROC curve was created from the S100P concentration of each patient, and the area under the ROC curve (AUC) remained at 0.7037 (95% confidence interval: 0.5787 to 0.8038) ( FIG. 1).
  • FIG. 2 shows the results of plotting the measured values of the S100P concentration for each patient age for the 1a + 1b group and the 0 / I + IIA group.
  • the stage of pancreatic cancer showed a statistically significant relationship with the S100P logarithm conversion value, age, and the presence or absence of diabetes. However, it was statistically related to sex, facility, presence or absence of esophageal disease, and smoking history There was no significant association.
  • ⁇ Setting the cut-off value for each age group> The above 71 patients are divided into 50-59 years old group, 60-69 years old group, 70 years old group and above, and ROC curve is created from S100P concentration for each age group, and the specificity is around 90%. Thus, the cut-off value was determined and the sensitivity was obtained. In addition, ROC curves were created from the S100P concentration for all ages (50 years and older), cut-off values were determined so that the specificity was around 90%, and sensitivity was obtained. Furthermore, the sensitivity and specificity were calculated when the cut-off value was determined for all age groups (uniform cut-off value) for the 50-59 age group, the 60-69 age group, and the 70+ age group. . The results are shown in Table 3. In the table, “50-59” indicates the age group of 50-59 years, “60-69” indicates the age group of 60-69 years, “70-” indicates the age of 70 years or older, and “50-” indicates the age of 50 years or older.
  • Sensitivity and specificity when using the cutoff value (137116pg / mL) when the cutoff value is uniformly determined, and when the cutoff value is determined so that the specificity is around 90% for each age group
  • the cutoff value (137116pg / mL) when the cutoff value is uniformly determined, and when the cutoff value is determined so that the specificity is around 90% for each age group

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Abstract

本発明は、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度に基づいて、膵疾患の罹患可能性を評価する方法を提供することを目的とする。本発明の膵疾患の罹患可能性評価方法は、（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を測定する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記被験者の年齢とに基づき、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する工程と、を有する。

Description

膵疾患の罹患可能性評価方法
　本発明は、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度に基づいて、被験者が膵疾患に罹患している可能性を評価する方法に関する。
　被検者の体液中の生体分子の濃度を指標として、がん等の各種疾患の罹患の有無の判定する方法が広く行われている。例えば、特許文献１には、被験者の血液中のＣＳＲＰ１タンパク質の量又はＣＳＲＰ１タンパク質の存在の有無を指標にして、被験者の癌を検出する方法が開示されている。また、特許文献２には、血液等の体液中のＹＫＬ－４０濃度を、年齢によって調整されたカットオフ値と比較し、消化管癌の罹患の有無や重症度の判定、治療法の選択等を行う方法が記載されている。
　十二指腸液は、膵臓から排出される膵液、胆管から排出される胆汁、及び十二指腸で分泌される粘液の混合体液である。十二指腸液の採取は、内視鏡を十二指腸まで挿入し、その場で吸引するだけで可能であり、膵管からの膵液採取に比べて低侵襲かつより簡便な手技で実施できる。このため、十二指腸液中の膵疾患マーカーを検出することにより、膵疾患を検査することができる（例えば、特許文献３参照）。
特開２０１４－１１５１８８号公報 特表２０１２－５０２２８５号公報 特開２０１５－１１０１１号公報 特開２００６－３０８５７６号公報
Pancreas,1994, vol.9, No.6号,p741－747 Pancreas, 2002, vol.24, No.54, p344－347
　十二指腸液に含まれる生体分子の量は、被験者ごとに異なりばらつきが多い。このため、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度に基づいて、膵疾患の罹患可能性を評価する際に、目的の膵疾患の罹患者群と非罹患者群に分けるカットオフ値を、被験者の背景等を考慮せず一律に設定した場合には、判定の精度が充分ではなかった。
　すなわち、本発明は、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度に基づいて、膵疾患の罹患可能性を、より精度よく評価する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度は、被験者の年齢が高くなるほど低下する傾向にあることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明に係る膵疾患の罹患可能性評価方法は、下記［１］～［９］である。
［１］　（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を測定する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記被験者の年齢とに基づき、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する工程と、
を有する、膵疾患の罹患可能性評価方法。
［２］　前記工程（ｂ）において、
　前記膵疾患マーカーの濃度と前記被験者の年齢とに基づきスコア値を算出し、得られたスコア値と、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値とを比較して、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する、又は、
　前記膵疾患マーカーの濃度と、被験者の年齢層ごとに設定されたカットオフ値とを比較して、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する、
前記［１］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
［３］　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーである、前記［１］又は［２］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
［４］　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーであり、
　前記工程（ｂ）において、前記膵疾患マーカーの濃度と前記被験者の年齢とに基づきスコア値を算出し、
　当該スコア値が、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値以上の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、前記カットオフ値未満の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する、前記［１］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
［５］　前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記スコア値Ｐとが、下記式（１）の関係を満たす、前記［４］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
（１）　ｌｏｇ〔Ｐ／（１－Ｐ）〕＝ａ×ｌｏｇ１０［膵疾患マーカー濃度］＋ｂ×［被検者の年齢］＋ｃ
［式（１）中、ａ、ｂ、及びｃは、膵疾患罹患者群及び膵疾患非罹患者群から採取された十二指腸液試料中の前記膵疾患マーカーの濃度と年齢を説明変数とする多重ロジスティック回帰分析により決定される実数である。］
［６］　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーであり、
　前記工程（ｂ）において、前記膵疾患マーカーの濃度が、予め年齢層ごとに設定されたカットオフ値以上の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、前記年齢層ごとに設定されたカットオフ値未満の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する、前記［１］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
［７］　前記年齢層ごとに設定されたカットオフ値は、年齢層が高いほど低く設定されている、前記［６］の膵疾患の罹患可能性評価方法。
［８］　前記膵疾患マーカーがＳ１００タンパク質である、前記［１］～［７］のいずれかの膵疾患の罹患可能性評価方法。
［９］　前記膵疾患が膵癌である、前記［１］～［８］のいずれかの膵疾患の罹患可能性評価方法。
　十二指腸液試料は個体差が大きい生体試料であるにもかかわらず、本発明に係る膵疾患の罹患可能性評価方法により、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度に基づく膵疾患の罹患可能性の評価を、高精度に、特に６５歳以上の高齢者を被検者とした場合に高い特異度で、実施することができる。
図１は、実施例１において、各患者のＳ１００Ｐ濃度の常用対数値から作成したＲＯＣ曲線である。 図２は、実施例１において、１ａ＋１ｂ群（左図）と０／Ｉ＋ＩＩＡ群（右図）について、患者の年齢ごとにＳ１００Ｐ濃度の測定値をプロットした結果を示した図である。 図３は、実施例１において、各患者のＳ１００Ｐ濃度の常用対数値と年齢を組み合わせたスコア値から作成したＲＯＣ曲線である。
　本発明及び本願明細書において、膵疾患マーカーは、膵液中に含まれているタンパク質、核酸、脂質、細胞等の各種生体分子であって、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子である。なお、膵疾患の非罹患者は、膵臓が正常であればよく、健常者に限らず、膵疾患以外の疾患の罹患者をも含む。また、膵疾患としては、例えば、膵癌、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、ＭＣＮ（粘液性嚢胞腫瘍）、ＳＣＮ（漿液性嚢胞腫瘍）、ＮＥＴ（膵内分泌腫瘍）、慢性膵炎（ＣＰ）、急性膵炎等が挙げられる。
　本発明及び本願明細書において、カットオフ値は、膵疾患マーカーの濃度又は当該濃度から導出される値について、目的の膵疾患の罹患者群と非罹患者群に分ける値を意味する。膵疾患の罹患者群と非罹患者群とを分けるカットオフ値は、膵疾患マーカーの種類、膵疾患マーカーの濃度の測定方法等を考慮して、実験的に設定することができる。カットオフ値の設定方法の一例としては、例えば、まず、膵疾患に罹患していないことが分かっている充分な数の被験者から採取された十二指腸液と、当該疾患に罹患していることが分かっている充分な数の被験者から採取された十二指腸液とに対して、それぞれ膵疾患マーカーの濃度を測定する。次いで、得られた測定値又は当該測定値から導出されるスコア値についてＲＯＣ曲線(Receiver Operator Characteristic Curve)を作成する。このＲＯＣ曲線に基づいて、目的の感度と特異度になるようにカットオフ値を設定することができる。
　膵疾患の罹患可能性を評価するためには、カットオフ値を、特異度が８０％以上となるように設定することが好ましく、特異度が８５％以上となるように設定することがより好ましく、特異度が９０％以上となるように設定することがさらに好ましい。
　本発明に係る膵疾患の罹患可能性評価方法（以下、「本発明に係る評価方法」ということがある。）は、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を指標として膵疾患の罹患可能性を評価する方法である。当該方法は、具体的には、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有する。
（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を測定する工程。
（ｂ）前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記被験者の年齢とに基づき、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する工程。
　後記実施例に示すように、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度は、膵疾患非罹患者において、被験者の年齢が高くなるほど低下する傾向にある。この理由は明らかではないが、膵臓の機能低下により、膵管からの膵液の排出量自体が低下する結果、十二指腸液に含まれる膵液量自体が低減してしまうためと推察される。
　この十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度と年齢の関係により、全年齢層について一律にカットオフ値を設定した場合には、被験者の年齢層ごとに精度がばらつき、評価精度が低くなる。すなわち、全年齢層に対して一律にカットオフ値を設定した場合、比較的年齢の低い層では感度が高いものの特異度が低くなり、偽陽性が多くなる。逆に、比較的年齢の高い層では、特異度は高いものの感度が低く、偽陰性が多くなる傾向がある。
　そこで、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度から膵疾患の罹患可能性を評価する際の評価精度を高めてより信頼性の高い評価結果を得るために、本発明に係る評価方法においては、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度と被検者の年齢の両方に基づいて、被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する。膵疾患マーカー濃度の加齢による自然低下分を考慮し、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を被検者の年齢で補正することにより、評価精度を高められる。
　例えば、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度と、試料を採取した被験者の年齢に基づいて試料についてのスコア値を算出し、得られたスコア値を、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値と比較することによって、被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する。膵疾患マーカーの濃度を被験者の年齢を加味したスコア値化することにより、全年齢層を対象とした一律のカットオフ値と比較した場合でも、年齢層ごとの精度のばらつきが抑えられ、いずれの年齢層においても同程度の感度と特異度を達成できる。全年齢層を対象とするカットオフ値は、統計学的に充分な数の膵疾患罹患者のスコア値と、同じく統計学的に充分な数の非罹患者のスコア値とについて作成されたＲＯＣ曲線に基づいて、感度及び特異度が所望の範囲になるように設定することができる。
　膵疾患マーカーの濃度に年齢を加味したスコア値Ｐは、例えば、膵疾患マーカー濃度の常用対数値に、膵疾患マーカー濃度の加齢による低下分を補うように設定される。具体的には、例えば、スコア値Ｐは、下記式（１）の関係を満たすように設定することができる。
（１）　ｌｏｇ〔Ｐ／（１－Ｐ）〕＝ａ×ｌｏｇ１０［膵疾患マーカー濃度］＋ｂ×［被検者の年齢］＋ｃ
　式（１）中、ａ、ｂ、及びｃは、膵疾患罹患者群及び膵疾患非罹患者群から採取された十二指腸液試料中の前記膵疾患マーカーの濃度と年齢を説明変数とする多重ロジスティック回帰分析により決定される実数である。多重ロジスティック回帰分析は常法により行うことができる。式（１）を設定する際に行う多重ロジスティック回帰分析の標本には、統計学的に充分な数の膵疾患罹患者と、同じく統計学的に充分な数の非罹患者からそれぞれ採取された十二指腸液試料中の膵疾患マーカー濃度を用いることが好ましい。
　例えば、式（１）中、ａを１．５～２．２、好ましくは１．７～１．９とし、ｂを０．１～０．２、好ましくは０．１２～０．１７とし、ｃを－２０～－１５とすることにより、全ての年齢層において、特異度を８０％以上、好ましくは９０％以上に調整することができる。
　例えば、膵疾患マーカーが、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーである場合には、被験者の十二指腸液試料中の膵疾患マーカー濃度と年齢から式（１）に基づいてスコア値Ｐを算出し、得られたスコア値Ｐが、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値以上の場合に、当該被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、当該カットオフ値未満の場合に、当該被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する。
　工程（ｂ）においては、目的の膵疾患の罹患者群と非罹患者群に分けるカットオフ値を、被験者の年齢層別に設定したものを用いることもできる。年齢層ごとのカットオフ値は、年齢層が高いほど低くなるように設定されている。カットオフ値を分けて設定する年齢層は、一定の年齢幅ごとに均等に分けて設定してもよく、年齢幅を不均等に設定してもよい。例えば、０歳からの全年齢を、５歳ごとや１０歳ごとの年齢層に分けて設定したり、５０歳未満の層と７０歳以上の層はそれぞれまとめ、５０～６９歳を一定の年齢幅ごとに均等に分けて設定することもできる。
　例えば、膵疾患マーカーが、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーである場合には、膵疾患マーカーの濃度が、予め年齢層ごとに設定されたカットオフ値以上の場合に、当該被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、年齢層ごとに設定されたカットオフ値未満の場合に、当該被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する。
　本発明に係る評価方法において指標とする膵疾患マーカーは、膵疾患の非罹患者と比較して、膵疾患に罹患している患者において、膵液中の濃度が有意に高くなる生体分子であればよく、特に限定されるものではない。本発明においては、膵疾患マーカーは、糖タンパク質や酵素等の、十二指腸液中に含まれている消化酵素の影響を受け難い生体分子であることが好ましい。本発明に係る評価方法において指標とする膵疾患マーカーとしては、Ｓ１００タンパク質（Ｓ１００Ｐ）、ＮＧＡＬ、ＭＩＣ－１、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９（例えば、非特許文献１参照。）、ＭＵＣ－１（ＫＬ－６）（例えば、特許文献４等参照）、ＭＭＰ２（Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２）（例えば、非特許文献２参照）、ＭＭＰ７（Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７）等が挙げられる。中でも、Ｓ１００Ｐ、ＮＧＡＬ、ＭＩＣ－１、ＣＥＡ等のように、評価する目的の膵疾患に罹患している被検者において、非罹患者よりも膵液中の濃度が有意に高くなる物質が好ましく、Ｓ１００Ｐが特に好ましい。例えば、Ｓ１００Ｐは、膵癌細胞からの分泌が増大するため、Ｓ１００Ｐを膵疾患マーカーとすることにより、早期発見が難しい上に予後が非常に悪いとされる膵癌の罹患可能性を高い信頼度で評価することができ、ひいては膵癌の早期発見に寄与し得る。
　工程（ａ）において、本発明に係る評価方法に供される十二指腸液試料は、被験者から採取された十二指腸液自体であってもよく、採取された十二指腸液に各種添加剤やバッファー等を添加したものであってもよい。添加剤としては、界面活性剤、タンパク質分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、ｐＨ調整剤等の、十二指腸液試料中の成分の分解や変性を抑制するための試薬等が挙げられる。バッファーとしては、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー等のようなタンパク質や核酸の検出のための反応液調製に用いられるバッファーを用いることができる。添加剤等は、生体から採取された十二指腸液を含む容器に添加してもよく、予め容器に入れておき、当該容器に十二指腸液を直接採取することもできる。
　十二指腸液は、被験者から常法により採取することができる。例えば、十二指腸液を内視鏡カテーテルに接続したシリンジや真空ポンプなどの吸引手段にて採取することができる。具体的には、内視鏡を口腔から十二指腸まで挿入し、鉗子チャネルを挿通して挿入したカテーテルを用いて、十二指腸の第二・第三ポーションに存在する十二指腸液を吸引し採取する。例えば、いわゆる胃カメラとしての胃・十二指腸の内視鏡検査（上部内視鏡検査）のついでに、十二指腸の腸管内に貯留している十二指腸液を採取してもよい。
　工程（ａ）に供される十二指腸液試料は、被験者から採取された直後のものであってもよく、室温、冷蔵、又は冷凍で保存した後のものであってもよく、凍結乾燥処理により得られた凍結粉末であってもよい。その他、十二指腸液試料は、遠心分離処理等により、細胞等の固形分を分離除去した後に工程（ａ）に供されてもよい。
　工程（ａ）において、十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を測定する方法は、試料中の膵疾患マーカーを定量的又は半定量的に検出し得る測定方法であれば特に限定されるものではない。例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、二次元電気泳動、ウエスタンブロット、質量分析法などを用いた種々のタンパク質解析や、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、プローブを用いたハイブリダイゼーションなどを用いた種々の核酸解析等によって、各種膵疾患マーカーを定量的又は半定量的に検出することができる。また、生化学自動分析装置等の各種分析装置を用いることにより、多数の十二指腸液試料について、迅速かつ容易に膵疾患マーカーの定量的又は半定量的な検出を行うことができる。これらの方法は常法により行うことができる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　２つの医療施設の患者のうち、Ｓ１００Ｐ濃度が検出限界値以上（０超）である、５０歳以上であり、かつ膵臓に疾患がない若しくは膵癌のステージが、０、Ｉ、若しくはＩＩＡである男女合計７１名を対象とし、十二指腸液試料中のＳ１００Ｐ濃度と膵癌の罹患の有無について統計学的解析を行った。なお、５０歳未満の患者では、膵癌罹患の確率が非常に低いため、本実験からは除外した。Ｓ１００Ｐ濃度が検出限界値以上（０超）である患者は２９６名であり、そのうち５０歳以上が２５４名、５０歳未満が４２名であった。
　これらの患者は、膵臓に疾患がなく、かつ膵癌の家族歴もない患者群（１ａ群）、膵臓に疾患がないが、膵癌の家族歴がある患者群（１ｂ群）、膵癌の早期（ステージ０とステージＩ）の患者群（０／Ｉ群）、膵癌のステージＩＩＡの患者群（ＩＩＡ群）に分けた。
　各患者から採取された十二指腸液試料中のＳ１００Ｐ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を、ＣｉｒｃｕＬｅｘ　Ｓ１００Ｐ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（Ｃｙｃｌｅｘ社製、カタログ番号：ＣＹ－８０６０）を用いて測定した。Ｓ１００Ｐ濃度の測定値を、膵臓に疾患がない患者群（１ａ群と１ｂ群の合計；１ａ＋１ｂ群）と膵癌患者群（０／Ｉ群とＩＩＡ群の合計；０／Ｉ＋ＩＩＡ群）を識別するカットオフ値を求めるために、各患者のＳ１００Ｐ濃度からＲＯＣ曲線を作成したところ、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は０．７０３７（９５％信頼区間：０．５７８７～０．８０３８）にとどまった（図１）。
　１ａ＋１ｂ群と０／Ｉ＋ＩＩＡ群について、患者の年齢ごとにＳ１００Ｐ濃度の測定値をプロットした結果を図２に示す。この結果、膵臓が正常な１ａ＋１ｂ群では、年齢が高くなるほど、Ｓ１００Ｐ濃度が低下する傾向が観察された。
　そこで、Ｓ１００Ｐ濃度（ｐｇ／ｍＬ）の常用対数値（ｌｏｇ１０［膵疾患マーカー濃度（ｐｇ／ｍＬ）］）、年齢、性別、施設、糖尿病の有無、食道の疾患の有無、喫煙歴のうち、それぞれ一つをロジスティック・モデルの説明変数とし、膵癌のステージ（１ａ＋１ｂ群か０／Ｉ＋ＩＩＡ群）との関連を調べた。各説明変数におけるオッズ比と９５％信頼区間、ｐ値を表１に示す。表中、「ｌｏｇ１０（Ｓ１００Ｐ）」はＳ１００Ｐ濃度の常用対数値を示す。この結果、膵癌のステージは、Ｓ１００Ｐの対数変換値、年齢、及び糖尿病の有無と統計学的に有意な関連を示したが、性別、施設、食道の疾患の有無、喫煙歴とは統計学的に有意な関連がなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜スコア値＞
　特に、Ｓ１００Ｐ濃度の常用対数値と年齢の関連が強かったこと、糖尿病は年齢と関連していることから、膵癌のステージと糖尿病の関連は年齢を介した関連の可能性が考えられた。そこで、特に年齢に注目して、Ｓ１００Ｐ濃度の常用対数値と年齢を説明変数とした多重ロジスティック回帰を行ったところ、下記式（２）で表されるスコア値Ｐ１が得られた。
（２）　ｌｏｇ〔Ｐ１／（１－Ｐ１）〕＝１．８２２７２×［Ｓ１００Ｐ濃度（ｐｇ／ｍＬ）の常用対数値］＋０．１３７５３×［被検者の年齢（歳）］－１８．２２７３
　得られたスコア値Ｐ１を用いてＲＯＣ曲線を作成したところ、ＡＵＣが０．８２４３（９５％信頼区間：０．７１９７～０．９０８２）にまで増加した（図３）。また、特異度９０％で膵癌の罹患の有無を評価するためには、スコア値０．６３４９７４とすればよく、この際の感度は５１．８５％であった。
　次いで、ロジスティック・モデルにＳ１００Ｐ濃度の常用対数値及び年齢に上記の３変数（施設、糖尿病、食道疾患）のそれぞれ１つ以上を、全ての組み合わせで投入した。各組み合わせにより得られたスコア値からＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣを求めた。前記３変数を加えたロジスティック回帰モデルから得られたＡＵＣとＳ１００Ｐ濃度の常用対数値及び年齢の２変数によるＡＵＣからの差の検定結果を表２に示す。この結果、いずれもＳ１００Ｐ濃度の常用対数値及び年齢の２変数によるロジスティック・モデルから得られたＲＯＣ曲線のＡＵＣより統計学的に有意に増加した場合はなかったため、Ｓ１００Ｐ濃度の常用対数値と年齢の組み合わせにより、膵癌の罹患の有無を精度良く評価できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜年齢層ごとのカットオフ値の設定＞
　前述の７１名の患者を５０～５９歳層、６０～６９歳層、７０歳以上層に分け、それぞれの年齢層ごとに、Ｓ１００Ｐ濃度からＲＯＣ曲線を作成し、特異度が９０％前後となるようにカットオフ値を決定し、感度を求めた。また、全年齢層（５０歳以上層）についてもＳ１００Ｐ濃度からＲＯＣ曲線を作成し、特異度が９０％前後となるようにカットオフ値を決定し、感度を求めた。さらに、５０～５９歳層、６０～６９歳層、７０歳以上層について、カットオフ値を全年齢層で求めたカットオフ値（一律カットオフ値）とした場合の感度と特異度を算出した。結果を表３に示す。表中、「５０－５９」は５０～５９歳層、「６０－６９」は６０～６９歳層、「７０－」は７０歳以上層、「５０－」は５０歳以上層を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　一律にカットオフ値を決めた場合のカットオフ値（１３７１１６ｐｇ／ｍＬ）を用いた場合の感度及び特異度と、年齢層ごとに特異度が９０％前後になるようにカットオフ値を決めた場合の感度及び特異度を比較すると、５０～５９歳層では特に差はなかったが、６０歳以上の年齢層では、年齢層ごとにそれぞれカットオフ値を定めたほうが、より高い検査性能がえられた。６０～６９歳層では、年齢層ごとに定めたほうが高い特異度が得られた。７０歳以上層では、一律カットオフ値では特異度が高くなるものの、感度が激減してしまったが、年齢層ごとに定めたカットオフ値では、感度も特異度も良好であった。
　６０～６９歳層を、６０～６４歳層と６５～６９歳層に分け、それぞれの年齢層ごとに、Ｓ１００Ｐ濃度からＲＯＣ曲線を作成し、特異度が９０％前後となるようにカットオフ値を決定し、感度を求めた。結果を表４に示す。表中、「６０－６４」は６０～６４歳層、「６５－６９」は６５～６９歳層、「７０－」は７０歳以上層を示す。この結果、６０～６４歳層は５０～５９歳層と同様に、一律カットオフ値を用いた場合と年齢層ごとにカットオフ値を設定した場合で特に差はなかったが、６５～６９歳層では、一律カットオフ値よりも年齢層ごとに定めたほうが高い特異度が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (9)

  1. 　（ａ）被検者から採取された十二指腸液試料中の膵疾患マーカーの濃度を測定する工程と、
    （ｂ）前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記被験者の年齢とに基づき、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する工程と、
    を有する、膵疾患の罹患可能性評価方法。
  2. 　前記工程（ｂ）において、
    　前記膵疾患マーカーの濃度と前記被験者の年齢とに基づきスコア値を算出し、得られたスコア値と、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値とを比較して、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する、又は、
    　前記膵疾患マーカーの濃度と、被験者の年齢層ごとに設定されたカットオフ値とを比較して、前記被験者の膵疾患の罹患可能性を評価する、
    請求項１に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  3. 　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーである、請求項１又は２に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  4. 　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーであり、
    　前記工程（ｂ）において、前記膵疾患マーカーの濃度と前記被験者の年齢とに基づきスコア値を算出し、
    　当該スコア値が、被験者の年齢によらず一律に設定されたカットオフ値以上の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、前記カットオフ値未満の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する、請求項１に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  5. 　前記工程（ａ）において測定された前記膵疾患マーカーの濃度と、前記スコア値Ｐとが、下記式（１）の関係を満たす、請求項４に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
    （１）　ｌｏｇ〔Ｐ／（１－Ｐ）〕＝ａ×ｌｏｇ１０［膵疾患マーカー濃度］＋ｂ×［被検者の年齢］＋ｃ
    ［式（１）中、ａ、ｂ、及びｃは、膵疾患罹患者群及び膵疾患非罹患者群から採取された十二指腸液試料中の前記膵疾患マーカーの濃度と年齢を説明変数とする多重ロジスティック回帰分析により決定される実数である。］
  6. 　前記膵疾患マーカーは、膵疾患罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度が、膵疾患非罹患者から採取された十二指腸液試料中の濃度よりも高くなるマーカーであり、
    　前記工程（ｂ）において、前記膵疾患マーカーの濃度が、予め年齢層ごとに設定されたカットオフ値以上の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が高いと評価し、前記年齢層ごとに設定されたカットオフ値未満の場合に、前記被験者が膵疾患を発症している可能性が低いと評価する、請求項１に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  7. 　前記年齢層ごとに設定されたカットオフ値は、年齢層が高いほど低く設定されている、請求項６に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  8. 　前記膵疾患マーカーがＳ１００タンパク質である、請求項１～７のいずれか一項に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
  9. 　前記膵疾患が膵癌である、請求項１～８のいずれか一項に記載の膵疾患の罹患可能性評価方法。
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