WO2013180238A1 - 認知症治療剤又は予防剤 - Google Patents

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WO2013180238A1
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森　啓
貴美 富山
松本　洋一
広志 江口
裕一 九里
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公立大学法人大阪市立大学
帝人ファーマ株式会社
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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a dementia therapeutic agent or preventive agent. Specifically, the present invention relates to a novel anti-phosphorylated protein or peptide antibody having an effect of improving excellent cognitive function, and a cognition containing an antigen that can induce anti-phosphorylated tau antibody or anti-phosphorylated tau antibody. The present invention relates to an agent for treating or preventing symptom.
  • Dementia refers to a condition in which intelligence once developed declines for some acquired reason and presents social adjustment difficulties.
  • Dementia-related diseases are classified into neurodegenerative diseases, vascular dementia, prion diseases, infectious diseases, metabolic / endocrine diseases, trauma and brain surgical diseases, toxic diseases, etc.
  • Non-patent Document 1 In Japan, there are about 2.1 million dementia patients as of 2010, and the prevalence of elderly people over 65 years old is said to be about 8-10%, more than 10%. It is recognized as a big problem (Non-Patent Document 2).
  • Non-patent Document 2 Dementia due to a neurodegenerative disease is a disease characterized by an insidious onset of memory impairment and / or personality change that progresses over a period of at least 6 months.
  • NFT neurofibrillary tangle
  • Tau protein is a protein encoded by the MAPT gene present on chromosome 17 (17q21) in humans, and is one of the microtubule-binding proteins that are often expressed in the central system. It has been found that tau is a major constituent protein of paired helical filament and straight filament that constitutes NFT in AD, which is a representative of neurodegenerative diseases, and has been found to accumulate in cells in various neurological diseases. Diseases in which such intracellular accumulation of tau occurs are collectively referred to as tauopathy (Non-patent Document 4).
  • the neurodegenerative diseases included in tauopathy include Alzheimer's disease (AD), cortical basal ganglia degeneration (CBD or CBS), progressive supranuclear palsy, Pick's disease, and addiction-granular dementia , Multiple system tauopathy with dementia (MSTD), frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17), neurofibrillary tangle dementia, chronic neurofibrillary tangle with calcification Diseases (DNTC), white matter tauopathy with globular glial inclusions (WMT-GGI) frontotemporal lobar degeneration with tau positive inclusions (FTLD-tau), etc.
  • Tauopathy includes those caused by infectious diseases such as acute sclerosing panencephalopathy and those caused by trauma such as fist encephalopathy (Non-patent Document 4).
  • Non-patent Document 4 The structure of the MAPT gene on the genome consists of 13 exons, and proteins as multiple isoforms are expressed by alternative splicing (Non-patent Document 4).
  • the tau structure is characterized by a proline, an N-terminal acidic domain that consists of 0 to 2 (N0 to N2) 29 amino acid repeats (N) that depend on alternative splicing of exon 2 and exon 3.
  • tau has a number of 3R0N (352 amino acids), 3R1N (381 amino acids), 3R2N (410 amino acids), 4R0N (383) depending on the number including the 29 amino acid repeat (N) and the repeat (R) involved in microtubule binding.
  • 6 types of amino acids) ⁇ 4R1N (412 amino acids) and 4R2N (441 amino acids) are representative isoforms.
  • isotypes only 3R0N exists in the embryonic brain, whereas all six isotypes exist in the adult human brain, but there are many 4R types (Non-patent Document 3). ).
  • the difference between isotypes 3R and 4R depends on whether exon 10 is removed (3R) or included (4R) by alternative splicing.
  • 4R2N (SEQ ID NO: 1) represents serine which is the 413rd amino acid residue
  • 4R1N (SEQ ID NO: 2) represents 384th
  • 4R0N (SEQ ID NO: 3) represents 355th
  • 3R2N (SEQ ID NO: 4) represents serine, which is the 382rd amino acid residue of 382nd, 3R1N (SEQ ID NO: 5), 353rd, and 3R0N (SEQ ID NO: 6), the 324th amino acid residue.
  • Non-patent Document 4 The involvement of tau in neurodegenerative diseases has been elucidated from the relationship between MAPT gene mutation and tau accumulation in frontotemporal dementia (FTDP-17) with parkinsonism linked to chromosome 17 first In FTDP-17, more than 40 types of gene mutations in the MAPT gene have been reported (Non-patent Document 4). It is suggested that such genetic mutation may be involved in the pathogenesis of a tau isoform due to a change in the ratio of tau isoforms or a change in the interaction of mutant tau with microtubules. However, unlike familial neurodegenerative diseases, MAPT mutations are often not found in sporadic neurodegenerative diseases such as AD. In addition, tau accumulated in neurodegenerative diseases is characterized by being highly modified by phosphorylation.
  • Non-patent Document 5 In patients with mild cognitive impairment (MCI), there was a correlation between the amount of phosphorylated tau in the cerebrospinal fluid and pituitary atrophy, and phosphorylated tau is associated with neurodegeneration in patients with tauopathy. It is considered to be a highly reliable biomarker (Non-patent Document 5). For this reason, in order to suppress excessive phosphorylation of tau phosphate, kinases, which are enzymes involved in phosphorylation, and in particular, attempts to use enzyme inhibitors for GSK-3 ⁇ have been made and developed. (Non-patent document 5). However, since kinases such as GSK-3 ⁇ are considered to be enzymes related to functional control not only in pathological conditions but also in normal physiological actions, there are concerns about side effects and the like. In fact, some of tau phosphorylation sites by GSK-3 ⁇ coincide with tau phosphorylation sites found in fetuses and normal human brain (Non-patent Document 3). There is also a possibility of affecting the function of.
  • tau present outside the cell leaked out due to cell death of degenerated neurons, but recent research has shown that tau is excessively phosphorylated inside the cell. It is believed to be actively secreted extracellularly through the process. Phosphorylated tau secreted outside the cell is dephosphorylated at some phosphorylation sites, and then acts on the muscarinic receptors M1 and M3 of surrounding cells to enhance intracellular tau phosphorylation And non-patent literature 7 and non-patent literature 7). In this way, since tau has been considered to act as a factor that acts outside the cell, the importance of therapeutic drugs that use high molecular weight compounds such as antibodies that are difficult to act intracellularly is also emphasized. It has come to be.
  • a drug that acts on the dephosphorylated tau portion may affect the function of normal tau.
  • Non-patent Document 5 Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3
  • Immunological treatment is performed for the purpose of inducing the production of specific antibodies by administering peptide vaccines and the like. Expected to reduce side effects due to high specificity for target proteins or peptides. Is done.
  • a vaccine using a phosphorylated tau partial peptide (the amino acid residue corresponding to Ser396 and Ser404 was phosphorylated and the amino acid residue corresponding to Ser262 was phosphorylated) It has been reported that immunization of an animal model that expresses mutant tau has improved the improvement of the motor function of the model animal.
  • Patent Document 4 an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction is administered to a tau peptide phosphorylated at Ser409, and an effect relating to the treatment of tauopathy is observed.
  • an expensive peptide vaccine the total dose is large, and the period until the effect appears is long.
  • the effect of the peptide vaccine is that the reactivity of the immune response of the administered human or animal varies depending on the genetic background, and antibody production cannot be effectively induced in all individuals. Therefore, it is conceivable to use immunotherapy by passive immunization with antibodies, but there are a large number of sites that undergo phosphorylation in tau, and information on which phosphorylation site it is effective to use Is almost nonexistent. Moreover, even if it sees the effect in the animal model with the antibody which exists now, it cannot be considered that it has sufficient function for using for a treatment.
  • the therapeutic dose of Actemra (registered trademark) (tocilizumab), a human anti-IL-6R antibody, is administered at 1 to 4 week intervals at 8 mg / kg body weight and Soliris (Registered humanized anti-complement C5 antibody) (Trademark) (Eculizumab) is administered at a dose of 600-900 mg per adult at a time, every 2-4 weeks.
  • Actemra registered trademark
  • Soliris Registered humanized anti-complement C5 antibody
  • Eculizumab is administered at a dose of 600-900 mg per adult at a time, every 2-4 weeks.
  • the antibody drugs it is necessary for the antibody drugs to be developed in the future to have effects at doses equivalent to or lower than these.
  • the organ to be treated for dementia such as AD is the brain, but when systemic administration such as intravenous or subcutaneous administration is performed, antibody transfer from the blood to the brain due to the presence of the cerebrovascular barrier Since the rate is said to be low, antibodies used for the treatment of dementia are less likely to have a pharmacological effect than when targeting diseases of other organs, and there is a major problem.
  • the main symptoms are memory impairment and cognitive impairment, especially because cognitive function is an important function for performing judgment, communication, and executive functions based on memory. It is an important symptom of symptom.
  • the motor function is a symptom observed in frontotemporal dementia (FTDP-17) with parkinsonism linked to chromosome 17 and end-stage Alzheimer's disease, but it is not necessarily a central symptom shown in dementia. is not. Therefore, when considering the treatment of dementia, improving cognitive function is a central issue.
  • FTDP-17 frontotemporal dementia
  • FTDP-17 frontotemporal dementia
  • FTDP-17 frontotemporal dementia
  • chromosome 17 chromosome 17
  • tauopathy an appropriate animal model of cognitive dysfunction caused by tauopathy
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent or preventive agent for dementia, focusing on tau phosphorylation in tauopathy. Further, the present invention relates to an antibody that specifically reacts with an antibody against tau phosphorylated at the amino acid residue corresponding to the vicinity of Ser413, or at least one amino acid residue having an amino acid sequence around Ser413. It aims at providing the dementia therapeutic agent or preventive agent which contains the made peptide as an active ingredient. Furthermore, the present invention provides a monoclonal antibody having a high effect of improving cognitive function, and further provides a method for producing an antibody suitable for the treatment of dementia, such as a humanized antibody, from the analysis of the structure of the monoclonal antibody. Objective.
  • the tau protein in the present invention is meant to include not only 4R2N but also all six isoforms.
  • the position of the amino acid residue in the present invention is specified based on the sequence shown in SEQ ID NO: 1 for convenience. For example, when expressed as the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1, No. 1 (4R2N) at 413th serine, SEQ ID NO: 2 (4R1N) at 384th, SEQ ID NO: 3 (4R0N) at 355th, SEQ ID NO: 4 (3R2N) at 382nd, SEQ ID NO: 5 (3R1N) at 353rd Or serine which is the 324th amino acid residue of SEQ ID NO: 6 (3R0N).
  • Treatment for dementia comprising as an active ingredient an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of the tau protein represented by SEQ ID NO: 1 has been phosphorylated Agent or preventive agent.
  • the therapeutic or preventive agent for dementia according to (1) wherein the antibody reacts with an antigen-antibody reaction with tau protein that has undergone phosphorylation characteristic of dementia.
  • (3) The antibody according to (1) or (2), wherein the antibody reacts with a tau protein phosphorylated at one or more sites selected from Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416.
  • An agent for treating or preventing dementia comprising as an active ingredient an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of the tau protein represented by SEQ ID NO: 1 has been phosphorylated Agent or preventive agent.
  • the antibody is an antibody that competes for binding with an antibody comprising VH consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 and VL consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 in binding to tau protein.
  • the dementia therapeutic agent or preventive agent according to any one of (3).
  • the antibody is represented by a CDR sequence of an H chain represented by SEQ ID NOs: 7 to 13, a CDR sequence of an H chain represented by at least one of SEQ ID NOs: 7 to 13, or represented by SEQ ID NOs: 7 to 13
  • the therapeutic agent or preventive agent for dementia according to any one of (6).
  • the antibody has an H chain variable region represented by any of SEQ ID NOs: 18 to 24, or an H chain variable region having a sequence of 85% or more homology with any of SEQ ID NOs: 18 to 24, and / or Or an antibody having an L chain variable region represented by any one of SEQ ID NOs: 25 to 30, or an L chain variable region having a sequence homologous to at least 85% of any of SEQ ID NOs: 25 to 30, (1)
  • the therapeutic or preventive agent for dementia according to any one of (7) to (7).
  • a peptide comprising at least eight consecutive amino acid sequences among the amino acid sequences consisting of amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1, wherein at least one amino acid residue contained in the peptide is A therapeutic or prophylactic agent for dementia, comprising a phosphorylated peptide as an active ingredient.
  • Tauopathy is Alzheimer's disease, cortical basal ganglia degenerative disease, progressive supranuclear palsy, Pick's disease, granulosis of the gonadotrophic gland Frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome (FTDP-17), neurofibrillary tangle dementia, chronic neurofibrillary tangle with calcification (DNTC), protein with globular glial inclusions
  • FTDP-17 neurofibrillary tangle dementia
  • DNTC chronic neurofibrillary tangle with calcification
  • the therapeutic or preventive agent for dementia according to (13), which is tauopathy (WMT-GGI) or frontotemporal lobar degeneration (FTLD-tau) with a tau positive inclusion body.
  • an antibody against a phosphorylated tau protein wherein the antibody comprises VH consisting of the amino acid set forth in SEQ ID NO: 20 and VL consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • the CDR sequence of the H chain represented by SEQ ID NOs: 7 to 13 the CDR sequence of the H chain represented by at least one of SEQ ID NOs: 7 to 13, or the H chain represented by SEQ ID NOs: 7 to 13
  • (21) A peptide consisting of at least eight consecutive amino acid sequences among amino acid sequences consisting of amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1, wherein at least one amino acid residue contained in the peptide is Phosphorylated peptide.
  • (22) The peptide according to (21), wherein at least one of amino acid residues corresponding to the amino acids of Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated.
  • (23) The peptide according to (21) or (22), wherein the phosphorylated amino acid residue is an amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to an antibody that specifically undergoes an antigen-antibody reaction against tau phosphorylated around the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1, or at least one amino acid sequence around Ser413 of SEQ ID NO: 1.
  • a dementia therapeutic agent or preventive agent By containing a peptide having an amino acid residue phosphorylated as an active ingredient, a dementia therapeutic agent or preventive agent can be provided.
  • the present invention also provides a monoclonal antibody having a high effect of improving cognitive function, and further provides a method for producing an antibody suitable for the treatment of dementia such as a humanized antibody from the analysis of the structure of the monoclonal antibody. .
  • FIG. 4 is a photograph showing immunohistochemical staining of the parahippocampal region of Ta1505 antibody in a memory learning damaged mouse (Tau-Tg) administered with Ta1505 antibody (1 mg / animal). It is a photograph showing immunohistochemical staining of hippocampal CA3 region and CA23 region by AT8 in mice with memory learning impairment (Tau-Tg) administered with control IgG (1 mg / animal) or Ta1505 antibody (1 mg / animal).
  • FIG. 4 is a photograph showing immunohistochemical staining of the parahippocampal region of Ta1505 antibody in a memory learning damaged mouse (Tau-Tg) administered with Ta1505 antibody (1 mg / animal). It is a photograph showing immunohistochemical staining of hippocampal CA3 region and CA23 region by AT8 in mice with memory learning impairment (Tau-Tg) administered with control IgG (1 mg / animal) or Ta1505 antibody (1 mg / animal).
  • FIG. 4 is a photograph showing immunohistochemical staining of the parahippocampal region by AT8 in a memory learning damaged mouse (Tau-Tg) administered with a control antibody (1 mg / animal). It is a photograph showing immunohistochemical staining of the parahippocampal region by AT8 of a memory learning damaged mouse (Tau-Tg) administered with Ta1505 (1 mg / animal). It is a graph which shows the amount of reactive Tau of G2, AT8, PHF1, and Ta1505 in the TBS soluble brain fraction of the memory learning damage mouse
  • the present inventors produced an antibody that specifically reacts with antigen-antibody reaction to tau phosphorylated at the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1, which is a site that is specifically phosphorylated by AD.
  • AD antigen-antibody reaction to tau phosphorylated at the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1
  • cognitive function can be recovered to almost the same extent as in the subject group.
  • an antibody against tau phosphorylated at the amino acid residue corresponding to Ser396 of SEQ ID NO: 1 having stronger affinity than the antibody of the present invention for an equivalent antigen was compared at the same concentration, There was not enough improvement in cognitive function.
  • the portion around the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1 is a region where there is no particular information regarding the relationship between the structure and function of tau. Having such a strong cognitive improvement effect was a completely unexpected result. Therefore, the present invention has revealed for the first time that the site around the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1 that has not been noticed so far is an important site for the onset of cognitive dysfunction in tauopathy. The present invention has been reached.
  • the tau (protein) in the present invention includes those gene variants in addition to the human tau proteins shown in SEQ ID NOs: 1 to 6. As shown in the background art above, in FTDP-17, which is a familial neurodegenerative disease related to dementia, more than 40 mutations are known, but the mutation sites are not limited thereto. Absent. Further, the number of mutations with respect to SEQ ID NOs: 1 to 6 is 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10 amino acid mutations are also treated as tau in the present invention.
  • a protein that shows 80% or more homology (Identities) by the BLAST method (default condition of NCBI PBLAST) with respect to the human tau protein shown in SEQ ID NO: 1 and isoforms thereof are also included.
  • Such includes tau in non-human species such as chimpanzees, rhesus monkeys, horses, pigs, dogs, mice, rabbits, rats, etc. and targets such tau for the purpose of improving the cognitive function of such animals It is also possible to produce therapeutic agents or preventive agents.
  • amino acid number in the present invention that is, the position of the amino acid residue is specified based on the sequence shown in SEQ ID NO: 1 for convenience. Therefore, for example, when expressed as an amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1, the 413rd of SEQ ID NO: 1 (4R2N), the 384th of SEQ ID NO: 2 (4R1N), and 355 of SEQ ID NO: 3 (4R0N)
  • the serine which is the 382nd amino acid residue of SEQ ID NO: 4 (3R2N), the 382rd of SEQ ID NO: 5 (3R1N), or the 324th amino acid residue of SEQ ID NO: 6 (3R0N).
  • Table 1 shows the positions of amino acid residues at the same position in each isoform.
  • Table 1 shows the positions of amino acid residues in the isoforms corresponding to 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 are shown, but the positional relationship between amino acid residues present at other positions is as follows. For example, it can be easily understood based on FIG. 1 and FIG.
  • Anti-phosphorylated tau antibody refers to an antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with tau phosphorylated at one or more amino acid residues in the amino acid sequence of tau shown above.
  • the amino acid residue to be phosphorylated include serine (Ser), threonine (Thr), tyrosine (Tyr) and the like.
  • Ser serine
  • Thr threonine
  • Tr tyrosine
  • Another desirable form of the site in the phosphorylated tau to which the anti-phosphorylated tau antibody of the present invention reacts with an antigen antibody is selected from amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414 and Ser416 of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1 refer to the site corresponding to the amino acid number of human 4R2N tau (SEQ ID NO: 1).
  • corresponding sites in isoforms and sites corresponding to non-human homologues shall be treated in the same manner regardless of the amino acid number assigned from the amino acid sequence.
  • those skilled in the art can use Pairwise Sequence Alignment such as Needleman-Wunsch method and Smith-Waterman method, Multiple such as ClustalW method and PRRP method. It can be properly analyzed and understood by Sequence Alignment.
  • FIGS. 1 and 2 show amino acid sequences (indicated by one letter) of six types of human isoforms arranged in ClustalW. From this, the structures around the amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1 are conserved in the six isoforms, and it is easy to understand which is the corresponding amino acid.
  • the anti-phosphorylated tau antibody that can be used in the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention is a tau protein in which at least one of the amino acid residues present at positions 410 to 421 of the tau protein of SEQ ID NO: 1 has been phosphorylated.
  • the antibody specifically reacts with tau protein, wherein one or more sites selected from amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1 are phosphorylated.
  • an antibody that reacts with an antibody and more preferably an antibody that competitively binds to an antibody having the VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (hereinafter also referred to as “1505 antibody”); Desirably, it is an antibody that specifically reacts with Tau protein phosphorylated at the Ser413 site.
  • the corresponding site represents a phosphorylated tau protein, more preferably a human tau protein, more preferably any one of the six isoforms in humans.
  • tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 in the present invention has been phosphorylated amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1
  • Such phosphorylated tau proteins also include peptides that are completely homologous to a part of the amino acid sequence of the amino acid residue to be processed or have a sequence homology of 80% or more, and the corresponding amino acid residue is phosphorylated
  • An antibody that specifically reacts with such a peptide with an antigen-antibody is also an anti-antibody in the present invention. It is a phosphorylated tau antibody.
  • antigen-antibody reaction means a tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated, Ser412, Ser413, Thr414 and Ser416 of SEQ ID NO: 1.
  • Binding with a dissociation constant (KD) of an affinity of 1 ⁇ 10 ⁇ 6 M or more, preferably binding with an affinity of an equilibrium dissociation constant of 1 ⁇ 10 ⁇ 7 M or more, more preferably an equilibrium dissociation constant of 1 ⁇ 10 -8 Refers to binding with an affinity of M or higher.
  • “specifically” corresponds to tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 has been phosphorylated, and corresponds to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1. Binding to tau protein phosphorylated at one or more sites selected from amino acid residues and / or tau protein phosphorylated at the site of amino acid residues corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1. More than 10 times stronger, preferably more than 30 times stronger than binding to non-phosphorylated tau protein (including peptides that are completely homologous to a portion of the amino acid sequence of tau protein or having a sequence homology of 80% or more), Desirably, it is 100 times stronger.
  • “competitive binding” with the antibody (1505 antibody) whose amino acid sequence of VH sequence is SEQ ID NO: 20 and whose amino acid sequence of VL is SEQ ID NO: 26 is that other antibodies are bound when the monoclonal antibody binds to an antigen.
  • This refers to a phenomenon in which the binding of the monoclonal antibody is inhibited when coexisting.
  • a certain amount (concentration) of the monoclonal antibody is added to another monoclonal antibody at a different amount (concentration).
  • measurement can be performed by measuring the amount of addition (concentration) at which the binding amount of the monoclonal antibody to the antigen decreases, and the degree of inhibition can be expressed as a value of IC 50 or Ki.
  • an antibody that competitively binds to the antibody (1505 antibody) whose amino acid sequence of VH is SEQ ID NO: 20 and whose VL sequence is SEQ ID NO: 26 was used with the monoclonal antibody 10 nM to detect antigen-antibody binding.
  • the IC 50 is a value lower than 1 ⁇ M, more preferably a value lower than 100 nM, and further preferably lower than 10 nM.
  • Antibody antigen binding to the phosphorylated tau protein of such an antibody can be performed by those skilled in the art by appropriately selecting binding measurement in a solid phase or liquid phase system. Examples include, but are not limited to, the ELISA method, the EIA method, the surface plasmon resonance method, the FRET method, and the LRET method. Further, when measuring such antigen-antibody binding, the antibody and / or antigen (phosphorylated tau protein or tau protein) is labeled with an enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, radioisotope, etc., and the labeled substance It is also possible to detect an antigen-antibody reaction using a measurement method suitable for the physical and / or chemical characteristics of the antibody.
  • the anti-phosphorylated tau antibody of the present invention includes the amino acid sequence of CDR-H1 as the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 or 8, and the amino acid sequence of CDRH-H2 as shown in SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12.
  • CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 comprising the amino acid sequence of CDRH-H3 selected from the combination of any one of the above, and the L chain variable region is the CDR-L1 amino acid sequence.
  • An antibody comprising the amino acid sequences of CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 comprising SEQ ID NO: 14 or 15, the CDR-L2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and the CDR-L3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 included.
  • the set of CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 contained in the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13; and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 13;
  • An antibody wherein the set of CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 contained in the region is SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17; or SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, more preferably A set of CDR-H1, CDR-H2, and CDR-H3 contained in the heavy chain variable region, and CDR-L1, CDR-L2, and C contained in the light chain variable region
  • CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, or CDR-L3 amino acid sequences at least one of the corresponding CDR sequences is subjected to the BLAST method (NCBI PBLAST).
  • the antibody of the present invention also includes sequences that show 85% or more homology (Identities), preferably 90% or more homology with any of SEQ ID NOs: 7 to 17 under default conditions.
  • the Kabat method or Chothia method is used as a method for identifying the CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, or CDR-L3 sequence in an antibody.
  • the Kabat method or Chothia method is used.
  • Those skilled in the art can identify the sequence of the portion corresponding to each CDR, such as Kabat (Kabat, EA and Wu, TT, J. Immunol., 147, 1709-1719, 1991) and Chothia (Al- Lazikani, B., Lesk, AM and Chothia, C., J. Mol. Biol., 273, 927-948, 1997) are technically common to those skilled in the art, for example Dr. You can also get an overview from the Andrew CR Martin's Group homepage (http://www.bioinf.org.uk/abs/).
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region (VH) is any one selected from SEQ ID NOs: 18 to 24, and the amino acid sequence of the light chain variable region (VL) is SEQ ID NOs: 25 to 30.
  • the combination of VH and VL amino acid sequences is SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 30.
  • At least one of the amino acid sequences of VH and VL is any one of the amino acid sequences of VH shown in SEQ ID NOs: 18 to 24, or the amino acid sequences of VL shown in SEQ ID NOs: 25 to 30, and the BLAST method
  • the antibodies of the present invention also include sequences that show 85% or higher homology (identities), preferably 90% or higher homology with SEQ ID NOs: 18 to 30 under NCBI PBLAST default conditions).
  • the amino acid sequence of the constant region is selected from mammalian IgG, IgA, IgM, IgE, IgD subtypes or variants thereof.
  • CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 amino acid sequence and / or base sequence of the gene encoding it, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 amino acid sequence and / or encoding it A person skilled in the art can design a recombinant antibody suitable for administration to a target species, such as a humanized antibody, for therapeutic purposes based on the information on the base sequence of the gene to be used.
  • amino acid sequence of CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, and / or the nucleotide sequence of the gene encoding it the amino acid sequence of CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, and / or Information on the base sequence of the gene to be encoded, the amino acid sequence of the H chain variable region and / or the base sequence of the gene encoding it, the amino acid sequence of the L chain variable region and / or the base sequence of the gene encoding the same
  • the production of low-molecular-weight antibodies and scaffold antibodies can be appropriately carried out by those skilled in the art using known techniques.
  • the antibody in the present invention may be an antibody composed of two H chains and two L chains, or an antibody composed of only two H chains.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment. Examples of such an antibody fragment include structures such as F (ab ') 2, Fab, Fv and the like.
  • the antibody in the present invention can be obtained using techniques well known to those skilled in the art.
  • the antibody in the present invention is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein et al., Nature (England), issued October 6, 1983, Vol. 305, No. 5934, p. 537-540). it can.
  • the polyclonal antibody is one or more selected from tau protein in which at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated, Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1.
  • bonded with carrier proteins, such as BSA and KLH, polylysine, etc. can be used.
  • the peptide used as an antigen the peptide of SEQ ID NO: 31 or 32 in which the site corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1 is phosphorylated can be used as described in Examples 1 and 2.
  • the present invention is not limited to this.
  • the monoclonal antibody in the present invention can be collected from a culture obtained by cloning a hybridoma obtained by removing immune cells from a mammal sensitized with an antigen and fusing them with myeloma cells and the like.
  • Example 2 A method for obtaining such a monoclonal antibody is described in Example 2, and the monoclonal antibody obtained thereby has a VH amino acid sequence of SEQ ID NOs: 18 to 24 and a monoclonal antibody having a VL sequence of SEQ ID NOs: 25 to 30.
  • Examples thereof include, but are not limited to, antibodies (Ta1501, 1502, 1505-1509).
  • the obtained monoclonal antibody can obtain a nucleic acid molecule having a gene sequence encoding the amino acid of the protein of the antibody, and it is also possible to produce an antibody by genetic engineering using such a nucleic acid component. is there.
  • the antibody's gene information is H chain, L chain, and their variable regions are modified to improve antibody binding and specificity using information such as CDR sequences. It is a technique well known to those skilled in the art to produce an antibody having a structure suitable for use as a therapeutic agent by modifying a human antibody into a human antibody. It is also possible to obtain a human-type monoclonal antibody by using a non-human-transgenic animal into which a human antibody gene has been introduced as an animal for sensitizing an antigen.
  • a phage library (human antibody phage display) that expresses the antigen-binding region of a human antibody or a part thereof is used to specifically identify the corresponding antigen.
  • a person skilled in the art can appropriately perform a technique for obtaining a phage clone comprising a binding antibody or a specific amino acid sequence and preparing a human antibody from the information. (For example, see Taketo Tanaka et al., Keio J. Med., 60, p37-46 review.)
  • a method for producing the above-mentioned monoclonal antibody it is possible to cultivate a hybridoma that produces the antibody to be obtained, and to purify the antibody from the obtained culture supernatant by a conventional method.
  • a gene encoding an antibody from a hybridoma producing the antibody to be obtained or a phage clone obtained by human antibody phage display, more specifically, an immunoglobulin heavy chain and / or light chain is obtained. It is also possible to obtain a gene to be encoded, prepare a vector for expressing the gene, and introduce it into a host cell (mammalian cell, insect cell, microorganism, etc.) to produce the antibody.
  • a host cell mammalian cell, insect cell, microorganism, etc.
  • the gene encoding the immunoglobulin heavy chain and / or light chain is genetically modified to introduce a desired trait, or the variable region or CDR region structure of the immunoglobulin heavy chain and / or light chain
  • Production of humanized antibodies, antibody chimeric proteins, small molecule antibodies and scaffold antibodies using information can be carried out by those skilled in the art using known techniques.
  • modification of the structure of the constant region of the antibody or modification at the sugar chain may be appropriately performed by techniques well known to those skilled in the art. It can be carried out.
  • the present invention also includes a peptide containing a part of the amino acid sequence of tau and phosphorylating one or more amino acid residues thereof.
  • a phosphorylated amino acid residue means a state in which a phosphate group is ester-bonded to the side chain of the amino acid residue. Typical examples of phosphorylated amino acid residues are serine, threonine, and tyrosine. Etc.
  • the phosphorylated peptide is a peptide having an amino acid sequence consisting of amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 having a length of at least 8 amino acids, preferably at least 5 consecutive amino acids, including at least 3 consecutive amino acids.
  • the amino acid residue to be phosphorylated in the phosphorylated peptide is any one of the amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1, preferably the amino acids of Ser412, Ser413, Thr414 and Ser416 of SEQ ID NO: 1.
  • a typical example of such a phosphorylated peptide is the phosphorylated peptide (SEQ ID NO: 31) used in antibody production in Example 1, but is not limited thereto.
  • the phosphorylated peptide having an amino acid sequence derived from the tau of the present invention can be used as an agent for treating or preventing dementia characterized by containing the antigen and the peptide in the preparation of the anti-phosphorylated tau antibody of the present invention.
  • the phosphorylated peptide can be modified with a substance having other functions depending on the purpose at the N-terminal and / or C-terminal of the sequence.
  • the phosphorylated peptide may have a form in which a methionine residue, an acetyl group, pyroglutamic acid or the like is added to the N-terminus of the phosphorylated peptide, or a form modified with a fluorescent substance.
  • the substance that modifies the N-terminal and / or C-terminal of the phosphorylated peptide may be a peptide or protein.
  • a suitable tag sequence typically at the N-terminal or C-terminal. Histidine tag or FLAG tag), amino acid sequence peptides for recognition by T cell receptors (TCR) and major histocompatibility antigens (MHC), viral and bacterial proteins, and peptides derived from them. The thing which was done is mentioned.
  • the phosphorylated peptide in the present invention includes those in which at least one amino acid residue other than the N-terminal and C-terminal is modified with a compound or peptide.
  • modifications of phosphorylated peptides are known to those skilled in the art, for example, as described in Hermanson et al. Bioconjugate techniques (USA, 1996, Academic Press). It is possible to implement using a method or the like.
  • the phosphorylated peptide in the present invention can be produced by a person skilled in the art using a synthesis method, a genetic engineering method, or the like as appropriate.
  • Methods for producing phosphorylated peptides by synthesis include the Boc method (Wakamiya T. et al., Chemistry Letters, Vol.22 P1401, 1993), and the Fmoc method (PERICH, J. W., International Journal of Peptide). and Protein 40Research, vol.40, P134-140, 1992), or the method described in Japanese Patent No. 3587390, etc., but those skilled in the art can appropriately implement other methods.
  • the genetic engineering method is a method of preparing genetic material (DNA, RNA) having a base sequence encoding a peptide to be produced or a precursor thereof, and appropriately incorporating it into an expression vector or adding a promoter sequence.
  • DNA, RNA genetic material having a base sequence encoding a peptide to be produced or a precursor thereof, and appropriately incorporating it into an expression vector or adding a promoter sequence.
  • a phosphorylation reaction is appropriately carried out in the host by a kinase possessed by the host or whose expression is induced by genetic engineering, It can be produced by collecting the peptide once and then carrying out a phosphorylation reaction by reacting a kinase or the like in vitro.
  • an enzyme whose function in the phosphorylation reaction of tau such as GSK3 or CDK5 is known as the target peptide.
  • the target amino acid residue is phosphorylated.
  • a method of recovering a phosphorylated peptide that specifically binds to an antibody by using an antibody may be used.
  • Dementia in humans refers to a state in which intellectual functions that have been developed or acquired have declined, and are regarded as one of intellectual disabilities (Kunitoshi Ueshima, Shinichi Niwa, NANKODO's ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES New Psychiatry , P69-70, 2008), in a broad sense, considered to be a disease that exhibits intelligence impairment and / or memory impairment.
  • neurodegenerative diseases such as AD
  • “neurodegeneration” can be confirmed by confirming the presence of neurofibrillary tangle (NFT) by performing histological analysis after death, Physicians use questions as neuropsychological tests for the diagnosis of neurodegenerative diseases / Clinical Dementia Rating (Hasegawa simplified intelligence evaluation scale revision (HDS-R), Mini-Mental State Examination (MMSE), etc. (CDR) and Functual Assessment Staging (FAST), biochemical tests such as increased tau and phosphorylated tau abundance and A ⁇ abundance in cerebrospinal fluid, imaging tests such as head CT, head MRI, Diagnosis of dementia, particularly dementia as a neurodegenerative disease, is made based on information obtained by SPECT, PET, or the like.
  • NFT neurofibrillary tangle
  • the therapeutic agent or preventive agent for dementia of the present invention is administered to a patient diagnosed as dementia by a doctor, and in one or more of the above-mentioned diagnosis items for neurodegenerative diseases, the effect of improving compared to before administration, or It has the effect of suppressing or maintaining or recovering the degree of progression of the condition to the state before administration by administration.
  • the patient to which the therapeutic agent or preventive agent for dementia of the present invention is administered is a patient with dementia, particularly a tauopathy patient, among which Alzheimer's disease (AD), cortical basal ganglia degeneration (CBD or CBS), progressive supranuclear palsy, Pick's disease, granulopathic dementia (grossy silver granule disease), multiple system taupopathy dementia (MSTD), frontotemporal with parkinsonism linked to chromosome 17 Dementia (FTDP-17), neurofibrillary tangle dementia, chronic neurofibrillary tangle with calcification (DNTC), white matter tauopathy with globular glial inclusions (WMT-GGI) with tau positive inclusions Frontotemporal lobar degeneration (FTLD-tau), sequelae of economy encephalitis, subacute sclerosing panencephalopathy and fist encephalopathy Is any of the patient's blood.
  • AD Alzheimer's disease
  • CBD or CBS cortical basal
  • the therapeutic agent for dementia of the present invention is also a therapeutic agent or preventive agent for tauopathy.
  • AD Alzheimer's disease
  • CBD or CBS cortical basal ganglia degeneration
  • MSTD Multiple system tauopathy with dementia
  • FTDP-17 frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17
  • DNTC central nervous system
  • WMT-GGI white matter tauopathy with globular glial inclusions
  • WMT-GGI frontotemporal lobar degeneration with tau positive inclusions
  • Economo It can also be said that it is a therapeutic or prophylactic agent for encephalitis sequelae, subacute sclerosing panencephalopathy, fist encephalopathy and the like.
  • the therapeutic agent or preventive agent for dementia of the present invention has an effect of improving cognitive function in non-human animals, or suppressing or maintaining the decrease in cognitive function.
  • non-human animals include, but are not limited to, animals that express tau with high homology to human tau, chimpanzees, rhesus monkeys, horses, pigs, dogs, mice, rabbits, rats, cats, etc. .
  • Tg mice transgenic mouse
  • Animal models, such as Tg mice, that express genetic mutant tau are useful as models of genetic familial tauopathy, but may be therapeutic agents or sporadic drugs for sporadic tauopathy that predominate in humans. In order to see the effect of the preventive agent, it is desirable to show the effect in Tg mice expressing normal type tau.
  • the mouse prepared in the production example of the present invention is most suitable, but others include Kobe et al. (Neurobiology of Disease, Vol.42, P404-414). , 2011) and Kimura et al. (The EMBO J. vol.26. P5143-5152, 2007) can be used.
  • Kobe et al. Nerobiology of Disease, Vol.42, P404-414.
  • Kimura et al. The EMBO J. vol.26. P5143-5152, 2007
  • Cognitive dysfunction is observed after 14 months and 20 months of age, respectively. There is a possibility of including effects, and there are problems and effects of long-term rearing.
  • the mouse produced in the production example of the present invention expresses normal human tau and develops cognitive dysfunction relatively early as about 6 months of age. It is most suitable as a dementia model that can eliminate factors such as, and by using such a model, it is possible to evaluate a dementia treatment or prevention agent that has a clearer effect on improving cognitive function. .
  • a method of testing cognitive functions such as a memory learning test is desirable.
  • a method of testing cognitive functions such as a memory learning test.
  • Morris water maze test, step-through learning test, novel substance recognition test, etc. can be used, but Open Field Test is used to support conditions such as behavioral amount and animal anxiety. It is desirable to combine behavior measurement test methods such as
  • a method for examining the increase or decrease of tau protein or phosphorylated tau in brain tissue when administered to a model animal of dementia can also be used.
  • AD and other neurodegenerative diseases it is said that an increase in tau protein expression level and abnormal phosphorylated tau is associated with pathological conditions (Khalid Iqbal et al., Curr. Alzheimer Res., .7, p654-664, 2010). It is also known that cognitive function and motor function are improved by reducing the expression of tau and the amount of abnormal phosphorylated tau in some disease model animals (K. SantaCruz et al., Science, Vol. 309).
  • the effect of the therapeutic or prophylactic agent for dementia in the present invention in a model animal is used as pharmacological effect data in the development of a therapeutic or prophylactic agent in humans and the like.
  • the form of the therapeutic or prophylactic agent for dementia of the present invention contains an anti-phosphorylated tau antibody, and preferably at least one of amino acid residues corresponding to positions 410 to 421 of SEQ ID NO: 1 of tau protein.
  • One is an antibody that specifically undergoes an antigen-antibody reaction with phosphorylated tau protein, and one or more sites selected from amino acid residues corresponding to Ser412, Ser413, Thr414, and Ser416 of SEQ ID NO: 1 are phosphorylated.
  • An antibody that reacts with a tau protein by antigen-antibody reaction more preferably an antibody that competitively binds to an antibody whose amino acid sequence of VH is SEQ ID NO: 20 and whose amino acid sequence of VL is SEQ ID NO: 26 (1505), and more preferably Is an anti-tau protein phosphorylated at the amino acid residue site corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1.
  • Another form of the therapeutic agent or preventive agent for dementia of the present invention includes a peptide containing a part of the tau sequence and phosphorylated at one or more amino acid residues thereof.
  • a peptide containing 8 or more amino acids in length including amino acids more preferably a peptide containing 8 or more amino acids in length including at least 8 consecutive amino acids.
  • amino acid residue to be phosphorylated in the phosphorylated peptide is any one of the amino acid residues corresponding to amino acid numbers 410 to 421 of SEQ ID NO: 1, preferably the amino acids of Ser412, Ser413, Thr414 and Ser416 of SEQ ID NO: 1. Any one of the amino acid residues corresponding to, more preferably the amino acid residue corresponding to Ser413 of SEQ ID NO: 1.
  • the description of such a peptide is described in the above-mentioned [phosphorylated peptide having an amino acid sequence derived from tau].
  • the dementia therapeutic agent or preventive agent of the present invention may contain any pharmaceutically acceptable additive.
  • the formulation with pharmaceutically acceptable excipients is “REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION, University of the Sciences in Philadelphia, Williams & Wilkins, December 15, 2000 It is also possible to implement by the method described in “Japanese issue”.
  • One form of such a therapeutic or prophylactic agent is provided as a liquid prepared by dissolving, suspending or emulsifying in a sterile aqueous or oily liquid.
  • Such a solvent examples include distilled water for injection, physiological saline and the like, and in addition, an osmotic pressure regulator (for example, D-glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • an osmotic pressure regulator for example, D-glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • Appropriate solubilizers such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50), etc. are used in combination. Sometimes it is done.
  • An oily liquid may be used as the solvent.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent.
  • a buffer eg, phosphates buffer, acetates buffer
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin
  • preservatives eg, ascorbic acid, erythorbic acid and their salts
  • colorants eg, copper chlorophyll, ⁇ -carotene, red No. 2, blue No.
  • preservatives eg, paraoxy Benzoic acid esters, phenol, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, etc.
  • thickeners eg hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose and their salts
  • stabilizers eg human serum albumin, mannitol, sorbitol, etc.
  • flavoring Additives such as menthol and citrus flavors may be used .
  • Other forms of therapeutic or prophylactic agents include solid agents such as powders, tablets, granules, capsules, pills, suppositories, and lozenges.
  • excipients eg, crystalline cellulose, lactose, starch, etc.
  • lubricants eg, magnesium stearate, talc, etc.
  • binding Agents hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, macrogol, etc.
  • disintegrating agents eg, starch, carboxymethylcellulose calcium, etc.
  • additives such as preservatives (for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, etc.), antioxidants, coloring agents, sweeteners, and the like can be used.
  • preservatives for example, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, etc.
  • antioxidants coloring agents, sweeteners, and the like
  • coloring agents sweeteners, and the like
  • sweeteners and the like
  • Thickeners, thickeners, etc. e.g. mucin, agar, gelatin, pectin, carrageenan, sodium alginate, locust bin gum, xanthan gum, tragacanth gum, gum arabic, chitosan, pullulan, waxy starch, sucralfate, cellulose and the like
  • Derivatives for example, hydroxypropylmethylcellulose, polyglycerin fatty acid ester, acrylic acid (meth) acrylic acid alkyl copolymer, or a salt thereof, polyglycerin fatty acid ester, etc.
  • Therapeutic or prophylactic form and solvent Additives are not limited to, it can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the therapeutic agent or preventive agent for dementia in the present invention also includes a therapeutic agent or prophylactic agent containing a substance having an effect of suppressing the progress of existing dementia in addition to the above-mentioned anti-phosphorylated tau antibody or phosphorylated peptide. It is.
  • the therapeutic agent or preventive agent for dementia in the present invention includes a therapeutic agent or prophylactic agent containing the above-mentioned anti-phosphorylated antibody or phosphopeptide and a treatment containing a substance having an effect of suppressing the progress of existing dementia.
  • a kit for the combined use of an agent or a prophylactic agent is also included.
  • substances that suppress the development of dementia include, but are not limited to, donepezil, galantamine, memantine, and rivastigmine.
  • a dose of a therapeutic agent or a preventive agent containing a substance having an effect of suppressing the development of dementia or a substance having an effect of suppressing the development of dementia the dose used for usual treatment may be used. However, it can be increased or decreased depending on the situation.
  • the antibodies used in the examples of the present invention show a medicinal effect by acting in the brain through the cerebrovascular barrier even by peripheral administration such as intraperitoneal administration.
  • a preparation for efficiently supplying anti-phosphorylated tau antibody used for the therapeutic agent or preventive agent for dementia in the present invention to brain tissue, and such a formulation is also a therapeutic agent for dementia of the present invention.
  • Known methods for efficiently supplying antibodies, peptides, and the like to brain tissue through the cerebrovascular barrier include a method of adding a targeting substance and a method of encapsulating in liposomes or nanoparticles.
  • Peptides, proteins, or compounds that have characteristics that bind to specific receptors, transporters, etc., as substances for targeting that change the overall or partial charge characteristics by binding to antibodies Can be used.
  • Examples of peptides, proteins or compounds that have the property of binding to specific receptors, membrane proteins, etc. include receptor ligands, ligands that bind to membrane proteins and their analogs, receptor ligands and membrane proteins.
  • receptor ligands and membrane proteins that are targets of peptides, proteins or compounds that have the property of binding to specific receptors and transporters include transferrin receptor (TfR), insulin receptor (IR), Insulin-like growth factor receptor (IGFR), LDL receptor-related protein (LRP), diphtheria toxin receptor (HB-EGF), and the like, but are not limited thereto (Angela R. Jones et al., Pharm .Res., 24, p1759-1771, 2007).
  • the targeting substance can be chemically added to the antibody used in the therapeutic agent or preventive agent for dementia of the present invention.
  • a known method such as a bioconjugate such as Hermanson is used.
  • a targeting substance may be bound to a liposome or nanoparticle including an antibody or a peptide (Sonu Bhaskar et al., Particle and Fiber Fibrous Toxicology, Vol. 7, No. 3, 2010).
  • the targeting substance when it is a peptide or protein, it can be produced as a fusion peptide by peptide chemical synthesis, or a nucleic acid consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of the peptide or protein can be used for the antibody or peptide used.
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding an amino acid sequence
  • the therapeutic agent or prophylactic agent in the present invention can be administered orally or parenterally for the purpose of improving symptoms.
  • dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solutions, syrups, emulsions or suspensions, and elixirs can be selected.
  • parenteral administration for example, a nasal agent can be used, and a liquid agent, a suspension agent, a solid preparation and the like can be selected.
  • Another form of parenteral administration can be an injection, which includes subcutaneous injections, intravenous injections, infusions, intramuscular injections, intraventricular injections or intraperitoneal injections, etc. Can be selected.
  • parenteral administration examples include suppositories, sublingual agents, transdermal agents, transmucosal agents other than nasal agents, and the like. Furthermore, it can also be administered locally to a blood vessel in such a manner that it is contained or applied to a stent or an intravascular embolic agent.
  • the dose of the therapeutic agent or prophylactic agent in the present invention varies depending on the age, sex, weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition, etc.
  • the main agent can be administered in the range of 0.1 mg to 1 g, preferably in the range of 0.5 mg to 200 mg, once per adult.
  • a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be required.
  • the therapeutic agent or prophylactic agent in the present invention can obtain an effect in a short administration period.
  • the pSer413 (S) peptide was synthesized, purified by HPLC, and covalently bound to KLH (Keyhole® Limpet® Hemocyanin).
  • the obtained conjugate was used for one immunization of 0.1 mg per rabbit.
  • the first immunization was performed by mixing 0.2 mL of the conjugate solution (conjugate concentration 0.5 mg / mL) with the same amount of Freund's complete adjuvant, and shaving the back of a white Japanese rabbit to 50 ⁇ L at 8 locations. This was done by intradermal injection.
  • Freund's incomplete adjuvant was used and the same immunizations were performed twice every two weeks.
  • the serum antibody level was confirmed by the following method.
  • the pSer413 (S) peptide was diluted to 5 ⁇ g / mL with PBS, dispensed at 100 ⁇ L / well on the plate, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. After removing the solution, blocking buffer (manufactured by MBL) was dispensed at 250 ⁇ L / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. Diluted series of pre-immune rabbit serum and post-immune rabbit serum 100, 500, 2500, 12,500, 62,500 times, blank, diluted with PBS, added at 100 ⁇ L / well, and 60 ° C. at 25 ° C. Reacted for 1 minute.
  • an anti-rabbit IgG-peroxidase label (MBL) diluted 8000 times with diluted Buffer (MBL) was added at 100 ⁇ L / well and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
  • 100 ⁇ L / well of a color developing solution (MBL) was added, color was developed for 3 to 10 minutes, and 2N sulfuric acid was added at 100 ⁇ L / well to stop the reaction. After the reaction was stopped, the absorbance was measured at a measurement wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 620 nm.
  • pSer413 (L) peptide [Pser413 (S) peptide (underlined) further extended in the N-terminal and C-terminal direction (SEQ ID NO: 33, synthesized by Biosynthesis): N- ProArgHisLeuSerAsnValSer (pSer) ThrGlySer IleAspMetValVal Alternatively, NonP (L) peptide (SEQ ID NO: 34, synthesized by Biosynthesis), which has the same amino acid sequence but is not phosphorylated at the site corresponding to Ser413, is diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS and then added to the plate at 50 ⁇ L / well.
  • blocking buffer (3% BSA-PBS) was dispensed at 250 ⁇ L / well and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour or longer.
  • the purified antibody was diluted with PBS, and the serialized product was added at 50 ⁇ L / well and reacted at 25 ° C. for 90 minutes.
  • goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase label (Bioscience) diluted 2,000 times with diluted Buffer (3% BSA-PBS) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at 25 ° C. for 60 minutes. It was.
  • the purified antibody was highly specific for the pSer413 (L) peptide and hardly reacted with the nonP (L) peptide. Therefore, the antibody is an antibody that specifically reacts with pSer413 (L) in an antigen-antibody reaction (in this specification, it may be referred to as “pSer413-recognized rabbit polyclonal antibody” or “pS413AB”).
  • Example 2 Production of monoclonal antibody (Ta15 series) against pSer413 peptide
  • the amino acid residue corresponding to the 413rd Ser of the amino acid sequence of human tau protein shown in SEQ ID NO: 1 was phosphorylated at the 403rd Thr.
  • a synthetic peptide pSer413 (Im) peptide (SEQ ID NO: 35) with GlyCysSerGly attached to the N-terminal site of the sequence corresponding to the 423th to 423th Pro was used.
  • the pSer413 (Im) peptide was synthesized and then purified by HPLC, and covalently bound to KLH (Keyhole Lime Hemocyanin).
  • the obtained conjugate was used for one immunization of 0.04 mg per mouse. Immunization was performed by mixing 0.4 ml of the conjugate solution (1.1 mg / ml in terms of peptide) with 0.7 mL of complete saline and 1.1 mL of Freund's complete adjuvant, and injecting intraperitoneally into 10 mice at 200 ⁇ L. Similar immunizations (the same immunization site and antigen amount were used, but Freund's incomplete adjuvant was used) were performed three more times every two weeks.
  • spleen cells was further crushed with a rubber plug surface, suspended in cold RPMI 1640 medium and filtered in the same manner, and the filtrate was collected. Finally, cold RPMI 1640 medium (or cold PBS) was added so that the spleen cell suspension became 40 mL. The lymphocyte concentration in the suspension was measured with a hemocytometer, and lymphocytes corresponding to 2 ⁇ 10 7 cells were finally transferred to a 50 mL centrifuge tube.
  • a mouse myeloma cell P3X63Ag8 / U1 strain in the logarithmic growth phase corresponding to 4 ⁇ 10 7 cells cultured in the culture medium B (RPMI1640 + 10% fetal calf serum + 2 mM glutamine + 100 ⁇ g / mL streptomycin + 100 units / mL penicillin) (Abbreviated as P3 ⁇ U1) was added, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded. The cell pellet was well dispersed by tapping the test tube.
  • PEG solution polyethylene glycol solution
  • PEG solution polyethylene glycol solution
  • RPMI 1640 2.3 mL + polyethylene glycol 2000 (1.4 mL) + dimethyl sulfoxide (0.3 mL): hereinafter abbreviated as “PEG solution”.
  • PEG solution a polyethylene glycol solution
  • the cells were gently suspended. After 1 minute, 0.5 mL of PEG solution was slowly added dropwise over 1 minute, 1.0 mL of RPMI1640 was further added dropwise over 1 minute, and RPMI1640 was further added dropwise over 2 minutes over 2 minutes.
  • HAT / GIT culture solution (GIT medium [Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% fetal calf serum + 100 ⁇ g / mL streptomycin + 100 units / mL penicillin + 95 ⁇ M hypoxanthine + 0.4 ⁇ M aminopterin + 16 ⁇ M thymidine) was added dropwise over 2 minutes. 4 mL of HAT / GIT culture solution was added dropwise over 2 minutes. Finally, HAT / GIT culture solution was added to make a 40-50 mL cell suspension. After incubation in a thermostatic bath at 37 ° C. for 30 minutes, this was seeded on 7 culture plates (96 holes).
  • a mouse (ICR system) peritoneal macrophage (feeder cell) was cultured for several days (> 1 ⁇ 10 5 / well) 96 well plate (feeder plate). The plate was then cultured for 7-10 days at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the pSer413 (L) peptide was diluted with PBS to 1 ⁇ g / mL, dispensed into a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. After removing the solution, blocking buffer (3% BSA-PBS) was dispensed at 250 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour or longer.
  • Blocking buffer (3% BSA-PBS) was aspirated, and the hybridoma supernatant was added at 30-50 ⁇ L / well and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
  • PBS-Tween phosphate buffered saline
  • secondary antibody alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG-Fc antibody [SouthernBiotech] diluted 2000 times in blocking buffer
  • a substrate solution a solution in which 0.7 to 1.2 mg / mL PNPP [paranitrophenyl phosphate] was added to 2.5 M MgCl 2 -containing 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8 was added, After color development at 25 ° C. for 60 minutes, the absorbance was measured at a measurement wavelength of 405 nm.
  • Cells that were positive in this screening were removed from the cells, counted with a hemocytometer, seeded on a 96-well plate (former feeder plate) at 1 to 3 cells / well, and cloned by limiting dilution. (Ta1501, Ta1502, Ta1505 to 1509).
  • the clones were cultured in large quantities, and then the antibody was purified using a protein G column.
  • Ta1505 is the same as Ta1505-2.
  • the isotype was determined using an AbD serotec kit.
  • the purified antibody was reacted with an ELISA plate coated with partial peptides for various phosphorylation sites of tau, and the phosphate group specificity was examined.
  • the method was as follows.
  • Various tau peptides (pS46 [SEQ ID NO: 36], pS199 [SEQ ID NO: 37], pS202 [SEQ ID NO: 38], pT212 [SEQ ID NO: 39], pS214 [SEQ ID NO: 40], pT212 / pS214 [SEQ ID NO: 41], pT217 [ SEQ ID NO: 42], pS413 [SEQ ID NO: 33], non pS413 [SEQ ID NO: 34]) in 10% DMSO or peptide and BSA conjugate (pS400 [SEQ ID NO: 43] -BSA, pS412 [SEQ ID NO: 44])
  • a PBS solution of BSA was diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS (pH 7), added
  • Ta15 series reacted only with pSer413 among the peptides studied, and had extremely high phosphate group specificity.
  • One method of measurement is to immobilize an anti-mouse antibody (code # BR-1008-38) on a CM5 chip (chip with carboxymethyldextran layer, code # BR-1100-14) by covalent bond by amine coupling reaction ( code # BR-1006-33), the Ta15 series antibody was bound to the immobilized anti-mouse antibody, and the binding kinetics of the antigen peptide was measured for the bound Ta15 series antibody.
  • the reaction solution for specific binding was HBS-EP buffer (code # BR-T-1001-88), and the CM5 chip was N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N -Activated with a mixed solution of hydroxysuccinimide (NHS).
  • EDC N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride
  • NHS hydroxysuccinimide
  • one is a negative antibody (mouse IgG2a isotype control, R & D Systems, code # MAB003)
  • the other flow cell is a Ta15 series antibody, and each has a density of about 1000 RU.
  • HBS-EP buffer with 1M NaCl (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v / v Surfactant P20) reacted for 3 minutes and adsorbed nonspecifically
  • the antibody was removed and the HBS-EP buffer was reacted for 10 minutes at a flow rate of 50 uL / min to stabilize the baseline.
  • the peptide is serially diluted with HBS-EP buffer at a concentration of 100 pM to 5 mM (near the approximate binding dissociation constant [KD]), and the resulting peptide solution (5 concentrations) is continuously added from the low concentration side.
  • the reaction was carried out for 4 to 6 minutes (uniformly) with an interval of 6 minutes each, and the binding kinetics were measured.
  • binding kinetic data of the antigen peptide binding kinetic data by a non-phosphorylated peptide (non pSer413 peptide) was obtained as a negative peptide and subtracted from the binding kinetic data of the antigen peptide in order to eliminate the influence of noise caused by the manipulation. In addition, the binding of the non-phosphorylated peptide to the antibody is not observed at the measured concentration.
  • Specific binding kinetics data was fitted with Single cycle kinetics 1: 1 binding with drift model using Biacore analysis software (BIAevaluation: single cycle kinetic analysis, code # AP-4000-01), and kinetic association rate ( Ka) and dissociation rate (Kd) were obtained simultaneously (Karlsson.
  • Ta1505 antibody having the strongest affinity to the antigenic peptide was used for behavioral tests using memory-impaired mice.
  • Example 4 Production of monoclonal antibody recognizing pSer396 and / or pSer404 peptide
  • amino acid residues corresponding to Sers 396 and 404 in the amino acid sequence of human tau protein represented by SEQ ID NO: 1 are phosphorylated.
  • a synthetic peptide (SEQ ID NO: 47: synthesized by Biosynthesis) with GlyCys added to the N-terminal site of the sequence from the 379th Arg to the 408th Leu was used (hereinafter referred to as the pSer396 / pSer404 peptide).
  • pSer396 / pSer404 peptide N-GlyCys-ArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGluIleValTyrLys (pSer) ProValValSerGlyAspThr (pSer) ProArgHisLeuC47
  • the pSer396 / pSer404 peptide was purified by HPLC, and the resulting conjugate covalently bound with Maleimide activated KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) (Thermo Scientific) was about 0. 0 per Balb / c mouse. 04 mg was used for one immunization. Immunization was performed by mixing 0.3 mL of the conjugate solution (0.77 mg / ml in terms of peptide) and 0.3 mL of Freund's complete adjuvant and injecting 100 ⁇ L each into 4 mice. Two of them received intraperitoneal immunity (antigen amount was the same, Freund's incomplete adjuvant was used) and sole immunity (antigen + Titer Max adjuvant was used).
  • Immunization alone was performed twice more every two weeks. 15 days after the last immunization, the antigen solution (dissolved in Saline) was injected into the tail vein of mice with high serum antibody titers to the antigen and subjected to intraperitoneal immunization and sole immunization, and 3 days later. The animals were sacrificed and spleens were collected. Using two 18G injection needles, the spleen was loosened, and then the loosened spleen was gently crushed with a rubber stopper surface.
  • the crushed splenocytes were suspended in about 10 mL of cold RPMI 1640 medium, the supernatant was filtered with a 40 ⁇ m cell strainer, and the filtrate was collected in a 50 mL centrifuge tube. Debris of spleen cells was further crushed with a rubber plug surface, suspended in cold RPMI 1640 medium and filtered in the same manner, and the filtrate was collected. Cold RPMI 1640 medium (or cold PBS) was added so that the final spleen cell suspension was 40 mL. The lymphocyte concentration in the suspension was measured with a hemocytometer, and lymphocytes corresponding to 2 ⁇ 10 7 cells were finally transferred to a 50 mL centrifuge tube.
  • mouse myeloma cells P3 ⁇ U1 corresponding to 4 ⁇ 10 7 cells cultured in culture medium B (RPMI1640 + 10% fetal bovine serum + 2 mM glutamine + 100 ⁇ g / mL streptomycin + 100 units / mL penicillin)
  • culture medium B RPMI1640 + 10% fetal bovine serum + 2 mM glutamine + 100 ⁇ g / mL streptomycin + 100 units / mL penicillin
  • the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was discarded.
  • the cell pellet was well dispersed by tapping the test tube.
  • 0.5 mL of PEG solution was added to gently float the cells.
  • HAT / GIT culture solution (GIT medium [Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.] + 5% fetal calf serum + 100 ⁇ g / mL streptomycin + 100 units / mL penicillin + 95 ⁇ M hypoxanthine + 0.4 ⁇ M aminopterin + 16 ⁇ M thymidine) was added dropwise over 2 minutes. 4 mL of HAT / GIT culture solution was added dropwise over 2 minutes.
  • HAT / GIT culture solution was added to make a 40-50 mL cell suspension. After incubation in a thermostatic bath at 37 ° C. for 30 minutes, this was seeded on 7 culture plates (96 wells).
  • a culture plate a mouse (ICR system) peritoneal macrophage (feeder cell) was cultured for several days (> 1 ⁇ 10 5 / well) 96 well plate (feeder plate). The plate was then cultured for 7-10 days at 37 ° C., 5% CO 2 . Half of the culture broth was replaced with a fresh HT broth (HAT / GIT broth removed from aminopterin) every week to obtain hybridomas.
  • Non-phosphorylated peptide-BSA or pSer396 / pSer404 peptide-BSA was diluted with PBS to 1 ⁇ g / mL, dispensed into a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. After removing the solution, blocking buffer (3% BSA-PBS) was dispensed at 250 ⁇ L / well and left at room temperature for 1 hour or longer. Blocking buffer (3% BSA-PBS) was aspirated, and the hybridoma supernatant was added at 30-50 ⁇ L / well and reacted at 25 ° C. for 60 minutes.
  • a detection reagent (a solution in which alkaline phosphatase-labeled Protein A diluted 2,000-fold in blocking buffer) was added at 100 ⁇ L / well. And reacted at 25 ° C. for 60 minutes. After washing, 100 ⁇ L / well of a substrate solution (a solution in which 0.7 to 1.2 mg / mL PNPP [paranitrophenyl phosphate] was added to 2.5 M MgCl 2 -containing 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8) was added, After color development at 25 ° C. for 60 minutes, the absorbance was measured at a measurement wavelength of 405 nm.
  • a substrate solution a solution in which 0.7 to 1.2 mg / mL PNPP [paranitrophenyl phosphate] was added to 2.5 M MgCl 2 -containing 0.1 M Diethanolamine buffer, pH 9.8 was added, After color development at 25 ° C. for 60 minutes, the absorbance was measured at a measurement wavelength of 405 nm.
  • the escape time until reaching the platform was recorded as data. Mice that did not escape within 60 seconds were guided to the platform by the operator's hand, and the escape time was treated as 60 seconds. Mice on the platform were removed from the pool after 10 seconds and allowed to move freely until the next trial, allowing the body to dry. The average number of seconds of the escape time of 5 trials was used for the results of mice per day. When the results of the Control group (nonTg) were stabilized, the acquisition test was terminated, and the probe test was performed the next day. Probe test: The day after the last day, the platform was removed from the pool and a 60-second free swim was filmed with a video camera.
  • the video taken was observed and the time during which a free-swimming mouse was swimming in the quadrant where the platform was present among the four quadrants was measured and expressed as a percentage in 60 seconds. At this time, the same analysis was performed for swimming up to 30 seconds after putting the pool.
  • the significant difference test of the trial (acquisition) test was performed by repeated measure, Fisher's PLSD, and the significant test of Probe test was performed by Fisher's PLSD.
  • mice were given one 20 minute session. The mouse was placed in the center of the acrylic box, the door was quickly closed and the soundproof environment was established, and the session was started. The first half of the session was measured for free behavior under bright conditions, and the second half of the session was measured for free behavior under dark conditions with the lights off. Analysis: The amount of action per minute of the mouse is indicated by a line graph for each of locomation and rearing. When it can be confirmed that the behavior amount of the mouse has changed in response to the environmental change to the dark condition 10 minutes after the start of the session, the vision is defined as normal.
  • the total amount of action for each of the light condition and the dark condition, and the total action amount for 20 minutes are shown by a bar graph.
  • a significant difference test between groups was performed for the total amount of behavior of Locomation and rearing. Lomotion is mainly interpreted as self-issued movement amount, and rearing is mainly interpreted as exploration action amount, but in reality, both indicators influence each other (eg, even if locomation seems to be decreasing, at that time In fact, if rearing is increasing, it can't be said that the amount of action is decreasing).
  • a mouse anti-human synaptophysin antibody (SIGMA SVP-38 diluted 200-fold with TS containing 10% bovine serum) was mounted and treated overnight at 4 ° C. .
  • a FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (the antibody of VECTOR was diluted 20-fold with TS containing 10% bovine serum) was mounted and treated at room temperature for 60 minutes.
  • VECTASHIELD VECTOR
  • Example 6 Effect of administration of Ta1505 antibody on neuronal function Immunostaining of antisynaptophysin antibody in the hippocampal CA3 region, which is the center of memory of the effect of administration of Ta1505 antibody on the amount of synaptophysin known as a marker reflecting neuronal function We investigated by. The fluorescence intensity was quantified with NIH-Image J. The results are shown in FIG. Although not significant, administration of Ta1505 antibody showed a recovery in hippocampal synaptophysin levels.
  • Example 7 Determination of nucleotide sequence of Ta15 series monoclonal antibody cDNA (1) Purification of hybridoma total RNA Various monoclonal antibody-producing hybridomas were cultured, and cells were lysed using 1 mL of ISOGEN per well of a 6-well plate. To this solution, 0.2 mL of chloroform was added, mixed by vortexing, and allowed to stand at room temperature for 2 to 3 minutes. The mixture was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the upper layer was transferred to a new tube. To this, 0.5 mL of isopropyl alcohol was added, mixed, and left at room temperature for 10 minutes.
  • 5′-RACE and 3′-RACE cDNAs were synthesized using SMART-RACE Kit (Clonetech) and 5′-RACE and 3 ′. -Performed RACE.
  • PCR reaction was performed using Advantage 2 Polymerase Mix (manufactured by Clonetech) according to the attached protocol.
  • the PCR product obtained by 5′-RACE and 3′-RACE was subjected to agarose gel electrophoresis, the main amplified DNA fragment was excised from the agarose gel, inserted into a TA cloning vector (manufactured by Invitrogen), and transformed into Escherichia coli.
  • TA cloning vector manufactured by Invitrogen
  • antibodies diluted with PBS were administered intraperitoneally once a week for a total of 5 times, each time 0.1 mg per mouse.
  • PBS used for preparing the antibody or mouse IgG monoclonal antibody not reactive with tau was administered to the peritoneal cavity at the same dose.
  • PBS used in preparing the antibody was administered to the peritoneal cavity at the same dose against non-Tg literates.
  • Example 9 Change in brain phosphorylated Tau amount by administration of Ta 1505 antibody Regarding the hippocampal region, which is the center of memory, the effect of Ta 1505 antibody administration on the amount of phosphorylated Tau in the brain of Tau-Tg mice was recognized.
  • Antibody and AT8 antibody PHF recognition pSer202 / pThr205 epitope
  • 5 animals were selected from each group and fixed at reflux with 4% paraformaldehyde / PBS.
  • the brain was taken out and embedded in paraffin, and a 5 ⁇ m slice was prepared with a microtome.
  • the cells were treated with xylene and ethanol four times for 10 minutes each, deparaffinized, and the sections were boiled at pH 2 for 10 minutes at room temperature (antigen activation treatment). After returning to room temperature, it was washed twice with Tris-buffered saline (TS) for 10 minutes. Blocking was performed for 60 minutes at room temperature with TS containing 20% bovine serum. Anti-tau antibody (Ta1505, AT8) diluted to 1 ug / mL with TS containing 10% bovine serum was mounted and treated overnight at 4 ° C.
  • VECTOR biotin-labeled anti-mouse antibody
  • Control IgG group is a collection of fine brown dots and is stained in a thick line from left to right in CA3.
  • CA23 it is dyed in a thick curved shape from the upper right to the left.
  • Ta1505 administration group very light brown fine dots gather and are stained in a thick line from upper left to lower right in CA3.
  • CA23 it is dyed in a thick curved shape from the upper right to the left. Staining is hardly observed in 4 individuals of CA3 and 3 individuals of CA23.
  • the Cortex region peripheral cortex (first column from the left in FIG. 23), Lateral Cortex (second column from the left in FIG. 23), and media enteral cortex (from the left in FIG.
  • Ta1505-positive Tau that is, Ser413 phosphorylated Tau
  • the Cortex region Peririnal Cortex, Lateral Cortex, or Mediantal Cortex
  • FIG. 23 it is dyed in brown spots, but in FIG. 24, almost brown spots were not confirmed.
  • the Control IgG group is a collection of fine brown dots and is stained in a thick line from upper left to lower right in CA3.
  • CA23 it is dyed in a thick curved shape from the upper right to the left.
  • Ta1505 administration group very light brown fine dots gather and are stained in a thick line from upper left to lower right in CA3.
  • CA23 it is dyed in a thick curved shape from the upper right to the left.
  • the Cortex region peripheral cortex (first column from the left in FIG. 26), Lateral Cortex (second column from the left in FIG. 26), and medial entricular cortex (third column from the left in FIG. 26) of the control IgG administration group 5 individuals.
  • Example 10 Influence of brain Tau amount by administration of Ta1505 antibody AT8 antibody (pSer202 / pThr205-recognizing mouse monoclonal antibody, manufactured by INNAX), G2 (anti-human), which is considered to recognize hyperphosphorylated Tau constituting PHF Specific N-terminal region recognition antibody: rabbit polyclonal antibody), PHF1 (pSer396 / pSer404 recognition mouse monoclonal antibody that is thought to recognize hyperphosphorylated Tau constituting PHF) and Ta1505, and Tau in brain homogenate
  • the effect of 1505 antibody administration on the amount of hyperphosphorylated Tau was examined by Western blotting using Tau-Tg mouse brain homogenate after antibody administration.
  • the mouse cerebral hemisphere 100-200 mg was sonicated with 5 times the amount of TBS (containing protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail). This was centrifuged at 100,000 g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered as a TBS soluble fraction. The precipitate was further suspended in 1% sarcosyl / TBS (containing protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail) and incubated for 1 hour at room temperature. This was centrifuged at 100,000 g for 15 minutes at room temperature, and the supernatant was used as the sarkosyl soluble fraction.
  • TBS containing protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail
  • TBS soluble fraction and sarkosyl soluble fraction were separated by electrophoresis with 7% Tris-Acetate Gel, transferred to a PVDF membrane, and room temperature was measured with 1% BSA / 3% Skimmilk / 0.05% Tween20 / TBS. Blocked all night. Thereafter, the antibody solution was reacted, the HRP-conjugated antibody was used as the secondary antibody, the reaction was performed by the ECL method, and the analysis was performed by the LAS3000 image analyzer and quantified.
  • Tg mice expressing normal human tau as a model for cognitive impairment Examination of the pharmacological effect of the cognitive function improvement by the antibody of the present invention is that human normal type tau, especially 3R type tau is expressed in embryonic period, and both 3R type and 4R type tau are expressed with growth. Tg mice exhibiting the same expression pattern as human ontogenesis and having the characteristic of developing cognitive dysfunction at about 6 months of age were used. The Tg mouse was prepared by the following method.
  • the structure of the gene for the generation of Tg mice is as follows: the 5 ′ intron of Simian virus 40 (SV40), (0.3 kb), tau gene (Tau; downstream of the ⁇ calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII) promoter (8.5 kb). 7.3 kb), a tau gene donor nucleic acid having the structure shown in FIG. 17 arranged in the order of SV40 3 ′ intron (0.8 kb) and SV40 polyA signal (0.3 kb) was used.
  • the tau gene used therein was Yamashita T. et al. (FEBS Letter, Vol.
  • the Tau-Tg mice described as line 609 and line 784 described in the examples are mice produced by the same method and exhibit equivalent traits (or the description of line in the examples is deleted) ).

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Abstract

　本発明は、新規な認知症治療剤又は予防剤を提供することである。　本発明は、配列番号１のＳｅｒ４１３周辺がリン酸化されたタウタンパク質に対して特異的に抗原抗体反応をする抗体や、Ｓｅｒ４１３周辺がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する認知症治療剤又は予防剤等を提供する。

Description

認知症治療剤又は予防剤
　本発明は、認知症治療剤又は予防剤に関する。具体的には、本発明は、優れた認知機能を改善する効果を有する新規の抗リン酸化タンパク質又はペプチド抗体、及び抗リン酸化タウ抗体又は抗リン酸化タウ抗体を誘導しうる抗原を含有する認知症治療剤又は予防剤に関する。
　認知症とは、いったん発達した知能が何らかの後天的理由によって低下し、社会的な適応困難を呈する状態をいう。認知症性の疾患は、神経変性疾患、血管性認知症、プリオン病、感染性疾患、代謝・内分泌疾患、外傷及び脳外科疾患、中毒性疾患等に分類される（非特許文献１）。わが国においては２０１０年現在約２１０万名程度の認知症患者が存在し、６５歳以上の高齢者における有病率は８～１０％程度とも１０％以上ともいわれ、世界的な高齢化の流れの中で大きな問題と認識されている（非特許文献２）。認知症にける基礎疾患をみると、約３５％がアルツハイマー病（ＡＤ）、約１５％がＡＤと脳血管性の混合型、５％が前頭葉側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と変性疾患であるＡＤやＦＴＬＤ等の神経変性疾患が多くの割合を占めている（非特許文献２）。神経変性疾患による認知症は少なくとも６ヶ月以上の期間をかけて進行する記憶障害及び／又は人格変化の潜行性の発症によって特徴づけられる疾患である。認知機能の障害の程度に高い相関性がある神経変性の過程における一貫した特長は、神経原線維変化（ＮＦＴ）である（非特許文献３）。
　タウ（タンパク質）とは、ヒトでは第１７番染色体（１７ｑ２１）に存在するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされるタンパク質で、中枢系で多く発現している微小管結合タンパク質の一つである。タウは神経変性疾患の代表であるＡＤにおけるＮＦＴを構成するpaired helical filamentとstraight filamentの主要構成タンパク質であることが発見され、さらに種々の神経疾患において細胞内に蓄積することが明らかになった。このようなタウの細胞内蓄積が生じる疾患はタウオパチーと総称される（非特許文献４）。タウオパチーに含まれる神経変性疾患としては、アルツハイマー病 （ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Multiple system tauopathy with dementia（MSTD）、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（FTDP-17）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（DNTC）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（WMT-GGI）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（FTLD-tau）等があるが、神経変性疾患以外でもエコノモ脳炎後遺症や亜急性硬化性全脳症等の感染症によるもの、拳闘家脳症等の外傷によるものもタウオパチーに含まれる（非特許文献４）。
　ＭＡＰＴ遺伝子のゲノム上での構造は１３個のエクソンからなり、選択的スプライシングによって複数のアイソフォームとしてのタンパク質が発現される（非特許文献４）。また、タウの構造の特徴としては、エクソン２とエクソン３の選択的スプライシングに依拠する２９アミノ酸反復配列（Ｎ）が０～２個（Ｎ０～Ｎ２）となるＮ末端の酸性ドメイン、プロリンを多く含む中間ドメイン、及び微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を３個（３Ｒ）又は４個（４Ｒ）を含むＣ末端の微小管結合ドメイン（エクソン９から１２によってコードされる）からなる（非特許文献３及び４）。そのため、タウは、２９アミノ酸反復配列（Ｎ）と微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を含む数によって、３Ｒ０Ｎ（３５２アミノ酸）・３Ｒ１Ｎ（３８１アミノ酸）・３Ｒ２Ｎ（４１０アミノ酸）・４Ｒ０Ｎ（３８３アミノ酸）・４Ｒ１Ｎ（４１２アミノ酸）及び４Ｒ２Ｎ（４４１アミノ酸）の６種類が代表的なアイソフォームとされている。そのようなアイソタイプのうち、胎生期の脳においては３Ｒ０Ｎのみが存在するのに対し、成人のヒトの脳においては６つ全てのアイソタイプが存在するが、４Ｒ型が多く存在する（非特許文献３）。アイソタイプの３Ｒ型と４Ｒ型の違いはエクソン１０が選択的スプライシングによって除かれる（３Ｒ）か含まれる（４Ｒ）によって決まる。このようにタウにはいくつかのアイソフォームが存在するが、その対応する位置のアミノ酸番号を特定するため、一番長いアイソフォームである４Ｒ２Ｎ（配列番号１）におけるアミノ酸の番号（１～４４１）で表す。例えば、Ｓｅｒ４１３と記載した場合には、４Ｒ２Ｎ（配列番号１）では４１３番目のアミノ酸残基であるセリンを表すが、４Ｒ１Ｎ（配列番号２）では３８４番目、４Ｒ０Ｎ（配列番号３）では３５５番目、３Ｒ２Ｎ（配列番号４）では３８２番目、３Ｒ１Ｎ（配列番号５）では３５３番目、３Ｒ０Ｎ（配列番号６）では３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを表す。
　神経変性疾患におけるタウの関与は、最初１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）において、ＭＡＰＴ遺伝子の変異とタウの蓄積の関係から解明された経緯があり、ＦＴＤＰ－１７ではＭＡＰＴ遺伝子における４０種類以上の遺伝子変異が報告されている（非特許文献４）。このような遺伝子変異は、タウアイソフォームの比率の変化や変異タウの微小管への相互作用の変化が起こり、病態形成に関与している可能性が示唆されている。しかしながら、家族性の神経変性疾患と異なり、ＡＤ等孤発性の神経変性疾患では、ＭＡＰＴの変異が見られない場合が多い。また、神経変性疾患で蓄積するタウの特徴としては高度にリン酸化による修飾を受けているという特徴がある。また、軽度の認知機能障害を示す患者（ＭＣＩ）において髄液中のリン酸化タウの量と下垂体萎縮との間には相関が見られ、リン酸化タウはタウオパチーの患者での神経変性についての信頼性の高いバイオマーカーであると考えられている（非特許文献５）。そのため、タウのリン酸の過剰なリン酸化を抑制するためにリン酸化に関わる酵素であるキナーゼ、その中でも特にＧＳＫ－３βに対する酵素阻害剤を治療に使用する試みがされ、開発が行なわれている（非特許文献５）。しかしながらＧＳＫ－３β等のキナーゼは病態のみではなく、正常な生理作用においても機能制御に関連する酵素と考えられることから、副作用等が懸念される。事実、ＧＳＫ－３βによってタウがリン酸化される部位のうちのいくつかは、胎児や正常なヒトの脳で見られるタウのリン酸化部位と一致することから(非特許文献３)、正常なタウの機能に影響する可能性も考えられる。
　また、従来の考えでは細胞外に存在するタウは変性した神経細胞の細胞死によって細胞外に漏れだすと考えられていたが、最近の研究によるとタウは細胞内で過剰にリン酸化された後、プロセスを受けて細胞外に能動的に分泌されると考えられている。細胞外に分泌されたリン酸化タウは、一部のリン酸化部位で脱リン酸化を受けた上で、周辺の細胞のムスカリン受容体のM1およびM3に作用して、細胞内のタウリン酸化の亢進や細胞死の誘導などの作用に関与していると考えられている（非特許文献６、非特許文献７）。このように、タウが細胞外で作用する因子として働くと考えられるようになってきたことから、細胞内で作用させるのが難しい抗体などの高分子を薬効成分とする治療薬の可能性も重視されるようになってきた。しかしながら、上述のように細胞外に分泌されるタウは一部プロセスを受け、また脱リン酸化を受けるなど、今まで標的とされてきた過剰にリン酸化されたタウの構造情報からさらに変化を受けている可能性がある。さらに脱リン酸化されたタウの部分に対して作用する薬剤は正常のタウの機能にも影響する可能性も考えられる。抗体などで病態におけるタウを標的とする場合、どのような病態特異的な部位、つまりタウのリン酸化エピトープに作用するものを選ぶのかが重要になるが、このような複雑な情報があることによって、そのようなエピトープを選ぶのはさらに困難になっている状況といえる。
　タウに対する特異的な作用を目指した試みとして、タウタンパク質をターゲットとしたタウオパチーの免疫学的治療に関する発明が報告されている（非特許文献５、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。免疫学的治療とは、ペプチドワクチンなどを投与することにより、特異的な抗体の産生を誘導することを目的に行なわれるもので、標的タンパク質又はペプチドに対する特異性の高さから副作用の低減が期待される。このような取り組みとして、リン酸化されたタウの部分ペプチド（Ｓｅｒ３９６及びＳｅｒ４０４に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの、並びにＳｅｒ２６２に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの）を用いたワクチンにより変異タウを発現する動物モデルを免疫することによって、当該モデル動物の運動機能改善等を改善したことを報告している。しかし、これらの報告ではＰ３０１Ｌ（タウの３０１番目のアミノ酸残基であるプロリンがロイシンに変化する変異）等の遺伝子変異を導入したトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）を用いた検討であり、当該ｔｇマウスは家族性の神経変性疾患の一つであるＦＴＤＰ－１７についての遺伝子変異モデルではあるものの、タウオパチーに含まれるタウ遺伝子変異を伴わない神経変性疾患の多くのもの、特に孤発性の神経変性疾患の病態を表しているわけではない。また、Ｐ３０１Ｌｔｇマウスは、運動機能障害のモデルであり、ヒトの認知症等で問題になる認知機能の障害を表すモデルではないため（非特許文献８）、この動物モデルでの結果によってヒトの認知症の治療に適応できるかを知ることは困難である。特許文献４では、Ｓｅｒ４０９がリン酸化されたタウペプチドに抗原抗体反応する抗体を投与して、タウオパチーの治療に関する効果をみている。しかしながら、高価なペプチドワクチンとしては全投与量が多く、また効果が現れるまでの期間が長い。また、ペプチドワクチンの効果は、投与されたヒトや動物の免疫応答の反応性が遺伝的背景によって異なり、全ての個体で有効に抗体産生を誘導できるとは限らない。そのため、抗体による受動免疫による免疫療法を用いることが考えられるが、タウにおけるリン酸化を受ける部位は非常に多数存在し、その中のどのリン酸化部位に対する抗体を用いることが有効であるかの情報はほとんど存在しない。また、現在存在する抗体での動物モデルでの効果を見ても、治療に用いるために十分な機能を有しているとは考えられない。
　さらに、抗体を治療剤又は予防剤の主剤として用いる場合、副作用の回避や医療経済的な問題から治療に用いられる抗体量についても留意が必要であり、特に慢性疾患や遺伝疾患などでは投与量については重要な課題となる。たとえば、ヒト抗IL-6R抗体であるアクテムラ（登録商標）（トシリズマブ）の治療での用量は体重１ｋｇあたり8mgで１～4週間隔に投与され、ヒト化抗補体C5抗体であるソリリス（登録商標）（エクリズマブ）の治療に用量は、1回に成人一人当たり600～900mgで2週から4週毎に投与される。これらは多くの抗体の中から選ばれて開発された優秀な抗体であるが、用量としては現状用いられている抗体医薬品の中では多いほうである。したがって、今後開発される抗体医薬品においてもこれらと同等以下の用量での効果が必要となる。さらに、ADなど認知症での治療対象となる臓器は脳になるが、静脈内や皮下での投与など全身投与を行う場合には、脳血管関門の存在によって血中から脳への抗体の移行率は低いといわれるため、認知症治療に用いられる抗体はほかの臓器の疾患を対象とする場合と比較して薬理効果が期待しにくく、大きな課題が存在する。
　ヒトの認知症においては、中心となる症状は記憶障害と認知機能の障害であり、特に認知機能は記憶に基づいて判断、コミュニケーション、遂行機能を発揮するために重要な機能であることから、認知症における症状として重要な位置をしめている。一方、運動機能については、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）や末期のアルツハイマー病において認められる症状ではあるものの、必ずしも認知症において示す中心となる症状ではない。したがって、認知症の治療を考える場合においては、認知機能を改善することが中心の課題となる。しかしながら、現状においてはそのような課題を解決するために必要な、タウオパチーによる認知機能障害の適切な動物モデルを用いて優れた認知機能改善効果を示す認知症治療剤又は予防剤を取得することができる方策は示されておらず、また、認知症に特異的で優れた効果を示す認知症治療剤又は予防剤は存在しない。
　したがって、以上のような状況から、特に認知機能の改善に対して強い効果を有する治療剤又は予防剤が求められている。
ＵＳ８０１２９３６ ＷＯ２０１０／１４２４２３ ＷＯ２０１０／１４４７１１
岸本年史、高橋茂樹編、STEP　Series　精神科　第2版、P103～104、海馬書房、2008年 浅田隆、別冊医学のあゆみ「認知症」、ｐ５～１０、医歯薬出版、2011年 Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P４０８～４６４、2005年 新井哲明、神経内科、72巻特別増刊号（Suppl.6）、P４６～５１、2010年 Wendy　Nobleら、Expert Opin. Drug Discov.、６巻８号、P７９７～８１０、2011年 Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry、２８５巻、P３２５３９－３２５４８、2010年 Venessa Plouffeら、PLoS ONE、７巻、P３６８７３、2012年 Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P４５９、2005年
　本発明の目的は、タウオパチーでのタウリン酸化に着目し、認知症治療剤又は予防剤を提供することである。
　また、本発明は、Ｓｅｒ４１３周辺に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに対して特異的に抗原抗体反応する抗体や、Ｓｅｒ４１３周辺のアミノ酸配列を有し少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する認知症治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、高い認知機能改善効果を有するモノクローナル抗体を提供し、さらにそのモノクローナル抗体の構造の解析からヒト化抗体等の、さらに認知症治療に適した抗体の作製方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下に示すものである。なお、本発明におけるタウタンパク質は、４Ｒ２Ｎだけでなく、全６種類のアイソフォームを含む意味である。また、本発明におけるアミノ酸残基の位置は、便宜上、配列番号１に示すものを基に特定しているが、例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基と表現した場合には、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３番目のセリン、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４番目、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５番目、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２番目、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３番目、又は配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを意味する。
（１）配列番号１で示されるタウタンパク質の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
（２）該抗体が、認知症に特徴的なリン酸化を受けたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、（１）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（３）該抗体が、Ｓｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（４）該抗体が、タウタンパク質に対する結合において、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体と結合競合する抗体である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（５）該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（６）該抗体が、Ｓｅｒ４１３の部位に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（７）該抗体が、配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＨ鎖のＣＤＲ配列、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＬ鎖のＣＤＲ配列を有する抗体である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（８）該抗体が、配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＬ鎖可変領域を有する抗体である、（１）～（７）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（９）該抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、（１）～（８）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１０）配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を含むペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
（１１）該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基の少なくとも一つが、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、又はＳｅｒ４１６のアミノ酸残基に相当するペプチドである、（１０）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１２）該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基が、少なくとも配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である、（１０）又は（１１）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１３）認知症が、タウオパチーである、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１４）タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔａｕｏｐａｔｈｙ　ｗｉｔｈ　ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う蛋白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）である、（１３）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１５）配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該ペプチドに含まれる配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドに、抗原抗体反応するモノクローナル抗体。
（１６）リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体との間で抗原への結合が競合的である抗体。
（１７）リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体。
（１８）配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＨ鎖、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＬ鎖を有するモノクローナル抗体。
（１９）配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性を有するＬ鎖可変領域を有するモノクローナル抗体。
（２０）抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、（１５）から（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（２１）配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列からなるペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチド。
（２２）配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及び
Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化されたことを特徴とする、（２１）に記載のペプチド。
（２３）リン酸化されたアミノ酸残基が、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である（２１）又は（２２）に記載のペプチド。
　本発明は、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基周辺がリン酸化されたタウに対して特異的に抗原抗体反応する抗体や、配列番号１のＳｅｒ４１３周辺のアミノ酸配列を有し少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有することによって、認知症治療剤又は予防剤を提供することができる。
　また、本発明は、高い認知機能改善効果を有するモノクローナル抗体を提供し、さらにそのモノクローナル抗体の構造の解析からヒト化抗体等のさらに認知症治療に適した抗体の作製方法を提供するものである。
ヒトタウタンパク質のアイソフォームの前半のアミノ酸配列をClustalWで並べたものを示す図である。 ヒトタウタンパク質のアイソフォームの後半のアミノ酸配列をClustalWで並べたものを示す図である。 ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の特異性を示す図である。 ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である。 ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である。 ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである。 ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである。 ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である（Ｔａ１５０５）。 ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である（Ｔａ１５０５）。 ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである（Ｔａ１５０５）。 ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである（Ｔａ１５０５）。 ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である（Ｔａ９）。 ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である（Ｔａ９）。 ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである（Ｔａ９）。 ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである（Ｔａ９）。 Ｔａ１５０５抗体を投与したモデルマウスの海馬シナプトフィジン量を示す図である。 タウ遺伝子が含まれる遺伝子断片を表す図である。 Ｔａ１５０５抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の水迷路Ｔｒｉａｌ試験の結果を示すグラフである。 Ｔａ１５０５抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の水迷路Ｐｒｏｂｅ試験の結果を示すグラフである。 Ｔａ９抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の水迷路Ｔｒｉａｌ試験の結果を示すグラフである。 Ｔａ９抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の水迷路Ｐｒｏｂｅ試験の結果を示すグラフである。 コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）又はＴａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬ＣＡ３領域及びＣＡ２３領域の免疫組織染色を示す写真である。 コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。 Ｔａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。 コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）又はＴａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬ＣＡ３領域及びＣＡ２３領域の免疫組織染色を示す写真である。 コントロール抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。 Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。 Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、ＴＢＳ可溶性脳分画中のＧ２、ＡＴ８、ＰＨＦ１及びＴａ１５０５の反応性Ｔａｕ量を示すグラフである。 Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）の、ザルコシル可溶性脳分画中のＧ２、ＡＴ８、ＰＨＦ１及びＴａ１５０５の反応性Ｔａｕ量を示すグラフである。
　本発明者らは、ＡＤで特異的にリン酸化される部位である配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに特異的に抗原抗体反応をする抗体を作製し、成熟に伴い認知機能障害を発症するｔｇマウスに投与したところ、対象群とほぼ同じ程度まで認知機能が回復できることを見出した。一方、同等の抗原に対して本発明の抗体よりも強い親和性を有する配列番号１のＳｅｒ３９６に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに対する抗体を、同様の濃度で用いて比較したところ、充分な認知機能の改善がみられなかった。配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部分は、タウの構造と機能との関係においては特に情報が無い領域であり、この部分に対して特異的に抗原抗体反応する抗体がこのような強い認知機能の改善効果を有することは全くの予想外の結果であった。従って、今まで注目をされていなかった、この配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部位は、タウオパチーにおいて認知機能障害の発症に重要な部位であることが本発明によって初めて解明され、本発明に至った。
　[抗リン酸化タウ抗体]
　本発明におけるタウ（タンパク質）とは、配列番号１～６に示したヒトタウタンパク質に加えて、それらの遺伝子変異体を含む。上記の背景技術で示したように、認知症に関連する家族性神経変性疾患であるＦＴＤＰ－１７では、４０箇所以上の変異が知られているが、変異の部位においてはそれに限定されるものではない。また、変異の数は配列番号１～６に対して１から５０箇所、好ましくは１から３０箇所、より好ましくは１から１０箇所のアミノ酸の変異があるものも本発明でのタウとして扱われる。さらに、配列番号１に示したヒトのタウタンパク質に対してＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で８０％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を示すタンパク質及びそのアイソフォームも含まれる。そのようなものには、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット等ヒト以外の種におけるタウが含まれ、そのような動物の認知機能改善の目的でそのようなタウを標的とした治療剤又は予防剤の作製も可能である。
　また、本発明におけるアミノ酸番号、すなわちアミノ酸残基の位置は、便宜上、配列番号１に示すものを基に特定する。従って、例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基と表現した場合には、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３番目、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４番目、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５番目、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２番目、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３番目、又は配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを意味する。表１に、各アイソフォームにおいて互いに同位置にあるアミノ酸残基の位置を示す。なお、表１では、配列番号１の４１０～４２１に相当する各アイソフォームでのアミノ酸残基の位置を示しているが、これ以外の位置に存在するアミノ酸残基の互いの位置関係については、例えば、図１及び図２に基づいて容易に理解することができる。
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　抗リン酸化タウ抗体とは、上に示したタウにおけるアミノ酸配列のうち１箇所以上のアミノ酸残基がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体をいう。リン酸化されるアミノ酸残基としては、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）等が挙げられる。また、本発明の抗リン酸化タウ抗体が抗原抗体反応するリン酸化タウの部位としては、ＡＤ等の神経変性疾患で特異的にリン酸化される部位が望ましい。また、本発明の抗リン酸化タウ抗体が抗原抗体反応するリン酸化タウでの部位の別の望ましい形態としては、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウの抗原抗体反応する抗体であり、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基、又は両方の部位がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体であり、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体である。ここで、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基とは、ヒトの４Ｒ２Ｎタウ（配列番号１）でのアミノ酸番号に相当する部位を指すが、上述の背景技術に記載したようにアイソフォームにおける対応する部位、またヒト以外の相同体に対応する部位についても、そのアミノ酸配列から付けられるアミノ酸番号に関わらず、同様に扱われるものとする。そのようなアイソフォームや相同体での対応部位を理解するためには、当業者であればNeedleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignment による方法や、ClustalW法やPRRP法等のMultiple Sequence Alignmentによって、適宜解析して理解することができる。対応部位の解析方法の１例として図１及び図２にヒトでの６種類のアイソフォームのアミノ酸配列（１文字表示）をClustalWで並べたものを示す。これを見れば６つのアイソフォームにおいて配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基周辺の構造が保存されていて、対応するアミノ酸がいずれであるかを容易に理解できる。
　本発明の治療剤又は予防剤で用いることができる抗リン酸化タウ抗体とは、配列番号１のタウタンパク質の４１０位から４２１位に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と特異的に抗原抗体反応する抗体であり、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に特異的に抗原抗体反応する抗体であり、より望ましくはＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である抗体（以下、「１５０５抗体」ともいう。）と競合結合する抗体であり、さらに望ましくはＳｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質に特異的に抗原抗体反応する抗体である。配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質とは、前述のようにヒト又は他の種でのアイソタイプを含めて対応する部位がリン酸化されたタウタンパク質を表すが、より好ましくはヒトのタウタンパク質であり、より好ましくはヒトでの６つのアイソフォームのうちのいずれかである。
　また、本発明における配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質には、タウタンパク質の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基のアミノ酸配列の一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドであって、該当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドもそのようなリン酸化タウタンパク質に含まれ、そのようなペプチドと特異的に抗原抗体反応する抗体も、本発明での抗リン酸化タウ抗体である。
　本発明において「抗原抗体反応する」とは配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、及び／又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に対して、平衡解離定数（ＫＤ）が１×１０－６Ｍ以上の親和性で結合すること、望ましくは平衡解離定数１×１０－７Ｍ以上の親和性で結合すること、さらに望ましくは平衡解離定数１×１０－８Ｍ以上の親和性で結合することをいう。
　また、「特異的に」とは配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、及び／又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に対する結合が、当該部位がリン酸化されていないタウタンパク質（タウタンパク質のアミノ酸配列の一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドを含む）に対する結合より１０倍以上強い、望ましくは３０倍以上強い、さらに望ましくは１００倍以上強い状態をいう。
　さらに、ＶＨ配列のアミノ酸配列が配列番号２０、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である抗体（１５０５抗体）と「競合結合する」とは、当該モノクローナル抗体が抗原に結合する際に他の抗体を共存させたときに、当該モノクローナル抗体の結合が阻害される現象を意味し、一般的には一定量(濃度)の当該モノクローナル抗体に対して、量（濃度）を変えて別の抗体を加えていった際に、当該モノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定が可能であり、その阻害の程度はＩＣ５０又はＫｉという値で表すことができる。本発明でのＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０であり、ＶＬの配列が配列番号２６である抗体（１５０５抗体）と競合結合する抗体とは、当該モノクローナル抗体１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ５０が１μＭより低い値のものをいい、さらに望ましくは１００ｎＭより低い値のものをいい、さらに望ましくは１０ｎＭより低いものをいう。
　このような抗体のリン酸化タウタンパク質への抗体抗原結合は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能であり、そのような方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ法、ＬＲＥＴ法等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原（リン酸化タウタンパク質又はタウタンパク質）を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
　また、本発明の抗リン酸化タウ抗体としては、Ｈ鎖可変領域がＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号７又は８、ＣＤＲＨ－Ｈ２のアミノ酸配列が配列番号９、１０、１１及び１２のうちから選択されるいずれかとＣＤＲＨ－Ｈ３のアミノ酸配列が配列番号１３の組合せからなる、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖可変領域が、ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号１４又は１５、ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号１６、及びＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列が配列番号１７の組合せからなるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む抗体も含まれる。好ましくは、Ｈ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３のセットが、配列番号７、配列番号９及び配列番号１３；配列番号８、配列番号９及び配列番号１３；配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３；配列番号８、配列番号１２及び配列番号１３；並びに配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３；の組合せから選択されるいずれかであり、Ｌ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３のセットが、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；又は配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７である抗体、より好ましくはＨ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３のセット、並びにＬ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３のセットの組合せが、配列番号７、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；並びに、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の組合せから選択されるいずれかである抗体である。ここで、これらのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、又はＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列のうち、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つがＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で配列番号７から１７のいずれかと８５％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）、好ましくは９０％以上の相同性を示す配列であるものも、本発明の抗体に含まれる。
　ここで、抗体におけるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、又はＣＤＲ－Ｌ３の配列を同定する方法としては、例えばＫａｂａｔの方法やＣｈｏｔｈｉａの方法を用いることで、当業者は各ＣＤＲに対応する部分の配列を同定することが可能であり、Ｋａｂａｔ（Kabat,E.A. and Wu,T.T.、 J. Immunol., 147, 1709-1719、1991年）やＣｈｏｔｈｉａ（Al-Lazikani,B., Lesk,A.M. and Chothia,C.、J. Mol.Biol., 273，927-948、1997年）の方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばDr. Andrew C.R. Martin’s Groupのホームページ（http://www.bioinf.org.uk/abs/）から概要を知ることも可能である。
　本発明における抗体の別の形態としては、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号１８から２４から選択されるいずれか、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号２５から３０から選択されるいずれかである抗体であり、好ましくはＶＨとＶＬのアミノ酸配列の組合せが、配列番号１８と配列番号２５、配列番号１９と配列番号２６、配列番号２０と配列番号２６、配列番号２１と配列番号２７、配列番号２２と配列番号２８、配列番号２３と配列番号２９、及び配列番号２４と配列番号３０の組合せから選択されるいずれかである抗体である。ここで、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の少なくとも片方が、配列番号１８から２４に示したいずれかのＶＨのアミノ酸配列又は配列番号２５から３０に示したＶＬのいずれかのアミノ酸配列、及びＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で配列番号１８から３０と８５％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）、好ましくは９０％以上の相同性を示す配列であるものも、本発明の抗体に含まれる。
　この抗体において、定常領域のアミノ酸配列は哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤの各サブタイプ又はその変異体から選ばれる。
　上記のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、当業者であればヒト化抗体等、目的の種に治療目的で投与するのに適した組換え体抗体をデザインすることが可能であり、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、当業者であれば目的に応じたキメラ抗体等をデザインすることができる。また、さらにＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報や、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作製することは、公知の技術を用いることで、当業者であれば適宜実施することができる。
　本発明における抗体は、Ｈ鎖及びＬ鎖が各２本によって構成される抗体であってもよく、Ｈ鎖が２本のみで構成される抗体であってもよい。また、本発明の抗体は、抗体の断片であってもよく、そのような抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の構造が例示できる。
　本発明における抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明における抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体(ミルスタイン（Milstein）等、ネイチャー（Nature）（England）1983年10月6日発行、305巻5934号、p.537～540)であることができる。例えば、ポリクローナル抗体は配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のタウタンパク質の４１０位から４２１位のアミノ酸配列の少なくとも一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドであって、該当するアミノ酸がリン酸化されたペプチドを抗原として哺乳動物に感作し、当該動物の血清等から回収することができる。また、ペプチドを抗原として用いる場合には、ＢＳＡやＫＬＨ等のキャリアタンパク質やポリリジン等に結合させた形態での抗原を用いることができる。また抗原として用いるペプチドの具体的例としては、実施例１及び２に記載のように、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当する部位がリン酸化された配列番号３１又は３２のペプチドを用いることができるが、これに限定されるものではない。当該発明におけるモノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞等と細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することができる。そのようなモノクローナル抗体の取得方法としては、実施例２に記載されており、それによって得られたモノクローナル抗体としては配列番号１８から２４のＶＨアミノ酸配列、配列番号２５から３０のＶＬ配列を有するモノクローナル抗体（Ｔａ１５０１、１５０２、１５０５～１５０９）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　得られたモノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。当該抗体の遺伝子情報はH鎖、L鎖、それらの可変領域はCDR配列などの情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物としてヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト－トランスジェニック動物を用いることによって、ヒト型のモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の抗原結合領域またはその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる。（例えば、Taketo Tanaka等、Keio J. Med., 60巻、p37-46のレビューなどを参照。）
　また、前述のモノクローナル抗体を製造する方法としては、それぞれ取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。また、別の製造方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマやヒト抗体ファージディスプレイで得られたファージクローン等から抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖をコードする遺伝子を取得して、該遺伝子を発現するためのベクターを作製し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖の可変領域又はCDR領域の構造情報を用いてヒト型化抗体、抗体キメラタンパク質、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作製することは、公知の技術を用いることで当業者であれば実施することができる。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
[タウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチド]
　本発明には、タウのアミノ酸配列の一部を含み、その１つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドも含まれる。アミノ酸残基がリン酸化されたとは、アミノ酸残基の側鎖に対してリン酸基がエステル結合した状態をいい、リン酸化されるアミノ酸残基の代表的なものとしては、セリン、スレオニン、チロシン等が挙げられる。当該リン酸化ペプチドは配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する３アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、好ましくは少なくとも連続する５アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、より好ましくは少なくとも連続する８アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチドである。さらに、当該リン酸化ペプチドにおいてリン酸化されるアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基のいずれか、好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のいずれか、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である。このようなリン酸化ペプチドの代表的なものとしては、実施例１で抗体作製で用いているリン酸化ペプチド（配列番号３１）が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明のタウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチドは、本発明における抗リン酸化タウ抗体の作製における抗原や当該ペプチドを含むことを特徴とする認知症治療剤又は予防剤に用いることができる。当該リン酸化ペプチドは、その配列のＮ末端及び／又はＣ末端に目的に応じて他の機能を有する物質で修飾することも可能である。例えば、当該リン酸化ペプチドのＮ末端に、メチオニン残基、アセチル基又はピログルタミン酸等が付加されたものや蛍光物質等で修飾された形であってもよい。また、当該リン酸化ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を修飾する物質は、ペプチドやタンパク質であっても良く、そのようなものの例としてはＮ末端又はＣ末端に適当なタグ配列（典型的にはヒスチジンタグ又はＦＬＡＧタグ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）や主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）によって認識されるためのアミノ酸配列のペプチド、ウイルスや細菌のタンパク質やそれに由来する配列のペプチド等が付加されたものが挙げられる。また、本発明におけるリン酸化ペプチドには、Ｎ末端及びＣ末端以外の少なくとも一つのアミノ酸残基が化合物又はペプチドで修飾されたものも含まれる。このようなリン酸化ペプチドの修飾は、当業者であれば公知の方法、例えばハーマンソン（Hermanson）等著のバイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques、USA、1996年発行、Academic Press）に記載の方法等を用いて実施することが可能である。
　本発明におけるリン酸化ペプチドは、当業者であれば適宜合成法や遺伝子工学的方法等を用いて製造することができる。リン酸化ペプチドを合成によって製造する方法としては、Ｂｏｃ法による方法（Wakamiya T.ら、Chemistry Letters、Vol.22 P1401, 1993年）、Ｆｍｏｃ法による方法（PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol.40, P134-140, 1992年）、又は特許第３５８７３９０号に記載の方法等が例示できるが、当業者であれば適宜別の方法でも実施可能である。また、遺伝子工学的方法による製造方法は、製造するペプチド又はその前駆体をコードする塩基配列を有する遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を調製し、適宜発現用のベクターへの組込やプロモーター配列の付加等を行うことで、適当な宿主に導入して発現させるか無細胞系タンパク質合成系を用いる等の方法で製造することができる。この場合、望む部位がリン酸化されたリン酸化ペプチドを得るためには、適宜、宿主が有する又は遺伝子工学的に発現が誘導されたキナーゼ類により宿主内でリン酸化反応を行わせるか、目的のペプチドを一度回収した後にin vitroにおいてキナーゼ等を反応させることでリン酸化反応を行うことによって製造することが可能である。このin vitroでのリン酸化反応を行うためには、目的のペプチドをＧＳＫ３やＣＤＫ５等タウのリン酸化反応での機能が知られている酵素を利用することができる。このように宿主内、又はin vitroでリン酸化されたリン酸化ペプチドのうち、目的のアミノ酸残基がリン酸化されたものを取得するためには、上記の抗リン酸化タウに対する抗体による抗体抗原反応を用いて特異的に抗体と結合したリン酸化ペプチドを回収する方法等を用いても良い。
[抗リン酸化タウ抗体又はリン酸化タウペプチドを含有する認知症治療剤又は予防剤]
　ヒトにおける認知症とは、いったん発達した、あるいは獲得された知的機能が低下する状態をいい、知能障害の一つとされるが（上島国利、丹羽真一編、NANKODO’s　ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES　New精神医学、ｐ６９－７０、2008年）、広い意味においては知能障害及び／又は記憶障害を呈する疾患と考えられる。ＡＤ等の神経変性疾患においては、「神経変性」を確定するには死後に組織学的な解析を行うことで神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在を確認すること等で行うことができるが、医師は神経変性疾患の診断として、神経心理学的検査として質問によるもの／長谷川式簡易知能評価スケール改訂版（HDS-R）やMini-Mental State Examination(MMSE) 等、観察によるものClinical Dementia Rating(CDR) やFunctinal Assessment Staging(FAST) 等、生化学検査として脳脊髄液中でのタウやリン酸化タウの存在量の上昇やＡβの存在量の上昇、画像検査として頭部ＣＴ、頭部ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での得られた情報を基に、認知症、特に神経変性疾患としての認知症を診断する。従って、本発明の認知症治療剤又は予防剤は医師が認知症として診断した患者に投与され、上記の神経変性疾患における診断の項目の１以上において、投与前と比較して改善する効果、又は病状が進行する程度を投与によって抑制又は投与前の状態に維持又は回復させる効果を有するものである。
　本発明の認知症治療剤又は予防剤が投与される患者としては、認知症の患者である、その中でもタウオパチーの患者であって、その中でもアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔａｕｏｐａｔｈｙ　ｗｉｔｈ　ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病　（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症のうちのいずれかの患者である。したがって、本発明の認知症治療剤はタウオパチー治療剤又は予防剤でもあり、別の観点ではアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Multiple system tauopathy with dementia（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症等の治療剤又は予防剤であるともいえる。
　また、本発明の認知症治療剤又は予防剤は、非ヒト動物での認知機能を改善、又は認知機能の低下を抑制又は維持する効果を持つものであるともいえる。当該非ヒト動物としてヒトのタウを高い相同性を有するタウを発現する動物、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット、ネコ等が含まれるが、それに限定されるものではない。
[認知症のモデル動物]
　本発明の認知症治療剤又は予防剤を研究するための動物としては、認知症のモデル動物が挙げられ、その中でも特にタウオパチーのモデル動物が挙げられる。また、タウオパチーの動物モデルとしては、正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物であり、特に認知機能の障害をおこす動物モデルである。このような正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物は遺伝子操作により作製することが可能であり、その代表的なものとしてはトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）が挙げられる。遺伝子変異型のタウを発現するＴｇマウス等の動物モデルは、遺伝的な家族性のタウオパチーのモデルとしては有用であるが、ヒトでの大多数をしめる孤発性のタウオパチーに対して治療剤又は予防剤の効果をみるためには正常型のタウを発現するＴｇマウスで効果を示すことが望ましい。そのような正常型のタウを発現するＴｇマウスとしては、本発明の製造例で作製しているマウスが最も適しているが、その他には神戸ら（Neurobiology of Disease, Vol.42, P404-414, 2011年）や木村ら（The EMBO J. vol.26. P5143-5152, 2007年）が報告しているＴｇマウス等を用いることができる。しかしながら、神戸らのマウス及び木村らのマウスにおいては、認知機能障害が認められるのが、それぞれ１４ヶ月齢及び２０ヶ月齢以降であることから、かなり老齢になってからの発症となり、加齢による影響も含んでいる可能性や、長期飼育による影響や手間の問題がある。それに対して、本発明の製造例で作製しているマウスは、ヒトの正常型のタウを発現し、６ヶ月齢程度と比較的早期に認知機能障害を発症するマウスであることから、加齢などの要因を排除できる認知症モデルとして最も適したものであり、このようなモデルを用いることでより明確に認知機能の改善効果を有する認知症治療剤又は予防剤を評価することが可能である。
　動物モデルで本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、記憶学習試験等の認知機能を試験する方法が望ましい。そのような方法としては、Morris水迷路試験、ステップスルー型学習試験、新奇物質認識試験等の方法を用いることが可能であるが、行動量や動物の不安等の条件を裏付けるためにOpen Field Test 等の行動測定試験の方法を組み合わせるのが望ましい。
　また、本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、認知症のモデル動物に投与した際に、脳組織におけるタウタンパク質またはリン酸化タウの増減を調べる方法も用いることができる。ＡＤや他の神経変性疾患において、タウタンパク質の発現量や異常リン酸化タウの増加が病態と関連しているといわれている（Khalid Iqbal等、 Curr. Alzheimer Res., 7巻、p654-664、2010年）。そして、いくつかの病態モデル動物においてタウの発現や異常リン酸化タウの量を低減することによって、認知機能や運動機能に改善がみられることも公知である（K. SantaCruz等、Science,　３０９巻、p476-481、2005年；Sylvie Le Corre等、Porc. Nat. Acad. Sci. USA,　１０３巻p9673-9678、2006年）。タウタンパク質またはリン酸化タウの増減を調べる方法としては、実施例に記載されていように脳組織のホモジネートを用いてウエスタンブロティングなどの方法で実施できるが、その他ELISA法（Xiyun Chai等、J. Biol. Chem.,　２８６巻、p34457-34467、2011年）や組織免疫化学法（David J. Irwin等、BRAIN，１３５巻、p807-818、2012年）など、当業者であれば適宜方法を選択して実施することが可能である。
　本発明での認知症治療剤又は予防剤のモデル動物での効果は、ヒト等での治療剤又は予防剤の開発における薬理効果のデータとして用いられる。
［認知症治療剤又は予防剤］
　本発明の認知症治療剤又は予防剤の形態としては、抗リン酸化タウ抗体を含有するものであり、好ましくはタウタンパク質の配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と特異的に抗原抗体反応する抗体であり、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体であり、より望ましくはＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０であり、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である（１５０５）抗体と競合結合する抗体であり、さらに望ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である。そのような抗体についての説明は、上述の[抗リン酸化タウ抗体]の部分に記載されている。
　本発明の認知症治療剤又は予防剤の別の形態としては、タウの配列の一部を含み、その１つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを含有するものであり、そのペプチドとしてはリン酸化ペプチドは配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する３アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、好ましくは少なくとも連続する５アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、より好ましくは少なくとも連続する８アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチドである。さらに、当該リン酸化ペプチドにおいてリン酸化されるアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に相当するアミノ酸残基のいずれか、好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のいずれか、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である。そのようなペプチドについての説明は上述の[タウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチド]の部分に記載されている。
　本発明の認知症治療剤又は予防剤は、薬学的に許容されるいずれの添加剤を含有してもよい。薬学的に許容される添加剤を用いての製剤は「REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION、フィラデルフィア科学大学（University of the Sciences in Philadelphia）著、Williams & Wilkins社、2000年12月15日発行」に記載の方法で実施することも可能である。このような治療剤又は予防剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤として供される。このような溶剤として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加されたり、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤としては油性液が用いられる場合もあり、該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような液剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β－カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。また別の治療剤又は予防剤の形態としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、トローチ剤等の固形剤があげられる。経口用製剤の形で投与する固形剤の場合には、添加剤として、賦形剤（例えば、結晶性セルロース、ラクトース、デンプン等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等）等が用いられる。また、必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等）、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加剤を用いることができる。さらに別の形態として、粘膜適用用治療剤又は予防剤もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
　本発明における認知症治療剤又は予防剤には、上記の抗リン酸化タウ抗体又はリン酸化ペプチドのほかに既存の認知症の進展を抑制する効果を有する物質を配合した治療剤又は予防剤も含まれる。また、本発明における認知症治療剤又は予防剤には、上記の抗リン酸化抗体又はリン酸化ペプチドを含む治療剤又は予防剤と既存の認知症の進展を抑制する効果を有する物質を含有する治療剤又は予防剤を併用するためのキットも含まれる。認知症の進展を抑制する物質としては、たとえばドネペジル（Donepezil）、ガランタミン（Galantamine）、メマンチン（Memantine）やリバスチグミン（Rivastigmine）などが挙げられるがこれに限定されるものではない。配合される認知症の進展を抑制する効果を有する物質や認知症の進展を抑制する効果を有する物質を含有する治療剤又は予防剤の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
　また、本発明の実施例で用いている抗体は、腹腔内投与という末梢からの投与によっても脳血管関門を通過して脳で作用して薬効を示すことが実施例の結果より証明されているが、本発明における認知症治療剤又は予防剤にも用いる抗リン酸化タウ抗体を脳組織に効率的に供給するための製剤も作製可能であり、そのような製剤も本発明の認知症治療剤又は予防剤に含まれる。抗体やペプチドなどを効率的に脳組織に脳血管関門を通過させて供給する方法としては、ターゲッティング用の物質を付加する方法や、リポソームやナノパーティクル内に封入する方法などが知られている。ターゲッティングのための物質としては、抗体と結合させることによって全体又は部分的な電荷的特性を変化させるものを用いたり、特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物を用いることが可能である。特異的な受容体や膜たんぱく質などと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物の例としては、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合するリガンドやその類縁体、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合する抗体、アゴニスト化合物／アンタゴニスト化合物／アロステリックモジュレーターやそれらの類縁化合物などが挙げられる。特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物の標的となる受容体のリガンドや膜たんぱく質の例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）やジフテリア毒素受容体（ＨＢ－ＥＧＦ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない（Angela R. Jones等、Pharm. Res.,　２４巻、p1759－1771、2007年）。ターゲティングのための物質は本発明の認知症治療剤又は予防剤に用いる抗体に化学的に付加することが可能であり、その方法としては、公知の方法、たとえばハーマンソン（Hermanson）等　バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）1996年発行 Academic Press）に記載の方法を参照して当業者であれば適宜行うことができる。また、ターゲッティングのための物質は、抗体やペプチドを包含させるリポソームやナノパーティクルに結合させてもよい（Sonu Bhaskar等、Particle and Fibre Toxicology，７巻３号、2010年）。さらに、ターゲッティングのための物質がペプチドやタンパク質である場合には、ペプチド化学合成による融合ペプチドとして製造したり、ペプチドやタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を、使用する抗体やペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸と組み合わせたりすることによって、当業者であれば適宜融合タンパク質として遺伝子工学的な技術を用いて製造することが可能である。
　本発明における治療剤又は予防剤は、症状の改善を目的として、経口又は非経口的に投与することができる。経口投与の場合には、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤、エリキシル剤等の剤型を選択することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。さらに、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
　本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２００ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
　また本発明における治療剤又は予防剤は、短い投与期間で効果を得ることが可能である。
　以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。実験は、大阪市立大学阿倍野地区動物実験委員会の承認のもとに行われた。
［実施例１］ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の作製
　ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対する抗体作製のために、抗原として、ヒトタウタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の４１３番目に相当するＳｅｒがリン酸化された４１０番目のＡｓｎから４１６番目のＳｅｒまでに相当するアミノ酸配列のＣ末端部位にＣｙｓをつけた合成ペプチド（配列番号３１．株式会社医学生物学研究所[ＭＢＬ]で合成）を用いた（以下、該ペプチドをｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドと呼ぶ）。
ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチド：Ｎ－ＡｓｎＶａｌＳｅｒ（ｐＳｅｒ）ＴｈｒＧｌｙＳｅｒＣｙｓ－Ｃ（配列番号３１）
　ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）と共有結合させた。得られたコンジュゲートはウサギ１羽に対して０．１ｍｇを１回分の免疫に用いた。一回目の免疫はコンジュゲート溶液０．２ｍＬ（コンジュゲート濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）と等量のフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、毛剃りした日本白色種のウサギの背部に、５０μＬずつ８箇所に皮内注射することで行った。二回目以降の免疫はフロイントのインコンプリートアジュバントを用いて、同様の免疫を２週間おきに、さらに２回行った。最後の免疫から２週間後に血液を一部採取して、その血清中の抗体価を、免疫したペプチドコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡ法で確認し、その１週間後に動物を屠殺して全血を採取した。得られた血液から血清を作製し、その血清からｐＳｅｒ４１３（Ａｆ）ペプチド（配列番号３２）のアフィニティーカラムを用いて抗体を精製した。
　なお、血清抗体値の確認は以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドをＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（ＭＢＬ社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。免疫前ウサギ血清と免疫後のウサギ血清の希釈系列を１００、５００、２,５００、１２,５００、６２,５００倍、ブランクとし、ＰＢＳで希釈したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ－パーオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製）を希釈Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製）で８，０００倍希釈したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（ＭＢＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３～１０分間発色させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、反応を停止させた。反応停止後、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。
　また、精製抗体の抗体反応性の確認は、以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチド［ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチド（下線部）をＮ端、Ｃ端方向に更に延長したペプチド（配列番号３３．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）：Ｎ－ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕＳｅｒＡｓｎＶａｌＳｅｒ（ｐＳｅｒ）ＴｈｒＧｌｙＳｅｒＩｌｅＡｓｐＭｅｔＶａｌＡｓｐ－Ｃ］、あるいは同じアミノ酸配列を有するがＳｅｒ４１３に相当する部位がリン酸化されていないＮｏｎＰ（Ｌ）ペプチド（配列番号３４．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、３７℃で１時間以上静置した。精製抗体をＰＢＳで希釈し、系列化したものを５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で９０分間反応させた。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ－アルカリフォスファターゼ標識（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、希釈Ｂｕｆｆｅｒ（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で２，０００倍希釈したものを、５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ　Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に１ｍｇ／ｍＬ　ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３０分間発色させ、測定波長４０５ｎｍ、参照波長５５０ｎｍで吸光度を測定した。
＜結果＞
　精製した抗体は図３に示すよう、ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチドに特異性が高く、ｎｏｎＰ（Ｌ）ペプチドには殆ど反応しないことが判った。従って、当該抗体はｐＳｅｒ４１３（Ｌ）に特異的に抗原抗体反応する抗体である（本明細書では、「ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体」又は「ｐS413AB」と記載する場合もある）。
［実施例２］ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するモノクローナル抗体（Ｔａ１５シリーズ）の作製
　抗原として、配列番号１に示されるヒトタウタンパク質のアミノ酸配列の４１３番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基がリン酸化された４０３番目Ｔｈｒから４２３番目のＰｒｏまでに相当する配列のＮ末端部位に、ＧｌｙＣｙｓＳｅｒＧｌｙをつけた合成ペプチドｐＳｅｒ４１３（Ｉｍ）ペプチド（配列番号３５）を用いた。ｐＳｅｒ４１３（Ｉｍ）ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と共有結合させた。得られたコンジュゲートはマウス１匹に対して０．０４ｍｇを１回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液０．４ｍｌ（ペプチド換算で１．１ｍｇ／ｍｌ）とＳａｌｉｎｅ０．７ｍＬ及び１．１ｍＬのフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、２００μＬずつ１０匹に腹腔内注射することで行った。同様の免疫（免疫箇所、抗原量は同じも、フロイントのインコンプリートアジュバンドを用いた）を２週間おきに、さらに３回行った。１０匹中、抗原に対する血清抗体価が唯一上昇した１匹に対して、最後の免疫から１ヶ月後に、ペプチド換算で０．５ｍｇ／ｍＬの抗原溶液（Ｓａｌｉｎｅに溶解）１００μＬを尾静脈内注射し、３日後に動物を屠殺して脾臓を採取した。１８Ｇ注射針２本を使用して脾臓を切りほぐした後、ゴム栓面で、切りほぐした脾臓を、緩やかに押しつぶした。押しつぶした脾細胞は、冷ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬ程度で懸濁し、その上澄みを４０μｍセルストレナーで濾過し、濾液を５０ｍＬ遠心管に採取した。脾臓細胞のＤｅｂｒｉｓをさらにゴム栓面で押しつぶし、冷ＲＰＭＩ１６４０培地で同様に懸濁、濾過し、濾液を採取した。最終的に脾臓細胞懸濁液を４０ｍＬになるように冷ＲＰＭＩ１６４０培地（又は冷ＰＢＳ）を加えた。血球計算盤にて、懸濁液中のリンパ球濃度を測定し、最終的に２×１０７Ｃｅｌｌｓに相当するリンパ球を５０ｍＬの遠心チューブに移した。ここに、培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２ｍＭグルタミン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン）で培養しておいた４×１０７Ｃｅｌｌｓに相当する対数増殖期のマウス・ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・Ｕ１株（Ｐ３・Ｕ１と略記する）を加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに０．５ｍＬのポリエチレングリコール液（ＲＰＭＩ１６４０（２．３ｍＬ）＋ポリエチレングリコール２０００（１．４ｍＬ）＋ジメチルスルホキサイド（０．３ｍＬ）より構成：以下「ＰＥＧ液」と略記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｍＬのＰＥＧ液を１分かけてゆっくり滴下し、更に１．０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を１分かけてゆっくり滴下し、更にＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ、２分かけてゆっくり滴下した。その後、４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液（ＧＩＴ培地［日本製薬］＋５％胎児牛血清＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン＋９５μＭヒポキサンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋１６μＭチミジン）を２分かけて滴下し、更に４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を２分かけて滴下した。最後に、ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を加え４０－５０ｍＬの細胞浮遊液とした。３７℃、３０分間恒温槽でインキュベーションした後、これを培養プレート（９６穴）７枚に播いた。なお、培養プレートとして、マウス（ＩＣＲ系）の腹腔マクロファージ（フィーダー細胞）を数日間培養した（＞１×１０５／ｗｅｌｌ）９６ｗｅｌｌプレート（フィーダープレート）を用いた。その後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で７～１０日間培養した。
　１週間毎に半量の培養液を新しいＨＴ培養液（ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液からアミノプテリンを除去したもの）で交換していき、ハイブリドーマを得た。
　抗体のスクリーニングは以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチドをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間以上放置した。ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を吸引し、ハイブリドーマの上清を３０～５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、２次抗体（ブロッキングバッファーに２０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識　ヤギ抗マウス　ＩｇＧ－Ｆｃ　抗体［ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社］を添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、基質溶液（２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ　Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に０．７～１．２ｍｇ／ｍＬ　ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、２５℃で６０分間発色させた後、測定波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。
　このスクリーニングで、陽性を示したＷｅｌｌから、細胞を取り出し、血球計算盤で細胞数を数えた後、１～３ケ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（先のフィーダープレート）に播き、限界希釈法によるクローニングを行った（Ｔａ１５０１、Ｔａ１５０２、Ｔａ１５０５～１５０９）。以後の解析用に、クローンを大量培養後、プロテインＧカラムにて、抗体を精製した。Ｔａ１５０５は、Ｔａ１５０５－２と同一である。アイソタイプの決定は　ＡｂＤ　ｓｅｒｏｔｅｃ社のキットを用いて行った。
　精製した抗体をタウの様々なリン酸化部位に対する部分ペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに反応させ、リン酸基特異性を調べた。方法は以下によった。
　各種タウペプチド（ｐＳ４６［配列番号３６］，ｐＳ１９９［配列番号３７］，ｐＳ２０２［配列番号３８］，ｐＴ２１２［配列番号３９］，ｐＳ２１４［配列番号４０］，ｐＴ２１２／ｐＳ２１４［配列番号４１］，ｐＴ２１７［配列番号４２］，ｐＳ４１３［配列番号３３］, ｎｏｎ ｐＳ４１３［配列番号３４］）の１０％ＤＭＳＯ溶液あるいはペプチドをＢＳＡコンジュゲートしたもの（ｐＳ４００［配列番号４３］－ＢＳＡ，ｐＳ４１２［配列番号４４］－ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液をＰＢＳ（ｐＨ７）にて１μｇ／ｍＬに希釈して５０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）に添加し、４℃で終夜インキュベートし固定化した。その後、ペプチド溶液を除去して０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを２８０μＬ／ｗｅｌｌにて添加し、３７℃、１時間ブロッキングをおこなった。
　ブロッキング液を吸引除去して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、各種Ｔａ１５シリーズのモノクローナル抗体溶液１μｇ／ｍＬ　ｉｎ　３％ＢＳＡ－ＰＢＳを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温にて１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｃｅ社）を５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、０．１Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ１０）に溶かした１ｍｇ／ｍＬＰＮＰＰ（パラニトロ・フェニルフォスフェート）溶液を１００μＬ加え、室温で１時間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。各抗体の各種ペプチドに対する反応性評価結果を表２に示す。反応性は、３段階に分けて評価した。＋：反応性有り、－：反応性無し、±：若干の反応性を認めるが非常に弱い
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらの抗体（以後、「Ｔａ１５シリーズ」と称する。）は、検討したペプチドのうち、ｐＳｅｒ４１３のみに反応し、極めてリン酸基特異性が高かった。
［実施例３］Ｔａ１５シリーズ抗体の結合親和性測定
　Ｔａ１５シリーズ抗体と抗原ペプチド（ｐＳｅｒ４１３ペプチド（Ｉｍ）：実施例２参照）との結合親和性を評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム　ビアコア（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００、ｃｏｄｅ＃ＢＲ－１１００－４５）及び各ビアコア製品を用い、取扱説明書に準拠し測定した。測定の一つの方法はＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストラン層形成済みチップ，ｃｏｄｅ＃ＢＲ－１１００－１４）に抗マウス抗体（ｃｏｄｅ＃ＢＲ－１００８－３８）をアミンカップリング反応による共有結合により固定化（ｃｏｄｅ＃ＢＲ－１００６－３３）し、固定化された抗マウス抗体にＴａ１５シリーズ抗体を結合し、結合したＴａ１５シリーズ抗体に対し、抗原ペプチドの結合動態を測定する方法であった。
　特異的結合の反応溶液をＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ｃｏｄｅ＃ＢＲ－Ｔ－１００１－８８）とし、ＣＭ５チップをＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液により活性化させた。抗マウス抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０により０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液をチップ上の４個のフローセルに反応させ、抗マウス抗体をＣＭ５チップに共有結合させた後、エタノールアミンでブロッキングした。抗マウス抗体を固定した４個のフローセルのうち、一つには陰性抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ｃｏｄｅ＃ＭＡＢ００３）を、その他のフローセルにはＴａ１５シリーズ抗体を、各１０００ＲＵ程度の密度で捕捉した。１Ｍ　ＮａＣｌを付加したＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．００５％　ｖ／ｖ　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を３分間反応させて、非特異的に吸着した抗体を除去し、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を流速５０ｕＬ／分で１０分間反応させ、ベースラインを安定にした。ペプチドをＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて、１００ｐＭから５ｍＭの濃度の間（概算結合解離定数[ＫＤ]近傍）で段階希釈し、得られたペプチド溶液（５濃度）を低濃度側から連続的に各６分の間隔を空けて４分間～６分間（一律）反応させ、結合動態を測定した。
　抗原ペプチドの特異的結合動態データとして、操作によって生じるノイズの影響を除くため、陰性ペプチドとして非リン酸化ペプチド（ｎｏｎ　ｐＳｅｒ４１３ペプチド）による結合動態データを得て、抗原ペプチドの結合動態データから差し引いた。なお、測定濃度において、非リン酸化ペプチドの抗体への結合は認められない。特異的結合動態データをビアコア解析ソフト（BIAevaluation：シングルサイクルカイネティクス解析，code#AP-4000-01）を用いて、Single cycle kinetics 1:1 binding with drift modelで適合させ、動力学的会合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を同時に得た（Karlsson. R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006). “Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.” Anal. Biochem. 349(1): 136-47）。Ｔａ１５シリーズ抗体の親和性測定値である平衡解離定数（ＫＤ）値は、Ｋd／Ｋaより算出した。
＜結果＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Ｔａ１５シリーズ抗体のうち、抗原ペプチドへの親和性が最も強いＴａ１５０５抗体を記憶障害マウスを用いた行動試験に用いた。
［実施例４］ｐＳｅｒ３９６及び／又はｐＳｅｒ４０４ペプチドを認識するモノクローナル抗体の作製
　抗原として、配列番号１で示されるヒトタウタンパク質のアミノ酸配列の３９６番目、４０４番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基がリン酸化された３７９番目Ａｒｇから４０８番目のＬｅｕまでの配列のＮ末端部位にＧｌｙＣｙｓをつけた合成ペプチド（配列番号４７：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）を用いた（以下、該ペプチドをｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドと呼ぶ）。
ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド：Ｎ－ＧｌｙＣｙｓ－ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ－Ｃ（配列番号４７）
　ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、Maleimide activated KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）(Thermo Scientific社)と共有結合させた得られたコンジュゲートはＢａｌｂ／ｃマウス１匹に対して約０．０４ｍｇを１回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液０．３ｍＬ（ペプチド換算で０．７７ｍｇ／ｍｌ）と０．３ｍＬのフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、１００μＬずつ４匹に腹腔内注射することで行った。うち２匹には、腹腔内免疫（抗原量は同じで、フロイントのインコンプリートアジュバンドを用いた）及び足裏免疫（抗原＋Titer Maxのアジュバントを用いた）を、残りの２匹には腹腔内免疫のみを、各々２週間おきに、さらに２回行った。抗原への血清抗体価の高かった、腹腔内免疫及び足裏免疫を行ったマウスに対して、最後の免疫から１５日後に、抗原溶液（Ｓａｌｉｎｅに溶解）を尾静脈内注射し、３日後に動物を屠殺して脾臓を採取した。１８Ｇ注射針２本を使用し、脾臓を切りほぐした後、ゴム栓面で、切りほぐした脾臓を、緩やかに押しつぶした。押しつぶした脾細胞は、冷ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬ程度で懸濁し、その上澄みを４０μｍセルストレナーで濾過し、濾液を５０ｍＬ遠心管に採取した。脾臓細胞のＤｅｂｒｉｓをさらにゴム栓面で押しつぶし、冷ＲＰＭＩ１６４０培地で同様に懸濁、濾過し、濾液を採取した。最終的に脾臓細胞懸濁液を４０ｍＬになるように、冷ＲＰＭＩ１６４０培地（又は冷ＰＢＳ）を加えた。血球計算盤にて、懸濁液中のリンパ球濃度を測定し、最終的に２×１０７Ｃｅｌｌｓに相当するリンパ球を５０ｍＬの遠心チューブに移した。ここに、培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２ｍＭグルタミン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン）で培養しておいた４×１０７Ｃｅｌｌｓに相当する対数増殖期のマウス・ミエローマ細胞Ｐ３・Ｕ１を加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに０．５ｍＬのＰＥＧ液を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｍＬのＰＥＧ液を１分かけてゆっくり滴下し、更に１．０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を１分かけてゆっくり滴下し、更にＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ、２分かけてゆっくり滴下した。その後、４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液（ＧＩＴ培地［日本製薬］＋５％胎児牛血清＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン＋９５μＭヒポキサンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋１６μＭチミジン）を２分かけて滴下し、更に４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を２分かけて滴下した。最後に、ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を加え、４０－５０ｍＬの細胞浮遊液とした。３７℃、３０分間恒温槽でインキュベーションした後、これを培養プレート（９６ｗｅｌｌ）７枚に播いた。なお、培養プレートとして、マウス（ＩＣＲ系）の腹腔マクロファージ（フィーダー細胞）を数日間培養した（＞１×１０５／ｗｅｌｌ）９６ｗｅｌｌプレート（フィーダープレート）を用いた。その後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で７～１０日間培養した。
　１週間毎に半量の培養液を新しいＨＴ培養液（ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液からアミノプテリンを除去したもの）で交換していき、ハイブリドーマを得た。
　モノクローナル抗体のスクリーニングは以下のように行った。スクリーニング用抗原として、ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド（Ｎ－ＧｌｙＣｙｓ－ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ－Ｃ）（配列番号４７）のＮ端のＣｙｓにＢＳＡをコンジュゲートしたｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド－ＢＳＡ、及び非リン酸化ペプチド（Ｎ－ＧｌｙＣｙｓ－ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓＳｅｒＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒＳｅｒＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ－Ｃ）（配列番号４８）のＮ端のＣｙｓにＢＳＡをコンジュゲートした非リン酸化ペプチド－ＢＳＡを用いた。非リン酸化ペプチド－ＢＳＡあるいはｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド－ＢＳＡをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間以上放置した。ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を吸引し、ハイブリドーマの上清を３０～５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、検出用試薬（ブロッキングバッファーに２,０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａを添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、基質溶液（２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ　Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に０．７～１．２ｍｇ／ｍＬ　ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、２５℃で６０分間発色させた後、測定波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。
　非リン酸化ペプチド－ＢＳＡに反応性が低く、ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド－ＢＳＡに反応性が高いＷｅｌｌから細胞を取り出し、１－３細胞／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（先のフィーダープレート）に播き、限界希釈法によるクローニングを行った。その中から、Ｔａ９抗体（ＩｇＧ３／κ）を産生するクローンを選別した。以後の解析用に、クローンを大量培養後、プロテインＧカラムにて、抗体を精製した。
　Ｔａ９抗体のｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドに対するＫＤ値を実施例３に記載した方法に準じて測定したところ、１．０８×１０－１０であり、ペプチドへの親和性はＴａ１５シリーズ抗体よりも高かった。
［実施例５］行動試験　取得抗体の記憶学習障害マウスに及ぼす影響
　以下の３種類の抗体の投与が、記憶学習障害マウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）に及ぼす影響を調べた。
（１）ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体：Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ６０９）マウスあるいはｎｏｎ－Ｔｇマウス（正常コントロール）９－１１か月齢を使用、ｎ＝９－１０／群
（２）Ｔａ１５０５（ｐＳｅｒ４１３認識モノクローナル抗体）：Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ－Ｔｇマウス１４か月齢を使用、ｎ＝９－１０／群
（３）Ｔａ９（ｐＳｅｒ３９６認識モノクローナル抗体）、Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ６０９）マウスあるいはｎｏｎ－Ｔｇマウス１４か月齢を使用、ｎ＝９－１０／群
　実験には９－１４か月齢のオスのヘテロ変異Ｔａｕ－Ｔｇマウス（ｌｉｎｅ　６０９又はｌｉｎｅ　７８４）、及びそのｎｏｎ－Ｔｇ　ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓを用いた。グループ間で平均体重に差がないようにグループ分けした。ヘテロ変異Ｔａｕ－Ｔｇマウスに対して、ＰＢＳ又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で希釈された抗体を１週間に１回、計５回、毎回１匹当り１ｍｇを腹腔に投与した。陰性対照群として、抗体を調製する際に用いた緩衝液あるいはタウに反応性を有しないマウスＩｇＧモノクローナル抗体を同用量、腹腔に投与した。陽性対照として、ｎｏｎ－Ｔｇ　ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓに対して、抗体を調製する際に用いた緩衝液を同用量、腹腔に投与した。
　（１）～（３）の群構成を以下に示す。
（１）<使用マウス>：変異Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ　６０９），９－１１ｍｏ（９－１１か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ－ｔａｕ　ｐＳｅｒ４１３ウサギポリクローナル抗体１．６ｍｇ／ｍＬ　ｉｎ　ＰＢＳ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
ｎｏｎ－Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
（２）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ　７８４），１４ｍｏ（１４か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ－ｔａｕ　ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体　Ｔａ１５０５　ｉｎ　０．１　Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）　３．８４　ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　マウスモノクローナル抗体　４Ｃ１０Ｆ４　ｉｎ　０．１　Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）　４．２８　ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝９）
ｎｏｎ－Ｔｇ群：０．１Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）（ｎ＝９）
（３）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ　６０９），１４ｍｏ（１４か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ－ｔａｕ　ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体　Ｔａ９　ｉｎ　０．０２Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝１０）２．６６ｍｇ／ｍｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　６Ｆ１１　ｉｎ　０．０２Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝９）４．５０　ｍｇ／ｍｌ
ｎｏｎ－Ｔｇ群：０．０２Ｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝９）
　最終投与の翌週月曜日からモリス水迷路を用いて空間参照記憶（ｓｐａｔｉａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍｅｍｏｒｙ）試験を行った（水迷路試験）。水迷路試験終了翌日からオープンフィールド装置を用いてマウスの自発運動量を測定した（Ｏｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ　試験）。
＜水迷路試験；（１）～（３）共通＞
準備：内径１００ｃｍ、高さ４５ｃｍの黒色プール内に１６ｃｍ深の水をはった。水温２１～２３度に調整し、酸化チタン等による着色は行わず無色透明に保った。塩素の添加も行わず、毎ｔｒｉａｌ　ｄａｙ後に糞の排除と、水の入れ替えを約１０Ｌずつ行った。Ｔｒｉａｌ（獲得）試験：１５ｃｍ高の透明なプラットフォームを壁から２０ｃｍ（中心より３０ｃｍ）の位置に沈めた。プラットフォームを沈めた場所を含め４象限に区切り、マウスはプラットフォームのない３象限のいずれかからのみランダムに投入した。１試行６０秒を限度とし、５試行／日で行った。１試行の間隔は約５分。プラットフォームへ辿り着くまでのｅｓｃａｐｅ　ｔｉｍｅをデータとして記録した。６０秒以内に逃避しないマウスについては、オペレーターの手によってプラットフォームへ誘導し、ｅｓｃａｐｅ　ｔｉｍｅは６０秒として扱った。プラットフォーム上のマウスは１０秒後にプールから取り除き、次の試行まで自由に行動させ、体を乾燥させた。日毎のマウスの成績には、５試行のｅｓｃａｐｅ　ｔｉｍｅの平均秒数を用いた。
　Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎｏｎＴｇ）の成績が安定した時点で獲得試験を終了し、翌日ｐｒｏｂｅ試験を行った。
　Ｐｒｏｂｅ試験：最終日の翌日、プラットフォームをプールから取り除き、６０秒間の自由遊泳をビデオカメラで撮影した。撮影されたビデオを観察し、自由遊泳中のマウスが４象限のうち、プラットフォームの存在した象限（ｔａｒｇｅｔ　ｑｕａｄｒａｎｔ）内を泳いでいる時間を測定し、６０秒間におけるパーセンテージで表した。この時、プール投入後３０秒までの泳ぎについても同様に解析した。
　Ｔｒｉａｌ（獲得）試験の有意差検定はｒｅｐｅａｔｅｄ　ｍｅａｓｕｒｅ，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ＰＬＳＤ、Ｐｒｏｂｅ　ｔｅｓｔの有意差検定はＦｉｓｈｅｒ’ｓ　ＰＬＳＤにより行った。
＜Ｏｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ試験；（１）～（３）共通＞
装置：５ｍｍ厚の透明アクリル板を用いて３０×３０×３０ｃｍの正方形の箱を作製し、防音環境に格納した。格納環境上部には４０ｗの白熱灯を設置し、床面を照度１１０ｌｕｘで照らした。
行動量：（ｉ）アクリル箱の側面外側、床面より１．５ｃｍの位置に、赤外線ビームを１０ｃｍ間隔で設置した。マウスが２個のビームを連続して遮断した際に、ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎとして検出し、カウントした。
（ｉｉ）向かい合う２側面の、床面より３．５ｃｍの位置に赤外線ビーム面を設けた。マウスがビーム面の一部を遮断した際に、ｒｅａｒｉｎｇとして検出しカウントした。
試験：マウスには２０分間のセッションを１回与えた。マウスをアクリル箱中央部に投入し、速やかにドアを閉じ防音環境にしたうえで、セッションを開始した。
　セッションの前半１０分は明条件での自由行動、後半１０分は照明を消して暗条件での自由行動を測定した。
解析：マウスの１分毎の行動量をｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ、ｒｅａｒｉｎｇそれぞれについて折れ線グラフで示す。
　セッション開始から１０分後の暗条件への環境変化に反応し、マウスの行動量に変化が現われていることが確認できた場合、視覚は正常であったと定義する。
　明条件、暗条件それぞれの総行動量、及び２０分間の総行動量を棒グラフで示した。
　Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ、ｒｅａｒｉｎｇの総行動量について群間の有意差検定を行った。
　Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎは主に自発行動量、ｒｅａｒｉｎｇは主に探査行動量と解釈されるが、実際には両方の指標が互いに影響しあう（例：ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎが低下しているように見えても、その時間には実際にはｒｅａｒｉｎｇが上昇していれば、行動量が低下しているとは言えない）。
＜免疫組織化学試験；（２）のみ実施＞
　行動試験終了後、各グループから５匹ずつ選び、ホリマリンで還流固定した。パラフィン包埋後、脳から薄切切片をミクロトームで作成し、キシレン、エタノールで各１０分間、４回処理し、脱パラフィン処理した。クエン酸バッファー（ｐＨ６）で３０分間煮沸処理し（抗原賦活化処理）、室温に戻した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＳ）で１０分間、２回洗浄した。２０％牛血清含有ＴＳで室温、６０分間ブロッキング後、マウス抗ヒトシナプトフィジン抗体（ＳＩＧＭＡ社ＳＶＰ－３８を１０％牛血清含有ＴＳで２００倍希釈したもの）をマウントし、４℃で一晩処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＯＲ社の当該抗体を１０％牛血清含有ＴＳで２０倍希釈したもの）をマウントし、室温で６０分間処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、顕微鏡観察した。蛍光強度をＮＩＨ　ｉｍａｇｅＪで定量・数値化し、ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｕｎｉｔで表した。
＜結果＞
１．各抗体の投与による記憶障害への影響
（１）ｐＳｅｒ４１３ウサギポリクローナル抗体
　（１－１）～（１－３）の結果を図４～図７に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３ポリクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウス（Ｔａｕ－Ｔｇ）での記憶障害がｎｏｎ‐Ｔｇと同レベルにまで顕著に改善された。なお、（１－３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
（２）ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体（１５０５抗体）（２－１）～（２－３）の結果を図８～図１１に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３モノクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウスでの記憶障害がｎｏｎ　Ｔｇと同レベルにまで顕著に改善された。なお、（２－３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
　（２－１）及び（２－２）の結果より、ｐＳｅｒ４１３エピトープはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれについても、受動免疫療法の標的として良好なエピトープと考えられた。
（３）ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体（Ｔａ９抗体）
　（３－１）～（３－３）の結果を図１２～図１５に示す。総合すると、Ｔａ９投与により記憶障害が有意に、ｎｏｎ－Ｔｇと同じレベルにまで改善された。なお、（３－３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
　しかしながら、Ｔａ９はＴａ１５０５に比べると、薬効が弱かった。抗原親和性はＴａ９＞Ｔａ１５０５である（実施例２、３参照）にも関わらず、薬効はＴａ９＜Ｔａ１５０５である（実施例５）ことから、リン酸化エピトープの違いによる薬効の差異が示唆された。
［実施例６］Ｔａ１５０５抗体投与による神経機能への影響
　神経機能を反映するマーカーとして知られているシナプトフィジン量に及ぼすＴａ１５０５抗体投与の影響を記憶の中枢である海馬ＣＡ３領域の抗シナプトフィジン抗体の免疫染色により調べた。蛍光強度はNIH-Image Jで定量化した。
　結果を図１６に示す。Ｔａ１５０５抗体投与により、有意ではないが、海馬シナプトフィジン量の回復がみられた。
［実施例７］Ｔａ１５シリーズモノクローナル抗体ｃＤＮＡの塩基配列決定
　（１）ハイブリドーマ全ＲＮＡの精製
　各種モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養し、６ウエルプレートの１ｗｅｌｌあたり１ｍＬのＩＳＯＧＥＮを使用し、細胞を溶解した。この溶解液に０．２ｍＬのクロロホルムを加え、ボルテックスで混和し、室温で２～３分間放置した。１２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、上層を新しいチュ－ブに移した。これに０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを加え、混合し、室温で１０分間放置した。これを１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して全ＲＮＡを沈殿させた。ペレットに７５％エタノールを１ｍＬ加え、よく混和した後、１００００ｒｐｍ、５分間４℃で遠沈した。ペレットを風乾し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーの水に溶解し、－８０℃で保存した。
　（２）５’－ＲＡＣＥ、３’－ＲＡＣＥによるＨ鎖、Ｌ鎖ｃＤＮＡの取得及び該ｃＤＮＡの塩基配列決定
　既知のマウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのＨ鎖のＣｏｎｓｔａｎｔ領域のｃＤＮＡ配列をもとに５’－ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）及び３’－ＲＡＣＥ用のプライマーを合成した。同様にマウスＬ鎖のＣｏｎｓｔａｎｔ領域のｃＤＮＡ配列をもとに５’－ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）及び３’－ＲＡＣＥ用のプライマーを合成した。
　一方、ハイブリドーマから採取したＴｏｔａｌ　ＲＮＡを１μｇ使用して、ＳＭＡＲＴ－ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、５’－ＲＡＣＥ、３’－ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの合成をおこない、５’－ＲＡＣＥ及び３’－ＲＡＣＥを施行した。ＰＣＲ反応はＡｄｖａｎｔａｇｅ　２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。５’－ＲＡＣＥ、３’－ＲＡＣＥによって得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、メインの増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルより切り出し、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に挿入し、大腸菌に形質転換してそれぞれ数クローンを得た。これらの形質転換体よりプラスミドを定法に従って調製し、挿入ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定した。
　（３）Ｈ鎖、Ｌ鎖全長ｃＤＮＡの取得及び該ｃＤＮＡの塩基配列決定
　塩基配列情報を基に、Ｈ鎖及びＬ鎖のＮ末端、及びＣ末端をコードするｃＤＮＡ配列を決定して、全長の配列を増幅するためのＦｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒを設計した。このＰｒｉｍｅｒを使用し、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭａｘＰＣＲ（ＴａＫａＲａ社製）によりＨ鎖、Ｌ鎖の全長を増幅して、そのＰＣＲフラグメントをｐＥＦ４ベクターにクローニングした。これを使用して、全長のｃＤＮＡの配列を最終的に決定した。
　得られた塩基配列情報から、アミノ酸配列に翻訳し、さらにＩｇＢＬＡＳＴ（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて、ＫＡＢＡＴの方法（Kabat,E.A. and Wu,T.T.、 J. Immunol., 147, 1709-1719、1991年）でＣＤＲ領域の同定をおこなった。
　得られたＣＤＲ領域の配列を配列番号１４～に示した。
　これらの配列の相同性から、ｐＳｅｒ４１３を特異的に認識するための抗体のＣＤＲ配列に関する情報を得た（表４～表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例８］行動試験　取得抗体の記憶学習障害マウスに及ぼす影響
　以下の２抗体の投与が、記憶学習障害マウスに及ぼす影響を０．１ｍｇ投与において調べた。
（４）Ｔａ１５０５（ｐＳｅｒ４１３認識モノクローナル抗体）：Ｔａｕ　Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ－Ｔｇマウス１０か月齢を使用、ｎ＝９－１０／群
（５）Ｔａ９（ｐＳｅｒ３９６認識モノクローナル抗体）、Ｔａｕ　Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ－Ｔｇマウス１１か月齢を使用、ｎ＝８－１０／群
　実験には１０－１１か月齢のオスのヘテロ変異Ｔａｕ－Ｔｇマウス（ｌｉｎｅ　７８４）、及びそのｎｏｎ－Ｔｇ　ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓを用いた。グループ間で平均体重に差がないようにグループ分けした。ヘテロ変異Ｔａｕ－Ｔｇマウスに対して、ＰＢＳで希釈された抗体を１週間に１回、計５回、毎回１匹当り０．１ｍｇを腹腔に投与した。陰性対照群として、抗体を調製する際に用いたＰＢＳあるいはタウに反応性を有しないマウスＩｇＧモノクローナル抗体を同用量、腹腔に投与した。陽性対照として、ｎｏｎ－Ｔｇ　ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓに対して、抗体を調製する際に用いたＰＢＳを同用量、腹腔に投与した。
　（４）～（５）の群構成を以下に示す。
（４）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ　７８４），１０ｍｏ
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ－ｔａｕ　ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体　Ｔａ１５０５　ｉｎ　ＰＢＳ　０．２５　ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　マウスモノクローナル抗体　４Ｃ１０Ｆ４　ｉｎ　ＰＢＳ　０．２５　ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）ｎｏｎ－Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
（５）＜使用マウス＞　：変異Ｔａｕ－Ｔｇ（ｌｉｎｅ　７８４），１１ｍｏ
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ－ｔａｕ　ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体　Ｔａ９　ｉｎ　ＰＢＳ（ｎ＝１０）０．２５ｍｇ／ｍｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ－Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　６Ｆ１１　ｉｎ　ＰＢＳ（ｎ＝８）　０．２５　ｍｇ／ｍｌ　ｎｏｎ－Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝８）
　最終投与の翌週月曜日からモリス水迷路を用いて空間参照記憶（ｓｐａｔｉａｌ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍｅｍｏｒｙ）試験を行った（水迷路試験）。水迷路試験は実施例５と同様に行った。
＜結果＞
１．各抗体の投与による記憶障害への影響
（４）ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体（１５０５抗体）
　Ｔｒｉａｌ試験（４－１）、Ｐｒｏｂｅ試験（４－２）の結果を図１８及び図１９に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３モノクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウスでの記憶障害がｎｏｎ　Ｔｇと比較して５０％以上のレベルで改善された。
　（４－１）及び（４－２）の結果より、ｐＳｅｒ４１３エピトープモノクローナル抗体の薬効が０．１ｍｇ投与においても確認された。
（５）ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体（Ｔａ９抗体）
　Ｔｒｉａｌ試験（５－１）、Ｐｒｏｂｅ試験（５－２）の結果を図２０及び図２１に示す。総合すると、Ｔａ９投与においては０．１ｍｇ投与において記憶障害は改善されなかった。
　これらの試験から、リン酸化エピトープの違いによる薬効の差異が０．１ｍｇ投与においてさらに明確に示唆された。
　なお、マウス１匹あたり０．１ｍｇの抗体投与は、約２．５ｍｇ／ｋｇの用量の投与に相当する。
［実施例９］Ｔａ１５０５抗体投与による脳内リン酸化Ｔａｕ量の変化
　Ｔａｕ－Ｔｇマウスの脳内におけるリン酸化Ｔａｕの量に及ぼすＴａ１５０５抗体投与の影響を記憶の中枢である海馬領域に関して、ｐＳｅｒ４１３認識Ｔａ１５０５抗体およびＡＴ８抗体（ＰＨＦ認識ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５エピトープ）の免疫組織染色により調べた。
　行動試験終了後、各グループから５匹ずつ選び、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで還流固定した。脳を取り出してパラフィン包埋し、５μｍ薄切切片をミクロトームで作成した。キシレンおよびエタノールで各１０分間、４回処理し、脱パラフィン処理し、切片をｐＨ２で室温１０分間煮沸処理（抗原賦活化処理）した。室温に戻した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＳ）で１０分間、２回洗浄した。２０％牛血清含有ＴＳで室温、６０分間ブロッキングした。
　１０％牛血清含有ＴＳで１ｕｇ／ｍＬに希釈した抗タウ抗体（Ｔａ１５０５、ＡＴ８）をマウントし、４℃で一晩処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、１０％牛血清含有ＴＳで５００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、室温で６０分間処理した。
　ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＨＲＰ標識ＡＢＣ液（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、室温で３０分間反応させ、再び洗浄後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）で発色させた。エンテラン（Ｍｅｒｃｋ）で封入し、観察、撮影した。
　Ｔａ１５０５による免疫組織染色結果を図２２～図２４に示す。
　図２２では、コントロールＩｇＧ投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から１列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から２列目）においてＴａ１５０５陽性Ｔａｕの染色が認められたが、Ｔａ１５０５投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から３列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から４列目）の染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。このことからＴａ１５０５投与により、海馬ＣＡ３領域および海馬ＣＡ２３領域においてＴａ１５０５陽性ＴａｕつまりＳｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。さらに詳細には、ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ群は、茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左から右へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。Ｔａ１５０５投与群は、非常に薄い茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。ＣＡ３の４個体とＣＡ２３の３個体では染色がほとんど認められない。
　図２３及び２４では、コントロールＩｇＧ投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から３列目））においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められた。（図２３において茶色い斑点のように染まっている）
　Ｔａ１５０５投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から３列目））においての染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下しており染色は認められないレベルであることが確認された。
　このことからＴａ１５０５投与により、Ｃｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ）においてＴａ１５０５陽性ＴａｕつまりＳｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。
　図２３では、茶色の斑点状に染まっているが、図２４では、ほとんど茶色い斑点状の染色が確認できなかった。
　脳内（＝海馬ＣＡ３領域、海馬ＣＡ２３領域、ＰＲｈ、Ｅｎｔ（Ｌａｔｅｒａｌ、Ｍｅｄｉａｌ））において、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｓｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕ量の減少が確認された。
　ＰＲｈ＝Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ
　Ｅｎｔ＝Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ
　ＡＴ８による免疫組織染色結果を図２５～図２７に示す。
　図２５では、コントロールＩｇＧ投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から１列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から２列目）においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められたが、Ｔａ１５０５投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から３列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から４列目）の染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。このことからＴａ１５０５投与により、海馬ＣＡ３領域および海馬ＣＡ２３領域においてＡＴ８陽性ＴａｕつまりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。具体的には、図２５では、ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ群は、茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。Ｔａ１５０５投与群は、非常に薄い茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。
　図２６では、コントロールＩｇＧ投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から３列目））においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められた。（図２６において茶色い斑点のように染まっている）
　図２７では、Ｔａ１５０５投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から３列目））においての染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。（図２７において薄く茶色い斑点のように染まっている）
　このことからＴａ１５０５投与により、Ｃｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ、Ｌａｔｅｒａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ、Ｍｅｄｉａｌ　Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ）においてＡＴ８陽性ＴａｕつまりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。脳内（＝海馬ＣＡ３領域、海馬ＣＡ２３領域、ＰＲｈ、Ｅｎｔ（Ｌａｔｅｒａｌ、Ｍｅｄｉａｌ））において、Ｔａ１５０５抗体投与により、ＡＴ８認識のＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕ量の減少傾向が確認された。
　この結果は、抗体の投与によって脳内での病態の改善を示すものであり、上記の記憶障害の改善効果を裏付けるものである。また、この結果は腹腔内に投与した抗体が脳内で作用することを示している。
［実施例１０］Ｔａ１５０５抗体投与による脳内Ｔａｕ量の影響
　ＰＨＦを構成する過リン酸化Ｔａｕを認識すると考えられているＡＴ８抗体（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５認識マウスモノクローナル抗体、ＩＮＮＡＸ社製）、Ｇ２（抗ヒト特異的Ｎ末端領域認識抗体：ウサギポリクローナル抗体）、ＰＨＦ１（ＰＨＦを構成する過リン酸化Ｔａｕを認識すると考えられているｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４認識マウスモノクローナル抗体）およびＴａ１５０５を使用して、脳ホモジェネートにおけるＴａｕおよび過リン酸化Ｔａｕ量に及ぼす１５０５抗体投与の影響を抗体投与後のＴａｕ－Ｔｇマウス脳ホモジェネートを使用してウエスタンブロッティングにより調べた。
　マウス大脳半球１００－２００ｍｇを５倍量のＴＢＳ（プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテルを含有）にてソニケーションをおこなった。これを１００，０００ｇで１５分間、４℃にて遠心分離して上清をＴＢＳ可溶性画分として回収した。
　さらに沈殿を１％ｓａｒｋｏｓｙｌ／ＴＢＳ（プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテルを含有）に懸濁して、１時間、室温でインキュベートした。これを１００，０００ｇで１５分間、室温にて遠心分離し、上清をザルコシル可溶性画分とした。
　このＴＢＳ可溶性画分、ザルコシル可溶性画分を７％Ｔｒｉｓ―Ａｃｅｔａｔｅ　Ｇｅｌにより電気泳動を行い分離し、ＰＶＤＦ膜に転写を行い、１％ＢＳＡ／３％ＳｋｉｍＭｉｌｋ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳにて室温で終夜、ブロッキングを行った。その後、抗体溶液を反応させ、２次抗体としてＨＲＰコンジュゲート抗体を使用して、ＥＣＬ法にて反応を行い、ＬＡＳ３０００　イメージアナライザーにて解析を行い定量化した。
　結果を図２８及び図２９に示す。
　ＴＢＳ可溶性画分においては、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｔａｕ－Ｔｇマウス脳内のヒトＴａｕ（Ｇ２抗体で認識）および過リン酸化Ｔａｕ（ＡＴ８（ｐＳ２０２／ｐＴ２０５エピトープ）、ＰＨＦ１（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４エピトープ）にて認識）、ｐＳ４１３Ｔａｕ（Ｔａ１５０５認識）が有意に減少していることが確認された。
　ザルコシル可溶性画分においては、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｔａｕ－Ｔｇマウス脳内の過リン酸化Ｔａｕ（ＡＴ８にて認識）が有意に減少していることが確認された。
　この結果は、抗体の投与によって脳内での病態の改善を示すものであり、上記の記憶障害の改善の効果を裏付けるものである。また、この結果は腹腔内に投与した抗体が脳内で作用することを示している。
[製造例１]認知機能障害モデルとしてのヒト正常型タウを発現するＴｇマウス（Ｔａｕ－Ｔｇマウス）
　本発明での抗体による認知機能改善の薬理効果の検討は、ヒトの正常型タウ、特に胎生期においては３Ｒ型のタウのみを発現し、成長に伴い３Ｒ型と４Ｒ型の両方のタウが発現するというヒトでの個体発生と同様の発現パターンを示し、生後６ヶ月齢程度で認知機能障害を発症する特徴を有するＴｇマウスを用いた。当該Ｔｇマウスは以下のような方法で作製した。
　Ｔｇマウス作製のための遺伝子の構造は、αカルモジュリンキナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター（８．５ｋｂ）の下流に、Ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０（ＳＶ４０）の５’イントロン、（０．３ｋｂ）、タウ遺伝子（Ｔａｕ；７．３ｋｂ）、ＳＶ４０の３’イントロン（０．８ｋｂ）、ＳＶ４０　ｐｏｌｙＡシグナル（０．３ｋｂ）の順番でならぶ形に構成した図１７に示す構造を有するタウ遺伝子供与核酸を用いた。その内で用いたタウ遺伝子は、Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｔ．等（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ，Ｖｏｌ．５７９，Ｐ２４１－２４４，２００５年）に記載の方法と同様に取得したものであり、ヒ
トタウをコードするｃＤＮＡからエクソン１から９に相当する部分の塩基配列、イントロン９の最初の１８塩基と最後の３ｋｂの部分の塩基配列、エクソン１０の塩基配列、イントロン１０の最初の３ｋｂと最後の３８塩基の部分（但し、イントロン１０の５’端方向から１６番目の塩基シトシンをチミンに置換している）、エクソン１１から１３に相当するｃＤＮＡの塩基配列を順番に含む７．３ｋｂの長さの遺伝子である。このタウ遺伝子をＳＶ４０の５’イントロン、３’イントロン及びｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を有するベクターであるｐＮＮ２６５（Ｃｈｏｉ　Ｔ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１１、ｐｐ３０７０－３０７４、１９９１年）の制限酵素ＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。得られたプラスミドから制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩでＳＶ４０の５’イントロン、タウ遺伝子、ＳＶ４０の３’イントロンとｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を含むＤＮＡ断片を切り出し、そのＤＮＡ断片をＣａＭＫＩＩプロモーターを有するｐＭＭ４０３ベクター（Ｍａｙｆｏｒｄ　Ｍ等、Ｃｅｌｌ　ｖｏｌ．８１　ｐｐ８９１－９０４　１９９５年）にクローニングした。そして、得られたプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩでタウ遺伝子が含まれる図１７に示した構造の遺伝子断片（１７．２ｋｂ）を切り出してアガロース電気泳動で分離し、対応するゲルの部位からＱＩＡＧＥＮ（Ｒ）　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）を用いて精製した。得られた遺伝子（ＤＮＡ）断片は公知の方法［Ｈｏｇａｎ，Ｂ等、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ．　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）］に従い、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの雌雄を掛け合わせて得られた前核期胚にインジェクションした。インジェクションを行なった偽妊娠させたメスのＣ５７ＢＬマウスの卵管に注入した。生まれた仔マウスについて尾を一部切断し、ＰＣＲ法によって導入した遺伝子が組み込まれているかを確認し、導入した遺伝子が組み込まれた雌又は雄のマウスを正常の雌又は雄とを掛け合わせることで、導入されたタウ遺伝子をヘテロで持つＴｇマウスとして維持し、実験に用いた。なお、実施例中に記載があるｌｉｎｅ　６０９およびｌｉｎｅ　７８４と記載されているＴａｕ－Ｔｇマウスは同様の方法で作製され、同等の形質を示すマウスである（または実施例でｌｉｎｅの記載は削除する）。

Claims (23)

  1. 　配列番号１で示されるタウタンパク質の４１０位から４２１位に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
  2. 　該抗体が、認知症に特徴的なリン酸化を受けたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、請求項１に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  3. 　該抗体が、Ｓｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応することを特徴とする、請求項１又は２に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  4. 　該抗体が、タウタンパク質に対する結合において、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体と結合競合する抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  5. 　該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  6. 　該抗体が、Ｓｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  7. 　該抗体が、配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＨ鎖のＣＤＲ配列、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＬ鎖のＣＤＲ配列を有する抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  8. 　該抗体が、配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＬ鎖可変領域を有する抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  9. 　該抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  10. 　配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を含むペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
  11. 　該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基の少なくとも一つが、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、又はＳｅｒ４１６のアミノ酸残基に相当するペプチドである、請求項１０に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  12. 　該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基が、少なくとも配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である、請求項１０又は１１に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  13. 　認知症が、タウオパチーである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  14. 　タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔａｕｏｐａｔｈｙ　ｗｉｔｈ　ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う蛋白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－ｔａｕ）である、請求項１３に記載の認知症治療剤又は予防剤。
  15. 　配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該ペプチドに含まれる配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドに、抗原抗体反応するモノクローナル抗体。
  16. 　リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体との間で抗原への結合が競合的である抗体。
  17. 　リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体。
  18. 　配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＨ鎖、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＬ鎖を有するモノクローナル抗体。
  19. 　配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性を有するＬ鎖可変領域を有するモノクローナル抗体。
  20. 　抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１５から１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  21. 　配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列からなるペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチド。
  22. 　配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化されたことを特徴とする、請求項２１に記載のペプチド。
  23. 　リン酸化されたアミノ酸残基が、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である請求項２１又は２２に記載のペプチド。
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